專利名稱：一種透明質酸的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種從透明質酸發酵液中分離提取透明質酸的方法。
背景技術：
透明質酸(Hyaluronic Acid， HA)又名玻尿酸，是一種酸性粘多糖，以其獨特的分
子結構和理化性質在機體內顯示出多種重要的生理功能，如潤滑關節，調節血管壁的通透
性，調節蛋白質，水電解質擴散及運轉，促進創傷愈合等。尤為重要的是，它具有特殊的保水
作用，是目前發現的自然界中保濕性最好的物質，被稱為理想的天然保濕因子。它可以改善
皮膚營養代謝，使皮膚柔嫩、光滑、去皺、增加彈性、防止衰老，在保濕的同時又是良好的透
皮吸收促進劑，與其他營養成分配合使用，可以起到促進營養吸收的更理想效果。 近年來，透明質酸在各個領域應用日益廣泛，如化妝品和保健食品、關節疾病治
療、給藥體系中的應用、眼科治療中的應用等。 目前從透明質酸發酵液中提取透明質酸的方法主要是酒精沉淀法，只是后續處理 有所差異。比如，先將透明質酸發酵液由乙醇分離得到透明質酸提取物，然后向提取物中加 入由4.2g/L碳酸氫鈉和5.3g/L碳酸鈉以體積比為45 : 5組成的水溶液及胰蛋白酶進行 水解。水解后所得分離物在磷酸二氫鈉含量為0. 45g/L，磷酸氫二鈉含量為0. 05g/L及氯 化鈉含量為11. 6g/L的水溶液中溶解，向其中加入3倍體積的95%乙醇，得到沉淀，絕干的 沉淀物中透明質酸質量比為98.9%。隨后，經活性炭以及透析處理。最終透明質酸質量比 為99. 996%，相對分子量58萬Da。但該法得到的透明質酸產品相對分子量小，操作繁瑣， 且成本較高，不利于工業化生產。 和其他生物工程產品一樣，透明質酸工業生產也常常會受到生產成本的制約，而 在生產成本的構成中，分離提取等下游工程的成本占有相當的比例。因此，研究透明質酸的 提取方法具有重要的理論意義和實用價值。
發明內容
本發明的目的是提供一種從透明質酸發酵液中分離提取透明質酸的方法，該方法 具有提取收率高，產品純度高，對環境的污染小等優點。 為了實現本發明目的，本發明的一種透明質酸的提取方法，包括如下步驟
1)先將透明質酸發酵液調pH為4. 0 6. O，再加入絮凝劑絮凝后，經過濾得透明 質酸清液； 2)然后將透明質酸清液經脫色、調p朋.0 6. 5，再經乙醇沉淀； 3)將乙醇沉淀物溶解后，再加絡合劑進行絡合沉淀，沉淀物用鹽解離，過濾，濾液
再經乙醇沉淀，最后沉淀物經脫水、干燥。 其中，所述透明質酸發酵液來自鏈球菌有氧發酵生產的發酵液，到發酵末期直接 放罐進行下游提取。 步驟l)中調pH多采用三氯乙酸。三氯乙酸在pH4.0 6.0的情況下可使蛋白質
3變性，從而達到滅活透明質酸酶的作用，防止透明質酸分子量損失。 所述絮凝劑為聚丙烯酰胺，選用的絮凝劑型號為A856或A656。其添加量為10 30卯m/L，絮凝溫度為50 90。C，絮凝時間為30 60min。 所述過濾采用板框過濾方式。也可用真空抽濾的過濾方式，但由于透明質酸發酵 液較粘稠，真空抽濾太慢， 一般不予采用。 步驟2)中所述脫色采用活性炭進行脫色，一般添加量為5 8g/L，脫色溫度為 60 80。C，脫色時間為30 60min。 步驟2)中采用氫氧化鈉調p朋.0 6. 5，氫氧化鈉溶液濃度為1. 25 2. 5mol/L。 乙醇沉淀采用95%乙醇，其用量為被處理液體積的2 4倍。 步驟3)中乙醇沉淀物采用鹽溶液溶解，比如O. lmol/L氯化鈉溶液，其用量為發酵
液等體積。 所述絡合劑為氯代十六烷基吡啶(CPC)水溶液，其中，CPC水溶液濃度為5 15g/ L。 所述沉淀物用鹽解離時，先需要采用0. lmol/L氯化鈉溶液洗滌2 3次，然后再 與發酵液等體積的0. 5mol/L氯化鈉溶液中攪拌解離15 20小時。
鹽解離后采用真空抽濾方式進行過濾。 過濾后采用濾液3 4倍體積的乙醇沉淀2 4小時，所述乙醇采用95 %的乙醇。
所述脫水采用無水乙醇脫水。 所述干燥采用真空干燥，干燥溫度為40 60°C，干燥時間2 4小時。
本發明從透明質酸發酵液中提取透明質酸的方法，其優點在于1)提取收率高， 達到75 85% ;2)產品質量好，蛋白含量為0. 5 1%，分子量為100 130萬Da;3)選 用試劑來源廣泛，價格低廉，4)對環境的污染小。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1 30L 3.99g/L鏈球菌有氧發酵生產的透明質酸發酵液(注以下實施例中均為 鏈球菌有氧發酵生產的透明質酸發酵液)，用三氯乙酸調pH至4. 62，加熱至7(TC后添加 300ml 10ppm/L絮凝劑聚丙烯酰胺A856，保溫30min后真空抽濾，得到29L清液，清液加熱 至8(TC后添加150g白云山粉末活性炭緩慢攪拌脫色30min，脫色液29L，用2. 5mol/L氫氧 化鈉溶液調pH至6. 5，加87L 95%乙醇沉淀，沉淀用30L0. lmol/L氯化鈉溶液溶解，在攪拌 下加入10g/L CPC水溶液絡合，靜置1小時后母液上排，沉淀再用0. lmol/L氯化鈉溶液洗 滌3次后，置于30L 0. 5mol/L氯化鈉溶液中攪拌解離16小時，真空抽濾，濾液加90L95%乙 醇沉淀3小時，用無水乙醇脫水后，于旋轉式真空干燥器中，在干燥溫度為6(TC下，真空干 燥3小時，得到102g透明質酸產品，收率為85. 2% 。
實施例2 20L 3.97g/L透明質酸發酵液用三氯乙酸調pH至4. 58，加熱至8(TC后添加 200mll0ppm/L絮凝劑聚丙烯酰胺A856，保溫30min后真空抽濾，得到19L清液，清液加熱至 8(TC后添加120g白云山粉末活性炭緩慢攪拌脫色40min，脫色液20L，用1. 25mol/L氫氧化
4鈉溶液調pH至6. 45，加60L 95%乙醇沉淀，沉淀用20L 0. lmol/L氯化鈉溶液溶解，在攪拌 下加入10g/L CPC水溶液絡合，靜置1小時后母液上排，沉淀再用0. lmol/L氯化鈉溶液洗 滌2次后，置于20L 0. 5mol/L氯化鈉溶液中攪拌解離15小時，真空抽濾，濾液加60L 95% 乙醇沉淀2小時，用無水乙醇脫水后，于旋轉式真空干燥器中，在干燥溫度為5(TC下，真空 干燥4小時，得到66. 4g透明質酸產品，收率為83. 6% 。
實施例3 20L 4.1g/L透明質酸發酵液用三氯乙酸調pH至4.60，加熱至70。C后添加 200mll0ppm/L絮凝劑聚丙烯酰胺A656，保溫60min后真空抽濾，得到20L清液，清液加熱至 8(TC后添加160g白云山粉末活性炭緩慢攪拌脫色50min，脫色液20L，用氫氧化鈉溶液調pH 至6. 32，加60L95%乙醇沉淀，沉淀用20L 0. lmol/L氯化鈉溶液溶解，在攪拌下加入10g/ LCPC水溶液絡合，靜置1. 5小時后母液上排，沉淀再用0. lmol/L氯化鈉溶液洗滌3次后， 置于20L 0. 5mol/L氯化鈉溶液中攪拌解離20小時，真空抽濾，濾液加60L 95%乙醇沉淀4 小時，用無水乙醇脫水后，于旋轉式真空干燥器中，在干燥溫度為4(TC下，真空干燥4小時， 得到71. 2g透明質酸產品，收率為86. 8% 。
實施例4 30L 4. Og/L透明質酸發酵液用三氯乙酸調pH至4. 50，加熱至50。C后添加300ml 10ppm/L絮凝劑聚丙烯酰胺A856，保溫30min后真空抽濾，得到29L清液，清液加熱至80°C 后添加150g白云山粉末活性炭緩慢攪拌脫色40min，脫色液30L，用1. 5mol/L氫氧化鈉溶 液調pH至6.47，加91L 95%乙醇沉淀，沉淀用30L 0. lmol/L氯化鈉溶液溶解，在攪拌下加 入10g/LCPC水溶液絡合，靜置2小時后母液上排，沉淀再用0. lmol/L氯化鈉溶液洗滌3次 后，置于30L 0. 5mol/L氯化鈉溶液中攪拌解離20小時，真空抽濾，濾液加90L 95%乙醇沉 淀4小時，用無水乙醇脫水后，于旋轉式真空干燥器中，在干燥溫度為6(TC下，真空干燥2小 時，得到106g透明質酸產品，收率為86.3%。
實施例5 30L 4. 2g/L透明質酸發酵液用三氯乙酸調pH至4.6，加熱至90。C后添加300ml 20ppm/L絮凝劑聚丙烯酰胺A856，保溫30min后真空抽濾，得到29L清液，清液加熱至70°C 后添加180g白云山粉末活性炭緩慢攪拌脫色30min，脫色液30L，用4mol/L氫氧化鈉溶液 調pH至6. O，加90L95X乙醇沉淀，沉淀用30L 0. lmol/L氯化鈉溶液溶解，在攪拌下加入 10g/L CPC水溶液絡合，靜置1. 5小時后母液上排，沉淀再用0. lmol/L氯化鈉溶液洗滌3次 后，置于30L 0. 5mol/L氯化鈉溶液中攪拌解離18小時，真空抽濾，濾液加90L 95%乙醇沉 淀3小時，用無水乙醇脫水后，于旋轉式真空干燥器中，在干燥溫度為5(TC下，真空干燥3. 5 小時，得到109g透明質酸產品，收率為86. 8 % 。 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
一種透明質酸的提取方法，其特征在于，包括如下步驟1)先將透明質酸發酵液調pH為4.0～6.0，再加入絮凝劑絮凝后，經過濾得透明質酸清液；2)然后將透明質酸清液經脫色、調pH6.0～6.5，再經乙醇沉淀；3)將乙醇沉淀物溶解后，再加絡合劑進行絡合沉淀，沉淀物用鹽解離，過濾，濾液再經乙醇沉淀，最后沉淀物經脫水、干燥。
2. 根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述絮凝劑為聚丙烯酰胺，其添加量 為10 30卯m/L，絮凝溫度為50 90。C，絮凝時間為30 60min。
3. 根據權利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步驟1)中調pH采用三氯乙酸。
4. 根據權利要求l-3任意一項所述的提取方法，其特征在于，步驟2)中所述脫色采用 活性炭進行脫色，添加量為5 8g/L，脫色溫度為60 8(TC，脫色時間為30 60min。
5. 根據權利要求l-4任意一項所述的提取方法，其特征在于，步驟2)中采用氫氧化鈉 調pH6. 0 6. 5，氫氧化鈉溶液濃度為1. 25 2. 5mol/L。
6. 根據權利要求l-5任意一項所述的提取方法，其特征在于，所述絡合劑為氯代十六 烷基吡啶水溶液，其濃度為5 15g/L。
7. 根據權利要求l-6任意一項所述的提取方法，其特征在于，步驟3)中，所述沉淀物用 鹽解離時，先采用0. lmol/L氯化鈉溶液洗滌2 3次，然后再與發酵液等體積的0. 5mol/L 氯化鈉溶液中攪拌解離15 20小時。
8. 根據權利要求l-7任意一項所述的提取方法，其特征在于，步驟3)中過濾后采用濾 液3 4倍體積的乙醇沉淀2 4小時，所述乙醇采用95%的乙醇。
9. 根據權利要求l-8任意一項所述的提取方法，其特征在于，所述脫水采用無水乙醇 脫水。
10. 根據權利要求l-9任意一項所述的提取方法，其特征在于，所述干燥采用真空干 燥，干燥溫度為40 6(TC，干燥時間2 4小時。
全文摘要
本發明提供了一種從透明質酸發酵液中分離提取透明質酸的方法，包括如下步驟先將透明質酸發酵液調pH為4.0～6.0，再加入絮凝劑絮凝后，經過濾得透明質酸清液；然后將透明質酸清液經脫色、調pH6.0～6.5，再經乙醇沉淀；然后將乙醇沉淀物溶解后，再經絡合劑進行絡合沉淀，沉淀物用鹽解離，過濾，濾液再經乙醇沉淀，最后沉淀物經脫水、干燥得到合格的透明質酸產品。該方法提取透明質酸的優點在于提取收率高，產品純度高，工藝簡單操作簡便，勞動強度小，對環境的污染小。
文檔編號C08B37/08GK101704905SQ20091009377
公開日2010年5月12日 申請日期2009年9月28日 優先權日2009年9月28日
發明者尚海濤, 崔剛, 李榮杰, 潘聲龍 申請人:安徽豐原發酵技術工程研究有限公司