專利名稱：生物粘附型聚乙二醇衍生物及其在藥學中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥用高分子輔料合成和藥物制劑領域，具體涉及一種生物粘附型聚乙二醇衍 生物。本發明還公開了這種材料的制備方法及應用。
背景技術：
生物粘附是指天然或是人造的材料與機體的粘膜表面產生的粘連作用。人機體中很多部 位，如口腔、鼻腔、胃腸道、眼部、陰道等的表面均覆蓋有粘膜層，要實現藥物通過這些粘 膜部位的遞送，首先就必須保證藥物能與粘膜部位產生較長時間的接觸，從而保證藥物通過 給藥部位的組織屏障并被吸收傳輸到靶器官。機體組織的粘膜可分泌粘液，其主要成分為粘 蛋白、糖蛋白、類脂等，只有粘附材料的分子鏈段與黏液層的黏性鏈段產生緊密作用，才能 產生生物粘附現象。然而大部分粘附材料只是通過簡單的靜電作用、范德華力、氫鍵作用等 與粘性片段作用，作用不夠緊密，加上粘膜部位自身的保護和屏障作用，大部分粘附材料及 其與藥物遞送載體或是藥物的結合物，在機體粘膜部位的滯留時間都是有限的。
膠體給藥組合物可實現藥物的緩控釋，提高對難溶性藥物的包裹，以及實現藥物的耙向 遞送等。但是由于粘膜表面纖毛的清除機制，膠體給藥組合物不能與粘膜表面產生長時間的 緊密接觸，粘膜層滯留時間較短，因此不能實現藥物在機體粘膜部位的有效遞送。通過對膠 體給藥組合物的表面進行修飾，有可能改變其表面特性，從而增加其與粘膜層的作用。
聚乙二醇類材料常用作膠體給藥組合物的表面修飾材料，其可有效的防止膠體微粒被巨 噬系統所識別，延長膠體微粒在血循環系統中的時間，實現其長循環及靶向性。聚乙二醇烷 基酯和聚乙二醇烷基醚是由聚乙二醇分別與長鏈的脂肪酸或脂肪醇縮合而成的聚乙二醇烷基 酯類或醚類衍生物，其結構中同時具有疏水的烷基端和親水的聚乙二醇鏈段，有較好的親水 親油性。
發明內容
本發明公開了一種具有生物粘附性的聚乙二醇醚類或是酯類的衍生物。利用本發明的衍 生物對膠體給藥組合物的表面進行修飾后，使膠體給藥組合物具有良好的生物粘附性能，從 而延長膠體給藥組合物在機體粘膜部位的滯留時間。
本發明的生物粘附型聚乙二醇類衍生物的結構式如下式I或II-<formula>formula see original document page 4</formula>
其中Ri或R2代表Cn.n的垸基；n代表3-200的整數尺3代表:
SH或
上述式I或式II的生物粘附型聚乙二醇類衍生物，其中R,優選代表十七垸基。R2優選代 表十二烷基、十四垸基、十六垸基或十八烷基。N優選代表10、 12、 20、 40、 50或100。
本發明的生物粘附型聚乙二醇衍生物可作為膠體給藥組合物的修飾載體，使膠體給藥組合 物具有粘膜粘附性能，大大提高其粘膜部位給藥的生物利用度。該膠體給藥組合物主要優選 包括脂質體、脂質納米粒、納米脂質載體、乳劑等。本發明的生物粘附型聚乙二醇衍生物 可和膠體給藥組合物組合用于眼部、口腔、胃腸道、陰道、鼻粘膜等粘膜部位的給藥。
本發明的聚乙二醇衍生物的制備方法簡單、副產物少，條件溫和，包括下列的步驟采
用對硝基苯基氯甲酸酯活化聚乙二醇垸基酯類或是烷基醚類衍生物的端羥基，然后在堿性的 條件下與提供氨基基團的具有端基硫羥基的物質進行氨解反應，形成以酰胺鍵相連的具有粘 膜粘附功能的聚乙二醇衍生物。其中所述提供氨基基團的具有端基硫羥基的物質為半胱氨酸、 半胱胺或高半胱氨酸。
更為優選的制備方法如下 1.聚乙二醇衍生物的端羥基活化
將4-硝基苯基氯甲酸酯和聚乙二醇烷基酯或聚乙二醇垸基醚溶于無水二氯甲烷中，加入
三乙胺調節溶液至堿性，密閉常溫磁力攪拌反應過夜。濾去反應中的三乙胺鹽酸沉淀，旋轉 蒸發除去溶劑。所得產物經乙酸乙酯和乙醚兩次重結晶，真空干燥得到端羥基活化的聚乙二 醇類衍生物。
合成路線如下<formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula>
其中Ri、 R2或n的定義同前。 2.巰基化聚乙二醇衍生物的制備
在端羥基活化后的聚乙二醇衍生物的水溶液中，加入半胱氨酸、半胱胺或高半胱氨酸，調 節pH為6-9，室溫避光反應l-4小時后，用醋酸緩沖液透析24小時，凍干后即得到巰基化的 聚乙二醇烷基醚或是聚乙二醇烷基酯。
合成路線如下
<formula>formula see original document page 5</formula>
其中Rb R2、 R3或n的定義同前。 將本發明的生物粘附型聚乙二醇衍生物溶于水，與膠體微粒溫孵5-20min，即可制得粒徑 為20-400nm的生物粘附型膠體給藥組合物。所謂的膠體給藥組合物包括脂質體、脂質納米粒、 脂質納米載體、乳劑等。
本發明的生物粘附型聚乙二醇衍生物可與膠體給藥組合物組合，使疏水的烷基端插入膠 體微粒的內核，而親水性的帶有端基硫醇基的聚乙二醇長鏈自由伸展于膠體微粒的表面，從 而有利于實現膠體微粒的粘膜粘附。例如，對脂質納米載體進行修飾后，可使不具有生物粘 附性能的脂質納米載體微粒，具有生物粘附性。
一、 游離巰基的含量測定
根據文獻報道(Eur. J. Pharm. Biopharm. 2003， 55 (2): 185-190)游離巰基的含量與聚合物 的粘附性密切相關，游離巰基的含量越大則聚合物的粘附性也越強。
采用Ellman's試劑法測定所制生物粘附型聚乙二醇衍生物的游離巰基含量。本發明的聚 乙二醇垸基酯類衍生物的巰基含量大于800mmol/mo1聚合物，本發明的聚乙二醇烷基醚類衍 生物的巰基含量大于450 mmol/mo1聚合物。
二、 生物粘附型聚乙二醇衍生物的粘附性能評價
根據文獻報道(Adv. Drug Deliv. Rev. 2005, 57(11):1583-1594)，只有生物粘附型材料的溶 液與粘蛋白溶液混合時，才會改變粘蛋白顆粒的表面性質。
用磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制粘蛋白溶液，用超聲細胞破碎儀將粘蛋白的顆粒粒徑減少至1微米以下，4000rpm離心后取上清液，過0.8微米的醋酸纖維素濾膜后備用。
將本發明的生物粘附型聚乙二醇衍生物配制成不同濃度的溶液，等體積與上述粘蛋白溶 液混合，考察粘蛋白顆粒粒徑和zeta電位的變化，以評價粘蛋白顆粒的表面性質的改變。結 果顯示本發明的生物粘附型聚乙二醇衍生物顯著的改變了粘蛋白顆粒的表面性質(尸O.05)，其 具有生物粘附性。見圖l (其中左圖和右圖分別是粘蛋白顆粒的粒徑和電位變化圖)。
三、 生物粘附型聚乙二醇衍生物修飾的脂質納米粒的粘附性評價
根據文獻(Eur.J.Pharm.Biopharm. 2003,56 (2):207-214)，采用粘度法對修飾后的納米粒 的生物粘附性能進行評價。只有具有生物粘附性能的材料或載體才會使粘蛋白溶液(mucin) 的粘度顯著上升。將粘蛋白配制成8%濃度的溶液，采用黏度計測定其粘度的初始值。將等體 積的脂質納米粒(NLC )和本發明生物粘附型聚乙二醇衍生物修飾后的脂質納米粒(Cys-NLC ) 分別加入其中，平衡20分鐘后，于室溫下測定混合后溶液的粘度。結果顯示，與普通脂質納
米粒與粘蛋白溶液混合后溶液的粘度較初始粘度沒有顯著的變化，但是經過本發明生物粘附 型聚乙二醇衍生物修飾后的脂質納米粒與粘蛋白溶液混合后顯著的提高了粘蛋白溶液的粘度 說明經過本發明所制的聚乙二醇衍生物的修飾，所得到的修飾后的脂質納米粒具有 生物粘附性。結果見圖2所示。
四、 生物粘附型脂質納米粒在粘膜部位的粘附性評價 通過考察生物粘附型脂質納米粒在眼部粘膜部位滯留的時間，來評價其在體內粘膜部位
的生物粘附性。采用環孢素A作為模型藥物制成環孢素A生物粘附型脂質納米粒滴眼劑，滴 入家兔眼中，測定環孢素A在淚液中的濃度，以評價修飾后的脂質納米粒攜帶藥物在眼前滯 留的時間。結果表明，本發明所制的生物粘附型脂質納米粒(Cys-NLC)較之普通的脂質納 米粒(NLC)，可顯著提高藥物在眼部粘膜部位的滯留時間(戶<0.05)，生物粘附型脂質納米粒 在6小時仍能測到較高的藥物濃度，但是普通脂質納米粒4小時就測不到藥物濃度，說明本 發明所制的修飾后的脂質納米粒具有較好的生物粘附性能。結果見圖3所示。
將本發明的生物粘附型脂質納米粒經大鼠鼻粘膜給藥后，測定血液中藥物的濃度，發現 本發明所制生物粘附型脂質納米粒的血藥濃度曲線下面積(AUC)比普通脂質納米粒的血濃 曲線下面積(AUC)提高了 3-5倍，說明由于增加了藥物在鼻粘膜部位的滯留，使藥物在吸 收部位停留的時間延長，從而使藥物的生物利用度得到提高。
圖1是本發明的生物粘附型聚乙二醇衍生物對粘蛋白顆粒表面性質的影響 圖2是本發明的生物粘附型脂質納米粒對粘蛋白溶液粘度的影響圖3是本發明的生物粘附型脂質納米粒眼部粘膜的滯留行為評價
具體實施例方式
實施例1
生物粘附型聚乙二醇40脂肪酸酯的制備
精密稱取4-硝基苯基氯甲酸酯2g，聚乙二醇脂肪酸酯12g，將以上兩種物質分別溶于無 水二氯甲垸中，并在聚乙二醇脂肪酸酯的無水二氯甲垸溶液中加入三乙胺l ml。將含有三乙 胺的聚乙二醇脂肪酸酯無水二氯甲烷溶液緩慢加入到攪拌狀態下的4-硝基苯基氯甲酸酯的無 水二氯甲烷溶液中，密閉常溫磁力攪拌反應過夜。抽濾除去反應液中生成的三乙胺鹽酸鹽沉 淀。用旋轉蒸發儀蒸干溶劑二氯甲烷和未反應的三乙胺。所得粗品用無水乙醚沉淀并洗滌， 抽濾除去無水乙醚，沉淀用乙酸乙酯:乙醚(l:l)混合溶劑重結晶。所得產品置真空干燥器干 燥，抽去殘留溶劑，得白色粉末7,2g。
將端基活化的聚乙二醇脂肪酸酯溶于醋酸緩沖液中，按摩爾比1:2加入半胱氨酸，調節 pH至8，室溫避光反應2小時，用0.1M的醋酸緩沖液透析24小時，所得樣品凍干后，置于 4。C冰箱，密封保存。
iH-NMR (300 MHz, CDC13): 36.2 (m， C(O)NH)， 53.56-3.69 (m, 0陽CH2CHrO)為聚乙二醇脂 肪酸酯中PEG鏈的特征吸收，S1.24 (m， CH2)為聚乙二醇脂肪酸酯中飽和的脂肪鏈，S2.28-2.33 (m, 4H, C(0)CH2)， S4.18-4.3 (m， 2H,CH2OCO)， 53.0 (m, 2H， C(O) CH2)。巰基含量結果表明 每摩爾聚合物修飾有827.893±25.56 (Jmol的巰基。該聚合物的結構式如下所示
o
實施例2
生物粘附型聚乙二醇100脂肪酸酯的制備
精密稱取4-硝基苯基氯甲酸酯2g,聚乙二醇100脂肪酸酯15g,將以上兩種物質分別溶 于無水二氯甲垸中，并在聚乙二醇100脂肪酸酯的無水二氯甲烷溶液中加入三乙胺lml。將 含有三乙胺的聚乙二醇脂肪酸酯無水二氯甲垸溶液緩慢加入到攪拌狀態下的4-硝基苯基氯甲 酸酯的無水二氯甲烷溶液中，密閉常溫磁力攪拌反應過夜。抽濾除去反應液中生成的三乙胺 鹽酸鹽沉淀。用旋轉蒸發儀蒸干溶劑二氯甲垸和未反應的三乙胺。所得粗品用無水乙醚沉淀并洗滌，抽濾除去無水乙醚，沉淀用乙酸乙酯:乙醚(l:l)混合溶劑重結晶。所得產品置真空 干燥器干燥，抽去殘留溶劑，得白色粉末8g。
將端基活化的聚乙二醇脂肪酸酯溶于醋酸緩沖液中，按摩爾比1:3加入半胱氨酸，調節 pH至8，室溫避光反應2小時，用0.1M的醋酸緩沖液透析24小時，所得樣品凍干后，置于 4。C冰箱，密封保存。
力-NMR (300 MHz, CDC13): S6.2(m, C(O)NH)， S3.56-3.69(m, 0-CH2CH2-0)為聚乙二醇脂 肪醇醚中PEG鏈的特征吸收，51.24 (m， CH2)為聚乙二醇脂肪醇醚中飽和的脂肪鏈，S2.28-2.33 (m, 4H, C(0)CH2)， S4.18-4.3 (m， 2H, CH2OCO)。巰基含量結果表明每摩爾聚合物修飾有878.4 ± 15.78 lJmol的巰基。該聚合物的結構式如下所示
o
OH
SH
實施例3
生物粘附型聚乙二醇20硬脂基醚的制備
精密稱取4-硝基苯基氯甲酸酯2g，聚乙二醇脂肪醇醚20g，將以上兩種物質分別溶于無 水二氯甲烷中，并在聚乙二醇脂肪醇醚的無水二氯甲垸溶液中加入三乙胺l ml。將含有三乙 胺的聚乙二醇脂肪醇醚無水二氯甲垸溶液緩慢加入到攪拌狀態下的4-硝基苯基氯甲酸酯的無 水二氯甲垸溶液中，密閉常溫磁力攪拌反應過夜。抽濾除去反應液中生成的三乙胺鹽酸鹽沉 淀。用旋轉蒸發儀蒸干溶劑二氯甲垸和未反應的三乙胺。所得粗品用無水乙醚沉淀并洗滌， 抽濾除去無水乙醚，沉淀用乙酸乙酯:乙醚(l:l)混合溶劑重結晶。所得產品置真空干燥器干 燥，抽去殘留溶劑，得白色粉末9,2g。
將端基活化的聚乙二醇脂肪醇醚溶于醋酸緩沖液中，按摩爾比1:2加入半胱氨酸，調節pH 至8，室溫避光反應2小時，用0.1M的醋酸緩沖液透析24小時，所得樣品凍干后，置于4。C 冰箱，密封保存。
^曙NMR (300 MHz, CDC13): S6.2(m, C(O)NH)， S3.56-3.69(m, 0-012。112-0)為聚乙二醇脂 肪醇醚中PEG鏈的特征吸收，31.24(111,(:112)為聚乙二醇脂肪醇醚中飽和的脂肪鏈。巰基含量 結果表明摩爾聚合物修飾有489.6±43.15 (Jmol的巰基。該聚合物的結構式如下所示<formula>formula see original document page 9</formula>實施例4
生物粘附型脂質納米粒的制備
采用環孢素A作為模型藥物，制備生物粘附型脂質納米粒。具體如下將甘油酯400mg 和辛酸/葵酸甘油酯200mg，環孢素A 50 mg在80°C水溶熔融，100 mg吐溫80和lOOmg聚 乙二醇硬脂酸酯溶于7 mL的水中加熱到80 。C，把水相滴加到熔融的油脂中，攪拌5min形 成初乳。初乳于400W超聲10分鐘，趁熱過0.45 tim微孔濾膜后，滴入2%的生物粘附型聚 乙二醇40脂肪酸酯(實施例l方法制得)3mL， 80。C溫孵攪拌5分鐘，冰浴冷卻。
采用Ellman，s測得所制生物粘附型脂質納米粒的巰基含量為2.33mmol/L。評價其在眼部 粘膜的滯留行為，發現6小時后仍然能夠檢測到較高的環孢素A的濃度，說明其生物粘附性 較好。
將所制生物粘附型脂質納米粒經大鼠鼻粘膜給藥后，測定血液中環孢素A的濃度，發現 本發明所制生物粘附型脂質納米粒的血藥濃度曲線下面積(AUC)比普通脂質納米粒的血濃 曲線下面積(AUC)提高了5倍，說明由于增加了藥物在鼻粘膜部位的滯留，使藥物在吸收 部位停留的時間延長，從而使藥物的生物利用度得到提高。
權利要求
1、通式I或II表示的生物粘附型聚乙二醇衍生物其中R1或R2代表C11-17的烷基；n代表3-200的整數；R3代表或
2、 權利要求1的生物粘附型聚乙二醇衍生物，其中Ri代表十七垸基。
3、 權利要求1的生物粘附型聚乙二醇衍生物，其中R2代表十二垸基、十四垸基、十六烷基 或十八烷基。
4、 權利要求1的生物粘附型聚乙二醇衍生物，其中n代表10、 12、 20、 40、 50或100。
5、 權利要求1至4中任一項的生物粘附型聚乙二醇衍生物的制備方法，包括采用對硝基苯 基氯甲酸酯活化聚乙二醇衍生物的端羥基，然后在堿性條件下與提供氨基基團的具有端基 硫羥基的物質進行氨解反應，形成以酰胺鍵相連的具有生物粘附功能的聚乙二醇衍生物， 其中提供氨基基團的具有端基硫羥基的物質為半胱氨酸、半胱胺或高半胱氨酸。
6、 一種藥物組合物，其中含有權利要求1至4中任一項的生物粘附型聚乙二醇衍生物及膠體 給藥組合物。
7、 權利要求6的藥物組合物，其中膠體給藥組合物為脂質納米粒、納米脂質載體、乳劑或脂 質體。
8、 權利要求1至4中任一項的生物粘附型聚乙二醇衍生物用于增加藥物組合物生物粘附性的 用途。
全文摘要
本發明涉及藥用高分子輔料合成和藥物制劑領域，具體涉及一種結構式I或結構式II的生物粘附型聚乙二醇衍生物。本發明的生物粘附型聚乙二醇衍生物可作為膠體給藥組合物的修飾載體，使膠體給藥組合物具有粘膜粘附性能，大大提高其粘膜部位給藥的生物利用度。本發明還公開了這種材料的制備方法及應用。
文檔編號C08G65/48GK101544756SQ20091003106
公開日2009年9月30日 申請日期2009年4月23日 優先權日2009年4月23日
發明者孫敏捷, 平其能, 潔 沈, 宇 王, 鄧艷平 申請人:中國藥科大學