專利名稱：一種在絞股藍中制備中性多糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種在絞股藍中制備中性多糖的方法，尤其是利用秦巴山區天然資源
的秦巴絞股藍中草藥中提取、分離、純化一種中性多糖的方法。
背景技術：
絞股藍(Gynostemma pentaphyllum Makino)為葫蘆科絞股藍屬多年生草質藤本 植物，具有增強免疫、抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗氧化等作用，且安全無毒。目前，全世界已 知絞股藍植物有13種，我國占11種，其中7種為我國獨有，占全部種數的53. 8% 。絞股藍 主要分布在亞洲一些國家，在我國應屬陜西絞股藍資源最為豐富，主要分布在以秦巴山區 為中心的37個縣市，安康、平利等縣市目前已成為我國絞股藍最大的生產基地，所產絞股 藍品種最為優良。 近年研究發現絞股藍多糖是絞股藍的有效活性成分之一，具有增強免疫、抗腫瘤、 抗氧化、降血糖、抗疲勞等藥理作用。目前國內外對絞股藍多糖的研究普遍停留在粗多糖水 平，主要集中在粗多糖提取和生物活性等方面的研究。中國專利公開號CN1098298A所述 的絞股藍多糖的提取技術，得到的多糖含有蛋白質、色素等其他成分。中國專利公開號CN 1490338A所用技術，雖然進行了除蛋白處理過程，但是缺少脫色等程序，此方法得到的絞股 藍多糖也只是粗品，含有大量色素等其他成分。目前尚未分離純化得到均一的絞股藍多糖 組分。
發明內容
要解決的技術問題 為了避免現有技術的不足之處，本發明提出一種在絞股藍中制備中性多糖的方
法，可以制備得到均一的絞股藍多糖組分。 技術方案 —種在絞股藍中制備中性多糖的方法，其特征在于中性多糖的制備由3步實現 先自絞股藍中制備得到粗多糖，然后制得精制多糖，由精制多糖制備得到中性多糖；具體步 驟如下 步驟1 :將95%乙醇加入到水分干燥的絞股藍中，在50±2°C的溫度下攪拌1小 時，然后過濾收集濾渣；再將濾渣采用95%乙醇在50士2t:回流攪拌1小時后過濾收集濾 渣；再將濾渣采用95%乙醇在50士2t:回流攪拌1小時后過濾收集濾渣；將濾渣自然風 干后加入6-10倍相對濾渣質量重的蒸餾水，在90-95 t:下攪拌10-12h，過濾收集濾液，重 復2-3次；將上述每次收集得到的濾液合并，在5(TC下抽真空減壓濃縮，在流動水中透析 48h ; 步驟2 :向步驟l得到的透析袋的溶液加入4倍體積的乙醇，在4t:下保存10-12h ; 然后用高速離心機在5000rpm離心10min，收集其中的沉淀物，依次采用乙醇、丙酮和乙醚 進行洗滌，再40-45t:真空干燥6h，得到棕褐色秦巴絞股藍粗多糖；
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步驟3 :將粗多糖加雙蒸水配成濃度為5%的水溶液，用lmol/L HC1調節pH為 5. 5，加入粗多糖質量1/20的木瓜蛋白酶在65t:恒溫下攪拌3h后加熱至IO(TC終止酶反 應； 步驟4 :加入雙蒸水將步驟3得到的溶液稀釋至0. 5%，滴加濃氨水將pH值調至 8. 0，于5(TC邊攪拌邊逐漸加入30% H202，攪拌3 5小時至溶液顏色變為較透明的淡黃色， 停止攪拌在5(TC下抽真空減壓濃縮； 步驟5 :向步驟4得到的濃縮液加入其體積1/5的sevag試劑，震蕩20min，放入高 速離心機中在5000rpm離心15min ;離心完后收集上清液，再加入其體積1/5sevag試劑，重 復5次；將得到的上清液用蒸餾水透析48h，收集透析袋中的溶液，加入其4倍體積的乙醇， 在4t:放置10-12h ;放入高速離心機中在5000rpm離心10min，離心完后收集沉淀，依次分 別用乙醇、丙酮和乙醚洗滌，冷凍干燥12h，得到白色絞股藍精制多糖；
步驟6 :將精制絞股藍多糖lg溶于50mL雙蒸水，5000rpm離心15min，取上清，上 DEAE-52 cellulose柱，上樣量為交換容量的10% 20% ; 步驟7 :將上述的離子交換柱依次用雙蒸水、0 lmol/L NaCl溶液線性梯度洗脫， 收集合并第一流出物的蒸餾水洗脫液，在5(TC下減壓濃縮，蒸餾水透析48h，冷凍干燥得到 絞股藍中性多糖。
有益效果 本發明提出的一種在絞股藍中制備中性多糖的方法，是一種從絞股藍中提取、分 離、純化的中性多糖的制備方法。本發明利用多糖、糖蛋白溶于水的特性，用水提法浸提，并 用乙醇分級沉淀法分離，最后用陰離子交換柱層析和凝膠柱層析純化多糖。
圖1秦巴絞股藍精制多糖的DEAE-52 cellulose柱層析
圖2 GPMPA的S印hadex G-100凝膠柱層析
圖3 9種單糖標準品糖腈衍生物GC圖
圖4 GPMPA糖腈衍生物GC圖
具體實施例方式
現結合實施例、附圖對本發明作進一步描述
本實施例中采用秦巴絞股藍制備中性多糖。
實施例1 稱取干燥絞股藍500g，加入2500mL95%乙醇，在50°C的溫度下攪拌1小時，然后 過濾收集濾渣；再將濾渣采用95%乙醇在5(TC回流攪拌1小時后過濾收集濾渣；再將濾渣 采用95%乙醇在5(TC回流攪拌1小時后過濾收集濾渣；將濾渣自然風干后加入3000mL的 蒸餾水，在95t:下攪拌10h，過濾收集濾液，重復3次；將上述每次收集得到的濾液合并，在 5(TC下抽真空減壓濃縮至1L，在流動水中透析48h ; 向透析后的溶液加入4倍體積的乙醇，在4。C下保存12h ;然后用高速離心機在 5000rpm離心10min，收集其中的沉淀物，依次采用乙醇、丙酮和乙醚進行洗滌，在4(TC真空 干燥6h，得到棕褐色秦巴絞股藍粗多糖；
稱取10g秦巴絞股藍粗多糖，加200mL去離子水配成5X粗多糖溶液，，用lmo1/ LHC1調節pH為5. 5，加入0. 5g木瓜蛋白酶，65。C恒溫攪拌3h后加熱至IO(TC，保持6min， 滅活，終止酶反應； 加入1800mL雙蒸水將溶液稀釋至0. 5% ，滴加濃氨水將pH值調至8. 0，于5(TC邊 攪拌邊逐漸加入30% 11202，攪拌3小時至溶液顏色變為較透明的淡黃色，停止攪拌，用醋酸 調節pH值至7. O，在5(TC下抽真空減壓濃縮至500mL ; 向濃縮液加入100mL sevag試劑，震蕩20min，放入高速離心機中在5000rpm離心 15min ;離心完后收集上清液，再加入其體積1/5 sevag試劑，重復5次；將得到的上清液用 蒸餾水透析48h，收集透析袋中的溶液，加入其4倍體積的乙醇，在4t:放置12h ;放入高速 離心機中在5000rpm離心10min，離心完后收集沉淀，依次分別用乙醇、丙酮和乙醚洗滌，冷 凍干燥12h，得到白色絞股藍精制多糖； 將精制絞股藍多糖lg溶于50mL雙蒸水，5000rpm離心15min，取上清，上DEAE-52 cellulose柱，上樣量為交換容量的10% 20% ; 將上述的離子交換柱依次用雙蒸水、0 lmol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，收集合
并第一流出物的蒸餾水洗脫液，在5(TC下減壓濃縮，蒸餾水透析48h，冷凍干燥得到絞股藍
中性多糖。 實施例2 稱取干燥絞股藍20kg，加入120L蒸餾水，投入提取罐中，在95。C下攪拌10h，過濾 收集濾液，重復2次；將上述每次收集得到的濾液合并，在50°C下抽真空減壓濃縮至40L，在 流動水中透析48h ; 向透析后的溶液加入4倍體積的工業乙醇，在fC下保存10h ;然后用高速離心機 在5000rpm離心10min，收集其中的沉淀物，依次采用乙醇、丙酮和乙醚進行洗滌，在45°C真 空干燥6h，得到棕褐色秦巴絞股藍粗多糖； 稱取10g秦巴絞股藍粗多糖，加200mL去離子水配成5X粗多糖溶液，用lmo1/ LHC1調節pH為5. 5，加入0. 5g木瓜蛋白酶，65。C恒溫攪拌3h后加熱至IO(TC，保持6min， 滅活，終止酶反應； 加入1800mL雙蒸水將溶液稀釋至0. 5% ，滴加濃氨水將pH值調至8. 0，于5(TC邊 攪拌邊逐漸加入30% 11202，攪拌3小時至溶液顏色變為較透明的淡黃色，停止攪拌，用醋酸 調節pH值至7. O，在5(TC下抽真空減壓濃縮至500mL ; 向濃縮液加入100mL sevag試劑，震蕩20min，放入高速離心機中在5000rpm離心 15min ;離心完后收集上清液，再加入其體積1/5 sevag試劑，重復5次；將得到的上清液用 蒸餾水透析48h，收集透析袋中的溶液，加入其4倍體積的乙醇，在4t:放置12h ;放入高速 離心機中在5000rpm離心10min，離心完后收集沉淀，依次分別用乙醇、丙酮和乙醚洗滌，冷 凍干燥12h，得到白色絞股藍精制多糖； 將精制絞股藍多糖lg溶于50mL雙蒸水，5000rpm離心15min，取上清，上DEAE-52 cellulose柱，上樣量為交換容量的10% 20% ; 將上述的離子交換柱依次用雙蒸水、0 lmol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，收集合 并第一流出物的蒸餾水洗脫液，在5(TC下減壓濃縮，蒸餾水透析48h，冷凍干燥得到得到本 發明的秦巴絞股藍中性多糖GPMPA，如圖l所示。
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實施例制備的秦巴絞股藍中性多糖GPMPA的理化性質
1.純度測定 S印hadex G-100填料在IO(TC溶脹5h后，用1. 0mol/L NaoH溶液處理，以蒸餾水 洗至中性后裝柱(柱尺寸為1.6cmX50cm)。裝柱后用蒸餾水平衡48h。將GPMPA 50mg溶 于5mL雙蒸水，離心，取上清，過柱，用0. lmol/L NaCl溶液洗脫，流速O. 5mL/min，自動部分 收集器收集(3mL/Tube)，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，將主峰收集合并，繪制洗脫管數與吸光度 的關系曲線。GPMPA的S印hadex G-100凝膠柱層析洗脫曲線為單一對稱峰，表明該樣品純 度較高，如圖2所示。
2.光譜分析 紫外光譜取GPMPA適量，去離子水溶解，配制成濃度為lmg/mL的溶液，在 200-400nm范圍內掃描。GPMPA的紫外光譜在260nm和280nm處無吸收峰，表明不含核酸和 蛋白質。 紅外光譜取GPMPA適量，溴化鉀壓片，4000-400cm—1區間掃描。IR光譜解析如下 3407 (0-H) ， 2920 (C_H) ， 1638 (C = 0) ， 1452 (C_0) 。 GPMPA在866cm—1處出現吸收峰，是妣喃 環的特征吸收，說明GPMPA是吡喃糖。
3.單糖組成測定 稱取20mg固體糖樣、10mg鹽酸羥胺和5mg內標(肌醇六乙酸酯)，加入2mL吡啶， 放入9(TC水浴中加熱反應30min并振蕩。取出后冷至室溫，加入lmL乙酸酐，在9(TC下繼 續反應30min進行乙酰化，反應產物直接進行氣相色譜分析。 用糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法對9種單糖標準品及GPMPA進行GC分析(安捷 倫6890)，氣相色譜分析條件如下 色譜柱石英毛細管柱DB-1701 ;氫火焰離子化檢測器(FID);柱溫ll(TC， 3min — 20°C /min — 210。C，30min ;氣化室溫度280。C ;監測器溫度280。C ;H2流速:40mL/ min ;空氣流速400mL/min ;N2流速1. OmL/min。 氣相色譜分析結果如圖4所示，對照單糖標準品色譜圖(圖3)可知，GPMPA由鼠李 糖(9. 9% )、阿拉伯糖(15. 73% )、甘露糖(8. 31% )、葡萄糖(40. 34% )、半乳糖(25. 72% ) 組成。
權利要求
一種在絞股藍中制備中性多糖的方法，其特征在于中性多糖的制備由3步實現先自絞股藍中制備得到粗多糖，然后制得精制多糖，由精制多糖制備得到中性多糖；具體步驟如下步驟1將95％乙醇加入到水分干燥的絞股藍中，在50±2℃的溫度下攪拌1小時，然后過濾收集濾渣；再將濾渣采用95％乙醇在50±2℃回流攪拌1小時后過濾收集濾渣；再將濾渣采用95％乙醇在50±2℃回流攪拌1小時后過濾收集濾渣；將濾渣自然風干后加入6-10倍相對濾渣質量重的蒸餾水，在90-95℃下攪拌10-12h，過濾收集濾液，重復2-3次；將上述每次收集得到的濾液合并，在50℃下抽真空減壓濃縮，在流動水中透析48h；步驟2向步驟1得到的透析袋的溶液加入4倍體積的乙醇，在4℃下保存10-12h；然后用高速離心機在5000rpm離心10min，收集其中的沉淀物，依次采用乙醇、丙酮和乙醚進行洗滌，在40-45℃真空干燥6h，得到棕褐色秦巴絞股藍粗多糖；步驟3將粗多糖加雙蒸水配成濃度為5％的水溶液，用1mol/L HCl調節pH為5.5，加入粗多糖質量1/20的木瓜蛋白酶在65℃恒溫下攪拌3h后加熱至100℃終止酶反應；步驟4加入雙蒸水將步驟3得到的溶液稀釋至0.5％，滴加濃氨水將pH值調至8.0，于50℃邊攪拌邊逐漸加入30％H2O2，攪拌3～5小時至溶液顏色變為較透明的淡黃色，停止攪拌在50℃下抽真空減壓濃縮；步驟5向步驟4得到的濃縮液加入其體積1/5的sevag試劑，震蕩20min，放入高速離心機中在5000rpm離心15min；離心完后收集上清液，再加入其體積1/5sevag試劑，重復5次；將得到的上清液用蒸餾水透析48h，收集透析袋中的溶液，加入其4倍體積的乙醇，在4℃放置10-12h；放入高速離心機中在5000rpm離心10min，離心完后收集沉淀，依次分別用乙醇、丙酮和乙醚洗滌，冷凍干燥12h，得到白色絞股藍精制多糖；步驟6將精制絞股藍多糖1g溶于50mL雙蒸水，5000rpm離心15min，取上清，上DEAE-52 cellulose柱，上樣量為交換容量的10％～20％；步驟7將上述的離子交換柱依次用雙蒸水、0～1mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，收集合并第一流出物的蒸餾水洗脫液，在50℃下減壓濃縮，蒸餾水透析48h，冷凍干燥得到絞股藍中性多糖。
2. 根據權利要求l所述的在絞股藍中制備中性多糖的方法，其特征在于所述的步驟l 和步驟2采用以下步驟替代步驟1 :取干燥絞股藍，加6-10倍重量的蒸餾水，在90-95 °C的溫度下攪拌于提取 10-12h，2-3次；離心后去殘渣，合并前2 3次提取的上清液，濃縮；步驟2 :向步驟1所得的提取液中加入4體積的工業乙醇，4t:放置；離心收集沉淀，依次分別用乙醇、丙酮和乙醚洗滌，真空干燥，得到棕褐色秦巴絞股藍粗多糖。
全文摘要
本發明涉及一種在絞股藍中制備中性多糖的方法，其特征在于中性多糖的制備由3步實現先加入乙醇提取絞股藍濃縮液真空干燥，得到棕褐色秦巴絞股藍粗多糖；將絞股藍粗多糖溶于水，加入木瓜蛋白酶反應、離心，收集上清液，透析，加入乙醇沉淀多糖，離心收集多糖，冷凍干燥，得到白色絞股藍精制多糖；將絞股藍精制多糖溶于水，上陰離子交換柱，依次用蒸餾水、NaCl溶液梯度洗脫，再上凝膠柱，用NaCl溶液洗脫，收集主峰，經透析后冷凍干燥得到絞股藍中性多糖GPMPA，它是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的吡喃糖。
文檔編號C08B37/00GK101717452SQ20091002391
公開日2010年6月2日 申請日期2009年9月14日 優先權日2009年9月14日
發明者尚曉婭, 徐春蘭, 牛衛寧, 鈔愈, 欽傳光 申請人:西北工業大學