利用兩個連接物制備羥烷基淀粉衍生物的方法

專利名稱：利用兩個連接物制備羥烷基淀粉衍生物的方法
利用兩個連接物制備羥烷基淀粉衍生物的方法本發明涉及一種制備羥烷基淀粉(HAS)衍生物的方法，包括a)將任選氧化的羥 烷基淀粉與包含至少兩個官能團-O-NH2的化合物(D)或其鹽反應，和b)將步驟a)獲得的 羥烷基淀粉衍生物與包含至少兩個獨立地選自醛基、適當保護的醛基、酮基和適當保護的 酮基的官能團的化合物(L)反應。具體而言，化合物(L)包含至少兩個獨立地選自醛基、半 縮醛基、-CH (OH)2、縮醛基、酮基和縮酮基的官能團W1和^。在巧或^中任一個或WjPW2 是酮基-C(O)-R的情況中，R優選選自飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取 代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基。此外，本發明涉及通過所示方法可獲得的和/ 或獲得的羥烷基淀粉衍生物，尤其是羥乙基淀粉衍生物，及其用途。另外，本發明涉及特定 的羥烷基淀粉衍生物，尤其是這樣的羥乙基淀粉衍生物。羥烷基淀粉(HAS)，尤其是羥乙基淀粉(HES)，是天然存在的碳水化合物聚合物支 鏈淀粉的取代的衍生物，其在玉米淀粉中以高達95重量％的濃度存在，且在體內由α-淀 粉酶降解。特別是HES顯示出有利的生物學性質，并在臨床中用作血容量置換劑和用于血 液稀釋治療(Sommermeyer 等人，1987，Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278 ；Weidler 等 X, 1991, Arzneimittel-forschung/Drug Res. ，41，494—498)。現有技術中描述了一些制備羥乙基淀粉衍生物的方法。DE26 16 086公開了血紅蛋白與羥乙基淀粉的偶聯，其中，在第一步驟中，交聯劑 (如bromocyane)結合羥乙基淀粉，隨后血紅蛋白連接到中間產物上。HES使用的一個重要方面是穩定應用于例如循環系統以獲得特定的生理效應的多 肽。這些多肽的一個具體例子是促紅細胞生成素，它是分子量大約為34，OOOkDa的酸性糖 蛋白，對于調節血液循環中血紅細胞的水平是必需的。多肽和酶應用的公知的問題是，這些蛋白質經常不能顯示出理想的穩定性。尤 其是，促紅細胞生成素具有相對短的血漿半衰期(Spivak和Hogans，1989，Blood 73，90 ； McMahon等人，1990，Blood 76，1718)。這意味著，治療血漿水平迅速喪失，因而必須進行重 復的靜脈施用。此外，在某些情況下，觀察到對于肽的免疫反應。人們普遍認為，當多肽與聚合物分子偶合時，多肽的穩定性可以得到改善，且對于 這些多肽的免疫反應降低。WO 94/28024公開了用聚乙二醇(PEG)修飾的生理活性的多肽顯示出降低的免疫 原性和抗原性，并在血流中的循環明顯長于非偶聯的蛋白質，即具有更長的清除率。但是， PEG-藥物偶聯物顯示出一些缺點，例如，它們沒有顯示出可以由體內降解途徑的元件識別 的天然結構。因此，除了 PEG-偶聯物外，已經制備了其他偶聯物和蛋白質polymerates。WO 02/080979公開了包含活性劑和羥烷基淀粉的偶聯物的化合物，其中，活性劑 和羥烷基淀粉或者直接連接或者通過連接化合物連接。關于直接連接，活性劑和羥烷基淀 粉的反應在包含至少10重量％的水的水性介質中進行。沒有給出涉及連接到活性劑中包 含的連接羰基上的羥烷基淀粉衍生物的例子，既沒有醛基或酮基，也沒有縮醛基或半縮醛 基。WO 03/074087公開了羥烷基淀粉蛋白偶聯物，其中，羥烷基淀粉和蛋白質分子之
10間的結合是共價的，且是由末端醛基或由醛基的反應產生的官能團與蛋白質的官能團偶合 產生的。WO 03/074088公開了羥烷基淀粉與低分子量化合物的偶聯物，其中，羥烷基淀粉 和低分子量化合物之間的結合是共價的，且是末端醛基或由醛基的反應產生的官能團與低 分子量化合物的官能團偶合產生的。WO 2005/014024公開了由氨氧基或其衍生物官能化的聚合物，偶聯物，其中，官能 化的聚合物通過肟連接基團與蛋白質共價偶合，還公開了制備官能化聚合物的方法，制備 偶聯物的方法，通過本發明的方法獲得的官能團化聚合物，通過所述方法獲得的偶聯物，和 包含至少一種偶聯物的藥物組合物，以及所述偶聯物和組合物用于預防或治療人類或動物 身體的用途。WO 2005/092390公開了羥烷基淀粉和蛋白質的偶聯物，其中，這些偶聯物通過羥 烷基淀粉或羥烷基淀粉的衍生物與蛋白質之間的共價鍵合形成，以及公開了制備這些偶聯 物的方法和這些偶聯物的用途。WO 2004/024777公開了羥烷基淀粉衍生物，尤其是可通過羥烷基淀粉與連接化合 物的伯氨基或仲氨基反應的方法獲得的羥烷基淀粉衍生物。根據特別優選的實施方式，WO 2004/024777公開了可通過下述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物羥烷基淀粉與連接化合物 的伯氨基或仲氨基反應，產生的反應產物通過連接化合物的至少一個其他的反應基團與多 肽，優選與糖蛋白，尤其優選與促紅細胞生成素反應。特別優選的羥烷基淀粉是羥乙基淀 粉。根據WO 2004/024777，羥烷基淀粉且優選羥基乙基淀粉在反應之前沒有被氧化的其還 原末端與連接化合物反應。WO 2004/024776公開了羥烷基淀粉衍生物，尤其是可通過下述方法獲得的羥烷 基淀粉衍生物羥烷基淀粉與交聯化合物伯氨基或仲氨基反應，或者與兩個交聯化合物反 應，其中產生的羥烷基淀粉衍生物具有至少一個能夠與另一種化合物的官能團Y反應的官 能團X，且其中該基團Y是醛基、酮基、半縮醛基、縮醛基或硫醇基。根據特別優選的實施 方式，WO 2004/024776涉及可通過下述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物羥烷基淀粉與交 聯化合物的伯氨基或仲氨基反應，產生的反應產物任選地進一步與第二交聯化合物反應， 其中產生的羥烷基淀粉衍生物具有至少一個能夠與另一種化合物的官能團Y反應的官能 團X，且其中該基團Y是醛基、酮基、半縮醛基、縮醛基或硫醇基，且產生的反應產物與多肽， 優選與如AT III、干擾素β或促紅細胞生成素的多肽，尤其優選與促紅細胞生成素反應， 該多肽包含這些官能團Y中的至少一種。尤其優選的羥烷基淀粉是羥乙基淀粉。根據WO 2004/024776,羥烷基淀粉，優選羥基乙基淀粉，在反應之前任選氧化的還原末端與連接化 合物反應。WO 2004/024776沒有提到下述方法將HAS與第一連接化合物反應制備的HAS 衍生物與第二連接化合物經過HAS衍生物的官能團-O-NH2與第二連接化合物的官能團的 反應(其中，獲得肟連接)進行反應。涉及血紅蛋白通過間隔物(spacer)連接到多糖上的方法的DE 3029 307 Al也沒 有提及通過將HAS與第一連接化合物反應制備的HAS衍生物經HAS衍生物的官能團-O-NH2 和第二連接化合物的官能團的反應(其中，獲得肟連接)而與第二連接化合物反應的方法。WO 2005/092928公開了羥烷基淀粉(優選羥乙基淀粉)與蛋白質的偶聯物，其中， 這些偶聯物通過羥烷基淀粉或羥烷基淀粉衍生物的至少一個醛基與蛋白質的至少一個氨
11基之間的還原胺化反應形成，使得羥烷基淀粉或其衍生物通過甲亞胺(azomethine)連接 或氨基亞甲基(aminomethylene)連接與蛋白質共價連接。WO 2005/092928還涉及制備這 些偶聯物的方法及這些偶聯物的特定用途。US 2006/0194940A1公開了水溶性聚合物鏈烷醛。其中，公開了與聚合物反應的 保護醛試劑。雖然一般地提及多糖，但特別優選的聚合物是聚乙二醇。US 2006/0194940A1 并沒有公開淀粉或尤其是改性淀粉(例如羥烷基淀粉)。因此，US 2006/0194940A1沒有公 開涉及將特定連接化合物與羥烷基淀粉偶合的具體方法。上述情況也存在于US7157546B2、 EP 1591467A1 和 WO 2004/022630A2 中。US 6，916，962B2公開了未保護和保護形式的氨基乙縮醛交聯化合物。該文件中沒 有公開有關該交聯化合物可能與聚乙二醇之外的聚合物的偶合。特別是，us 6，916，962B2 沒有公開淀粉，更不用說改性淀粉如羥烷基淀粉。因此，US 6，916，962B2沒有公開給定 的連接化合物與羥烷基淀粉偶合的具體方法。上述情況也存在于US 6，956，135B2和WO 03/049699A2 中。US 5，990，237公開了包含保護的醛基的結構。包含這些結構的化合物優選與聚乙 二醇偶合，且偶合經過作為含保護的醛基的化合物中包含的官能團的鹵素進行，該鹵素基 團與聚乙二醇的羥基反應。本發明的目的是提供一種獲得羥烷基淀粉衍生物的新的方法。本發明的進一步目的是提供一種考慮給定的羥烷基淀粉衍生物與生物活性物質 的氨基的優選反應條件的情況下獲得羥烷基淀粉衍生物的新的方法。本發明的進一步目的是提供新穎的羥烷基淀粉衍生物，尤其是羥乙基淀粉，特別 地，其特征在于羥烷基淀粉(尤其是羥乙基淀粉)與給定的生物活性劑(尤其是蛋白質) 之間的新型間隔物結構。因此，本發明涉及一種通過以下步驟制備羥烷基淀粉(HAS)衍生物的方法a)將任選氧化的羥烷基淀粉與包含至少兩個官能團-O-NH2的化合物(D)或其鹽 反應，和b)將步驟a)獲得的羥烷基淀粉衍生物與包含至少兩個獨立地選自醛基、適當保 護的醛基、酮基和適當保護的酮基的官能團W1和W2的化合物(L)反應。I.羥烷基淀粉在本發明中，術語“羥烷基淀粉” (HAS)指已被至少一個羥烷基取代的淀粉衍生物。 本發明優選的羥烷基淀粉具有式(I)的構成(constitution) 其中，HAS'是羥烷基淀粉分子的其余部分，且RpR2和R3獨立地為氫、直鏈或分支
12羥烷基或-[(CR1R2) m0] n [CR3R4]。-OH基團，其中，R1、R2、R3和R4獨立地選自氫和烷基，優選氫 和甲基，m是2至4，其中，m個CR1R2基團中的殘基R1和R2可以相同或不同；η為0至20，優選0至4 ；ο是2至20，優選2至4，其中，ο個CR3R4基團中的殘基R3和R4可以相同或不同。優選地，R1、R2和R3獨立地為基團-(CH2CH2O) η_Η，其中，η是整數，優選是0、1、2、3、 4、5或6，且特別地，禮、R2和R3獨立地為氫或2-羥乙基。在式(I)中，淀粉分子的還原末端顯示為非氧化形式，且HAS的末端糖單元顯示為 半縮醛形式，其可以根據例如溶劑的不同與(游離的)醛形式相平衡。用于本發明的縮寫 HAS'指在HAS分子的還原末端沒有末端糖單元的HAS分子。這可以由用于本發明的術語 “羥烷基淀粉分子的其余部分”來表示。用于本發明的術語“羥烷基淀粉”并不局限于其中末端糖部分包含在式(I)中為 簡潔起見所描述的羥烷基禮、R2和/或R3的化合物，還指其中存在于任何位置的至少一個 羥基(在末端糖部分中和/或在羥烷基淀粉分子的其余部分HAS'中)被羥烷基隊、R2和 /或民取代的化合物。包含兩個或多個不同羥烷基的羥烷基淀粉也是可能的。HAS中包含的至少一個羥烷基可以包含一個或多個，尤其是兩個或多個羥基。根據 優選的實施方式，HAS中包含的至少一個羥烷基包含一個羥基。詞語“羥烷基淀粉”還包括其中烷基被單取代或多取代的衍生物。在本文中，優選 烷基被鹵素(尤其是氟)或芳基取代。此外，羥烷基的羥基可以被酯化或醚化。此外，可以使用直鏈或分支的取代或未取代的鏈烯基代替烷基。羥烷基淀粉是淀粉的醚衍生物。除了所述醚衍生物，在本發明中也可以使用其他 淀粉衍生物。例如，包含酯化羥基的衍生物是有用的。這些衍生物可以是，例如，未取代的 2-12個碳原子的單或二羧酸的衍生物或其取代的衍生物。特別有利的是未取代的2-6個碳 原子的單羧酸衍生物，尤其是乙酸衍生物。在本文中，乙酰淀粉、丁酰淀粉和丙酰淀粉是優 選的。此外，未取代的2-6個碳原子的二羧酸的衍生物是優選的。在二羧酸衍生物的情況下，有用的是二羧酸的第二羧基也被酯化。此外，二羧酸的 單烷基酯的衍生物也適用于本發明中。對于取代的單或二羧酸，取代基可以優選地與上述對于取代的烷基殘基的取代基 相同。淀粉酯化技術是本領域已知的(參見，例如，Klemm D.等人，Comprehensive Cellulose Chemistry 第 2 卷，1998，WiIey-VCH, ffeinheim, New York,尤其是第 4. 4 章， Esterification of Cellulose(ISBN 3-527-29489-9))。根據本發明優選的實施方式，使用上述式(I)的羥烷基淀粉。HAS'中包含的其他 糖環結構可能與明確描述的糖環相同或不同，區別在于它們缺少還原末端。對于式⑴的殘基禮、R2和R3,沒有特別的限制。根據優選的實施方式，R1^ R2和 R3獨立地為氫或在各自的烷基殘基具有2到10個碳原子的羥烷基、羥基芳烷基或羥基烷芳 基。優選氫和具有2至10個碳原子的羥烷基。更優選羥烷基具有2至6個碳原子，更優選2到4個碳原子，甚至更優選2到3個碳原子。在優選的實施方式，羥烷基淀粉是羥乙基淀 粉，其中，R1、R2和R3獨立地為氫或(CH2CH2O) n_H基團，其中，η是整數，優選是0、1、2、3、4、5 或6。因此，“羥烷基淀粉”優選包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥基丁基淀粉，其中，羥 乙基淀粉和羥丙基淀是特別優選的，且羥乙基淀粉是最優選的。烷基、芳烷基和/或烷芳基可以是直鏈或分支的，且被適當取代。因此，本發明還涉及如上所述的方法和HAS衍生物，其中，R1, R2和R3獨立地為氫 或具有2至6個碳原子的直鏈或分支羥烷基。因此，禮、R2和R3優選可以為氫、羥己基、羥戊基、羥丁基、羥丙基(如2-羥丙基、 3-羥丙基、1-羥異丙基)、羥乙基(如2-羥乙基)，氫和2-羥乙基是特別優選的。因此，本發明還涉及如上所述的方法和HAS衍生物，其中，R1, R2和R3獨立地為氫 或2-羥乙基，其中至少一個殘基禮、R2和R3是2-羥乙基的實施方式是特別優選的。羥乙基淀粉(HES)對于本發明的所有實施方式是最優選的。因此，本發明涉及如上所述的方法和HAS衍生物，其中，聚合物是羥乙基淀粉，且 衍生物是羥乙基淀粉(HES)衍生物。HAS，尤其是HES，主要由分子量分布、取代度和C2 (；取代比來表征。有兩種描 述取代度的可能方式HAS取代度(DS)對于取代的葡萄糖單體相對于所有葡萄糖部分的比例相對地進 行描述。HAS的取代模式也可以描述為摩爾取代度(MS)，其中計算每個葡萄糖部分的羥乙 基的數目。在本發明中，HAS(優選HES)的取代模式被稱為MS，如上所述(也參見 Sommermeyer 等人，1987，Krankenhauspharmazie, 8 (8)，271-278，尤其是第 273 頁)在HES分子全部水解后，通過氣相色譜法測定MS。給出各個HAS (尤其是HES)起 始原料的MS值。假定，在本發明方法的步驟a)和b)的衍生化過程中MS值不受影響。HAS (尤其是HES)溶液作為多分散的組合物存在，其中各個分子在聚合度、分支位 點的數目和模式及取代模式方面與其它分子不同。HAS(尤其是HES)因此是具有不同分子 量的化合物的混合物。因此，在統計方法的幫助下，通過平均分子量確定特定的HAS(尤其 是HES)溶液。在本文中，Mn計算為取決于分子數目的算術平均值。可選擇地，Mw(或MW)， 重均分子量，代表取決于HAS (尤其是HES)質量的單位。在本文中，數均分子量通過等式1定義 其中，ni是摩爾質量為Mi的種類i的分子數目。E表示值是平均值，但橫線(line)按照慣例通常省略。Mw是重均分子量，由等式2定義
其中，ni是摩爾質量為Mi的種類i的分子數目。I,表明值是平均值，但橫線按照慣例通常省略。優選用于本發明中的羥烷基淀粉(尤其是羥乙基淀粉)具有1到大約IOOOkDa, 更優選大約1至大約800kDa，更優選大約1至大約500kDa，更優選大約2至大約400kDa， 更優選大約5至大約300kDa，更優選大約10至大約200kDa，尤其是大約50至大約150kDa 的平均分子量(重均)。羥乙基淀粉可以進一步顯示出0. 1至3、優選0. 1至2、更優選0. 1 至0. 9或0. 4至2、優選0. 4至1. 3的優選摩爾取代度，和顯示出對于羥乙基優選2至20的 C2 C6取代的比例。用于本發明的術語“平均分子量”涉及根據Sommermeyer等人，1987， Krankenhauspharmazie, 8 (8) ,271-278 禾口 Weidler 等人，1991, Arzneim. -Forschung/Drug Res. ,41,494-498所述的LALLS-(小角激光光散射)-GPC方法測定的重量。另外，對于 IOkDa和更小的平均分子量，用預先通過LALLS-GPC證明的標準進行校準。根據本發明優選的實施方式，使用的羥乙基淀粉的平均分子量是大約1至大約 IOOOkDa,更優選大約1至大約800kDa，更優選大約1至大約500kDa，更優選大約2至大約 400kDa,更優選大約5至大約300kDa，更優選大約10至大約200kDa，尤其是大約50至大約 150kDa。此外，HAS (尤其是HES)的摩爾取代度為優選大約0. 1至大約3，優選大約0. 4至 大約 1. 3，如 0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1· 2 或 1. 3。具有大約5至300kDa、優選50到150kDa的平均分子量的HES的例子是具有0. 1 至 3，優選是 0.4 至 1.3，如 0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1.2 或 1.3 的摩爾取代度
的 HES。至于C2 C6取代的比例，所述取代比優選在2到20，更優選2到15，甚至更優選 3至12的范圍內。除了羥烷基淀粉之外的其它淀粉一般情況下，也可以使用除了上述羥烷基淀粉(尤其是羥乙基淀粉)之外的其他 淀粉進行本發明的方法和制備本發明的衍生物，條件是這些淀粉也包含以半縮醛形式(任 選地與(游離的)醛形式相平衡)存在的還原末端，該還原末端可以被適當氧化以產生相 應的氧化形式。特別地，可以使用高度分支的、未取代的或低取代的淀粉產物，即具有比支 鏈淀粉明顯更高的分支度，并具有糖原的α -1，6分支程度，或者甚至超過這一點，并且如 果取代的話，僅具有高達0. 3，優選0. 05到0. 3的摩爾取代度MS的淀粉。此處使用的術語 高度分支的、未取代或低取代的淀粉產物的MS(摩爾取代度)是指每脫水葡萄糖單元的羥 乙基或羥丙基基團的平均數。通常通過測定樣品中羥乙基或羥丙基基團的含量和對其中存 在的脫水葡萄糖單元的計算分配來測量MS。也可以通過氣相色譜法測定MS。可以通過氣相 色譜甲基化分析以聚合物中的0-1，4，6-糖苷連接的脫水葡萄糖的摩爾％測定分支度。每 種情況下分支度是平均值，因為本發明的高度分支的、未取代或低取代的淀粉產物是多分散的化合物。所述高度分支的、未取代或低取代的淀粉產物中葡萄糖單元通過α-1，4_和 α-1，6_鍵連接。分支度是指以全部脫水葡萄糖中以總體的摩爾％計的α-1，4，6_連接葡 萄糖單元的比例。C2/C6比例表示仏處與(；處取代的比例。高度分支的、未取代或低取代 的淀粉產物具有可通過在分支酶幫助下的轉糖苷步驟獲得的優選6%至50%的分支度。甚 至更優選地，分支度為10至45，更優選20至40 (如20、25、30、35或40)。也優選為大于20 至40，優選大于20至30如21到40，優選21至30。可用于這一目的的起始原料在原則上可以為任何淀粉，但優選具有高比例支鏈淀 粉的蠟質淀粉(waxy starch)或支鏈淀粉部分本身。淀粉產物(涉及這些“其他淀粉”) 用于本發明必要的分支度以脫水葡萄糖的摩爾％表示在8%到20%的范圍內。這意味著， 可用于本發明目的的淀粉產物平均每12. 5至5個葡萄糖單元具有一個α -1，6連接，因而 具有一個分支點。優選的高度分支的、未取代或低取代的淀粉產物具有超過10%至高達 20%，且尤其是11%至18%的分支度。較高的分支度意味著本發明的淀粉產物的較高溶 解度和這些溶解的淀粉產物在體內的較高的生物利用度。特別優先具有超過10%，尤其是 11%至18%的分支度的未改性淀粉產物。可以通過以使用所謂分支或轉移酶的酶效應組裝 (enzymatic assembly)為靶標，在適當情況下接著用羥乙基或羥丙基對游離的羥基進行部 分衍生化而制備高度分支的、未取代或低取代的淀粉產物。代替這種方法，可以通過使用所 謂分支或轉移酶的酶效應組裝將羥乙基化或羥丙基化的淀粉轉化成為高度分支的、未取代 或低取代的淀粉產物。從具有高達10%分支度的小麥淀粉通過酶作用獲得的分支淀粉產物 本身是已知的，并在例如 WO 00/66633A 中有描述。WO 00/18893A、US 4，454，161、EP 0 418 945A.JP 2001294601A或US 2002/065410A公開了合適的分支或轉移酶和其獲得方法。后 一公開描述了具有超過4%至高達10%或更高的分支度的未改性的淀粉產物。可以以本身 已知的方法完成酶促轉糖苷作用(transglycosilation)，例如，通過在6至8的pH值和25 至40°C的溫度的溫和條件下在水溶液中，與適當的酶一起溫育蠟質玉米淀粉、由具有高支 鏈淀粉含量的馬鈴薯獲得的馬鈴薯淀粉、或由大米、木薯、小麥、具有高支鏈淀粉含量的小 麥、玉米、具有高支鏈淀粉含量的玉米、或者具有高直鏈淀粉含量的玉米獲得的淀粉。分子 量Mw用于高度分支的、未取代或低取代的淀粉產物時是指重均分子量。這可以通過各種方 法由本身已知的方式測定，即通過凝膠滲透色譜(GPC)或高壓液相色譜法(HPLC)結合光散 射和RI檢測測定。取代淀粉優選的(2/(6比是5至9的范圍。高度分支的、未取代或低取 代的淀粉產物的高分支度提高其水溶解性至羥乙基或羥丙基取代可完全或基本上分散的 程度，以將淀粉保持在溶液中。可以經過腹膜的通透性限制以合適的方式增加高度分支的、 未取代或低取代的淀粉產物的平均分子量。可以用于這種情況中的特征變量也是所謂底部 分BF90% (作為較小分子部分的比例的量度的90%峰面積的分子量)的GPC值。通過在 跨腹腔膜吸收急劇降低的同時適當提高分子量可以達到更大的超濾(UF)效率。同時，由內 源性淀粉酶的降解作用產生的(其不再進一步由淀粉酶降解)且存儲在器官或組織中的高 分子量殘留片段不再出現或此時只以較低的程度出現。II.步驟 a)在本發明方法的步驟a)中，任選氧化的HAS與包含至少兩個官能團-O-NH2的化 合物(D)或其鹽反應。在優選的實施方式中，HAS在與化合物(D)反應之前沒有被氧化。在特別優選的實施方式中，HAS在與化合物(D)反應之前沒有被氧化的HAS的至少一個還原末端與化合 物⑶反應。用于本發明中的術語“HAS在至少一個還原末端反應”可能涉及HAS主要通過其還 原末端反應的過程。術語“主要通過其還原末端”涉及統計上超過50 %、優選至少55 %、更優選至少 60 %、更優選至少65 %、更優選至少70 %、更優選至少75 %、更優選至少80 %、更優選至少 85%、更優選至少90%、還更優選至少95%如95%、96%、97%、98%或99%的給定的反應 所采用的HAS分子通過每HAS分子至少一個還原末端反應的過程，其中通過至少一個還原 末端反應的給定的HAS分子可以在給定的同樣反應中通過所述聚合物分子中包含的且為 非還原末端的至少一個另外的適當官能團反應。如果一個或多個HAS分子通過至少一個還 原末端并同時通過這一(這些)HAS分子中包含的且不是還原末端的至少一個另外的適當 官能團反應，那么，這些HAS分子的所有反應的官能團(所述官能團包括還原末端)統計學 上優選超過50 %、優選至少55 %、更優選至少60 %、更優選至少65 %、更優選至少70 %、更 優選至少75 %、更優選至少80 %、更優選至少85 %、更優選至少90 %、還更優選至少95 %如 95%、96%、97%、98%或 99%是還原末端。用于本發明中的術語“還原末端”涉及HAS分子的末端醛基，其可以作為醛基和/ 或作為相應的半縮醛形式和/或作為縮醛基存在，所述縮醛基具有下面的結構
如果上述式(I)的殘基-OR3是-O-CH2-CH2-OH,則其可以存在。如果HAS在與化合物⑶反應之前被氧化，那么在一個實施方式中，該反應可以進 行以使得至少兩個醛基按照下式被引入HAS中 根據本發明的這一實施方式，可使用能夠氧化聚合物的至少一個糖環以產生具有 至少一個、優選至少兩個醛基的開放的糖環的各氧化劑或氧化劑的組合。通過下面的反應 路線舉例說明該反應，其顯示聚合物的糖環被氧化以產生具有兩個醛基的開放環 合適的氧化劑其中有高碘酸鹽，如高碘酸堿金屬鹽或其兩種或多種的混合物，優 選高碘酸鈉和高碘酸鉀。在優選的實施方式中，在步驟a)中，化合物⑶或其鹽通過至少兩個官能 團-O-NH2中的至少一個與羥烷基淀粉的醛基和/或半縮醛基和/或縮醛基反應，特別地化 合物(D)或其鹽通過至少兩個官能團-O-NH2中的至少一個與羥烷基淀粉的至少一個還原 末端反應，且其中羥烷基淀粉在步驟a)的反應前沒有被氧化。在優選的實施方式中，用于步驟a)中的化合物(D)具有式(II)的結構H2N-O-R4-O-NH2 (II)或其鹽，其中，R4選自飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取代或未 取代的亞烷基(亞烷基鏈中可能含有雜原子)、取代或未取代的亞芳基、取代或未取代的亞 芳烷基、取代或未取代的亞烷芳基及取代或未取代的亞雜芳基、取代或未取代的亞雜芳烷 基(heteroaralkylene)和取代或未取代的亞烷雜芳基(alkheteroarylene)。化合物D)的 鹽優選是其中官能團-O-NH2被質子化且各基團-O-NH3+相互獨立地具有藥學上可接受的陰 離子(如氯離子、硫酸氫根、硫酸根、碳酸根，碳酸氫根、檸檬酸根、磷酸根和/或磷酸氫根) 的化合物D)。在優選的實施方式中，其中，R4選自飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分 支的、取代或未取代的亞烷基(且在亞烷基鏈中不合有雜原子)、取代或未取代的亞芳基、 取代或未取代的亞芳烷基、取代或未取代的亞烷芳基及取代或未取代的亞雜芳基、取代或 未取代的亞雜芳烷基和取代或未取代的亞烷雜芳基，R4可以被1至4個，優選1個選自C1-C6 烷基(如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基和叔丁基)、鹵素(如氯、溴)、羥基和巰基的取代基 取代。在一個優選的實施方式中，式(II)的化合物⑶中的R4選自C1-C12亞烷基、C6-C14 亞芳基和_[ (CR5R6)m0]n[CR7R8]。-，其中，R5、R6、R7和R8彼此獨立地選自氫、烷基和芳基，m是 2至4 ;n為0至20，和ο是2至20，其中在η為0的情況下，ο不是0。優選地，式(II)的化合物(D)中的R4 為 _[(CR5R6)m0]n[CR7R8]o-^，R5、R6、MP R8彼此獨立地選自氫、C1-C6烷基和C6-C14芳基，m為1或2，η為1至5 ；和ο為1或2，最優 選地，其中，R5、R6、R7和R8彼此獨立地選自氫和C1-C6烷基，優選選自氫、任選取代的，優選 非取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基，尤其是氫，m是2，η是1和ο是2。在一個特別優選的實施方式中，用于步驟a)的化合物(D)是 禾口/ 或 禾口/ 或H2N-O- (CH2CH2O) 6_ΝΗ2或其鹽，尤其是 或其鹽。步驟a)中的反應優選在以下條件下進行HAS溶于水性介質中，優選在反應緩沖 液中，并加入化合物(D)。優選的反應緩沖液是，例如，檸檬酸鈉緩沖液、醋酸鈉緩沖液、磷 酸鈉緩沖液、碳酸鈉緩沖液、硼酸鈉緩沖液、水。優選反應緩沖液的PH值為2到9，更優選3 至7，更優選4至6，最優選大約5。基于HAS衍生物的Mn，化合物⑶與HAS的摩爾比優選彡200，更優選彡100。特 別優選的化合物⑶與HAS的摩爾比為90到10，更優選80到30，甚至更優選70到50。在大約0°C至大約40°C，更優選10°C至30°C的溫度下，優選在室溫下攪拌反應混 合物。優選反應進行大約5至大約30小時，更優選大約15至大約25小時。優選通過超濾或滲析將獲得的羥烷基淀粉衍生物與反應混合物分離，優選超濾后 接著凍干分離的羥烷基淀粉分離。在一種替代的實施方式中，從反應混合物沉淀出羥烷基 淀粉衍生物，尤其是通過加入醇(優選2-丙醇)或通過超濾和/或凍干分離。獲得的沉淀 物可以通過常規步驟純化，尤其是通過離心、滲析、超濾和/或凍干。在一種替代的實施方式中，步驟a)另外包括在步驟b)之前將獲得的羥烷基淀粉 衍生物還原。尤其是，根據這一實施方式，由或者還原末端(優選HES)或者由上述的開環 氧化反應獲得的至少一個醛基(優選還原末端)與化合物(D)的基團-O-NH2反應獲得的 肟連接基團-CH = N-O-還原為基團-CH2-NH-O15在此實施方式中，還原可以在合適的還原 劑(如硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、三乙酰氧基硼氫化鈉、有機硼烷絡合化合物(如4-( 二甲 基氨基)_吡啶硼烷絡合物、N-乙基二異丙基胺硼烷絡合物、N-乙基嗎啉硼烷絡合物、N-甲 基嗎啉硼烷絡合物、N-苯基嗎啉硼烷絡合物、二甲基吡啶硼烷絡合物、三乙胺硼烷絡合物或 三甲胺硼烷絡合物)，優選NaCNBH3或NaBH4)的存在下，在大約10°C至大約80°C的溫度下 進行大約5小時至大約24小時(如過夜)。
在如上所述的替代實施方式中，在步驟a)獲得的羥烷基淀粉衍生物直接用于步 驟b)中而不進行任何進一步的化學反應，優選不進行還原。III.步驟 b)在本發明方法的步驟b)中，步驟a)獲得的羥烷基淀粉衍生物與包含至少兩個獨 立地選自醛基、適當保護的醛基、酮基和適當保護的酮基的官能團W1和W2的化合物(L)反應。本發明中所用的術語“醛基”也包含醛合水(即-CH(OH)2)和對應于該醛基的半縮酸基。作為可能的“保護的醛基”，可以舉例提及合適的縮醛基。作為可能的“保護的酮 基”，可以舉例提及合適的縮酮基。因此，根據本發明的優選實施方式，化合物(L)包含至少兩個獨立地選自醛基、半 縮醛基、-CH(OH)2、縮醛基、酮基和縮酮基的官能團W1和W2。甚至更優選，化合物型(L)包含至少兩個獨立地選自半縮醛基、-CH(OH)2、縮醛基 和縮酮基及-C(O)-R基團(其中，R選自氫、飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支 的、取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基)的官能團。在優選的實施方式中，在基團-C (0) -R是酮基的情況下，殘基R選自C1-C6烷基和 C6-C14芳基，甚至更優選選自任選取代的，優選非取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁 基、異丁基和叔丁基。在優選的實施方式中，化合物(L)通過該至少兩個官能團W1和W2中的至少一個與 步驟a)獲得的羥烷基淀粉或其鹽的至少一個官能團H2N-O-反應。至于如以下標記為“A”的縮醛基或縮酮基，不存在特別的限制。在本發明中，術語 “縮醛基”還包括硫縮醛和氮縮醛，且術語“縮酮基”還包括硫縮酮和氮縮酮。根據本發明的 優選實施方式，基團A是式(IIa)的殘基 其中，Z1和Z2各個獨立地為0或S或NRX，優選為0，其中，Rx是H或低級烷基(如甲基、 乙基或丙基如正丙基或異丙基或C (0) -Ry，其中Ry優選選自C1-C6烷基和C6-C14芳基，甚至 更優選選自任選取代的，優選非取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁 基)；A1和A2各個獨立地為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、苯甲基、1，1， 1-三氯乙基、硝基苯甲基、甲氧基苯甲基、乙氧基苯甲基，或形成式(lib)的環 其中，A1和A2 —起為任選適當取代的-(CH2)2-或任選適當取代的-(CH2)3-或任選 適當取代的-(CH2CH(CH3))-,和其中，A3是H或甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、戊基、苯甲基。優選，Z1和Z2中的至少一個是0，更優選Z1和Z2都是0。至于殘基A3，根據本發明 縮醛基是優選的，即A3優選是H。如果A是縮酮基，優選A3是甲基。因此，根據本發明可以想象的縮酮基A特別是 以下的
或根據優選的實施方式,A1和A2各個是甲基或乙基，甚至更優選乙基。因此，根據本 發明，特別優選的縮醛基A是-CH(OCH3)2或-CH(OC2H5)2,尤其是-CH(0C2H5)2。根據其中A1 和A2形成式(IIb)的環的進一步的實施方式，A1和A2—起優選是-(CH2)2-。至于這一實 施方式，根據本發明尤其優選的縮醛基A是 進一步可以想象的縮醛基可以是，例如， 在本發明的特別優選實施方式中，用于步驟b)中的化合物(L)是雙官能團交聯化 合物。這種雙官能團交聯化合物除了獨立地選自醛基、適當保護的醛基、酮基和適當保護的 酮基的至少兩個官能團W1和W2之外，不包含進一步的官能團。這些進一步的官能團可以是 任選適當保護的醛基和/或酮基，但還可以是其他官能團，例如，在任選適當保護的各情況
下，氨基、硫醇基、羧基、羥基、鹵素基團等。在優選的實施方式中，用于步驟b)中的化合物(L)具有式(III)的結構W1-R9-W2 (III)，其中，R9選自化學鍵(優選單鍵)、飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支 的、取代或未取代的亞烷基(亞烷基鏈中可能含有雜原子)、取代或未取代的亞芳基及取代 或未取代的亞雜芳基、取代或未取代的亞芳烷基、取代或未取代的亞烷芳基及取代或未取 代的亞雜芳基、取代或未取代的亞雜芳烷基和取代或未取代的亞烷雜芳基，WJPW2基團(如上述定義)中的任一個或雙個獨立地選自醛基、適當保護的醛基、 酮基和適當保護的酮基，優選選自醛基、半縮醛基、-CH(OH)2、縮醛基、酮基和縮酮基，甚至 更優選選自半縮醛基、-CH(OH)2、縮醛基和縮酮基及基團-C(O)-R,其中R選自氫、飽和或不 飽和、環狀或線性的、分支或不分支的、取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基。甚至 更優選地，基團R選自C1-C6烷基和C6-C14芳基，甚至更優選選自任選取代的，優選非取代的 甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基。優選R9是取代或未取代的亞芳基或取代或未取代的亞烷基。特別地，R9是未取代 的C6-C14亞芳基或-(CH2)n-(η優選為1-6)，最優選亞苯基。優選R9是未取代的。如果R9是 取代的，它可以被1至4個、優選1個選自C1-C6烷基(如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基和 叔丁基)、鹵素(如氯、溴)、羥基和巰基的取代基取代。在優選的實施方式中，用于步驟b)中的化合物(L)選自在1，2_、1，3或1，4位被 兩個官能團W1和W2取代的苯，所述兩個官能團W1和W2獨立地選自-CH = 0、半縮醛基、縮醛 基、縮酮基、-CH(OH)2和基團-C(O)-R,其中R選自飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或 不分支的、取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基，優選選自C1-C6烷基和C6-C14芳基， 甚至更優選選自氫、任選取代的，優選非取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基 和叔丁基。根據本發明的優選實施方式，化合物(L)的兩個官能團W1和W2都是-CH = 0。在以下情況下，本發明的這種實施方式是特別優選的-由化合物(L)的基團-CH= 0與根據步驟a)獲得的HAS衍生物的基團-O-NH2 反應產生的肟連接，-或者如上所述由化合物(D)與羥烷基淀粉的反應產生的肟連接，和由化合物(L)的基團-CH = 0與根據步驟a)獲得的HAS衍生物的基團-O-NH2反應產生的肟連接，在步驟b)獲得的HAS衍生物與以下詳述的生物活性劑BA反應之前不進行還原。至于本發明的這一優選實施方式，優選的化合物(L)是，例如， 根據本發明的另一優選的實施方式，化合物(L)的一個官能團W1或W2是適當保護 的醛基或酮基，優選是適當保護的醛基，另一個官能團優選是未保護的醛基或酮基，更優選 是未保護的醛基。在以下情況下，本發明的這一實施方式是特別優選的-由化合物(L)的基團-CH= 0與根據步驟a)獲得的HAS衍生物的基團-O-NH2 反應產生的肟連接，-或者如上所述由化合物(D)與羥烷基淀粉反應產生的肟連接和由化合物(L)的 基團-CH = 0與根據步驟a)獲得的HAS衍生物的基團-O-NH2反應產生的肟連接在由步驟b)獲得的HAS衍生物與以下詳述的生物活性劑BA反應之前進行還原。 特別是，化合物(L)的官能團巧或^是保護的醛基或酮基，優選是適當保護的醛基，其在用 于還原上述肟連接的反應條件下是穩定的。適當的保護基應當是穩定的這樣的反應條件是 例如，3至8的pH值、如作為還原劑NaCNBH3存在下的還原條件。對于官能團W1和W2的適 合的保護基是本領域的技術人員已知的，因此，可以由本領域的技術人員根據用于還原上 述肟連接的相應的還原條件來選擇。至于本發明的這一優選的實施方式，可設想的化合物 (L)是，例如， 正如以下所述的，如果在由步驟b)獲得的衍生物與以下詳述的生物活性劑BA的 反應獲得的HAS衍生物在由步驟b)獲得的HAS衍生物和BA之間應包含兩個還原的肟連接 (即-CH2-NH-O-)和優選亞甲胺連接(即-CH2-NH-)，特別選擇本發明的這一實施方式。步驟b)中的反應優選在極性溶劑(優選DMF)或水/極性溶劑的混合物(優選具 有一定量極性溶劑的水/DMF，優選DMFS 50% (ν ν)，更優選<30% (ν ν))中進行。
基于HAS衍生物的Mn，化合物(L)與步驟a)獲得的HAS衍生物的摩爾比優選 (200，更優選≤100，尤其是≤20。更優選，化合物(L)與步驟a)獲得的HAS衍生物的摩 爾比是70到1，更優選40到2，甚至更優選10至5。反應混合物優選在5至80°C、更優選10至60°C、更優選20到50°C、甚至更優選 30至50°C和甚至更優選35至45°C (如大約35、40或45°C )的溫度下攪拌。反應優選進行大約5至大約30小時，更優選大約15至大約25小時。優選通過超濾或滲析將獲得的羥烷基淀粉衍生物與反應混合物分離，優選超濾后 接著凍干分離的羥烷基淀粉分離。在替代的實施方式中，羥烷基淀粉衍生物從反應混合物 沉淀出來，尤其是通過加入醇和/或酮(優選丙酮和乙醇的混合物)。獲得的沉淀物可以通 過常規步驟純化，尤其是通過離心、滲析、超濾和/或凍干。在替代的實施方式中，步驟b)另外包括還原獲得的羥烷基淀粉衍生物。尤其是， 根據這一實施方式，通過化合物(D)的-O-NH2基團與化合物(L)的基團巧或^反應獲得的 肟連接基團-O-N = CH-還原為基團-O-NH-CH2-,和/或如果適宜的話，在步驟a)中通過羥 烷基淀粉和化合物(D)的基團NH2-O-反應獲得的基團-CH = N-O-還原為基團-CH2-NH-0-。 在該實施方式中，可能在化合物(L)可能存在的醛基或酮基進行適當保護之后，例如，在 用于還原上述肟連接基團的反應條件下穩定的合適保護基的形式(例如合適的縮醛的形 式)，還原可以在大約10°C至大約80°C的溫度下，在合適的還原劑，如NaBH(OAc)3、硼氫化 鈉、氰基硼氫化鈉、有機硼烷絡合化合物(如4-( 二甲基氨基)-吡啶硼烷絡合物、N-乙基 二異丙基胺硼烷絡合物、N-乙基嗎啉硼烷絡合物、N-甲基嗎啉硼烷絡合物、N-苯基嗎啉硼 烷絡合物、二甲基吡啶硼烷絡合物、三乙胺硼烷絡合物或三甲胺硼烷絡合物)，優選NaCNBH3 或NaBH4的存在下進行5小時至24小時(如過夜)。如已經描述的，代替步驟b)之后的保 護基W1和W2，也可以使用化合物(L)作為步驟b)的起始材料，其已包含在用于還原上述肟 連接基團的反應條件下是穩定的適當保護的基團W1或W2。在替代的實施方式中，步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物可以直接用于步驟C)而 不進行任何進一步的化學反應，優選不進行還原。在優選的實施方式中，步驟a)獲得的羥烷基衍生物可以在步驟b)中與基于兒的 大約2至大約70當量的化合物(L)反應， 特別是在極性溶劑(如DMF或DMF/水的混合物(10 90, ν ν))中，在室溫或 者在大約40°C和隨后在室溫下，反應時間為大約10至大約24小時。獲得的HAS衍生物然 后可以用乙醇/丙酮的1 l(v ν)的混合物進行沉淀，沉淀物然后可以溶解于極性溶劑 (如DMF)中，并再次沉淀。然后可以將沉淀物溶于水，并超濾和凍干。優選地，反應混合物可 以用水1 l(v ν)稀釋，獲得的沉淀物可以進行過濾或離心，并再次用水1 l(v ν) 稀釋，獲得的溶液然后可以進行超濾和凍干。
因此，本發明涉及具有以下結構的HAS衍生物(在下文中，假設化合物(L)與從步 驟a)獲得的HAS衍生物的反應通過化合物(L)的官能團W1發生) 和/或相應的環結構(在HAS或HES的還原末端與化合物(D)之間包含非還原肟 連接的所有以下結構式中，以上顯示的開環結構還應當包括如下所示的相應的環結構) 和/ 或 根據不同的反應條件和/或交聯化合物的特定的化學性質，C-N雙鍵可以以E或Z 構象存在，其中，兩種形式的混合物也可能以一定的平衡分布而存在；至于用于本發明目的 的相應環結構應視為等同于上述的開放結構，并取決于反應條件和/或交聯化合物的特定 的化學性質，這些HAS衍生物可以在平伏或直立位置存在N原子，其中，兩種形式的混合物 也可以以一定的平衡分布而存在。因此，根據優選的實施方式，本發明還涉及HAS衍生物，優選HES衍生物，其中甚至 更優選HES具有大約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大約1至大約 500kDa、更優選大約2至大約400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大約10至大約 200kDa、尤其是大約50至大約150kDa的平均分子量，和0. 1至3、優選0. 4至1. 3如0. 4、 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩爾取代度，和優選2至20、更優選2到15 和甚至更優選3至12的C2 C6取代比
禾口/ 或 根據其他優選的實施方式，本發明還涉及上述2種結構的HAS衍生物，優選HES衍
生物，其中，替代 化合物 用作化合物(L)。根據進一步的實施方式，本發明還涉及HAS衍生物，優選HES衍生物，其中甚至更 優選HES具有大約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大約1至大約 500kDa、更優選大約2至大約400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大約10至大約 200kDa、尤其是大約50至大約150kDa的平均分子量，和0. 1至3、優選0. 4至1. 3如0. 4、 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩爾取代度，和優選2至20、更優選2到15 和甚至更優選3至12的C2 C6取代比
HAS 根據其他的優選實施方式，本發明還涉及上述2種結構的HAS衍生物，優選HES衍 生物，其中，替代 用作化合物(L)。根據進一步的實施方式，本發明還涉及HAS衍生物，優選HES衍生物，其中甚至更 優選HES具有大約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大約1至大約 500kDa、更優選大約2至大約400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大約10至大約 200kDa、尤其是大約50至大約150kDa的平均分子量，和0. 1至3、優選0. 4至1. 3如0. 4、 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩爾取代度，和優選2至20、更優選2到15 和甚至更優選3至12的C2 C6取代比
根據其他的優選實施方式，本發明還涉及上述2種結構的HAS衍生物，優選HES衍
生物，其中，替代
用作化合物(L)。在上述公開的包含末端基團W2的各HAS衍生物中，W2選自醛基、適當保護的醛基、 酮基和適當保護的酮基，優選選自醛基、半縮醛基、-CH(OH)2、縮醛基、酮基和縮酮基，甚至 更優選選自半縮醛基、-CH (OH) 2、縮醛基、縮酮基和基團-C (0) -R (其中，R選自氫、飽和或不 飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基)。甚 至更優選地，在基團-C (0) -R是酮基的情況下，R選自C1-C6烷基和C6-C14芳基，甚至更優選 選自任選取代的，優選非取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基。根據本發明的優選方式之一，其中肟連接在下面所描述的步驟C)的反應之前沒 有被還原，基團W2優選是未保護的醛基或未保護的酮基，尤其是未保護的醛基。因此，舉例來說，本發明還涉及HAS衍生物，優選HES衍生物，其中甚至更優選HES具有大約1至大約 lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大約1至大約500kDa、更優選大約2至大約 400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大約10至大約200kDa、尤其是大約50至大約 150kDa 的平均分子量，和 0. 1 至 3、優選 0. 4 至 1. 3 如 0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8、0. 9,1. 0,1. 1、 1. 2或1. 3的摩爾取代度，和優選2至20、更優選2到15和甚至更優選3至12的C2 C6 用作化合物(L)。根據本發明另一種優選的實施方式，其中肟連接在下面所描述的步驟C)的反應 之前被還原，基團W2:-如果在還原過程之前作為未保護的醛基或酮基存在的話，在肟連接的還原反應 之前對其進行適當保護；-或者，已經作為用作步驟b)中的起始材料的化合物(L)中的適當保護的醛基或 適當保護的酮基而存在。因此，至于包含還原的肟連接的HAS衍生物，舉例來說，本發明還涉及HAS衍生物， 優選HES衍生物，其中甚至更優選HES具有大約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約 800kDa、更優選大約1至大約500kDa、更優選大約2至大約400kDa、更優選大約5至大約 300kDa、更優選大約10至大約200kDa、尤其是大約50至大約150kDa的平均分子量，和0. 1 至 3、優選 0.4 至 1.3 如 0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1. 2 或 1. 3 的摩爾取代度，和 優選2至20、更優選2到15和甚至更優選3至12的C2 C6取代比
至少一種生物活性劑BA反應。用于步驟c)中的至少一種生物活性劑BA包含至少一個官 能團-NH2。為了這種情況和本發明的目的，BA也表示SH2N-BA'，其中BA'是BA的其余部 分。根據本發明的一種實施方式，從步驟b)獲得的具有未保護的醛基或未保護的酮 基(優選未保護的醛基)作為基團W2的HAS衍生物在任選地通過例如超濾、滲析和/或沉 淀的方法適當純化后，在本發明的步驟c)中與BA反應。根據本發明的另一種實施方式，從步驟b)獲得的具有保護的醛基或保護的酮基 (優選保護的醛基)作為基團W2的HAS衍生物在任選地通過例如超濾、滲析和/或沉淀的 方法適當純化后，適當地進行保護的基團向相應的醛基或酮基的轉化，其中產生的HAS衍 生物在與BA反應之前進行適當的純化和/或分離步驟。向醛基或酮基的轉化優選通過酸 催化的水解反應進行。該反應優選在以下條件下進行0到100°C、更優選10到80°C和更 優選20到60°C的溫度，優選1到6、更優選1至5、更優選1到4、更優選1至3和甚至更優 選1到小于3的pH值。可以通過本領域的技術人員熟知的方法，例如，通過滲析或超濾，實 現水解反應產物的純化和緩沖液交換(buffer exchange) 0轉化的材料可以作為固體從溶 液中回收，例如通過冷凍干燥。根據本發明的更另外的一種實施方式，從步驟b)獲得的已優選經過純化的HAS衍 生物適當地進行保護基團W2向相應的醛基或酮基的轉化，其中產生的HAS衍生物直接與BA 反應，即，不進行包含醛基或酮基的HAS衍生物的獨立的合適純化和/或分離步驟。向醛基 或酮基的轉化優選通過酸催化的水解反應進行。該反應優選在以下條件下進行0到10°C、 更優選10到80°C和更優選20到60°C的溫度，優選1到6、更優選1至5、更優選1到4、更 優選1至3和甚至更優選1到小于3的pH值。可以直接或在調整pH到與BA反應相容的 值后將水解反應產物與緩沖溶液中的BA混合。根據本發明的更另外的一種可以設想的實施方式，從步驟b)獲得的已優選經過 純化的HAS衍生物直接與BA反應，即，在允許保護的基團向相應的醛基或酮基原位轉化而 不需要單獨的合適純化和/或分離步驟和不需要單獨的保護基團向相應的醛基或酮基轉 化的步驟的反應條件下與BA反應。至于本發明的生物活性物質(BA)，這些化合物可能包含一個或多個用于本發明的 階段(ii)的偶合的氨基。對于BA本身不包含適于這種偶合的氨基的情況，可以設想在使 BA進行步驟(ii)之前，通過本領域的技術人員已知的方法進行適當的官能化而將至少一 個這樣的氨基引入BA。用于本發明中的術語“生物活性物質”(BA)涉及可以影響生物有機體(包括但不 限于病毒、細菌、真菌、植物、動物和人類)的任何物理或生化性質的物質。具體地，用于本 發明中的術語“生物活性物質”涉及用于診斷、治愈、緩解、治療或預防人類或動物的疾病或 另外地提高人類或動物的身體或精神健康的物質。活性物質的例子包括但不限于肽、多 肽、蛋白質、酶、小分子藥物、染料、脂類、核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、細胞、病 毒、脂質體、微粒(microparticle)和膠束。優選本發明的生物活性物質包含天然的氨基。蛋白質的例子包括但不限于促紅細胞生成素(EPO)如重組人EPO(rhEPO)或EPO 模擬物、集落刺激因子(CSF)如G-CSF，如重組人G-CSF (rhG-CSF)、α -干擾素(IFN- α )、 β-干擾素(IFN-β)或Y-干擾素(IFN-γ)如IFN-α禾口 IFN-β，如重組人IFN-α或
32IFN-β (rhIFN- α 或 rhIFN-β )、白介素例如，IL-1 至 IL-34，如 IL-2 或 IL-3 或 IL-11，如 重組人IL-2或IL-3(rhIL-2或rhIL-3)、血清蛋白如凝血因子II-XIII，如因子VIII、因 子VII、因子IX、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子X、因子XI、因子XII、因 子XIII、絲氨酸蛋白酶抑制劑如α 1-抗胰蛋白酶(AlAT)、活化蛋白C(APC)、纖溶酶原激活 物如組織型纖溶酶原激活物(tPA)，如人類組織纖溶酶原激活物(hTPA))、AT III如重組 人AT IIKrhAT III)、肌紅蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、生長因子如表皮生長因子 (EGF)、血小板生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、腦源性生長因子(BDGF)、神經 生長因子(NGF)、B細胞生長(BCGF)、腦源性的神經營養生長因子(BDNF)、睫狀神經營養因 子(CNTF)、轉化生長因子(如TGF-α或TGF-β )、BMP(骨形態發生蛋白)、生長激素如人 生長激素(hGH)、腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β、生長抑素(somatostatine)、促生長素 (somatotropine)、生長調節素(somatomedine)、血紅蛋白、激素或激素原如胰島素、促性腺 激素、黑色素細胞刺激素(α -MSH)、曲普瑞林(triptorelin)、下丘腦(hypothalamic)激素 (如抗利尿激素(ADH)和催產素以及釋放激素和釋放抑制激素)、甲狀旁腺激素、甲狀腺激 素(如甲狀腺素、促甲狀腺激素、促甲狀腺素釋放素)、降鈣素、胰高血糖素、胰高血糖素樣 肽(GLP-1、GLP-2 等)、exendines (如 Exendin-4)、瘦素(Ieptin)、加壓素、胃泌素、胰泌素 (secretin)、整聯蛋白、糖蛋白激素(如LH、FSH等hmelanoside-刺激激素、脂蛋白和載脂 蛋白(如3 0-8、3 04、3 0-1^)、免疫球蛋白(如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段)、水蛭 素、組織途徑抑制劑、植物蛋白(如植物凝集素或蓖麻毒蛋白)、蜂毒、蛇毒、免疫毒素、抗原 Ε、α-蛋白酶抑制劑、豚草過敏原、黑色素、寡賴氨酸(oligolysine)蛋白、RGD蛋白或這些 蛋白質之一的任選相應的受體；催乳素或其突變體，如G129R (其中，在129位的野生型氨基 酸甘氨酸被精氨酸取代)(這一突變體的商品名稱是“LactoVert”)，和這些蛋白質或受體 的功能性衍生物或片段、抗體或抗體片段、或替代的蛋白質支架(scaffold)。用于本發明中 的術語“替代的蛋白質支架”涉及具有類似于特定抗體的結合能力的分子，其中，所述分子 基于替代的非抗體蛋白骨框架。在本文中，可以提及A. Skerra，Τ. Hey等人和H. K. Binz的 文章(見下文的參考文獻列表)。活性物質優選選自抗生素、抗抑郁藥、抗糖尿病藥物、抗利尿藥、抗膽堿能藥、抗心 律失常藥、止吐藥、鎮咳藥、抗癲癇藥、抗組胺藥、抗真菌藥、antisympathotonics、抗血栓 藥、雄激素、抗雄激素、雌激素、抗雌激素、抗骨質疏松藥(antiosteoporotics)、抗腫瘤藥 物、血管擴張藥、其他抗高血壓藥、解熱藥、鎮痛藥、抗炎藥、β "受體阻滯劑、免疫抑制藥和 維生素。活性物質的某些另外的、非限制性的例子是阿侖膦酸(alendronate)、amikazin, 阿替洛爾、脒唑硫嘌呤、西咪替丁、可樂定、替可克肽(cosyntropin)、環絲氨酸、去氨加 壓素、雙氫麥角胺、多巴酚丁胺、多巴胺、ε-氨基己酸、麥角新堿、艾司洛爾、法莫替丁、 氟卡尼、葉酸、氟胞嘧啶、呋塞米、更昔洛韋、胰高血糖素、hydrazaline、異丙基腎上腺素、 氯胺酮、碘塞羅寧、LHRH、merpatricin,甲基多巴、美托洛爾、新霉素(neomicin)、尼莫 地平、制霉菌素、催產素、酚妥拉明、苯腎上腺素(phenyl印hrine)、普魯卡因胺、普魯卡 因、普萘洛爾、利托君、索他洛爾、特布他林、硫胺素、替魯膦酸(tiludronate)、妥拉唑林 (tolazoline)、甲氧芐氨嘧啶、氨丁三醇、加壓素；氨磷汀、胺碘達隆、氨基己酸、對氨基馬 尿酸 內(aminohippurate sodium)、M魯米特、乙酉先丙酸(aminolevulinic acid) >
33氨基水楊酸、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、天冬酰胺酶、蒽環類(anthracycline)、蓓薩羅 丁(bexarotene)、比卡魯胺、博來霉素、布舍瑞林、白消安、卡麥角林、卡培他濱、卡鉬、卡 莫司汀、苯丁酸氮芥(chlorambucil!)、西司他丁鈉、順鉬、克拉屈濱(cladribine)、氯曲 膦酸(clodronate)、環磷酰胺、環丙孕酮、阿糖胞苷、喜樹堿、13-順視黃酸、全反式視黃 酸；達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、去鐵胺、地塞米松、雙氯芬酸、己烯雌酚、多西他賽、 多柔比星、表柔比星、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非索非那定、氟達拉濱、氟氫可的松、 氟尿嘧啶、氟羥甲睪酮(fluoxymesterone)、氟他米特、吉西他濱、腎上腺素、左旋多巴、羥 基脲、伊達比星、異環磷酰胺、伊馬替尼、依立替康、伊曲康唑、戈舍瑞林、來曲唑、甲酰四氫 葉酸、左旋咪唑、賴諾普利(Iisinopril)、左旋甲狀腺素鈉(lovothyroxine sodium)、洛 莫司汀、氮芥、甲羥孕酮、甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、重酒石酸間羥胺、甲氨喋呤、甲氧氯普 胺、美西律、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、納洛酮、煙堿、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米 膦酸(pamidronate)、噴司他丁、普卡霉素(pilcamycin)、卟吩姆(porfimer)、潑尼松、丙 卡巴胼(procarbazine)、丙氯拉嗪、昂丹司瓊、雷替曲塞(raltitrexed)、西羅莫司、鏈佐 星、他克莫司、他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睪酮、四氫大麻酚、沙利度 胺、硫鳥嘌呤、塞替派、拓撲替康、維甲酸、戊柔比星(valrubicin)、長春堿、長春新堿、長 春地辛、長春瑞濱、多拉司瓊、格拉司瓊；福莫特羅、氟替卡松、亮丙瑞林(leuprolide)、咪 達唑侖、阿普唑侖、兩性霉素B、鬼臼毒素(podophylotoxins)、核苷類抗病毒藥物、芳酰基 腙類、舒馬曲坦；大環內酯類抗生素如紅霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、羅紅霉素、克拉霉素 (clarithromycin)、環酯紅霉素(davercin)、阿奇霉素、氟紅霉素、地紅霉素、交沙霉素、螺 方 霉素(spiromycin)、麥迪霉素、柱晶白霉素(Ieucomycin)、美歐卡霉素(miocamycin)、 羅他霉素、andazithromycin和swinolide A ；氟喹諾酮類藥物如環丙沙星、氧氟沙星、左 氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲沙星、莫西沙星(moxifloxicin)、諾氟沙星、依諾沙星、格帕沙 星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替馬沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟羅沙星、托氟沙星、普 盧利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星和西他沙星；氨基糖苷類如慶大霉素、奈替米星、 草履蟲素(paramecin)、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和鏈霉素、萬古霉素、替考拉 寧(teicoplanin)、雷莫拉寧(rampolanin)、麥地拉寧、粘菌素(colistin)、達托霉素、短桿 菌肽、甲磺酸粘菌素(colistimethate)；多粘菌素類如多粘菌素乙(polymixin B)、卷曲霉 素、桿菌肽、青霉烯類；青霉素類包括青霉素敏感劑，如青霉素G、青霉素V ；抗青霉素酶劑， 如甲氧西林、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、萘夫西林；革蘭氏陰 性微生物活性劑，如氨芐西林、阿莫西林和海他西林、cillin及galampicillin ；抗假單胞 菌青霉素，如羧芐西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林；頭孢菌素，如頭孢泊肟、 頭孢丙烯、頭孢布坦(ceftbuten)、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭 孢拉定(c^phradrine)、頭孢西丁、頭孢孟多、頭孢唑啉、頭孢利定、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、 頭孢來星(c印haloglycin)、頭孢氨呋肟、頭孢雷特(ceforamide)、頭孢噻肟、頭孢曲秦、氰 乙酰頭孢菌素(cephacetrile)、頭孢吡肟、頭孢克肟、頭孢尼西、頭孢哌酮、頭孢替坦、頭孢 美唑(cefinetazole)、頭孢他啶、氯碳頭孢和拉氧頭孢，及單環β-內酰胺(monobactam) 類，如氨曲南；及碳青霉烯類，如亞胺培南、美羅培南、噴他脒羥乙基磺酸鹽、硫酸沙丁胺醇、 利多卡因、奧西那林硫酸鹽、丙酸倍氯米松(beclomethasonedipr印ionate)、曲安西龍乙酰 胺、布地奈德丙酮化合物、氟替卡松、異丙托溴銨、氟尼縮松、色甘酸鈉和酒石酸麥角胺；紫杉烷類、如紫杉醇；SN-38和tyrphostines。因此，技術人員已知為“小分子”的化合物根據本發明也是可以想象的生物活性物 質。用于本發明中的術語“小分子”涉及蛋白質和寡核苷酸之外的生物活性化合物，但是， 包括最多50個氨基酸的肽。這種小分子典型的例子如前述段落所列。寡核苷酸的例子是適體(aptamer)。作為可以想象的生物活性物質另外提到的是 肽核酸(PNA)。在一個特別優選的實施方式中，用于步驟C)中的至少一種生物活性劑BA選自肽、 多肽、蛋白質和多肽或蛋白質的功能性衍生物、片段或模擬物。優選地，肽選自促紅細胞生成素(EPO)如重組人EPO (rhEPO)或EPO模擬 物、集落刺激因子(CSF)如G-CSF，如重組人G-CSF (rhG-CSF)、α -干擾素(IFN- α )、 β-干擾素(IFN-β)或Y-干擾素(IFN-γ)如IFN-α禾口 IFN-β，如重組人IFN-α或 IFN- β (rhIFN- α 或 rhIFN- β )、白介素例如，IL-I 至 IL-18，如 IL-2 或 IL-3，如重組人 IL-2 或IL-3 (rhIL-2或rhIL-3)、血清蛋白如凝血因子ΙΙ-ΧΙΙΙ，如因子VIII、因子VII、因子IX、 因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、α 1-抗 胰蛋白酶(AlAT)、活化蛋白C(APC)、纖溶酶原激活物如組織型纖溶酶原激活物(tPA)，如人 類組織纖溶酶原激活物(hTPA))、AT III如重組人AT III (rhAT III)、肌紅蛋白、白蛋白 如牛血清白蛋白(BSA)、生長因子如表皮生長因子(EGF)、血小板生長因子(PDGF)、成纖維 細胞生長因子(FGF)、腦源性生長因子(BDGF)、神經生長因子(NGF)、B細胞生長(BCGF)、 腦源性的神經營養生長因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、轉化生長因子(如TGF-α 或TGF_i3)、BMP(骨形態發生蛋白)、生長激素如人生長激素、腫瘤壞死因子(如TNF-α或 TNF-β)、生長抑素、促生長素、生長調節素、血紅蛋白、激素或激素原(如胰島素、促性腺激 素、黑色素細胞刺激素(α-MSH))、曲普瑞林、下丘腦激素(如抗利尿激素(ADH)和催產素以 及釋放激素和釋放抑制激素)、甲狀旁腺激素、甲狀腺激素(如甲狀腺素、促甲狀腺激素、促 甲狀腺素釋放素)、降鈣素、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽(GLP-1、GLP-2等)jxendines (如 Exendin-4)、瘦素(Ieptin)、加壓素、胃泌素、胰泌素、整聯蛋白、糖蛋白激素(如LH、FSH 等)、melanoside-刺激激素、脂蛋白和載脂蛋白(如apo_B、apo-E、apo-La)、免疫球蛋白 (如IgG, IgE, IgM, IgA和IgD及其片段)、水蛭素、組織途徑抑制劑、植物蛋白(如植物凝 集素或蓖麻毒蛋白)、蜂毒、蛇毒、免疫毒素、抗原Ε、α -蛋白酶抑制劑、豚草過敏原、黑色 素、寡賴氨酸蛋白、RGD蛋白或這些蛋白質之一的任選相應的受體；和這些蛋白質或受體的 功能性衍生物或片段。多肽甚至更優選選自促紅細胞生成素(EPO)如重組人EPO(rhEPO)、集落刺激 因子(CSF)如G-CSF，如重組人G-CSF (rhG-CSF)、α 1-抗胰蛋白酶(AlAT)、因子IX、 α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)或Y-干擾素(IFN-γ )如重組人IFN-α或 IFN- β (rhIFN- α 或 rhIFN- β )，尤其是 AlAT、因子 IX、IFN- a、G-CSF 和 ΕΡ0。在優選的實施方式中，步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物在步驟C)中通過在步驟 b)通過化合物(L)引入羥烷基淀粉衍生物中的官能團W2與該至少一個生物活性劑的氨基 反應，官能團W2選自醛基或酮基，優選選自-CH = 0、半縮醛基、-CH(OH)2和基團-C(O)-R(其 中，R選自飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取代或未取代的烷基和取代或 未取代的芳基)。在優選的實施方式中，在基團-C(O)-R是酮基的情況下，殘基R選自C1-C6烷基和C6-C14芳基，甚至更優選選自任選取代的，優選非取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、 正丁基、異丁基和叔丁基。在一個實施方式中，步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物在步驟C)中通過生物活性 劑的至少一個官能團-NH2與在步驟b)通過化合物(L)引入羥烷基淀粉衍生物中的選自醛 基或酮基，優選選自-CH = 0、半縮醛基、-CH(OH)2和基團-C(O)-R的官能團W2反應，其中， 在步驟c)中使用的至少一個生物活性劑中包含的至少一個官能團-NH2是多肽或蛋白質的 N-末端氨基。在優選的實施方式中，步驟C)在還原胺化的反應條件下進行。還原胺化的反應條 件是本領域技術人員已知的。特別地，在這些條件下，通過選自-CH = 0、半縮醛基、-CH(OH)2 和基團-C(O)-R的官能團W2與生物活性劑BA的-NH2基團的反應獲得的基團-CH = N-還 原為-CH2-NH-O在一種替代的實施方式中，步驟a)獲得的羥烷基淀粉衍生物或步驟b)獲得的羥 烷基淀粉衍生物都不在相應的步驟后進行還原，只有步驟c)的反應在還原條件下進行，更 優選地，其中，步驟c)用適當的還原劑進行，所述適當的還原劑如NaBH(OAc)3、硼氫化鈉、 氰基硼氫化鈉、有機硼烷絡合化合物(如4-( 二甲基氨基)-吡啶硼烷絡合物、N-乙基二異 丙基胺硼烷絡合物、N-乙基嗎啉硼烷絡合物、N-甲基嗎啉硼烷絡合物、N-苯基嗎啉硼烷絡 合物、二甲基吡啶硼烷絡合物、三乙胺硼烷絡合物或三甲胺硼烷絡合物)，優選NaCNBH3或 NaBH40因此，本發明還涉及HAS衍生物(優選HES衍生物)，其中甚至更優選HES具有大 約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大約1至大約500kDa、更優選大 約2至大約400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大約10至大約200kDa、尤其是大 約50至大約150kDa的平均分子量，和0. 1至3、優選0. 4至1. 3如0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、 0.9,1. 0,1. 1、1.2或1.3的摩爾取代度，和優選2至20、更優選2到15和甚至更優選3至 12的C2 C6取代比 和/ 或
HAS'
OH
2 CH
\o
(H和/ 或
HASf
OH
R-4
I
O
OR, H
-O-
-N—C*"“Rg CH=N-H H,
-BA'
OwwwRj* O
1
CH
_ A.
CH
Ir
ι
■
NN _
-BA'
-O_R:~O-
-N=C-H
-Rr—C-N-BA*
9 H, H優選是，除其他外，本發明涉及HAS衍生物(優選HES衍生物)，其中甚至更優選 HES具有大約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大約1至大約500kDa、 更優選大約2至大約400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大約10至大約200kDa、 尤其是大約50至大約150kDa的平均分子量，和0. 1至3、優選0. 4至1. 3如0. 4、0. 5、0. 6、 0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1.2或1.3的摩爾取代度，和優選2至20、更優選2到15和甚至更 優選3至12的(2 C6取代比
HAS'
OR3 H
C=N-和/ 或
37HAS
OR, H2 H
CH
導
H 根據其他優選的實施方式，本發明還涉及上述4種結構的HAS衍生物，優選HES衍 生物，其中，替代
用作化合物(L)。
根據進一步的實施方式，本發明還涉及HAS衍生物(優選HES衍生物)，其中甚至更優選HES具有大約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大約1至大約 500kDa、更優選大約2至大約400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大約10至大約 200kDa、尤其是大約50至大約150kDa的平均分子量，和0. 1至3、優選0. 4至1. 3如0. 4、 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩爾取代度，和優選2至20、更優選2到15 和甚至更優選3至12的C2 C6取代比
和/ 或 和/ 或 禾P/或 根據其他優選的實施方式，本發明還涉及上述4種結構的HAS衍生物，優選HES衍 生物，其中，替代 化合物 用作化合物(L)。根據進一步的實施方式，本發明還涉及HAS衍生物(優選HES衍生物)，其中甚至 更優選HES具有大約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大約1至大約 500kDa、更優選大約2至大約400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大約10至大約 200kDa、尤其是大約50至大約150kDa的平均分子量，和0. 1至3、優選0. 4至1. 3如0. 4、 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩爾取代度，和優選2至20、更優選2到15 和甚至更優選3至12的C2 C6取代比 和/ 或 和/ 或 在上述確定的各種含有BA'的HAS衍生物(優選HES衍生物)中，BA'優選選自 IFN- α ‘ ,G-CSF' ,EPO' ,AlAT'和因子 IX'，尤其是 IFN-α'。因此，根據特別優選的實施方式，本發明涉及HAS衍生物(優選HES衍生物)，其中 甚至更優選HES具有大約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大約1至 大約500kDa、更優選大約2至大約400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大約10至 大約200kDa、尤其是大約50至大約150kDa的平均分子量，和0. 1至3、優選0. 4至1. 3如 0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2 或 1. 3 的摩爾取代度，和優選 2 至 20、更優選 2 至Ij 15和甚至更優選3至12的C2 C6取代比和/ 或
0 -
NH
1,
CH
H H
C=N-IFNaIpha'和/ 或
HAS,.
—O^^-^O^s/^O"·^=日h~-C-N-IFNaIpha'尤其是
HAS'
ha' P al
IFN
H"'
CH

CH
I
NH
I
O
O --
-N
C在優選的實施方式中，優選選自IFN-α、G-CSF, ΕΡ0、AlAT和IX因子，尤其是 IFN-α的生物活性劑BA溶于水性介質中，優選緩沖液，尤其是醋酸鈉緩沖液。水性介質可 能另外含有添加劑，如洗滌劑和/或分散劑，特別是選自SDS、Chaps、Tween 20, Tween 80、 Nonidet P-40和Triton X 100。如果使用洗滌劑和/或分散劑，其優選以大約0. 05重量％ 至大約3重量％，優選大約0. 5重量％的量存在。生物活性劑BA的水溶液優選具有大約為3至大約9、尤其是大約4至大約7的pH值。在一個實施方式中，將步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物添加到如上所述的生物 活性劑BA的水溶液中。優選地，隨后加入合適的還原劑，如NaBH(OAc)3、硼氫化鈉、氰基硼 氫化鈉、有機硼烷絡合化合物(如4-( 二甲基氨基)吡啶硼烷絡合物、N-乙基二異丙基胺
42硼烷絡合物、N-乙基嗎啉硼烷絡合物、N-甲基嗎啉硼烷絡合物、N-苯基嗎啉硼烷絡合物、二 甲基吡啶硼烷絡合物、三乙胺硼烷絡合物或三甲胺硼烷絡合物)，優選NaCNBH3或NaBH4。在替代的實施方式中，可以將步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物加入任選的 水溶液中，然后加入生物活性劑BA，優選蛋白質。優選地，隨后加入合適的還原劑，如 NaBH(OAc)3、硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、有機硼烷絡合化合物(如4-( 二甲基氨基)-吡啶硼 烷絡合物、N-乙基二異丙基胺硼烷絡合物、N-乙基嗎啉硼烷絡合物、N-甲基嗎啉硼烷絡合 物、N-苯基嗎啉硼烷絡合物、二甲基吡啶硼烷絡合物、三乙胺硼烷絡合物或三甲胺硼烷絡合 物)，優選 NaCNBH3 或 NaBH4。在步驟c)中，步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物與生物活性劑BA(優選選自 IFN- α、G-CSF、EP0、因子IX和A1AT，尤其是IFN- α )的反應優選在大約3至大約7，尤其是 大約4至大約6的ρΗ值下進行。在步驟c)中，步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物與生物活性劑BA(優選選自 IFN-α、G-CSF、ΕΡ0、AlAT和因子IX，尤其是IFN- α )的反應優選在大約0°C至大約25°C, 尤其是大約0°C或大約5°C或大約10°C或大約21°C的溫度下進行。步驟c)的反應時間取決于溫度、步驟b)獲得的衍生物HAS (尤其是HES)與生物 活性劑BA的比例及HAS衍生物和生物活性劑BA的絕對濃度。基于步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物的重均分子量(Mw)，在步驟C)中，步驟b) 獲得的羥烷基淀粉衍生物與生物活性劑BA的摩爾比一般為大約0.1 1至200 1，優選 大約1 1到大約100 1當量，優選摩爾比為大約1 1到大約40 1，特別地摩爾比為 大約1 1到大約20 1，優選在生物活性劑選自IFN-α、G-CSF、EP0、A1AT和因子IX，尤 其是IFN-α的情況下。在特別優選的實施方式中，用于步驟C)中的在步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物 的濃度高于大約10% m/v，尤其是高于大約15% m/v。在優選的實施方式中，生物活性劑BA (尤其是選自IFN-a、G_CSF、EP0、A1AT和因 子IX，特別是IFN-a )的濃度高于大約1毫克/毫升，優選高于大約2毫克/毫升，尤其高 于大約4毫克/毫升。可以用常規方法分離步驟C)獲得的反應產物，如液相色譜，例如，離子交換色譜 法、SEC、HPLC或任何其他方法。反應可以在純化之前通過稀釋、降低反應溫度、加入伯氨基 化合物(例如，氨基酸)或這些方法的組合來停止。在一個特別優選的實施方式中，在步驟a)中，未氧化的羥烷基淀粉(優選羥乙基 淀粉)在羥烷基淀粉的一個還原末端通過一個官能團-O-NH2與化合物(D)
H2hr0s^"0^^0、NH2反應，并且在步驟b)中，步驟a)獲得的羥烷基淀粉衍生物通過官能團-O-NH2與 化合物(L)
43
的一個官能團-CH = 0反應。 在步驟c)中，上述步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物優選與選自IFN-α、G-CSF, EPO、因子IX和AlAT，尤其是IFN-α的生物活性劑BA反應，其中，在步驟c)中，步驟b)獲 得的羥烷基淀粉衍生物在還原胺化條件下與IFN-α反應，尤其是在合適的還原劑存在下， 如NaBH (OAc) 3、硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、有機硼烷絡合化合物(如4- ( 二甲基氨基)-吡啶 硼烷絡合物、N-乙基二異丙基胺硼烷絡合物、N-乙基嗎啉硼烷絡合物、N-甲基嗎啉硼烷絡 合物、N-苯基嗎啉硼烷絡合物、二甲基吡啶硼烷絡合物、三乙胺硼烷絡合物或三甲胺硼烷絡 合物)，優選NaCNBH3或NaBH4。已令人驚訝地發現，當進行上述方法時，尤其是在對于上述的步驟c)的優選條件 下，可以高產率(如高達80%的產率，如70%至80%的范圍內)獲得步驟b)獲得的羥烷基 淀粉衍生物與生物活性劑BA的反應產物。V.藥物組合物和用涂本發明還涉及包含治療有效量的可通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物的藥 物組合物，尤其是當所述方法包括步驟a)至步驟c)時，優選其中生物活性劑BA優選選自 IFN-α、G-CSF、EP0，尤其是IFN-α。藥物組合物可以包含通常的藥用賦形劑。本文所用的“治療有效量”是指對于給定的條件和施用方案提供治療效果的量。至于如上所述包含含有BA'的HAS衍生物的本發明藥物組合物，HAS衍生物可 與藥物賦形劑組合使用。一般情況下，HAS衍生物為可與適當的固體或液體形式的藥物賦 形劑結合的固體形式。作為賦形劑，碳水化合物、無機鹽、抗菌劑、抗氧化劑、表面活性劑、 緩沖劑、酸、堿及其組合可能被提及。碳水化合物，如糖、衍生的(derivatized)糖(如糖 醇(alditol)、醛糖酸(aldonic acid)、酯化的糖和/或糖聚合物可作為賦形劑存在。具 體的碳水化合物賦形劑包括，例如單糖如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨 糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖如棉子糖(raffmose)、松三糖、麥芽 糖糊精、葡聚糖、淀粉等；及糖醇，如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇 (葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨醇(pyranosyl sorbitol)、肌醇等。賦形劑還可以包括無機 鹽或緩沖劑，如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉及其組 合。本發明的藥物組合物還可以包含用于防止或阻止微生物生長的抗菌劑，如苯扎氯銨、 芐索氯銨、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、thimersol及其 組合。本發明的藥物組合物還可以包含抗氧化劑，例如，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥 基茴香醚(butylatedhydroxyanisole)、丁基化輕氧甲苯(butylated hydroxytoluene) > 次磷酸、單硫代甘油、沒食子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、甲醛合次硫酸鈉(sodiumformaldehyde sulfoxylate)、焦亞硫酸鈉及其組合。本發明的藥物組合物根據還可以包含表面活性劑，例 如，聚山梨醇酯(polysorbate)或pluronics山梨聚糖酯；脂質，如磷脂(如卵磷脂和其他
磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺酸)和脂肪酸酯)；類固醇類如膽固醇；和螯合劑如EDTA或鋅。本發明的藥物組合物還可以包含酸或堿，如鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、甲酸、 三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富馬酸及其組合，和/或氫氧化鈉、醋酸鈉、氫氧化銨、 氫氧化鉀、醋酸銨、醋酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、富馬酸鉀及 其組合。一般來說，賦形劑在本發明的藥物組合物中以0. 001重量％到99. 99重量％、優選 0. 1重量％到99. 9重量％的量存在，每種情況下基于藥物組合物的總重量計算。本發明的組合物優選用于適于皮下或靜脈或腸胃外注射的制劑。為此，適當的賦 形劑和載體是，例如，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、谷氨酸鈉、甘露醇、山梨醇、聚山梨 醇酯80、HSA和注射用水。可以每周施用組合物3次，優選每周2次，更優選每周1次，最優 選每兩周1次。優選地，藥物組合物以以下的量施用0. 01微克/千克-6毫克/千克患者體重， 優選0. 01-10微克/千克患者體重，更優選0. 1-5微克/千克，尤其是0. 1-1微克/千克或 0. 2-0. 9微克/千克，最優選0. 3-0. 7微克/千克，和最優選0. 4-0. 6微克/千克體重。一般來說，優選每劑施用10微克至6毫克，優選10微克至200微克，優選15微克 至100微克。本發明還涉及作為治療劑或預防劑的可通過上述方法(尤其是包括步驟a)至c)) 獲得的羥烷基淀粉衍生物。本發明還涉及可通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物用于制備治療選自癌癥 (如毛細胞白血病、惡性黑色素瘤、濾泡性淋巴瘤和/或AIDS相關卡波濟氏肉瘤)、尖銳濕 疣、慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎，優選慢性乙型肝炎和丙型肝炎的疾病的藥物的用途，所 述方法尤其是包括步驟a)至步驟c)，且步驟c)中生物活性劑BA是IFN- α。本發明還涉及可通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物用于制備治療選自癌癥 患者例如接受骨髓抑制化療的癌癥患者、接受誘導或鞏固化療的患有急性髓性白血病的患 者和/或接受骨髓移植的癌癥患者、進行外周血祖細胞收集和治療的患者和患有嚴重慢性 中性粒細胞減少癥的患者的患者中的疾病的藥物的用途，所述方法尤其是包括步驟a)至 步驟c)，且步驟c)中生物活性劑BA是G-CSF。本發明還涉及可通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物用于制備治療貧血如慢 性腎衰竭患者、齊多夫定治療的HIV感染患者、化療的癌癥患者的貧血、或用于減少手術患 者的異體輸血的藥物的用途，所述方法尤其是包括步驟a)至步驟c)，且步驟c)中生物活性 劑BA是EPO。本發明還涉及可通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物用于制備預防或治療癌 癥(尤其是乳腺癌)的藥物的用途，所述方法尤其是包括步驟a)至步驟c)，且步驟c)中生 物活性劑BA是促乳素或其變異體。本發明還涉及通過施用治療有效量的可根據上述方法獲得的羥烷基淀粉偶聯物 治療選自以下患者的疾病的方法癌癥患者如接受骨髓抑制性化療的癌癥患者、接受誘導 或鞏固化療的患有急性髓性白血病的患者和/或接受骨髓移植的癌癥患者、進行外周血祖 細胞收集和治療的患者和患有嚴重慢性中性粒細胞減少癥的患者；貧血如慢性腎衰竭患 者、齊多夫定治療的HIV感染患者、化療的癌癥患者的貧血；或用于減少手術患者的異體輸 血；和癌癥、尤其是乳腺癌。本發明還參照以下非限制的實施例更詳細地進行描述
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圖1顯示通過SDS凝膠電泳對粗制蛋白60/1. 0偶聯物的分析。道 X:Mark 12MW Standard (Invitrogen, Karlsruhe, D)從頂部到底部以kDa計的分子量標志物:200、116、97、66、55、37、31、22、14、6、
3· 5、2· 5 ο 14. 3kDa ο 14. 3kDa ο圖3顯示根據實施例6. 1，Intron A對于NIH標準品的增殖活性的曲線圖。 圖4顯示根據實施例6. 2，HES-IFN- α的體外活性的曲線圖。 圖5顯示根據實施例7. 2，HES-IFN-α的半衰期的曲線圖。 圖6顯示通過SDS凝膠電泳對根據實施例8的HES-G-CSF偶聯反應的分析。 道 M:Mark 12MW Standard(Invitrogen, Karlsruhe, D)從頂部到底部以kDa計的分子量標志物:200、116、97、66、55、37、31、22、14、6、
3· 5、2· 5 ο道1 :10微克反應混合物HES60/0. 7-G-CSF 道2 :10微克反應混合物HES60/1. O-G-CSF 道3 :10微克反應混合物HES100/1. O-G-CSF道4 :10微克反應混合物HES100/1. 3-G-CSF 道 5 :5 微克 rh-metG-CSF圖7顯示通過SDS凝膠電泳對根據實施例9獲得的粗制蛋白-HES60/1. 3偶聯物 的分析。
道 A :3. 7 微克 IFN-α。 道B :Q4的合成。 道C :Q5的合成。
道 Y =Roti -Mark STANDARD (Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe, D) 從頂部到底部的分子量標志物200kDa、119kDa、66kDa、43kDa、29kDa、20kDa、
道D :Q8的合成。 道E :Q9的合成。 道 F :10 微克 IFN-α。 道G :5微克IFN-α。 道 H :2. 5 微克 IFN-α。 道I :1微克IFN-α。
圖2顯示通過SDS凝膠電泳對粗制蛋白-HES 100/1. 0偶聯物的分析。 道 X=Roti -Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe, D) 從頂部到底部的分子量標志物200kDa、119kDa、66kDa、43kDa、29kDa、20kDa、
道A :R83的合成。 道B :R84的合成。 道C :R85的合成。
道X :Roti _Mark STANDARD (Carl Roth GmbH+Co. KG, Karl sruhe, D)從頂部到底部以kDa計的分子量標志物245、123、77、42、30、25. 4、17。道A 10微克反應混合物HES60/1. 3-EP0實驗部分HES和HES-衍生物的規格Mw 重均分子量Mn 數均分子量通過凝膠滲透色譜法結合光散射檢測器測定Mw和Mn。MS =摩爾取代度HES的每個脫水葡萄糖殘基的平均羥乙基取代基數目在HES分子全部水解后，通過氣相色譜法測定MS。沒有通過實驗確定醛基 (Aldehydo)-HES的MS值。相反，給出各HES起始原料的MS值。假定在衍生化過程中，MS 的值不受影響。HES 60/1. 0 HES 60/1. 0 (Supramol Parenteral Products GmbH, Rosbach)Mw :62kDaMn :35kDaMS: 1.01醛基-HES-60/1. 0 (如實施例1. 2b所述合成)Mw :63kDaMn:35kDaMS: 1.01HES100/1. 0 HES 100/1. 0 (Supramol Parenteral Products GmbH, Rosbach)Mw :93kDaMn :4IkDaMS :1. 01醛基-HES 100/1. 0 (如實施例1. 2a所述合成)Mw :92kDaMn 4IkDaMS: 1· 01IFN- α 規格干擾素α _2b，其在歐洲藥典中有描述干擾素α -2b的濃縮液，歐洲藥典，01/2002 1110實施例1 醛基-HES衍生物60/1. 0和100/1. 0的合成實施例1. 1 由 HES 60/1. 0 和 100/1. 0 制備羥氨基-HES 60/1. 0 和 100/1. 0將 HES A(B ^,MW = C kDa,Lot D，供應商 Supramol ParenteralProducts GmbH, Rosbach, D)Ampuva /K (Fresenius-Kabi, BadHomburg, D) 白勺中夕夜(F 毫升，0.IM的醋酸鈉，ρΗ 5.2)中，并加入0-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]-羥胺(G克， 如Boturyn等人Tetrahedron 53(1997)第5485-5492頁中所述以2步驟用市售起始材料
47制備)。在室溫下攪拌H小時后，將反應混合物加入2-丙醇(I毫升)中。在4°C通過離心 收集沉淀的產物。將粗制產物溶于水(J毫升)中，相對于Milli-Q水(SnakeSkin滲析管， IOkDa MWCO, Perbio SciencesDeutschland GmbH, Bonn, D)滲析 50 小時，并凍干。分離的
產物的產率為L%。
表1 羥氨基-HES衍生物的合成實施例1. 2 由羥氨基-HES 60/1. 0 和 100/1. 0 制備醛基-HES 60/1. 0 和 100/1. 0將羥氨基-HES A(B克，麗=C kDa，如實施例D所述制備)溶解于溶解在E毫 升 DMF(月太合成級，Biosolve, Valkenswaard, NL)中，并力口入對駄酸(F 克，Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) 0在室溫下振搖G小時后，將反應混合物慢慢加入1 1 的丙酮和乙醇混合物(H毫升，ν/ν)中。在4°C通過離心收集沉淀的產物，再溶于DMF(Ε毫 升)中，并用如上所述的丙酮和乙醇混合物(H毫升，ν/ν)沉淀。離心后，沉淀物溶于水(Ε 毫升，Milli-Q)中，相對于 Milli-Q 水(SnakeSkin 滲析管，IOkDa MWCO, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)滲析I小時，并凍干。分離的產物的產率為M%。 表2 醛基-HES衍生物的合成實施例2HES (60/1.0)-IFN-α偶聯物的合成實施例2. IHES (60/1. 0) -IFN- α 偶聯物(Lot :Q4)的合成緩沖液交換在20°C下，在 Amicon Ultra-4 濃縮器(Millipore, 5kDa MWC0)中以 7. 500xg 離心 IFN- α溶液(5. 32毫升，10毫克，1. 88毫克/毫升)20分鐘。通過用反應緩沖液(0. IM的 醋酸鈉，ρΗ4. 0)稀釋殘留溶液至5毫升并如所述的離心16分鐘重復洗滌過程3次。用反 應緩沖液調整最終體積至1. 15毫升(計算的濃度為8. 7毫克/毫升)。蛋白質濃度沒有通 過實驗檢測。偶聯作用將醛基-HES 60/1. 0(623毫克，如實施例1.2b所述制備，20當量)溶于蛋白質溶 液(1.15毫升，8.7毫克/毫升，如上所述制備)中，并用移液管充分混合該混合物。在冰 上孵育15分鐘后，加入預冷卻的氰基硼氫化鈉溶液(40微升，在反應緩沖液中為1. 24M，Fluka, Sigma-AldrichChemie GmbH, Taufkirchen, D)，并在 0°C下孵育反應混合物 6 小時。 加入氰基硼氫化鈉時觀察到沉淀。通過加入3毫升反應緩沖液和2. 97毫升含有350mM的 賴氨酸(Merck，Darmstadt，D)的0. IM醋酸鈉來終止反應。用反應緩沖液稀釋混合物至10 毫升，并在純化前在冰上存儲過夜。通過SDS-PAGE分析反應混合物(見圖1)。實施例2. 2HES (60/1. 0) -IFN- α 偶聯物(Lot :Q5)的合成緩沖液交換在20°C下，在 Amicon Ultra-4 濃縮器(Millipore, 5kDa MWC0)中，以 7. 500xg 離 心IFN- α的溶液(5. 32毫升，10毫克，1. 88毫克/毫升)20分鐘。通過用反應緩沖液(0. IM 的醋酸鈉，ΡΗ4. 0)稀釋殘留溶液至5毫升并如上所述離心16分鐘，重復洗滌過程3次。用 反應緩沖液調整最終體積至0. 926毫升(計算的濃度為10. 8毫克/毫升)。該蛋白質濃度 沒有經實驗檢驗。偶聯作用將醛基-HES 60/1. 0(309毫克，如實施例1.2b所述制備，10當量)溶于蛋白質溶 液(0.926毫升，10. 8毫克/毫升，如上所述制備)中，并用移液管充分混合該混合物。加入 預冷卻的氰基硼氫化鈉溶液(20. 3微升，在反應緩沖液中為1.24M，Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen,D)，并在21°C下孵育反應混合物2小時。通過加入3毫升反應 緩沖液和1. 5毫升含有350mM賴氨酸(Merck，Darmstadt，D)的0. IM的醋酸鈉來終止反應。 用反應緩沖液稀釋混合物至10毫升，并在純化前在冰上存儲過夜。通過SDS-PAGE分析反 應混合物(見圖1)。實施例2. 3HES (60/1. 0) -IFN- α 偶聯物(Lot :Q8)的合成緩沖液交換在20°C 下，在 Vivaspin 6mL CONCENTRATOR (Viva Science, 5kDa MWCO，Hannover, D)中，以3. 939xg離心IFN-α的溶液(5. 32毫升，10毫克，1. 88毫克/毫升)45分鐘。通 過用反應緩沖液(0. IM的醋酸鈉，pH 4.0)稀釋殘留溶液至6毫升并如上所述離心40分鐘， 重復洗滌過程3次。用反應緩沖液調整最終體積至1. 0毫升(計算的濃度為10毫克/毫 升)。該蛋白質濃度沒有經實驗檢驗。偶聯作用將醛基-HES 60/1. 0(232毫克，如實施例1.2b所述制備，7. 5當量)溶于蛋白質溶 液(1.0毫升，10毫克/毫升，如上所述制備)中，并用移液管充分混合該混合物。在冰上孵 育15分鐘后，加入預冷卻的氰基硼氫化鈉溶液(100微升，在反應緩沖液中200mM，Fluka, Sigma-AldrichChemie GmbH, Taufkirchen, D)，并在 10°C下孵育反應混合物 7 小時。用 100當量的賴氨酸(1. 95毫升，在反應緩沖液中的0. 2M鹽酸賴氨酸(Fluka Biochemica, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D), pH 4.0)和IOmM甲硫氨酸(650微升，在反應緩沖液中的 0. IM 甲硫氨酸(FlukaBiochemica，Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D)，pH 4. 1)終止反應。 用反應緩沖液稀釋混合物至6. 5毫升，并在純化前在冰上存儲過夜。通過SDS-PAGE分析反 應混合物(見圖1)。實施例2. 4HES (60/1. 0) -IFN- α 偶聯物(Lot :Q9)的合成緩沖液交換如實施例2. 3 所述，用 Vivaspin 6mL CONCENTRATOR交換 IFN- α 溶液(5. 32 毫升，
4910毫克，1.88毫克/毫升)的緩沖液為0. IM的醋酸鈉(pH 4. 0)，并在0°C下，在濃縮器中 孵育該溶液15分鐘。偶聯作用加入醛基-HES 60/1. 0溶液(155毫克，如實施例1. 2b所述制備，在5mL反應緩沖 液(0. IM的醋酸鈉，pH 4. 0)中為5當量，在冰上預冷卻)，并在10°C下以3. 939xg離心混 合物2. 5小時。向大約700微升反應混合物的剩余體積中加入預冷卻的氰基硼氫化鈉溶液 (5 毫升，在反應緩沖液中 20mM，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在 10°C下以3. 939xg離心溶液18小時，并在純化前在冰上存儲。通過SDS-PAGE分析反應混 合物(見圖1)。實施例3HES (100/1.0)-IFN-α偶聯物的合成實施例3. IHES (100/1. 0) -IFN- α 偶聯物(Lot :R83)的合成將IFN- α的原液(19. 68毫升，37毫克，1. 88毫克/毫升)等分到兩個Vivaspin 15R濃縮器(Viva Science, 5kDa MWCO, Hannover, D)中，各用反應緩沖液(0. IM的醋酸鈉 緩沖液，PH 4. 0，用 Ampuwa 水(Fresenius-Kabi，Bad Homburg, D)制備)稀釋至 18 毫升， 并在21°C下以3. 939xg離心36分鐘。通過用反應緩沖液稀釋殘留溶液至18毫升并如所述 離心35分鐘，重復洗滌過程3次。用反應緩沖液調整合并的蛋白質溶液的體積至3. 47毫 升(計算的蛋白質濃度為10. 8毫克/毫升)。該蛋白質濃度沒有經實驗檢驗。將醛基-HES 100/1. 0 (1. 156克，如實施例1. 2a所述制備，12當量)溶于反應緩 沖液(1.628mL)中，并加入蛋白質溶液(1. 736毫升，10. 8毫克/毫升，如上所述制備)。在 0°C下孵育30分鐘后，加入預冷卻的氰基硼氫化鈉溶液(100微升，在反應緩沖液中為58. 2 毫克 / 毫升，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)，并充分混合該混合物。 加入NaCNBH3時形成少量細沉淀。在混合過程中溶液澄清，用反應緩沖液調整其體積至4. 6 毫升，并在0°C孵育該混合物18小時。通過SDS-PAGE分析反應混合物(見圖2)。實施例3. 2HES (100/1. 0) -IFN- α 偶聯物(Lot :R84)的合成將醛基-HES 100/1. 0(462毫克，如實施例1.2a所述制備，4. 8當量)溶于蛋白質 溶液(1.736毫升，10. 8毫克/毫升，如實施例3.1所述制備)中。在0°C下孵育30分鐘 后，加入預冷卻的氰基硼氫化鈉溶液(50微升，在反應緩沖液中為58. 2毫克/毫升，Fluka， Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Taufkirchen，D)，并充分混合該混合物。加入 NaCNBH3 時形 成少量微細的沉淀物。在混合過程中溶液澄清，用反應緩沖液調整其體積至2. 3毫升，并在 0°C孵育該混合物17. 5小時。通過SDS-PAGE分析反應混合物(見圖2)。實施例3. 3HES (100/1. 0) -IFN- α 偶聯物(Lot :R85)的合成將IFN-α原液(10. 63毫升，20毫克，1. 88毫克/毫升)用反應緩沖液(0. IM的 醋酸鈉緩沖液，PH 4.0，用 Ampuwa 水(Fresenius_Kabi，BadHomburg，D)制備)稀釋到 18 毫 升，并在 21°C下以 3. 939xg 在 Vivaspinl5R 濃縮器(Viva Science, 5kDa MWCO, Hannover, D)中離心40分鐘。通過用反應緩沖液稀釋殘留溶液至18毫升并如所述離心35分鐘，重 復洗滌過程3次。用反應緩沖液調整蛋白質溶液的體積至1. 85毫升(計算的蛋白質濃度 為10. 8毫克/毫升)，40微升用反應緩沖液將稀釋至1毫升，并以反應緩沖液作為對照在 279nm進行測量。用18000的摩爾消光系數和OD279 (0. 382)計算蛋白質的量為18. 9毫克， 得到蛋白質回收率為95%。
50
將HES-醛100/1. 0(616毫克，如實施例1.2a所述制備，6當量)溶于蛋白質溶液 (1.85毫升，10. 8毫克/毫升，如上所述制備)中。加入氰基硼氫化鈉(3. 2毫克，Fluka， Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)，并充分混合該混合物。加入 NaCNBH3 時形成 少量微細的沉淀物。在混合過程中溶液澄清，并在21°C孵育混合物2小時。通過SDS-PAGE 分析反應混合物(見圖2)。實施例4HES-IFN- α偶聯物的SDS PAGE分析對從實施例2和實施例3獲得的反應混合物的含有10微克蛋白質的樣品(由 各反應混合物中的計算蛋白濃度確定相應的體積)進行研究。XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)和 ConsortE143 電源(CONSORTnv，Turnhout, B)用 于SDS凝膠電泳。根據生產商的說明書，使用4-12% Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPS SDS 電泳緩沖液(兩個都來自 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)。實施例5IFN- α -HES偶聯物的純化5. IHES-IFN- α 的純化在室溫下，使用人KTA explorer 10設備進行全部樣品的純化。在使用的前一 天，用IM NaOH以1毫升/分鐘的流速對含有10毫升Q-S印harose Fast Flow的柱進行處 理，再生，然后用緩沖液A(20mMTriS/HCl，pH 8. 0)平衡。在無菌條件下，用緩沖液以1 8 將樣品稀釋，并通過使用樣品泵以1. 5毫升/分鐘的流速應用。在用25毫升的緩沖液A洗 滌樣品泵后，進一步以1. 5毫升/分鐘的流速用30毫升緩沖液A清洗柱子。通過以1. 2毫 升/分鐘的流速使用0% -100%的線性梯度的超過60毫升的緩沖液B (在20mM的Tris/ HCl中0.3M NaCl,pH 8.0)和用20毫升緩沖液B進行等強度運行來進行洗脫。通過以1. 2 毫升/分鐘的流速使用30毫升的緩沖液C(在20mM的Tris/HCl中為1. 5MNaCl，pH 8. 0)、 接著是10毫升緩沖液B對柱進行再生。通過使用50毫升緩沖液A和1. 5毫升/分鐘的流 速為下次運行進行再平衡。5. 2材料與方法設備AiCTA explorer 10 (Amer sham Pharmacia Biotech)，具有M P-903混合器M-925，帶有0. 6毫升的室監測器UV-900，帶有10毫米流動池監測器pH/C-900泵P-95O (樣品泵)軟件Unicorn 版本 3. 21ft =Amersham Biosciences XK 16/20柱材料Q_S印haroseFast Flow，編號 17-0510-01，批號 307552柱體積10毫升5. 2. 1 方法緩沖液A :20mM Tris/HCl, pH 8. 0緩沖液B 在 20mM Tris/HCl 中的 0. 3M NaCl，pH 8. 0緩沖液C 在 20mM Tris/HCl 中的 1. 5M NaCl，pH 8. 0體積 步驟緩沖液流速
25毫；升平衡100%緩沖液A1. 5毫升/分鐘
加載樣品2-3毫升/分鐘
25毫；升洗滌樣品泵100%緩沖液A3. 0毫升/分鐘
30毫；升洗出未結合的樣品100%緩沖液A1. 5毫升/分鐘
開始分級分離
60毫；升洗脫，線性梯度0-100%緩沖液B1. 2 I 升/分鐘
20毫；升洗脫，等強度100%緩沖液B1. 2 I 升/分鐘
30毫；升再生100%緩沖液C1. 2毫升/分鐘
10毫；升再生100%緩沖液B1. 2毫升/分鐘
停止分級分離
50毫；升再平衡100%緩沖液A1. 5毫升/分鐘
檢測:280nm，260nm，220nm
電導率
分級分離:1，5毫升級分
5. 2. 2方法
緩沖液A:10mM Tris/HCl, pH 8.0
緩沖液B在 20mM Tris/HCl 中的 0. 3M NaCl，pH 8.0
緩沖液C在 20mM Tris/HCl 中的 1. 5M NaCl，pH 8.0
體積步驟緩沖液流速
25毫；升平衡100%緩沖液A1. 5 I 升/分鐘
加載樣品2. 0毫升/分鐘
15毫；升洗滌樣品泵100%緩沖液A3. 0 I 升/分鐘
30毫；升洗出未結合的樣品100%緩沖液A1. 5 I 升/分鐘
開始分級分離
60毫；升洗脫，線性梯度0-100%緩沖液B1. 2毫升/分鐘
20毫；升洗脫，等強度100%緩沖液B1. 2毫升/分鐘
30毫；升再生100%緩沖液C1. 2 I 升/分鐘
10毫；升再生100%緩沖液B1. 2 I 升/分鐘
停止分級分離
50毫；升再平衡100%緩沖液A1. 5 I 升/分鐘
檢測:280nm，260nm，220nm
電導率
分級分離:1，5毫升級分
5. 3結果
5. 3. 1實施例2. 1的樣品
根據方法5. 2. 1純化
開始體積10毫升，用緩沖液A以1 8稀釋=80毫升
級分80/1.5毫升
運行號QS172 Q04
由于樣品組合物中的高賴氨酸含量，蛋白質偶聯物的主要部分不能結合到柱上。 因此，進行進一步的純化步驟。5. 3. 2實施例2. 1的樣品樣品組合物來自實施例5. 3. 1的220毫升流量。根據5. 2. 1的方法進行純化開始體積220毫升，用緩沖液A以1 2稀釋=440毫升流速3，5毫升/分種(加載樣品)級分80/1.5 毫升運行號QS172Q045. 3. 3實施例2. 2的樣品根據5. 2. 1的方法進行純化開始體積10毫升，用緩沖液A以1 8稀釋=80毫升級分80/1.5毫升運行號QS173Q05由于樣品組合物中的高賴氨酸和甲硫氨酸濃度，蛋白質偶聯物的主要部分不能結 合到柱上。因此，進行進一步的純化步驟。5. 3. 4實施例2. 2的樣品樣品組合物來自實施例5. 3. 3的220毫升流量。根據5. 2. 1的方法進行純化開始體積220毫升，用緩沖液A以1 2稀釋=440毫升流速3，5毫升/分種(加載樣品)級分80/1.5毫升運行號QS177Q055. 3. 5實施例2. 3的樣品根據5. 2. 1的方法進行純化開始體積6. 5毫升，用緩沖液A以1 3稀釋=20毫升運行號QS176Q085. 3. 6實施例2. 4的樣品根據5. 2. 1的方法進行純化開始體積0. 8毫升，用緩沖液A以1 25稀釋=20毫升級分80/1.5 毫升運行號QS175Q095. 3. 7實施例3. 1的樣品根據5. 2. 2的方法進行純化開始體積4. 6毫升，用緩沖液AWl 17稀釋=80毫升，用48微升12. 5%的氨 溶液調整PH值至8-8，5級分80/1.5 毫升運行號QS183R835. 3. 8實施例3. 2的樣品根據5. 2. 2的方法進行純化開始體積2. 3毫升，用緩沖液AWl 17稀釋=40毫升，用48微升12. 5%的氨溶液調整PH值至8-8，5級分80/1.5 毫升運行號QS184R845. 3. 9實施例3. 3的樣品根據5. 2. 2的方法進行純化開始體積2. 5毫升，用緩沖液AWl 17稀釋=43毫升，用48微升12. 5%的氨 溶液調整PH值至8-8，5級分80/1.5 毫升運行號QS177R855. 4結果比較測定實施例5. 3 的合并級分Q48-24、Q58-23、Q89-24、Q97-16、R839-20、R849-20、 R859-20的蛋白質濃度。在280nm和221nm處，用RP-HPLC測定蛋白質濃度。用標定函數 以外標IFN-α進行定量。使用消光系數ε = 0. 9054ml mfcnT1進行光度測定的濃度的計
笪弁。由于使用標準品α -干擾素CRS-IFN-α _2b，其具有1. 724毫克/毫升的蛋白濃 度。為了校準，使用10微克、20微克和40微克的濃度。由校準標準的兩次注射的平均面積 計算校準值。為了計算樣品的蛋白質濃度，進行兩次注射，并計算平均面積。 對于所有進一步的研究，蛋白質濃度指HPLC(221nm)的值。實施例6 干擾素α抗病毒活性生物測試的描述測試程序的描述干擾素α的抗病毒活性
經過在細胞培養基中預稀釋測試物后，制備系列的2倍稀釋液。在96孔微量滴定 板中，向新胰蛋白酶化的MDBK細胞(40. 000每孔細胞)中加入稀釋的干擾素，每個稀釋度 重復四次。在37°C下孵育測試24小時(每孔總體積175微升)。隨后，向各孔(除了陽性對照孔外)中加入50微升稀釋的VSV原液，導致0. 1的
感染復數。在各個測試中包括以下對照接受病毒加細胞培養基(而不是干擾素)的12個孔 (ja^iMj，和接受細胞培養基(而不是干擾素)和病毒的12個孔(陽件對照)。在37°C下孵育這些測試42小時。孵育期結束時，用50微升的MTT溶液(在細胞培養基中，至少2毫克/毫升)代 替各孔的細胞培養上清液。孵育細胞3小時。通過向各孔加入100微升異丙醇/鹽酸(具 有40mM HCl的異丙醇)溶液溶解由增殖細胞形成的紫色甲播(formazan)染料。隨后，在 微滴定板讀板器中在570/630nm下測量溶液的吸光度值。對于干擾素的各稀釋度，在干擾素和VSV存在下生長的MDBK細胞的增殖活性如下 計算
((4個干擾素處理孔的平均吸光度W陰性對照的平均吸光度T)* 100
(陽性對照的平均吸光度)-(陰性對照平均吸光度)對于各個測試物，在4個獨立的測試中確定干擾素α的抗病毒活性。實施例6. 1 Intron A相對于NIH標準品的抗病毒活性在所有實驗中，相對于NIH 標準品的 rhIFN-α 2a(NIAID，NIH, Bethesda, USA, GxaO 1-901-535)校準的 Intron A(干擾素-α 2b，Schering-Plough)用作內部實驗室基 準。NIH標準品具有9000IU/毫升的比活性。在測試中，內部實驗室基準Intron A具有 8, 487, OOOIU/毫升的比活性。Intron A與NIH標準品rhIFN- α 2a相比的增殖活性如圖3所示。實施例6. 2 干擾素-α -HES偶聯物相對于Intron A的抗病毒活性在實施例6所述的分析系統中，相比于未修飾的IFN-α起始原料、Intron A和 Pegasys (Roche)對偶聯物(Q4、Q5、Q8、Q9、R83、R84、R85)進行測試。計算該材料的 CPE50 濃度。所有IFN-α -HES偶聯物保留了抗病毒活性，其明顯高于Pegasys。相比于未修飾的IFN- α起始原料和Intron A，IFN- α -HES偶聯物的相對體外活 性如圖4所示。實施例7 IFN- α -HES偶聯物的體內生物活性(小鼠的PK研究)實施例7. 1 小鼠血清對分析系統的影響在細胞培養基(對照)和小鼠血清(1 40稀釋和1 80稀釋)中制備干擾 素-α的稀釋液。如實施例6所述進行測試。對于對照、1 40稀釋的小鼠血清以及1 80稀釋的小鼠血清，在兩個獨立的測 試中測定干擾素-α的抗病毒活性。結果表明1 40和1 80稀釋的小鼠血清不影響 對于干擾素-α的抗病毒活性的生物測定。實施例7. 2 小鼠體內研究
在抗病毒測試中測定合并的血清的抗病毒活性。每次，從2只小鼠(雌性BALB/ c小鼠，8周鼠齡)收集血清，在靜脈注射30微克/千克(基于蛋白質含量)的IFN-α或 IFN- α -HES偶聯物2小時、4小時、12小時和24小時后處死小鼠。解凍血清樣品，并通過渦旋(和稀釋)完全均一化。在細胞培養基中制備系列的 2倍稀釋液。解凍小瓶的(稀釋的)Intron Α，并通過渦旋完全均一化。在細胞培養基中制 備系列的2倍稀釋液。如實施例6所述，由1 2稀釋系列的劑量響應曲線確定CPE-分析 的EC50-稀釋度。與未修飾的起始原料和Pegasys相比，確定該材料的半衰期。由EC50-稀釋相對于 注射后時間的半對數作圖計算半衰期。對于HES-IFN- α :Q4、Q5、Q8、Q9、R83、R84、R85檢測 長達24小時的抗病毒活性。如從圖5中看出，半衰期介于6至8.7小時之間。對于未修飾 的干擾素-α，血清的抗病毒活性過低而不能計算血清半衰期。在K. R. Reddy等人Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 571-586中，測定了大鼠中IFN-α的血清半衰期(靜脈 注射)為2小時。實施例8 =HES-G-CSF偶聯物的合成對于偶合反應(反應條件見下表)，在醋酸鹽緩沖液(10mM，pH4_5)中配制的 rh-metG-CSF的溶液(例如，Neupogen⑧或生物等效制劑)填充到配備有磁力攪拌棒的50 毫升Falcon管中。各醛基-HES (al_HES)衍生物(類似于實施例1制備)溶于反應緩沖液 (0. IM的醋酸鈉，pH 5.0)中，并在攪拌(-200rpm)下慢慢逐滴加到蛋白質中以產生30 1 的HES衍生物/G-CSF比例。持續攪拌直到樣品看起來均一化。通過在攪拌器攪拌下加入 25倍濃縮的NaCNBt3溶液(0. 5M ；終濃度為20mM)再次開始反應。在設置為10°C的冰箱中 不進行進一步攪拌孵育Falcon管過夜(16小時)。制備HES-G-CSF偶聯物的偶合條件 通過SDS-PAGE分析(參照圖6)顯示Gh
實施例9 =HES-EPO偶聯物的合成緩沖液交換在20°C下，在Vivaspin15R濃縮器(Viva Science, IOkDa MWCO，Hannover，D)中， 以3. 939xg離心EPO溶液(17. 5毫升，35毫克，2毫克/毫升，例如，Epocrit 或生物等效 制劑)30分鐘。通過用反應緩沖液(0. IM的醋酸鈉，pH 5. 0)稀釋殘留溶液至18毫升并如 所述離心35分鐘，重復洗滌過程2次。偶聯作用將醛基-HES 60/1. 3(類似于實施例1制備，2. 893克，40當量)溶于蛋白質溶液 和反應緩沖液至最終體積為6.0毫升。用移液管充分混合該混合物，并在0°C孵育。加入 氰基硼氫化鈉溶液(430微升，在0°C預冷卻的反應緩沖液中300mM，Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)，在用移液管混合并離心后得到5. 4毫克/毫升的最終計算 蛋白質濃度和45% [w/v]的最終HES濃度。在冰上孵育反應混合物19小時。通過SDS凝 膠電泳分析反應混合物的樣品(10微克)。XCellSure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)和 Consort E143 電源(CONSORTnv，Turnhout, B)用于 SDS 凝膠電泳。根據 生產商的說明書使用4-12% Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPS SDS電泳緩沖液(兩個都
來自nvitrogen GmbH, Karlsruhe, D)。
WO 03/049699A2US 5, 990, 237Kle讓 D.等人，Comprehensive Cellulose Chemistry 第 2 卷，1998，Wiley-VCH， ffeinheim, New York，特別是 4. 4 章，Esterif ication ofCellulose (ISBN 3-527-29489-9)WO 00/66633AWO 00/18893AUS 4，454，161EP 0 418 945AJP 2001294601AUS 2002/065410AK. R. Reddy 等人 Advaced Drug Delivery Reviews 54(2002)第 571-586 頁
59
權利要求
一種制備羥烷基淀粉(HAS)衍生物的方法，包括a)將任選氧化的羥烷基淀粉與包含至少兩個官能團 O NH2的化合物(D)或其鹽反應，和b)將步驟a)獲得的羥烷基淀粉衍生物與包含至少兩個獨立地選自醛基、適當保護的醛基、酮基和適當保護的酮基的官能團W1和W2的化合物(L)反應。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述羥烷基淀粉具有式(I)的結構 其中，HAS'是羥烷基淀粉分子的其余部分，且禮、R2和R3獨立地為氫或直鏈或分支羥燒基基團。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，禮、1 2和1 3獨立地為(CH2CH20)n-H基團，其中，n 是整數，優選是0、1、2、3、4、5或6。
4.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述羥烷基淀粉是羥乙基淀粉。
5.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述羥烷基淀粉在步驟a)中與化合物 (D)或其鹽反應之前不氧化。
6.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，化合物(L)包含至少兩個官能團巧和 w2，其獨立地選自醛基、半縮醛基、-ch(oh)2、縮醛基、酮基和縮酮基，優選選自半縮醛基、-CH (OH) 2、縮醛基、縮酮基和-c (0) -R基團，其中R選自氫、飽和或 不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基， 其中，在-C (0) -R基團是酮基的情況下，殘基R優選選自(「(；烷基和C6-C14芳基，甚至更優 選選自任選取代的，優選非取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基。
7.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，在步驟a)的反應之前未氧化的所述羥 烷基淀粉在羥烷基淀粉的還原末端與化合物(D)或其鹽反應。
8.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，化合物(D)或其鹽在步驟a)中通過所 述至少兩個官能團-O-NH2中的至少一個與羥烷基淀粉的醛基和/或半縮醛基反應。
9.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，化合物(D)或其鹽通過所述至少兩個 官能團-O-nh2中的至少一個與羥烷基淀粉的還原末端反應，且其中，所述羥烷基淀粉在步 驟a)的反應之前未氧化。
10.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述步驟a)進一步包括在步驟b)之 前對獲得的羥烷基淀粉衍生物進行還原。
11.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，化合物(L)通過所述至少兩個官能 團Wi和W2中的至少一個與步驟a)獲得的羥烷基淀粉衍生物或其鹽的至少一個官能團 h2n-O-反應。
12.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述用于步驟a)中的化合物(D)具有 式(II)的結構 或其鹽，其中，R4選自飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取代或未取 代的亞烷基，亞烷基鏈中可能含有雜原子、取代或未取代的亞芳基、取代或未取代的亞芳烷 基、取代或未取代的亞烷芳基、及取代或未取代的亞雜芳基、取代或未取代的亞雜芳烷基和 取代或未取代的亞烷雜芳基。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，R4選自亞烷基丄6-(14亞芳基和_[(CR5R6) m0]n[CR7R8]。-，其中，R5、R6、R7和R8彼此獨立地選自氫、烷基和芳基，m是2至4 ;n為0至20， 和o是2至20，其中，在n為0的情況下，o是不是0。
14.根據權利要求13所述的方法，其中，化合物(D)中的R4是-[(CR5R6)m0]n[CR7R8]。-， 其中，R5、R6、R7和R8彼此獨立地選自氫、Q-C；烷基和C6-C14芳基，m是2，n是1和o是2。
15.根據權利要求14所述的方法，其中，用于步驟a)中的化合物(D)是或其鹽。
16.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，用于步驟b)中的化合物(L)是雙官能 交聯化合物。
17.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，用于步驟b)中的化合物(L)具有式 (III)的結構m an)，其中，&選自化學鍵，優選單鍵、飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取 代或未取代的亞烷基，亞烷基鏈中可能含有雜原子、取代或未取代的亞芳基及取代或未取 代的亞雜芳基、取代或未取代的亞芳烷基、取代或未取代的亞烷芳基和取代或未取代的亞 雜芳基、取代或未取代的亞雜芳烷基和取代或未取代的亞烷雜芳基。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，&是取代或未取代的亞芳基或取代或未取代 的亞烷基，特別地其中，&是未取代的C6-C14亞芳基或_(CH2)n_，n優選為1-6，優選是亞苯 基。
19.根據權利要求18所述的方法，其中，所述R9是未取代的C6-C14亞芳基。
20.根據權利要求19所述的方法，其中，所述用于步驟b)中的化合物(L)是
21.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，步驟b)進一步包括對獲得的羥烷基 淀粉衍生物進行還原。
22.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，步驟b)中獲得的羥烷基淀粉衍生物c)與至少一種生物活性劑反應。
23.根據權利要求22所述的方法，其中，所述用于步驟c)中的所述至少一種生物活性 劑包含至少一個官能團-NH2。
24.根據權利要求22或23所述的方法，其中，所述用于步驟c)中的所述至少一種生物 活性劑選自肽、多肽、蛋白質及多肽或蛋白質的功能衍生物、片段或模擬物。
25.根據權利要求24所述的方法，其中，所述多肽選自促紅細胞生成素(EP0)如重組人 EPO(rhEPO)或EP0模擬物、集落刺激因子(CSF)如G-CSF，如重組人G-CSF(rhG-CSF)、a -干 擾素(IFN- a )、日-干擾素(IFN- 3 )或Y -干擾素(IFN- y )如IFN- a和IFN- 3，如重組 人 IFN-a 或 IFN-0 (rhIFN-a 或 rhIFN-0 )、白介素例如 IL-1 至 IL-18，如 IL-2 或 IL-3， 如重組人IL-2或IL-3(rhIL-2或rhIL-3)、血清蛋白如凝血因子II-XIII，如因子VIII、因 子VII、因子IX、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子X、因子XI、因子XII、因 子XIII、a 1-抗胰蛋白酶(A1AT)、活化蛋白C(APC)、纖溶酶原激活物如組織型纖溶酶原激 活物(tPA)，如人類組織纖溶酶原激活物(hTPA)、AT III如重組人AT III(rhAT III)、肌 紅蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、生長因子如表皮生長因子(EGF)、血小板生長因子 (PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、腦源性生長因子(BDGF)、神經生長因子(NGF)、B細胞 生長(BCGF)、腦源性的神經營養生長因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、轉化生長因 子如TGF-a或TGF-0、BMP (骨形態發生蛋白)、生長激素如人生長激素、腫瘤壞死因子如 TNF-a或TNF-0、生長抑素、促生長素、生長調節素、血紅蛋白、激素或激素原如胰島素、促 性腺激素、黑色素細胞刺激素(a-MSH)、曲普瑞林、下丘腦激素如抗利尿激素(ADH)和催產 素以及釋放激素和釋放抑制激素、甲狀旁腺激素、甲狀腺激素如甲狀腺素、促甲狀腺激素、 促甲狀腺素釋放素、降鈣素、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽(GLP-1、GLP-2等)、exendines 如Exendin-4、瘦素、加壓素、胃泌素、胰泌素、整聯蛋白、糖蛋白激素(如LH、FSH等)、 melanoside-刺激激素、脂蛋白和載脂蛋白如ap0-B、ap0-E、ap0-La、免疫球蛋白如IgG、IgE、 IgM、IgA、IgD及其片段、水蛭素、組織途徑抑制劑、植物蛋白如植物凝集素或蓖麻毒蛋白、蜂 毒、蛇毒、免疫毒素、抗原E、a -蛋白酶抑制劑、豚草過敏原、黑色素、寡賴氨酸蛋白質、RGD 蛋白質或任選這些蛋白質之一的相應的受體；催乳素或其突變體，如G129R，其中129位的 野生型氨基酸甘氨酸被精氨酸取代，及這些蛋白質或受體的功能衍生物或片段。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，所述多肽選自促紅細胞生成素(EP0)如重組人 EPO(rhEPO)、集落刺激因子(CSF)如重組人 G-CSF (rhG-CSF)、a -干擾素(IFN- a )、0 -干 擾素(IFN- 3 )、y -干擾素(IFN- y )如重組人 IFN- a 或 IFN- 3 (rhIFN- a 或 rhIFN- 3 )、 A1AT和因子IX。
27.根據權利要求26所述的方法，其中，所述多肽是IFN-a。
28.根據權利要求26所述的方法，其中，所述多肽是G-CSF。
29.根據權利要求26所述的方法，其中，所述多肽是EP0。
30.根據權利要求22至29中的任一項所述的方法，其中，步驟b)中獲得的所述羥烷基 淀粉衍生物在步驟c)中通過在步驟b)中由化合物(L)引入羥烷基淀粉衍生物中的官能團 Wi和W2中的至少一個與至少一種生物活性劑反應。
31.根據權利要求30所述的方法，其中，步驟b)中獲得的所述羥烷基淀粉衍生物在步驟c)中通過生物活性劑的至少一個官能團-NH2與在步驟b)通過化合物(L)引入羥烷基 淀粉衍生物中的官能團Wi和W2中的至少一個反應。
32.根據權利要求23至31中的任一項所述的方法，其中，用于步驟c)中的至少一種生 物活性劑所包含的至少一個官能團_NH2是多肽或蛋白質的N-末端官能團_NH2。
33.根據權利要求23至32中的任一項所述的方法，其中，步驟c)在還原胺化反應條件 下進行。
34.根據權利要求23至33中的任一項所述的方法，其中，步驟c)利用還原劑進行，優 選硼烷，特別是NaCNBH3。
35.根據前述權利要求22至34中的任一項所述的方法，其中基于步驟b)獲得的羥烷 基淀粉衍生物的重均分子量(Mw)，在步驟c)中，步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物與生物活 性劑的摩爾比為大約1 1到大約100 1當量。
36.根據權利要求35所述的方法，其中，所述比例為大約1 1至大約20 1。
37.根據權利要求33至36中的任一項所述的方法，其中，用于步驟c)中的步驟b)獲 得的羥烷基淀粉衍生物的濃度高于大約10% m/v。
38.根據權利要求22至37中的任一項所述的方法，其中，步驟c)中的溫度為大約0°C 至大約25°C。
39.根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中，在步驟a)中，未氧化的羥烷基淀 粉在羥烷基淀粉的還原末端通過一個官能團-0-NH2與化合物(D) 反應，且在步驟b)中，步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生物通過官能團-0-NH2與化合物(L) 的一個官能團-CH = 0反應。
40.根據權利要求39所述的方法，其中，在步驟c)中，步驟b)獲得的羥烷基淀粉衍生 物與IFN- a在還原胺化條件下，特別是在NaCNBH3存在的條件下反應。
41.能夠通過權利要求1至40中的任一項所述的方法獲得的羥烷基淀粉衍生物。
42.以下結構的HAS衍生物，優選HES衍生物 OR.和/或相應的環結構 OR, 其中，更優選，HES具有大約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大 約1至大約500kDa、更優選大約2至大約400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大 約10至大約200kDa、特別是大約50至大約150kDa的平均分子量，和0. 1至3、優選0. 4至 1. 3 如 0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2 或 1. 3 的摩爾取代度，和優選 2 至 20、更優 選2到15和甚至更優選3至12的C2 C6取代比；其中，HAS'是羥烷基淀粉分子的其余部分，且Ri、R2和R3獨立地為氫、直鏈或分支羥烷 基或-[(CRY) ffl0] n [CR3R4]。-OH 基團，其中，R1、R2、R3和R4獨立地選自氫和烷基，優選氫和甲基， m是2至4，其中，在m個CR1! 2基團中殘基R1和R2可以相同或不同； n為0至20，優選0至4;o是2至20，優選2至4，其中，o個CR3R4基團中的殘基R3和R4可以相同或不同； 其中，R4選自飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取代或未取代的亞烷 基，亞烷基鏈中可能含有雜原子、取代或未取代的亞芳基、取代或未取代的亞芳烷基、取代 或未取代的亞烷芳基及取代或未取代的亞雜芳基、取代或未取代的亞雜芳烷基和取代或未 取代的亞烷雜芳基；其中，&選自化學鍵，優選單鍵、飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取 代或未取代的亞烷基，亞烷基鏈中可能含有雜原子、取代或未取代的亞芳基及取代或未取 代的亞雜芳基、取代或未取代的亞芳烷基、取代或未取代的亞烷芳基、和取代或未取代的亞 雜芳基、取代或未取代的亞雜芳烷基和取代或未取代的亞烷雜芳基；并且其中％選自醛基、適當保護的醛基、酮基和適當保護的酮基，優選選自醛基、半 縮醛基、_CH(0H)2、縮醛基、酮基和縮酮基，優選選自半縮醛基、-CH(0H)2、縮醛基、縮酮基 和-C(0)-R基團，其中R選自氫、飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取代或 未取代的烷基和取代或未取代的芳基，其中在基團-C (0)-R是酮基的情況下，殘基R優選選 自Ci-Q烷基和C6-C14芳基，甚至更優選選自任選取代的，優選非取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基。
43.以下結構的HAS衍生物，優選HES衍生物 和/或相應的環結構 其中，更優選，HES具有大約1至大約lOOOkDa、更優選大約1至大約800kDa、更優選大 約1至大約500kDa、更優選大約2至大約400kDa、更優選大約5至大約300kDa、更優選大約 10至大約200kDa、特別是大約50至大約150kDa的平均分子量，0. 1至3、優選0. 4至1. 3 如0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩爾取代度，和優選2至20、更優選2 到15和甚至更優選3至12的C2 C6取代比；其中，HAS'是羥烷基淀粉分子的其余部分，且Ri、R2和R3獨立地為氫、直鏈或分支羥烷 基或-[(CRf) ffl0] n [CR3R4]。-OH 基團，其中，R1、R2、R3和R4獨立地選自氫和烷基，優選氫和甲基， m是2至4，其中，m個CR1! 2基團中的殘基R1和R2可以相同或不同； n為0至20，優選0至4;o是2至20，優選2至4，其中，o個CR3R4基團中的殘基R3和R4可以相同或不同； 其中，R4選自飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取代或未取代的亞烷 基，亞烷基鏈中可能含有雜原子、取代或未取代的亞芳基、取代或未取代的亞芳烷基、取代 或未取代的亞烷芳基及取代或未取代的亞雜芳基、取代或未取代的亞雜芳烷基和取代或未 取代的亞烷雜芳基；其中，&選自化學鍵，優選單鍵、飽和或不飽和的、環狀或線性的、分支或不分支的、取 代或未取代的亞烷基，亞烷基鏈中可能含有雜原子、取代或未取代的亞芳基及取代或未取 代的亞雜芳基、取代或未取代的亞芳烷基、取代或未取代的亞烷芳基及取代或未取代的亞 雜芳基、取代或未取代的亞雜芳烷基和取代或未取代的亞烷雜芳基；并且其中，BA是生物活性劑，BA包含至少一個官能團_NH2，BA表示為H2N-BA'，其中， BA'是BA的其余部分，BA優選選自促紅細胞生成素(EP0)如重組人EP0(rhEPO)、集落刺激 因子(CSF)如重組人G-CSF (rhG-CSF)、a -干擾素(IFN- a )、旦-干擾素(IFN- 3 )、Y -干 擾素(IFN-y)如重組人 IFN-a 或 IFN-3 (rhIFN-a 或 rhIFN-3 )、A1AT 和因子 IX， 尤其優選為
44.包含治療有效量的能夠通過權利要求22至40中的任一項所述的方法獲得的羥烷 基淀粉衍生物或權利要求43所述的羥烷基淀粉衍生物的藥物組合物。
45.根據權利要求44所述的藥物組合物，其中，所述羥烷基淀粉衍生物能夠通過權利 要求27所述的方法獲得。
46.能夠通過權利要求22至40中的任一項所述的方法獲得的羥烷基淀粉衍生物或權 利要求43所述的羥烷基淀粉衍生物作為治療劑或預防劑。
47.能夠通過權利要求27所述的方法獲得的羥烷基淀粉衍生物用于制備治療選自癌 癥如毛細胞白血病、惡性黑色素瘤、濾泡性淋巴瘤和/或AIDS相關卡波濟氏肉瘤、尖銳濕 疣、慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎，優選慢性乙型肝炎和丙型肝炎的疾病的藥物的用途。
48.能夠通過權利要求28所述的方法獲得的羥烷基淀粉衍生物用于制備治療選自癌 癥患者如接受骨髓抑制性化療的癌癥患者、接受誘導或鞏固化療的急性髓性白血病患者和 /或接受骨髓骨移植的癌癥患者、經受外周血祖細胞收集和治療的患者和患有嚴重慢性中 性粒細胞減少癥的患者的患者中的疾病的藥物的用途。
49.能夠通過權利要求29所述的方法獲得的羥烷基淀粉衍生物用于制備用于治療貧 血如慢性腎衰竭患者、齊多夫定治療的HIV感染患者、化療的癌癥患者的貧血、或用于減少 手術患者中的異體輸血的藥物的用途。
50.通過施用治療有效量的能夠根據權利要求27至29中的任一項所述的方法獲得的 羥烷基淀粉治療選自癌癥患者如接受骨髓抑制性化療的癌癥患者、接受誘導或鞏固化療的 急性髓性白血病患者和/或接受骨髓骨移植的癌癥患者、經受外周血祖細胞收集和治療的 患者和患有嚴重慢性中性粒細胞減少癥的患者的患者中的疾病，用于治療貧血，如慢性腎 衰竭患者、齊多夫定治療的HIV感染患者、化療的癌癥患者的貧血或用于減少手術患者中 的異體輸血的方法。
全文摘要
一種制備羥烷基淀粉(HAS)衍生物的方法，包括a)將任選氧化的羥烷基淀粉與包含至少兩個官能團-O-NH2的化合物(D)或其鹽反應，和b)將步驟a)獲得的羥烷基淀粉衍生物與包含至少兩個獨立地選自醛基、適當保護的醛基、酮基和適當保護的酮基的官能團W1和W2的化合物(L)反應。
文檔編號C08B31/12GK101918454SQ200880124245
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月15日 優先權日2007年12月14日
發明者A·米奇, F·哈克特, F·豪席爾德, H·克內勒, M·席梅爾, N·燦德爾, W·艾希納 申請人:弗雷澤紐斯卡比德國有限公司