纖維生物質的并行糖化和發酵的制作方法

專利名稱：纖維生物質的并行糖化和發酵的制作方法
技術領域：
本發明涉及將纖維生物質分級為組成部分的系統和方法。更具體地說，本發明涉
及在一個容器中從木質纖維素材料同時產生和發酵碳水化合物
背景技術：
植物產生的天然的纖維生物質通常含有各種己糖碳水化合物，如葡萄糖、半乳糖 和甘露糖，它們容易被產乙醇酵母發酵為乙醇。葡萄糖是纖維素的唯一部分，但也是半纖維 素，特別是在軟木中半纖維素的重要組分。半乳糖和甘露糖是存在于半纖維素中的其它的 主要己糖碳水化合物。當用于乙醇工業生產的酵母和包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖的原料 一起存在時，它們首先發酵葡萄糖，并且當基質中的它們被消耗后，酵母細胞接著適應攝取 和發酵甘露糖，當甘露糖耗竭后，酵母細胞將又適于代謝半乳糖，半乳糖是來源于半纖維素 的三種主要碳水化合物中最難發酵的。這種類型的適應代謝行為被稱為二階段生長或代謝 (對于兩種碳水化合物)和三階段生長或代謝(對于三種碳水化合物)。在碳水化合物利用 的各階段之間，通常會有幾個小時的時間不發生代謝，在此期間在酵母的細胞膜中誘導所 需要的轉運蛋白。這種誘導現象通常顯著地延長完全消耗來自半纖維素的可發酵碳水化合 物的混合物的時間。在設計為用于從木質纖維素材料如被子植物纖維、裸子植物纖維和大 田作物纖維產生的混合的己糖碳水化合物原料流中生產乙醇的工業工藝中，在二階段生長 和三階段生長代謝過程中由酶調節引起的發酵延遲顯著增加了與這些工藝有關的資金和 運轉費用。因此，通常利用菌株篩選策略，基于在實驗室規模系統中菌株將液體己糖流轉化 為乙醇或其它代謝產物的效率，來鑒定和篩選有望適于工業發酵工藝的酵母菌株。將液體 己糖流發酵為乙醇的適宜示例性酵母菌株包括連續代謝葡萄糖_甘露糖_半乳糖的釀酒酵 母Tl和連續代謝半乳糖_葡萄糖_甘露糖的釀酒酵母Y-1528 (Keating等人，2004， J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:235-244)。 工業規模加工纖維性木質纖維素材料的初始階段一般包括物理化學破裂纖維，然 后使用溶劑、稀釋的酸或堿化學提取破裂的材料。溶劑提取過程通常實現木質素從纖維 的低聚糖和多糖部分中的分離，導致木質素和至少一些單糖、低聚糖和多糖釋放進入到提 取溶劑中。回收溶劑后，廢提取水溶液接著可以用作原料流產生乙醇。然而，提取廢液通 常也含有大量的木質纖維素衍生的有機化合物，如酮類、醛類、羧酸類和其它的顯著損害 或抑制微生物發酵代謝過程的此類化合物。這樣的抑制劑的例子有糠醛、5-羥基甲基糠 醛、乙酸等。因此，鑒定商業上使用的發酵微生物的選擇標準也包括評價它們在長時間暴 露于抑制劑的過程中的耐受性和代謝性能。Keating等人，2006， Biotechnol. Bioeng. 93 : 1196-1206已經表明，盡管當包含在液體己糖流的選擇的抑制劑水平升高時，釀酒酵母菌株 Tl和Y-1528的發酵速率下降，但實驗室規模間歇發酵的總乙醇產量不受影響。

發明內容
本發明的示例性實施方案包括設計成用于同時并存的下游糖化和發酵在上游提取纖維性木質纖維素原料過程中釋放的結構組分的工業過程、系統和方法。適于本文提供、 描述和期望的本發明的工業規模并行的糖化和發酵過程、系統和方法的示例性纖維性木質 纖維素結構組分，包括纖維素、半纖維素、多糖和低聚糖。 根據本發明的一個示例性實施方案，提供了用于同時并存的糖化和發酵有機溶劑 提取纖維性木質纖維素原料過程中釋放的結構組分的工藝。示例性的工藝一般包括步驟 用有機溶劑加工選擇的木質纖維素原料產生混合的固體部分和液體部分，分離固體部分和 液體部分，混合分離的固體部分和選擇的液體單糖和/或低聚糖或混合的單糖/低聚糖流 以降低分離的固體部分的粘度，隨后將粘度降低的固體部分與有效量的包含用于發酵戊糖 和/己糖碳水化合物的合適微生物培養物的接種物混合，另外，向其中加入有效量的用于 糖化多糖和低聚糖的合適酶，然后提供合適的反應條件糖化固體部分和發酵單糖和/或低 聚糖合適的時間(如果微生物具有發酵低聚糖的能力)。 適宜的固體部分可以從以下示例性的纖維性木質纖維素原料產生被子植物生物 質、裸子植物生物質、大田作物生物質、植物漿和/或果實漿、木材和木材加工碎片和廢料、 可回收再用的紙和硬紙板貨物等。 用于降低從提取的木質纖維素原料分離的固體部分粘度的適宜液流的示例為從 提取的木質纖維素原料分離的去木質素液體部分。其它適宜的液流示例為包括水、短鏈醇、 酸、堿等的含碳水化合物的溶液。所述液流還可以添加有一種或多種選擇的單糖碳水化合 物，諸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等。 發酵戊糖和/或己糖碳水化合物的適宜微生物接種物包括選自于酵母菌種、真菌 菌種、細菌菌種、原生動物(protozoae)或其它種類的一種或多種適宜菌株。適宜酵母的示 例為酵母屬(Saccharomyces spp)和畢赤酵母屬(Pichia spp)。適宜的酵母屬的示例為釀 酒酵母，諸如菌株Y-1528， Tembec-l等。適宜的真菌菌種的示例為曲霉屬和木霉屬。適宜 細菌的示例為天然的和遺傳改造的大腸桿菌、發酵單胞菌屬、梭菌屬和棒狀桿菌屬等。提供 包括以下菌的接種物也在本發明的范圍內，該接種物包含單個菌株，或可選地，包括來自單 個類型微生物的多個菌株，或者還可選地，包括來自多個菌種和微生物類型的菌株(即，酵 母、真菌和細菌)的混合物。 適宜酶的示例為纖維素酶、半纖維素酶、13 -葡萄糖苷酶、|3 -木糖苷酶、a -淀粉 酶、P-淀粉酶和其它的聚糖酶。 本發明的一個方面是回收和循環從提取的纖維性木質纖維素原料的固體部分分 離的液體部分。在木質纖維素原料加工過程中提取進入溶劑的木質素與液體部分分離。脫 毒的或非脫毒的液體部分，或可選地，部分去木質素的液體部分是降低分離的固體部分粘 度的適宜稀釋劑。在用于降低固體部分的粘度前用一種或多種單糖碳水化合物調理脫毒的
或非脫毒的液體部分是適宜的。適宜的單糖碳水化合物的示例為葡萄糖、甘露糖、半乳糖等。 根據一個方面，所述工藝是間歇工藝。
根據另一個方面，所述工藝是連續工藝。
根據再一個方面，所述工藝是半連續工藝。 根據本發明的另一個實施方案，提供了并行糖化和發酵從提取的纖維性木質纖維 素原料分離的固體部分的系統。所述系統一般包括(a)能夠分離為固體部分和液體部分
6的提取的纖維性木質纖維素原料供應，(b)多個設計為分開接收和加工其中的分離自提取 的木質纖維素原料的固體和液體部分的適宜裝置和操作系統，(c)富含選擇用于降低固體 部分粘度的可發酵碳水化合物的適宜液流供應，(d)合適的微生物培養物供應，(e)適宜的 選擇的酶，和(f)可控地將固體部分、液流、微生物培養物和酶混合成反應混合物的器件、 裝置、設備和軟件，其中所述反應混合物包括反應產物，例如木質素和乙醇。適宜的液流的 示例為這樣的液體部分，其從提取的纖維性木質纖維素原料收集，接著脫毒或不脫毒，然后 在與用于降低其粘度的固體部分混合前完全或部分除去乙醇。從反應混合物分離的乙醇可 以用作燃料或可選地在進一步純化后用作燃料組分或其它的非燃料相關的應用，如用于制 藥、食品和飼料業。 根據一個方面，所述系統可以另外設計為接收和脫毒其中的富含從提取的木質纖 維素纖維性原料分離的可發酵碳水化合物的液體部分，所述木質纖維素纖維性原料包括懸 浮的顆粒纖維素、半纖維素、多糖和低聚糖。 根據另一個方面，所述系統可以被設計為連續接收和加工從提取的木質纖維素原 料分離的分批固體部分，同時排出反應產物。 根據另一個方面，所述系統可以被設計為連續接收和降低從提取的木質纖維素原 料分離的，和進一步加工各批固體部分，同時排出反應產物。
根據本發明的另一個方面，所述系統被設計為間歇系統。 根據再一個方面，所述系統被涉及為回收和恢復用過的有機或無機溶劑，以及循 環所述的恢復的無機或有機溶劑。 根據進一步的方面，所述系統被設計為回收和再生用過的有機或無機溶劑，循環 再生的有機或無機溶劑，以在并行糖化和發酵所述固體部分前，在其中用作降低從提取的 木質素原料分離的固體部分粘度的液流。 根據本發明的再一個示例性實施方案，提供了并行糖化和發酵從提取的纖維性木 質纖維素原料分離的固體部分的方法，其包括混合分離的固體部分、其中包括碳水化合物 的適宜無機或有機溶劑、有效量的選擇用于發酵戊糖和/己糖碳水化合物的適宜的微生物 培養物和有效量的適宜酶。包括碳水化合物的適宜有機或無機溶劑的示例為，從提取的木 質纖維素原料分離并接著在與固體部分混合前脫毒或不脫毒的液體部分。用于發酵戊糖和 /己糖碳水化合物的適宜微生物培養物包括選自酵母菌、真菌和細菌種類的一種或多種適 宜菌株。適宜的酵母的實例為酵母屬和畢赤酵母屬。適宜的酵母屬的示例為釀酒酵母，諸如 菌株Y-152、Tembec-l等。適宜的真菌種類示例為曲霉屬和木霉屬。適宜的細菌的示例為 大腸桿菌、發酵單胞菌屬、梭菌屬和棒狀桿菌屬。包括天然的和遺傳改造的菌等。在本發明 范圍內的是，提供包括以下菌株的接種物單個菌株或可選地來自 一個類型微生物的多個 菌株或進一步可選地包括來自多個種或微生物類型(即，酵母、真菌和細菌)的菌株的菌株 混合物。適宜的酶的示例是纖維素酶、半纖維素酶、P-葡萄糖苷酶、P-木糖苷酶、a-淀 粉酶、P-淀粉酶和其它這樣的聚糖酶。 根據本發明的另一個示例實施方案，提供了并行糖化和發酵從提取的纖維性木 質纖維素原料分離的固體部分的方法，其包括混合以下組分分離的固體部分和適宜的液 流、有效量的被遺傳改造為發酵戊糖碳水化合物和分泌降解生物質的酶的釀酒酵母菌株 Y-1528培養物。


本發明通過結合以下附圖描述，其中 圖l是比較專有釀酒酵母菌株(Ethanol Red ;Ethanol Red是法國巴黎Lesaffre et Compagnie的注冊商標)與命名為"Y-1528"的公有領域釀酒酵母菌株當培養在包括 兩種或三種單糖的混合物溶液時，它們的己糖到乙醇的轉化效率。數據點是三個樣品的平 均值的圖。數據點上方和下方延伸的條代表在95%置信水平的士標準偏差(SD)。沒有SD 條的數據點包含那些數據點的SD范圍。 圖2是顯示了當培養在使用添加有從采伐的不列顛哥倫比亞(BritishColumbia) 白楊(歐洲白楊)全原木獲得的闊葉樹固體部分作為發酵基質的同時存在的糖化和發酵系 統中，釀酒酵母菌株Y-1528的乙醇產生速率。數據點是三個樣品的平均值。數據點上方和 下方延伸的數據條代表在95%置信水平的±標準偏差(SD)。沒有SD條的數據點包含那 些數據點的SD范圍。 圖3顯示，當培養在添加有半乳糖和甘露糖的從白楊獲得的闊葉樹固體部分作為 發酵基質同時存在的糖化和發酵系統中，釀酒酵母菌株Y-1528的乙醇產生速率。數據點是 三個樣品的平均值。數據點上方和下方延長的數據條代表在95%置信水平的±SD。沒有 SD條的數據點包含那些數據點的SD范圍。 圖4顯示，當培養在半乳糖/甘露糖基質16h后，接種到添加有從白楊獲得的闊葉 樹固體部分作為發酵基質的同時存在的糖化和發酵系統中，釀酒酵母菌株Y-1528的乙醇 產生速率。數據點是三個樣品的平均值。數據點上方和下方延長的數據條代表在95%置信 水平的±SD。沒有SD條的數據點包含那些數據點的SD范圍。 圖5顯示，比較了圖2-4中所示的三個系統中釀酒酵母菌株Y-1528的乙醇產生速 率。數據點是三個樣品的平均值。數據點上方和下方延長的數據條代表在95%置信水平的 ±SD。沒有SD條的數據點包含那些數據點的SD范圍。
具體實施例方式
本發明的示例性的實施方案關于這樣的發酵工藝和系統，其設計為并行糖化和發 酵(CSF)固體部分和任選地富含從提取的纖維性木質纖維素和用過的提取溶劑分離的碳 水化合物的脫毒液體部分。這種CSF系統通常也稱為并行糖化和發酵(SSF)工藝。本發明 的發酵工藝可以設計為間歇工藝，或可選地，連續工藝，或進一步可選地為半連續工藝或補 料分批工藝。 本發明的示例實施方案涉及用有機溶劑加工選擇的木質纖維素原料，產生通常包 括纖維素纖維(即，富含纖維素的固體部分)的固體部分和包括有機溶劑的液體部分，所述 有機溶劑中溶解有包括在木質纖維素原料的各種結構性有機和礦物組分。用于分離成固體 和液體部分的適宜木質纖維素原料混合物的示例為來自植物材料如被子植物、裸子植物和 大田作物、植物性或果實漿料、木頭和木頭加工的碎片和廢料，可循環的紙、硬紙板貨物等 以及它們的混合物的纖維生物質。選擇的木質纖維素原料與適宜的通常用于有機溶劑工藝 的溶劑混合，然后加工木質纖維素原料一段合適的時間，使得包括纖維素漿料的固體部分 與含有溶解的組分如木質素、半木質素、多糖、低聚糖及其它化合物的液體部分分離。有機溶劑工藝利用有機化學品如短鏈脂族醇(例如甲醇、乙醇)、甲酸、乙酸、乙酸乙酯、苯酚和 甲酚作為漿化溶劑，從植物生物質溶解和轉移木質素。在纖維性木質纖維素材料的溶劑去 木質素的過程中，大多數植物基的纖維的半纖維素組分部分水解和溶解到溶劑中。隨著有 機溶劑工藝逐漸完成，簡單的碳水化合物和低聚糖釋放到黑液中(黑液是溶解的木質素、 碳水化合物、碳水化合物分解的化合物和其它的有機和無機化合物與水和用于提取的化學 物質的混合物)。接著將這些碳水化合物經過漿液加工步驟，其包括在沸點溫度下蒸發稀 釋的液流、冷卻蒸發過的液體、調節PH到發酵的條件和最后將作為蒸發濃縮物排出加工系 統，準備與SSF工藝方案中的固體混合或準備另外發酵為乙醇。 本發明的另一個示例實施方案是關于進一步加工蒸發濃縮物除去木質素組分或 木質素降解產物、碳水化合物降解產物、提取物降解產物，由此產生富含脫毒的碳水化合物 的有機溶劑，該有機溶劑適合用于在進行并行糖化和發酵步驟前稀釋富含纖維素的固體部 分以降低其粘度。 本發明的另一個示例實施方案涉及混合含有富含脫毒碳水化合物的有機或無機 溶劑的富含粘度降低的纖維素固體部分和選擇用于增加以下的速率和效率的微生物接種 物和酶(a)將富纖維素的固體主要糖化為葡萄糖、甘露糖、半乳糖和較少程度地糖化為木 糖和阿拉伯糖，和(b)并行發酵這些通過酶水解作用產生的己糖和戊糖。發酵戊糖和/或 己糖碳水化合物的適宜微生物接種物包括選自酵母菌種、真菌種和細菌種的一種或多種適 宜菌株。適宜的酵母的示例為酵母屬和畢赤酵母屬。適宜的酵母屬的示例為釀酒酵母等。 適宜的真菌菌種的示例為曲霉屬和木霉屬。適宜細菌的示例為天然的和遺傳改造的大腸桿 菌、發酵單胞菌屬、梭菌屬和棒狀桿菌屬等。提供下列菌株的接種物也在本發明的范圍內 單個菌株或可選地，包括來自單個類型生物的多個菌株，或者還可選地，包括來自多個菌株 和微生物類型(即，酵母、真菌和細菌)的菌株的混合物。適宜的酵母屬培養物的示例為釀 酒酵母菌株Y-1528、Tembec-l，它們可以是天然的和/或遺傳工程改造的菌株。在纖維生物 質例如木質生物質發現的所有的三個主要己糖碳水化合物，即葡萄糖、半乳糖和甘露糖會 被這樣的釀酒酵母菌株Y-1528培養物同時發酵為乙醇，由此避免通常使用的酵母種和菌 株的長滯后時間和與之相關的高運行成本。消除這些自養相關的時間滯后具有加快總發酵 工藝、由此減少設備大小要求和相關的資本成本等益處。另外，通常在糖化纖維素中使用的 降解生物質的酶制劑常常具有足夠的第二種活性，將預處理步驟期間衍生于半纖維素的大 多數半纖維素多糖和低聚糖水解為它們的組成多糖。因此，由于衍生于半纖維素的低聚糖 可以任意地加入到本發明工藝的糖化階段，不需要大量的另外的降解半纖維素的酶來最大 發酵在提取纖維性木質纖維素原料所提供的水解工藝期間產生的各種單糖組分。依賴于纖 維素酶的酶源，可以有足夠的第二活性來完全水解與固體纖維素漿料相關的半纖維素。如 果沒有，任選地將附加的木聚糖酶、P-木糖苷酶、酯酶和其它的降解半纖維素的酶可以任 選地加到糖化混合物中以實現該期望目標。 盡管本發明的工藝，其中有效量的微生物培養物如釀酒酵母菌株Y-1528與纖維 性生物質固體部分和適宜的液流混合，特別適于工業SSF工藝，但是它們也適于分開的水 解和發酵(SHF)工業工藝。另外，處理從提取的木質纖維素原料分離的固體部分以在將生 物質運送到SSF工藝或可選地運輸到SHF工藝前啟動纖維破裂和水解在本發明的范圍內。
在目的是產生燃料乙醇的工業工藝中，經濟期望的是，在從有機溶劑提取或其它
9適于纖維性木質纖維素原料的提取或預處理方法中獲得的發酵液中產生的乙醇濃度為大 于5. 0-6. 5% w/w。為了實現該目標，在糖化階段典型的有機溶劑預處理的生物質樣品需要 具有至少16% (w/w)的木質纖維素固體稠度。這些發酵母液濃度(大約> 5. 0% w/w)是在 相對低的干物質濃度的有機溶劑基質的情況下取得的。含有16%固體的混合的固體部分懸 浮液很稠、很粘，且難于混合。這是預處理最好的有機溶劑基質的最好實例(其它的基質如 蒸汽爆裂木材或稀酸預處理的農業殘留物會需要高得多的稠度(30-40%)以實現該目標， 因為具有高含量的非發酵組分，如灰分(5-15%)和木質素(20-40% ))。有機溶劑處理的來 自提取的木質纖維素基質如木材基質的固體部分沒有該問題，因為最適提取的木材基質具 有低于0.5%的灰分含量和低于5%的木質素含量。因此，本發明的另一個實施方案提供了 含有釀酒酵母Y-1528的工藝，其中包含碳水化合物混合物的液流與固體木質纖維素材料 混合，由此提供了較低的稠度，即較低稠度的固體，其反過來促進實現發酵液中最終的乙醇 濃度，其>5. 0-6.5%。含有混合液體碳水化合物流的一個方面是一些單糖，例如木糖形式， 會存在于水解纖維性木質纖維素的早期階段。附帶存在的木糖會提供給酵母其代謝和活力 所需要的碳源，這在大多數原纖維生物質原料的水解早期階段不存在。提供根據該實施方 案的補充的液體碳水化合物流有助于更完全地利用來自包括農業廢棄物的木質或非木質 生物質的混合己糖碳水化合物，由此在設計為處理這些類型木質纖維素原料的木質纖維素 生物精煉廠中產生更少的廢物和更低的廢物處理成本。這也會利于在后期階段通過天然的 戊糖發酵微生物如樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)將戊糖碳水化合物發酵為乙醇，樹干 畢赤酵母通常受到葡萄糖存在的抑制。該實施方式也可以降低與在SHF或SSF系統中高粘 度的材料必要混合相關的能量成本，同時利于在發酵母液中產生終濃度超過5. 0-6. 5% w/ w的乙醇。另外，該實施方案可以使降低微生物的負載，即降低功效所需要的酵母培養物的 量，因為更高濃度的己糖和戊糖碳水化合物會被酵母代謝利用并維持纖維素固體水解和發 酵早期階段的活力。 根據該實施方案，高稠度(> 40% )的固體纖維素組分用含有來自于用于提取木 質纖維素原料的溶劑的單糖和低聚糖混合物的含水液流稀釋到適于SSF或SHF的稠度( 20%)。適宜的預處理工藝的示例為有機溶劑、蒸汽爆裂、稀酸水解、氨纖維爆裂(ammonia fiber e鄧losion) (AFEX)等。另外，在本發明的范圍的是，對于適宜的纖維素酶、半纖維素 酶和其它的降解生物質酶混合物，預混合到液體碳水化合物流中，由此進一步利于完全水 解富含低聚糖部分和富含固體纖維性纖維素組分。在SSF工藝中，有效量的適宜微生物接 種物會加入到混合物中，由此提供與糖化工藝并行的發酵裝置。適宜的微生物接種物包括 至少一個選自酵母種、真菌種和細菌種的菌株。適宜的酵母的示例為酵母屬和畢赤屬。適 宜的酵母屬的示例為釀酒酵母等。適宜的真菌種的示例為曲霉屬和木霉屬。適宜的細菌的 示例為大腸桿菌、發酵單胞菌屬、梭菌屬和棒狀桿菌屬等，它們是天然的和遺傳改造的。在 本發明的范圍內的是，提供包括以下菌株的接種物單個菌株或可選地來自單個類型微生 物的多個菌株，或進一步可選地包括來自多個菌種和微生物類型(即，酵母、真菌和細菌) 的菌株的混合物。 在SHF工藝中，糖化會首先進行，接著進行發酵。完全發酵后，蒸餾得到的乙醇發 酵液以收集乙醇。剩余的釜餾液可以被進一步加工以收集(a)殘余的木質素，其適合作為 原料或可選地作為產生基于木質素的塑料、粘合劑、抗氧化劑、表面活性劑、包衣材料等的
10原材料，(b)用于轉化成飼料蛋白或回收以再用于乙醇生產工藝的酵母細胞，(c)木糖和/
或阿拉伯糖，其用作食品工業的原材料或被微生物發酵或通過化學裝置加工為乙醇或其它
有用的化學物質如木糖，同時(d)被喜氧或厭氧處理設備處理的任何殘留液體。 本發明用于并行的下游糖化和發酵在上游提取和分裂纖維性木質纖維素原料期
間釋放的結構組分的工藝、系統和方法，在以下實施例中更加具體地描述，其為示例性的，
不是旨在限定本發明。 實施例1 Red Ethanol⑧的釀酒酵母菌株的干培養物從PhibroChem(Ridgefield Park, NJ， USA)獲得。釀酒酵母菌株Y-1528的培養物獲于美國國家農業應用研究中心的美國農業研 究菌種保藏中心(美國伊利諾斯州皮奧里亞)。通過在瓊脂板上培養酵母菌株制備酵母 接種物。提供2L的三角瓶，每個瓶子含有600mL的生長培養基，生長培養基含有BioShop Canada Inc. (Burlington, 0N， Canada)供應的1%酵母提取物和1%蛋白胨、2%蔗糖 (Sigma, St. Louis， M0， USA)。用10% v/v HC1將pH調節到5. 5。用從瓊脂板挑取的菌落 接種三角瓶，接著將接種的培養基在微好氧條件下在3(TC以250rpm的速率振動培養過夜。
發酵實驗在250mL三角瓶中進行，每個三角瓶含有lOOmL的0. 1M檸檬酸緩沖液 (pH 5. 5)。準備兩套三角瓶。第一套三角瓶接收(a)47. 5g/L甘露糖和(b)47. 5g/L半乳糖。 第二套三角瓶接收(a)47. 5g/L甘露糖、(b)47. 5g/L半乳糖和(c)47. 5g/L葡萄糖。每個三 角瓶也力口入0. 5ppm的抗生素Lactrol (Lactrol是Phibro Animal Health Corp. ， Fort Lee， NJ， USA的注冊商標)。通過向選擇的三角瓶中加入3g/L odw的從酵母提取物_蛋白 胨生長培養基收集的酵母細胞一式兩份，然后在36t:培養這些接種后的三角瓶，檢測各酵 母菌株在這些培養基中的發酵特性。在0、 1 、2、3、 12、20、40和64h取每個三角瓶中的上清 樣品分析(a)通過氣相色譜(GC)測乙醇含量和(b)通過HPLC測定碳水化合物含量。
該研究結果示于圖1中。Red ￡讓肌01@釀酒酵母菌株是為工業性的從淀粉到乙醇 工業開發的專門選擇的菌株。該菌株對乙醇具有高的耐受性，被設計用于在高的溫度下產
生醇類。圖l中的數據表明，在高溫(即，36t:)下在半乳糖-甘露糖基質和在半乳糖-甘
露糖-葡萄糖基質中，公有領域的釀酒酵母菌株Y-1528的發酵特性與Red ￡讓肌01 菌株 相似。接種后12h小時內，這兩種酵母菌株都達到最大乙醇濃度約3. 7% w/w的乙醇，這相 當于約76%的總乙醇理論產率。在12h后，上清中不存在可檢測濃度的碳水化合物，這表明
這兩種釀酒酵母菌株都實現了完全的碳水化合物消耗。
實施例2 使用從白楊木碎片(稱為Asp4)產生的闊葉樹木漿評價釀酒酵母菌株Y-1528在 SSF系統中的產乙醇特性。Asp4槳液從不列顛哥倫比亞白楊(歐洲山楊)原木的代表樣本 制備，將原木采伐。剝皮、裂開、碎片和碾碎為大小為20mmX20mmX3mm的碎片。將碎片貯存在 環境溫度下的通氣的塑料袋中，直到含水量達到約10%。接著將200g(0. d. w.)的風干碎片 進行在195"下在含有乙醇水溶液(50% ;w/w)的定制高壓間歇反應器(Parr Instrument Co. ，Moline， IL， USA)中使用0. 55%硫酸作為催化劑以漿液木材為5 : 1的比例進行有 機溶劑預處理30分鐘。經30分鐘的熬煉時間后，用水冷卻旋管將反應器冷卻到環境溫度。 接著通過過濾將固體和漿液分開。用溫的70% (v/v)乙醇溶液在British粉碎機均化固體 部分，接著用水洗滌。洗滌的固體部分即，漿液用液壓擠壓以將最終的含水量降低到約50%(w/w)。化學分析最終的Asp4漿液以測定其組成(a)阿拉伯聚糖=0%， (b)半乳聚糖= 0%， (c)葡聚糖=84.87%， (d)木聚糖=5. 71%， (e)甘露聚糖=1. 59%和(f)木質素= 2. 94%。 該研究的反應混合物包括16. 0g的Asp4 〃濕 〃 漿液，用68. 24mL的0. 1M檸檬酸緩 沖液在2. 0L三角瓶中稀釋到8% 。 ASP4漿的固體含量是48. 23% ，而葡聚糖含量是為93% 。 向反應混合物補充有O. 5卯m的Lactrol⑧，和2g的包括1. 7g/L的Yeast Nitrogen Base(酵 母氮源)(Prod. No. YNB404 ;BioShop Canada Inc.) 、2. 27g/L尿素(Prod. No. URE002 ; BioShop Canada Inc.)和6.56g/L蛋白胨(Prod. No. PEP403 ;BioShop Canada Inc.)的酵 母營養混合物。加入里氏木霉纖維素酶制劑(Novozym 50013 ;Novozymes， Franklinton， NC， USA)，得到20. 0FPU/g葡聚糖(FPU =濾紙酶活單位)。加入黑曲霉P -葡萄糖苷酶 (Novozym 50010 ;Novozymes)得到40. 0CBU/g葡聚糖(CBU =纖維二糖酶單位，表示為每分 鐘轉化為葡萄糖的纖維二糖酶的摩爾數)。根據實施例1所述制備的釀酒酵母菌株Y-1528 接種物加入到反應混合物中，濃度為5g/L。三角瓶準備一式三份。每個三角瓶加入十個鋯 混合球，接著將三角瓶在36t:在微喜氧條件下以150rpm振動培養。在18h、25h和40h從三 角瓶取樣。分別通過GC和HPLC測定取樣的反應混合物中的乙醇產量和單糖濃度。圖2中 的數據顯示，就該反應混合物中最大的乙醇產量而言，SSF反應工藝基本在20小時內完成。
實施例3 向Asp4〃濕〃 漿補充半乳糖和甘露糖對實施例2中所述SSF系統中的釀酒酵母菌 株Y-1528的乙醇產生的效應通過向反應混合物的檸檬酸緩沖液組分中加入半乳糖和甘露 糖母液達到終濃度2. 5g/L的半乳糖和2. 5g/L的甘露糖測定。其它的反應組分即Asp4漿、 養分、酶和酵母接種物與實施例2所述的相同。準備三角瓶一式三份。每個三角瓶加入十 個鋯混合球，接著將三角瓶在36t:在微喜氧條件下以150rpm振動培養。在4h、 18h、25h和 40h從三角瓶取樣。分別通過GC和HPLC測定取樣的反應混合物中的乙醇產量和單糖濃度。 圖3中的數據顯示，在40小時的SSF反應工藝期間酵母細胞保持活力和活性，表現為在最 初的25h期間葡萄糖濃度減小，接著在隨后的取樣期間增加，但是甘露糖和半乳糖濃度在 前25h降低，隨后保持恒定。大部分的乙醇產生在最初的25h內，但是乙醇產生的速度在研 究期間下降，在每個取樣時間記錄到了乙醇濃度不斷增加。
實施例4 本研究測定了通過將酵母培養在糖培養基中16小時以引發其發酵活性，接著將 活躍發酵的酵母轉移到實施例3中所述的SSF系統中進行調節釀酒酵母菌株Y-1528的 效應。包含調節到pH 5. 5的0. 1M檸檬酸緩沖液的調節培養物溶液補充2. 5g/L半乳糖和 2. 5g/L的甘露糖。調節的培養物溶液接種如實施例1所述的5g/L的接種物。調節的培養物 溶液在3(TC在微喜氧條件下以250rpm振動培養16h。接著取出68. 24mL調節的培養物溶液 并添加8. 51mL的新鮮0. 1M檸檬酸緩沖液。添加緩沖液的調節培養物溶液接著被用于制備 實施例3中的補充半乳糖和甘露糖的反應混合物。三角瓶準備一式三份。向每個三角瓶中 加入十個鋯混合球(Ten Zirconium mixing balls)，然后在36。C在微喜氧條件下在150rpm 振動下溫育三角瓶。在18h、25h和40h對這些三角瓶取樣。分別通過GC和HPLC測定取樣 的反應混合物中乙醇的產量和單糖的濃度。圖4中的數據表明將處理的酵母加到補充半乳 糖和甘露糖的反應混合物中能夠使發酵進行達到40小時SSF期的終點(即， 100%完全轉化為乙醇)。
實施例5 釀酒酵母菌株Y-1528在實施例2-4所述的三個SSF條件下的乙醇生產特性示于 圖5。當該菌株用于36t:下以纖維素漿作為發酵基質的SSF工藝時，其乙醇產量為3. 7% 乙醇(w/w)，在18h計算為84%，在40h計算為86%，這兩個數值都是與理論產量相比的值 (圖5 ;實施例2)。向發酵基質加入2. 5g/L半乳糖和2. 5g/L甘露糖將乙醇的產量增加到 4.68% (w/w)，經測定，在18h為潛在理論產量的78X，在40h為理論產量的85X (圖5 ;實 施例3)。通過在含有兩種單糖的培養基中培養，接著加入補充有半乳糖和甘露糖的發酵基 質預處理酵母菌株，進一步將相同時期的SSF系統中的乙醇產量增加到5. 56% (w/w)，該量 計算為18h的理論產量的93%，和40h的理論產量的100% (圖5 ;實施例4)。
盡管已經根據示例實施方案對本發明進行了描述，但是本領域技術人員會明白如 何通過混合適宜選擇的液體流降低固體部分的粘度，然后在其中混合有效量的適宜微生物 接種物和適宜酶，來更改和修改本文所述的用于并行糖化和發酵從提取的木質纖維素原料 分離的固體和液體部分的這些工藝、系統和方法。鑒于許多改變和變體對本領域技術人員 是顯而易見的，本發明的范圍被認為只限于所附權利要求。
權利要求
并行糖化和發酵從木質纖維素原料提取的纖維素固體部分的方法，該方法包括步驟將提取的木質纖維素原料分離為纖維素固體部分和液體部分；加工所述的液體部分以從中除去提取的木質素，由此產生一種脫毒的或沒有脫毒的液體部分；通過將所述的纖維素固體部分與部分所述脫毒的或沒脫毒的液體部分混合來降低分離的纖維素固體部分的粘度；混合粘度降低的纖維素固體部分和(a)有效量的發酵微生物培養物以及(b)有效量的降解纖維素生物質的酶；混合所述的微生物培養物、所述降解生物質的酶和所述粘度降低的纖維素固體部分，以提供包含乙醇的反應混合物；和從所述反應混合物分離乙醇。
2. 根據權利要求l的方法，其中所述脫毒的或沒脫毒的液體部分與液體碳水化合物流 混合。
3. 根據權利要求l的方法，其中所述液體碳水化合物流含有葡萄糖、半乳糖、木糖或其 混合物中的一種。
4. 根據權利要求1的方法，其中在與纖維素固體部分混合前，所述脫毒的或沒脫毒的 液體部分另外地被加工，以除去乙酸、糠醛和5-羥甲基-2糠醛中的至少一種。
5. 根據權利要求1的方法，其中所述木質纖維素原料選自由以下物質組成的組被子 植物生物質、裸子植物生物質、大田作物生物質、植物性漿和/或果實漿、木材和木材加工 的碎片和廢料、可再循環的紙和硬紙板貨物。
6. 根據權利要求l的方法，其中發酵微生物培養物是選自由酵母種、真菌種、原生動物 種和細菌種組成的組的菌株。
7. 根據權利要求6的方法，其中發酵微生物培養物是選自由天然菌株和遺傳改造的菌 株組成的組的菌株。
8. 根據權利要求7的方法，其中發酵微生物培養物選自酵母屬的菌株。
9. 根據權利要求8的方法，其中發酵微生物培養物是釀酒酵母菌株Y-1528。
10. 根據權利要求7的方法，其中發酵微生物培養物是選自由木霉屬和曲霉屬組成的 組的真菌菌株。
11. 根據權利要求7的方法，其中發酵微生物培養物是選自由發酵單胞菌屬、棒狀桿菌 屬、梭菌屬和大腸桿菌組成的組的細菌菌株。
12. 根據權利要求l的方法，其中降解纖維素生物質的酶選自由纖維素酶、P-葡萄糖 苷酶、半纖維素酶、13 -木糖苷酶和它們的混合物組成的組。
13. 根據權利要求l的方法，其中所述方法是間歇工藝。
14. 根據權利要求l的方法，其中所述方法是連續工藝。
15. 根據權利要求l的方法，其中所述方法是半連續工藝或補料分批工藝之一。
16. 并行糖化和發酵從木質纖維素原料提取和分離的纖維素固體部分的方法，該方法 包括步驟通過混合纖維素固體部分與包括至少一種單糖碳水化合物的液流，降低所述分離的纖維素固體部分的粘度；混合粘度降低的纖維素固體部分與(a)有效量的發酵微生物培養物以及(b)有效量的 降解纖維素生物質的酶；混合所述微生物培養物、所述降解生物質的酶和所述粘度降低的纖維素固體部分，以 提供包含乙醇的反應混合物；禾口從所述反應混合物分離乙醇。
17. 根據權利要求16的方法，其中所述液流包括選自由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖 及其混合物組成的組的單糖。
18. 根據權利要求16的方法，其中所述木質纖維素原料選自由以下物質組成的組被 子植物生物質、裸子植物生物質、大田作物生物質、植物性漿和/或果實漿、木材和木材加 工的碎片和廢料、可再循環的紙和硬紙板貨物。
19. 根據權利要求16的方法，其中發酵微生物培養物是選自由酵母種、真菌種和細菌 種組成的組的菌株。
20. 根據權利要求19的方法，其中發酵微生物培養物是選自由天然菌株和遺傳改造的 菌株組成的組的菌株。
21. 根據權利要求20的方法，其中發酵微生物培養物選自酵母屬的菌株。
22. 根據權利要求21的方法，其中發酵微生物培養物是釀酒酵母菌株Y-1528。
23. 根據權利要求20的方法，其中發酵微生物培養物是選自由木霉屬和曲霉屬組成的 真菌菌株。
24. 根據權利要求20的方法，其中發酵微生物培養物是選自由發酵單胞菌屬、棒狀桿 菌屬、梭菌屬和大腸桿菌組成的組的細菌菌株。
25. 根據權利要求16的方法，其中降解纖維素生物質的酶選自由纖維素酶、13 -葡萄糖 苷酶、半纖維素酶、13 -木糖苷酶、聚糖酶和它們的混合物組成的組。
26. 根據權利要求16的方法，其中所述方法是間歇工藝。
27. 根據權利要求16的方法，其中所述方法是連續工藝。
28. 根據權利要求16的方法，其中所述方法是半連續工藝。
29. 并行糖化和發酵從木質纖維素原料提取的纖維素固體部分的系統，所述系統包括 多個互聯的協作裝置，這些裝置設計用于可控地傳送和接收通過其中的液流供應；接收和加工其中的纖維素固體部分，同時可控地傳送液流供應；可控地接收其中的加工的纖維素固體部分流，其中含有并行糖化和發酵工藝，該工藝 設計為從所述加工的纖維素固體部分產生反應產物，和可控制的從中排出反應產物；禾口 將反應產物分離成選擇的組分并可控地排出各所述分離的組分。
30. 根據權利要求29的系統，其中所述系統設計為接收和加工其中的多個批次的提取 的纖維素固體部分。
31. 根據權利要求29的系統，其中所述系統設計為連續接收和加工其中的提取的纖維 素固體部分，同時從中并行排出反應產物。
32. 根據權利要求29的系統，其中所述系統設計為從中收集液體組分。
33. 根據權利要求32的系統，其中所述收集的液體組分被進一步加工和制備，以適于再循環為液流供應。
34.根據權利要求33的系統，其中所述提取的纖維素固體部分通過與部分所述再循環 的液流供應混合進行預處理。
全文摘要
本發明涉及并行糖化和發酵從木質纖維素提取的纖維素固體部分的方法。纖維素部分的粘度通過與液體碳水化合物流混合降低。適宜的液體碳水化合物流是事先在木質纖維素原料的加工過程中從固體部分分離的脫木質素的液體部分。可選地，通過與包括一種或多種單糖的液體碳水化合物流混合降低固體部分的粘度。粘度降低的纖維素固體部分接著與發酵的微生物接種體以及纖維素生物質降解酶組合物混雜。混雜的混合物保持在高溫的加壓的反應容器中，使得能夠同時將纖維素固體酶促水解為單糖和將單糖發酵產生乙醇發酵液。將乙醇發酵液蒸餾回收燃料級乙醇和釜餾液，釜餾液可以被進一步加工。
文檔編號C08H8/00GK101784668SQ200880103958
公開日2010年7月21日 申請日期2008年7月4日 優先權日2007年7月4日
發明者亞歷克斯·伯林, 唐納德·奧康納, 愛德華·肯德爾·派伊 申請人:麗格諾新創有限公司