專利名稱：徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，尤其是一種徑向色譜純化天然可溶性多糖的 方法。
背景技術：
早在20世紀50年代，隨著色譜技術不斷研究，徑向色譜迅速發展起來。 這種色譜技術主要是Rhee et al將傳統的軸向色譜演化而來的，目前這種色譜 已經廣泛的被應用于分子分離技術。
在徑向色譜與軸向色譜相比較的相關報道中，徑向色譜都顯示出了處理 量大、速度快的優點，同時還具有樣品在起始處與填料接觸面積大和在出液 口匯聚的特點。到了20世紀80年代中期，徑向色譜技術開始實現工業化，主 要應用于蛋白質的分離純化，如單克隆抗體的純化、IGase酶的分離純化和人 尿激肽釋放酶的分離純化等方面，然而徑向色譜運用于分離純化多糖的研究 鮮有報道。
天然多糖主要是從動物、植物、真菌及微生物或其分泌物中提取分離得 到的，是一種極性大分子化合物。但是一般植物組織或動物組織中提取的粗 多糖通常會存在多種不同多糖及雜質，因此要將不同分子量或組成的多糖分 離開來或除去其中非糖組分，需要對多糖混合物進行分離和純化。常用的多 糖分離純化方法有以下幾種分部沉淀法、季銨鹽沉淀法、鹽析法、金屬絡 合物法及柱層析法等，其中柱層析法包括離子交換層析和凝膠層析兩種方法。
離子交換層析是根據被分離多糖所帶陽或陰離子與帶相反電荷的離子交 換劑間的靜電結合，即根據物質的酸堿性、極性等差異，通過離子間的吸附 和脫吸附而將待分離溶液各多糖組份分開；樣品加入后，用電解質溶液或緩 沖液進行洗脫，基于電荷不同的各種物質對離子交換劑有不同的親和力，通 過改變洗脫液離子強度及pH值，控制這種親和力，使這些多糖不同組分及雜 質按親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來，從而達到分離和純化的目的。
凝膠層析是將粗多糖的溶液緩慢地流經凝膠色譜柱，各分子在柱內同時 進行著兩種不同的運動沿流動相方向移動和在凝膠固定相內無定向的擴散
運動。大分子物質由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布在 顆粒之間，所以在洗脫時向前移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆 粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在流動 相洗脫過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的移動速度落后于大分子物質，從而使樣品 中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，從而 將不同的分子量的多糖分離或將多糖與小分子非糖雜質分開。
發明內容
本發明提供一種徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法，是利用徑向色譜 樣品和流動相從柱的外周向柱圓心會聚且處理量大、速度快的特點對天然可 溶性多糖進行分離純化。
為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案
一種徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法，其特征在于粗多糖溶液進 入徑向色譜柱后，由色譜柱的周圍向中心流動，流經色譜柱填充的固定相， 用相應的溶劑作流動相進行洗脫，然后由中心出液口流出。
而且，所述色譜柱固定相半徑R應大于或等于lcm。
而且，所述粗多糖從動物、植物、真菌及微生物或其分泌物中得到，包 括殼聚糖、人參多糖、發菜多糖、螺旋藻多糖、當歸多糖、灰樹花多糖、豬 苓多糖、茯苓多糖、靈芝多糖、蘆薈多糖、紫菜多糖、蓮子心多糖、茶多糖、 銀耳多糖、滸苔多糖、香菇多糖、黃原膠、結冷膠、肝素、硫酸軟骨素、柴 胡多糖、短梗霉多糖、冬蟲夏草多糖、枸杞多糖、石斛多糖、普魯蘭多糖黃 芪多糖、銀耳多糖、當歸多糖、木耳多糖、苦瓜多糖、天麻多糖、短梗霉多糖、右旋糖酐和小核菌萄聚糖等，其分子量在5,000 5,000,000范圍內，并含 有一種以上多糖組分，或多糖總含量<97%，在水溶液中溶解度在常溫下大于 0.2g/L。
而且，所述粗多糖溶液通過水提或醇提而得多糖粗提物，醇提時乙醇與 水以各種比例混和。
而且，所述徑向色譜柱固定相是離子交換樹脂或凝膠樹脂的陽離子交換 樹脂或陰離子交換樹脂，如苯乙烯型離子交換樹脂、丙烯酸系離子交換樹脂、 瓊脂糖離子交換樹脂、交聯葡聚糖離子交換樹脂及纖維素離子交換樹脂。
而且，所述徑向色譜柱固定相可以是凝膠樹脂，包括交聯葡聚糖凝膠、 瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和聚苯乙烯凝膠，其凝膠類型為G-10、 G-15、 G-25、 G-50、 G-75、 G-IOO、 G-150、 G-200， Sephadex LH-20 、 Sepharose 和 Styrogel。
而且，所述洗脫流動相分別是指，離子交換層析中的洗脫液是濃度為0 4.7mol/L的KC1溶液、濃度為0 6.2 mol/L的NaCl溶液、濃度為0 9.4 mol/L 的NH4C1溶液以及磷酸氫鹽如鈉鹽、鉀鹽或銨鹽與磷酸二氫鹽如鈉鹽、鉀鹽 或銨鹽組成的緩沖溶液，或者是三羥甲基氨基甲烷(Tris) -NaCl緩沖液、 Tris-KCl緩沖液；其中凝膠層析中的洗脫液是去離子水或蒸餾水。
本發明的優點和積極效果是
本發明在進行色譜分離時流動相由色譜柱的周圍向中心流動，攜帶多糖 沿徑向流經固定相，使得多糖中不同的物質由于其在固定相中移動速度不同 而分離開來，達到分離純化多糖不同成分的目的。本發明徑向色譜柱具有樣 品在起始處與填料接觸面積大和在出液口匯聚的特點，可對天然可溶性多糖 進行分離純化。
圖1是本發明徑向色譜柱結構簡圖； 圖2是本發明離子交換層析洗脫曲線； 圖3是本發明凝膠層析洗脫曲線。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發明進一步說明；下述實施例是說明性的，不是 限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。
本發明中徑向色譜柱1是由兩個濾網4構成的同軸多孔圓環組成，參見 圖1，兩個濾網中間空間用來填充固定相填料。徑向色譜純化天然可溶性多 糖的方法是填料自填料口2進入，由出料口5出料；流動相和樣品從進液 口 3進入，由圓柱的周圍通過外多孔濾網徑向進入填料固定相向中心遷移， 最后通過內多孔濾網由出液口 6流出，樣品內不同組分由于在固定相內遷移 的速度不同而實現彼此分離。
下面通過具體示例來進一步證明本發明的先進性。
示例1:
(1) .選用DEAE-650M陰離子交換樹脂填充滿徑向色譜柱(尺寸見圖1)， 稱取15mg發菜粗多糖溶于去離子水配成濃度為0.5mg/mL的多糖溶液，離心 除去沉淀后，進行離子交換層析。
(2) .用1000mLNaCl溶液從01.0 mol/L進行線性梯度洗脫，洗脫速度為 lmL/min，利用部分收集器收集洗脫液。
(3) .采用苯酚一硫酸法檢測各管的吸光度A490，以洗脫體積為橫坐標，吸
光度值和NaCl溶液的濃度梯度變化為縱坐標做圖，得多糖的離子交換層析 洗脫曲線，見圖2。從圖中可以看到，洗脫曲線呈三個獨立的峰，即發菜多 糖呈三個不同組分，并且第一個峰和第二個峰的分離度R12以及第二個峰和 第三個峰的分離度R23在經過徑向色譜柱后分別達到1.191和l.OOl(分離度， 又稱為解析度、分辨率，是色譜圖中相鄰兩峰分離程度的量度)。
(4) .將三個不同峰的洗脫液分別合并，透析，冷凍干燥，依次得NaCl含 量約為1.5%的三個不同單組分多糖4.2mg、 4.5mg和3.9mg。
示例2:
(1) .選用凝膠G-100填充自制徑向色譜柱(尺寸見圖1)，稱取3mg發 菜多糖(實施例1中得到的第1組分的發菜多糖)，溶于去離子水配成濃度 為0.5mg/mL的多糖溶液，離心除去沉淀后，進行凝膠層析以除去所含大部 分電解質NaCl。
(2) .用200mL去離子水進行洗脫，洗脫速度為0.3 mL/min，利用部分收 集器收集洗脫液。
(3) .采用苯酚一硫酸法檢測各管的吸光度A490，以洗脫體積為橫坐標，吸
光度值和NaCl的電導率變化為縱坐標做圖，得多糖的凝膠層析洗脫曲線(見 圖3)。
(4) .將兩曲線交點處之前的洗脫液合并，減壓濃縮，冷凍干燥，得NaCl 含量為0.06%的發菜多糖2.4mg。
權利要求
1. 一種徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法，其特征在于粗多糖溶液進入徑向色譜柱后，由色譜柱的周圍向中心流動，流經色譜柱填充的固定相，用相應的溶劑作流動相進行洗脫，然后由中心出液口流出。
2. 根據權利要求1所述的徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法，其特征 在于所述色譜柱固定相半徑R大于或等于lcm。
3. 根據權利要求1所述的徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法，其特征在于所述粗多糖從動物、植物、真菌及微生物或其分泌物中得到，包括殼 聚糖、人參多糖、發菜多糖、螺旋藻多糖、當歸多糖、灰樹花多糖、豬苳多 糖、茯苓多糖、靈芝多糖、蘆薈多糖、紫菜多糖、蓮子心多糖、茶多糖、銀 耳多糖、滸苔多糖、香菇多糖、黃原膠、結冷膠、肝素、硫酸軟骨素、柴胡 多糖、短梗霉多糖、冬蟲夏草多糖、枸杞多糖、石斛多糖、普魯蘭多糖黃芪 多糖、銀耳多糖、當歸多糖、木耳多糖、苦瓜多糖、天麻多糖、短梗霉多糖、右旋糖酐和小核菌萄聚糖等，其分子量在5，000 5,000,000范圍內，并含有一 種以上多糖組分，或多糖總含量<97%，在水溶液中溶解度在常溫下大于 0.2g/L。
4. 根據權利要求1所述的徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法，其特征 在于所述粗多糖溶液通過水提或醇提而得多糖粗提物，醇提時乙醇與水以 各種比例混和。
5. 根據權利要求1所述的徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法，其特征在于所述徑向色譜柱固定相是離子交換樹脂或凝膠樹脂的陽離子交換樹脂 或陰離子交換樹脂，如苯乙烯型離子交換樹脂、丙烯酸系離子交換樹脂、瓊 脂糖離子交換樹脂、交聯葡聚糖離子交換樹脂及纖維素離子交換樹脂。
6. 根據權利要求1或5所述的徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法，其特征在于所述徑向色譜柱固定相可以是凝膠樹脂，包括交聯葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和聚苯乙烯凝膠，其凝膠類型為G-IO、 G-15、 G-25、 G-50、 G-75、 G-IOO、 G-150、 G-200, Sephadex LH-20、 Sepharose和 Styrogel 。
7. 根據權利要求1所述的徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法，其特征在于所述洗脫流動相分別是指，離子交換層析中的洗脫液是濃度為0 4.7mol/L的KC1溶液、濃度為0 6.2 mol/L的NaCl溶液、濃度為0 9.4 mol/L 的NH4Cl溶液以及磷酸氫鹽如鈉鹽、鉀鹽或銨鹽與磷酸二氫鹽如鈉鹽、鉀鹽 或銨鹽組成的緩沖溶液，或者是三羥甲基氨基甲烷(Tris) -NaCl緩沖液、 Tris-KCl緩沖液；其中凝膠層析中的洗脫液是去離子水或蒸餾水。
全文摘要
本發明涉及一種徑向色譜純化天然可溶性多糖的方法，其中粗多糖溶液進入徑向色譜柱后，由色譜柱的周圍向中心流動，流經色譜柱填充的固定相，用相應的溶劑作流動相進行洗脫，然后由中心出液口流出。本發明利用徑向色譜柱具有樣品在起始處與填料接觸面積大和在出液口會聚的特點，對天然可溶性多糖進行分離或純化。
文檔編號C08B37/00GK101385909SQ20081015131
公開日2009年3月18日 申請日期2008年9月12日 優先權日2008年9月12日
發明者瑾 姚, 岳思君, 戴玉杰, 王靜文, 鵬 許, 譚之磊, 賈士儒, 賈夢瑤, 偉 郭 申請人:天津科技大學