羥基苯交聯大分子網絡及其應用的制作方法

專利名稱：羥基苯交聯大分子網絡及其應用的制作方法
羥基苯交聯大分子網絡及其應用
背景技術：
關節軟骨在健康的關節中行使基本功能。關節軟骨吸收和分散沖 擊和摩擦載荷從而將這些載荷從骨骼上轉移，保護骨骼免受傷害。軟 骨通過將載荷力轉移至受限于關節間隙內的聚集蛋白聚糖分子(在下 一節中有所描述)三維網絡內的流體相實現該功能。聚集蛋白聚糖分
子含有與核心蛋白相連的多達ioo條的硫酸軟骨素鏈，在每條硫酸軟
骨素鏈全長上分布著多個電負性的硫酸根基團。這些硫酸根基團引起 了單個聚集蛋白聚糖分子上的各條硫酸軟骨素鏈之間的相互排斥(造
成靜態聚集蛋白聚糖分子占有最大的空間體積)，并導致軟骨聚集體中 相鄰的聚集蛋白聚糖分子互相排斥。
在健康軟骨中，聚集蛋白聚糖分子與透明質酸長鏈相連，而透明 質酸鏈被胞外膠原纖維基質限制于關節伺隙內的大型軟骨聚集體中。 因此，即使每個聚集蛋白聚糖分子(和與相同或不同的透明質酸鏈相 連的相鄰聚集蛋白聚糖分子)中相鄰的硫酸軟骨素鏈之間相互排斥， 它們仍然被限制在膠原基質中。圖1描述了正常、健康的軟骨。由于 硫酸軟骨素鏈之間如此排斥，透明質酸一聚集蛋白聚糖網絡(或大分 子網絡)在膠原基質的限制下會盡可能大的延展從而在靜態獲得盡可 能低的能量態，即使得相鄰的電負性的硫酸根基團間的距離盡可能最 大化。由此，網絡分子為了避免和相鄰的網絡分子靠近而很難發生移 動或替代。這些大型軟骨聚集體被限制在體積為其自由溶液體積五分 之一的膠原纖維網絡中，無法繼續膨脹。具有很高的負電荷密度的軟 骨聚集體與大量溶劑結合從而賦予軟骨吸收載荷和抵抗變形的能力。 在壓縮下，固定在聚集蛋白聚糖上的負電荷基團之間的距離縮小，從 而增加了電荷_電荷之間的排斥力以及自由浮動的平衡陽離子的濃度
(如C^+和Na+)。這些效應均對軟骨的粘彈性和軟骨抵抗變形及吸收壓
縮載荷的能力有所幫助，以下將進一步加以說明。
水分子在大分子網絡中提供了充分連續的流體相。如下所述，大 分子網絡通過將沖擊和摩擦載荷轉移至連續的流體(水)相將它們從 骨骼上轉移。當關節承受載荷時，大分子網絡首先將力吸收，該力作 用于網絡欲使其變形或將其壓縮。力在流體相中形成壓力梯度從而誘 導流體流動以適應由載荷造成的網絡的變形或壓縮。但是流體無法改 變堅實的大分子網絡，網絡填滿了相互排斥的硫酸軟骨素鏈，足以在 不移動或替代網絡分子的情況下容納大量的水。因此，雖然每個水分 子可以在網絡中擴散，但由于網絡分子不會發生替代，因此除非流速 大幅減慢，否則大量的流體相將基本被限制于網絡中而無法通過。盡 管存在壓力梯度，但是由于水分子無法順利流動，沖擊或摩擦載荷的 能量轉移至流體相并被其吸收，其中該能量壓縮液體水直至水發生充 分的轉移以適應網絡形狀且壓力梯度發生衰減。總體效果即軟骨吸收 潛在有害載荷，并將其從骨骼上轉移。
通過該完善的機制，正常的關節能夠通過將大量的載荷力轉移至 受限于大分子網絡內的流體相而吸收大量的載荷。在現有技術中，該 過程還沒有被人工或合成方法充分地重現。因此，對于軟骨退行性疾 病還無法進行充分的治療，如關節炎，其中聚集蛋白聚糖分子從它們 的透明質酸鏈上脫離，被消化或運出軟骨聚集體。
據估計，骨性關節炎和風濕性關節炎分別影響著20. 7和2. 1百萬 美國人。僅骨性關節炎每年就造成大約7百萬次的醫生探訪。對于嚴 重的致殘性關節炎，目前的治療包括全關節置換手術，僅美國每年就 平均進行168， 000樁全髖關節置換和267， 000樁全膝關節置換手術。 由于軟骨細胞在修復軟骨中的有限能力，關節軟骨的缺陷帶來了復雜 的治療問題。迄今為止的治療策略將重點放在對細胞培養中的自體軟 骨細胞的應用或在體內通過趨化試劑或促有絲分裂試劑對間質干細胞 的募集上。這些策略的目的在于增加和/或活化軟骨細胞群落從而重新 合成正常的、健康的關節軟骨表面。這些策略的一個主要問題是無法 將這些試劑保留在缺陷位點。由于透明質酸特有的性質，包括極佳的 生物相容性、可降解性和流變學及理化性質，有提議將透明質酸用作
發展軟骨細胞或生物活性試劑局部給藥的生物材料的候選材料。然而， 懸浮于組織工程透明質酸基質中的軟骨細胞能否合成機械性質與正常 健康的關節軟骨相當的新軟骨基質仍然是未知的。這是因為由透明質 酸制成傳統生物材料的化學制備方法與保持細胞存活力不相容。軟骨 細胞必須在基質形成后才能被引入基質，結果不穩定且通常很差。
因此，本領域需要一種能夠以有效的方式將載荷力從骨骼上有效 轉移的人工或合成基質。優選地，此基質在整形外科手術過程中可以 在原位點或在體內修復或置換關節軟骨。更優地，人工或合成基質以 一種液體或多種液體的形式提供在原位點或體內靶點，在位點與病人 體內已經存在的軟骨或骨骼組織形成基本密實的整合。

發明內容
發明綜述
本發明提供的大分子網絡包含以下結構<formula>formula see original document page 6</formula>
其中&和R2分別是或者包含選自聚羧酸酯、聚胺、聚羥基苯分子 以及它們的共聚體的結構，其中R和R2的結構可以相同也可以不同。
本發明還提供了含有大量酪胺取代透明質酸分子的大分子網絡， 其中至少兩個相鄰透明質酸分子由二酪胺鍵相連。
本發明還提供了一種水凝膠，水凝膠包含酪胺取代透明質酸分子 的大分子網絡，網絡通過透明質酸分子之間的二酪胺鍵交聯。
本發明還提供了制備大分子網絡的方法，包含步驟有提供第一 類大分子，大分子選自羥基苯取代聚羧酸酯、羥基苯取代聚胺、其它 聚羥基苯分子和它們的共聚物；以及在與相鄰的第一類大分子分別相 連的兩個羥基苯基團之間形成至少一個二羥基苯鍵。
本發明還提供了包含下列步驟的制備水凝膠的方法a)提供第一 溶液，其中含有過氧化物酶或過氧化物但不同時含有兩者，同時含有
一類大分子，大分子選自羥基苯取代聚羧酸酯、羥基苯取代聚胺、其它聚羥基苯分子和它們的共聚物；b)提供第二溶液，其中含有第一溶 液中所沒有的過氧化酶或過氧化物中的一種；和c)混合第一和第二溶 液起始二羥基苯交聯反應，形成水凝膠。


圖1是正常健康的人體軟骨的示意圖。
圖2是本發明的二羥基苯交聯大分子網絡的示意圖。
圖3是透明質酸分子的結構式。
圖4是本發明的T-HA水凝膠在封閉抗壓測試機械測試中(平衡應 力對施加張力)的結果與已公開的關節軟骨栓的結果(實施例3)的比 較圖表。
圖5是埋于T-HA水凝膠中(1. 7%和4. 7%T-HA)的軟骨細胞與在組 織培養塑膠上培養的軟骨細胞(對照)關于葡萄糖利用的比較數據的 圖表。
具體實施例方式
在此所用的術語聚羧酸酯指鏈長含有至少兩個功能基團或單位的 分子、結構或類，其鏈中的至少兩個這樣的基團或單位是或者包含羧 酸基團，在所述的親核取代反應中，該羧酸基團在空間上是可以接近 的。同樣在此所用的術語聚胺指鏈長含有至少兩個功能基團或單位的 分子、結構或類，其鏈中的至少兩個這樣的基團或單位是或包含可用 于親核取代反應的一級胺基團。同樣在此所用的聚羥基苯分子指鏈長 含有至少兩個功能基團或單位的分子，其鏈中的至少兩個這樣的基團 或單位是或包含羥基苯基團，它們能通過C-C鍵與另一個羥基苯基團 相連。同樣用于此的水凝膠是制備的一種含有大分子網絡的材料，大 分子網絡用于組織置換或工程應用，例如作為人工軟骨、作為手術器 材的包被材料以防止組織發炎、或作為人工腎的半透膜等。
本發明包括大分子網絡的一種新穎的結構，大分子網絡通過相鄰 長鏈大分子上的羥基苯基團之間的連接形成，這些連接使得大分子之
間形成有效的交聯從而生成一個巨大的網絡。網絡的基本交聯結構如 下所示
<formula>formula see original document page 8</formula>
其中R1和R2分別是長鏈大分子。R,和R2可以是相同的或不同的分
子，但將了解到為了生成合適的網絡，本發明的網絡中至少有部分二
羥基苯鍵中的K和R2是不同的分子。R和R2不必需但卻優選地是同類 分子。
通過相鄰大分子之間形成的大量二羥基苯鍵，生成了如圖2中所 示的二羥基苯交聯大分子網絡。在圖中，大分子用圓柱形帶表示，每 個大分子含有至少兩個與其相連的羥基苯基團。需要注意的是并不是 每個羥基苯基團都必須與另一個羥基苯基團相連。
簡要地，所記載的發明包括含有羥基苯的化合物經過碳化二亞胺 介導的反應通過它們的一級胺(或羧基)基團共價連接到各種聚合支 架材料上的羧基(或一級胺)基團上，所述化合物包括但不限于酪胺， 所述聚合支架材料包括但不限于透明質酸或硫酸軟骨素(例如以聚集 蛋白聚糖的形式)。在分離和純化羥基取代聚合支架后，在極稀的過氧 化氫的存在下，山葵過氧化物酶(HRP)使得羥基苯殘基選擇性地發生 交聯生成水凝膠。
制備大分子網絡的第一步是制備或提供周期性地帶有羥基苯基團 的長鏈大分子。在一個具體實施方案中，大分子為帶有多個或周期性 帶有羥基苯基團的聚羥基苯分子，如多酚。合適的多酚包括聚氨基酸 (例如聚酪氨酸)、表沒食子兒茶酚(EGC)和從綠茶中分離出的表沒 食子兒茶酚沒食子酸(EGCG)、其他次優的多酚。
在進一步的具體實施方案中，通過化學反應可將羥基苯基團周期 性地或隨機地添加到大分子的長鏈上。將羥基苯基團添加到大分子上 的一個優選方法是利用碳二亞胺介導的取代反應途徑在帶有一個羥基 苯基團的一級胺和大分子上的羧酸基團之間形成酰胺鍵。在此方法中，
優選的長鏈大分子是周期性帶有羧酸基團的聚羧酸酯分子。羥基苯基 團是帶有一級胺基團的小分子中的一部分，通過碳二亞胺途徑可以連 接到長鏈大分子的羧酸基團中的羧基碳原子上。反應進行如下<formula>formula see original document page 9</formula>其中
結構A是碳二亞胺；
結構B是聚羧酸酯(雖然僅標明了一個C02H基團)； 結構C是反應A的產物，活化的O-酰基異脲； 結構D是含有羥基苯基團的一級胺； 結構E是羥基苯取代聚羧酸酯；
結構F是酰基脲副產物；
其中各個R可以分別選擇，彼此相同或不同，可以是直鏈或支鏈
垸基或酰基基團，或其他任何結構，只要這些結構不會干擾碳二亞胺
反應途徑在NH2和C02H之間生成上述結構E中的酰胺鍵即可。
在以上示意的途徑中，反應A代表了碳二亞胺對羧基基團的活化進而生成活化的o-酰基異脲中間體。該中間體中正電性的碳原子可以
接受相鄰的帶有羥基苯基團的一級胺分子中氮原子的孤對電子的親核攻擊。該親核取代反應(反應B)的產物是羥基苯取代聚羧酸酯和酰基脲副產物，酰基脲可以通過透析去除從而得到足夠純的羥基苯取代聚 羧酸酯產物。
上述碳二亞胺反應途徑中可能發生特定的副反應，該領域的普通 技術人員應該對此加以考慮。首先，碳二亞胺可與其它親核試劑反應，
而不是與生成理想的o-酰基異脲所必需的聚羧酸酯分子的羧酸氧原子發生反應(反應A)。其它的親核試劑可以包括上述結構D中的胺和/ 或羥基苯基團。特別地，反應A會發生3種可能的副反應從而降低碳 二亞胺和帶有羥基苯基團的一級胺的有效濃度(結構A和D)，并且可 能導致在聚羧酸酯(結構B)上生成非理想的加合物
纖C
纖0
細E
胺和碳二亞胺的反應產物(反應c)沒有自由胺基，因此有效地減 少了可以和o-酰基異脲發生反應的酪胺的量。該反應還減少了可以生成理想的0-酰基異脲的碳二亞胺的量。羥基苯反應產物(反應D)沒 有UV吸收，這使得在最終的羥基苯取代聚羧酸酯產物(解釋見下)中
用uv光譜對它們進行觀察變得更加困難。但是，由于這些產物仍然帶
有自由胺基，它們可以通過反應B和聚羧酸酯分子生成酰胺鍵。反應 可生成兩種無效的透明質酸取代結構，由于缺乏生成自由基(解釋見 下)所需的可提取的酚羥基氫原子，兩個結構均無法參與到制備本發 明交聯網絡的第二步過氧化物酶交聯反應中(說明見下)。最終，碳二 亞胺會與水發生無效的反應(反應E)生成與上述反應B副產物相同的 酰基脲，但是沒有理想產物，結構E的生成。
一旦在反應A中生成理想的0-酰基異脲產物，又可能發生某些額 外的副反應
<formula>formula see original document page 11</formula> 0-酰基異脲(結構C)可以如反應F所示發生水解，釋放出原始的
未修飾的聚羧酸酯(結構B)和碳二亞胺的酰基脲(結構F)。該反應 是和反應E相似的無效反應，降低了碳二亞胺的有效濃度。0-酰基異 脲還可以通過分子內重排(反應G)生成兩種化學惰性的N-酰基脲。 這些結構在羧酸酯分子上生成無效的加合物，無法用于本發明網絡制 備中的過氧化物酶催化交聯反應(以下討論的步驟2)。 0-酰基異脲也 可以和相同或不同聚羧酸酯分子上的第二個羧基基團發生反應(反應 H)生成酸酐。該分子隨后可與結構D發生反應形成理想的酰胺并重新
獲得第二個羧基基團。因此對于o-酰基異脲存在兩個可能的副反應，
這些副反應能降低碳二亞胺的有效濃度(反應F和G)并可能導致在聚 羧酸酯分子上生成非理想的加合物。
這些副反應的負面效應并非由于不當的實驗方法，而是通過常規 操作就會發生。
上述途徑中的大分子為聚羧酸酯(結構B)，在另一種可選擇的途 徑中，大分子可以是帶有多個或周期性帶有胺基基團的聚胺，其中羥 基苯基團作為羧酸小分子的一部分。合適的聚胺包括聚己糖胺如殼 聚糖(聚葡萄糖胺)；聚氨基酸如聚賴氨酸；聚脫氧核糖核酸如聚(dA) (聚脫氧腺苷酸)、聚(dC)(聚脫氧胞苷酸)、聚(dG)(聚脫氧鳥苷 酸)；以及聚核糖核酸如聚(A)(聚腺苷酸)、聚(C)(聚胞苷酸)和 聚(G)(聚鳥苷酸)。碳二亞胺介導反應途徑完全按照以上所解釋的反 應途徑進行，從而在胺基基團和羧酸基團之間形成酰胺鍵，唯一的不 同是生成的產物是羥基苯取代聚胺而不是聚羧酸酯，這是本領域普通 技術人員能夠理解的。其他肽和/或蛋白質也可以用作本發明中的大分 子，只要其帶有羥基苯基團，或通過在此說明的取代反應可以獲得羥 基苯取代基團即可。例如，除了本發明已記載的肽，聚精氨酸可以被 用作大分子。
當聚羧酸酯分子上發生取代時，用于本發明的合適的含有羥基苯 的化合物包括帶有自由一級胺的化合物， 一級胺能夠用于修飾帶有多 個或周期性帶有C02H基團的支架材料，包括酪氨酸(2-氨基-3- (4-羥基苯)丙酸)和酪胺(酪胺或2- (4-羥基苯)乙胺)。當聚胺上發生
取代時，合適的含有羥基苯的化合物包括帶有自由C02H基團的化合物， C02H基團可以用于修飾帶有多個或周期性帶有一級麗2基團的支架材 料，包括酪氨酸、3- (4-羥基苯)丙酸和4-輕基苯乙酸。
根據本發明制備交聯大分子網絡的第二步是通過二羥基苯連接結 構將獲得的己經帶有一個或多個羥基苯基團的大分子連接。在這一步 中，不同的大分子上的羥基苯基團通過以下的反應機理在過氧化物酶 的存在下利用過氧化物試劑發生連接
<formula>formula see original document page 14</formula>錢驅苯取代聚羧黢醱(結構E)
<formula>formula see original document page 14</formula>
(應當注意的是一些二羥基苯連接也可以在同一分子的不同羥基 苯基團之間形成。)在稀釋的過氧化物(優選H202)存在下過氧化物酶 可以從帶有羥基苯的化合物中(如酪胺)提取酚羥基的氫原子，留給
酚羥基氧原子一個孤電子，成為極端活躍的自由基。該自由基將兩個 等價鄰位碳原子中的一個異構化，隨后兩個這樣的結構發生二聚化形 成共價鍵將結構有效地交聯，交聯結構經過烯醇化生成二羥基苯二聚 體(以下說明的二羥基苯鍵如二酪胺鍵)。
簡明起見，以上只顯示了單個的二羥基苯連接反應，但是應該明 白當把帶有羥基苯基團的大分子置于反應條件下時(過氧化物和過氧 化物酶)將會生成數個或多重這樣的鍵。上述機制中使用了過氧化氫， 但也可以使用其他合適的過氧化物。同樣地，過氧化物酶優選山葵過 氧化物酶(HRP)。可選地，能夠生成自由基使帶有羥基苯基團的支架 材料發生交聯的其它任何合適的酶(或其它試劑)均可以使用，在下 述的普通代謝條件下發生作用的為優選。
由于交聯反應是酶驅動的(過氧化物酶)，二羥基苯交聯大分子網 絡優于傳統的軟骨或其它組織置換或取代方法和產品。酶驅動意味著
交聯反應在普通的體內或代謝條件下進行，溫度為35°C_39°C (例如 37°C)、 pH范圍為6-7 (例如6.5)，反應試劑等等。(過氧化物，如過 氧化氫，是交聯反應中唯一需要的反應試劑)。因此，交聯反應可以在 體內進行，在手術位點如整形外科手術位點提供交聯的水凝膠，從而 促成水凝膠和天然組織如骨骼和軟骨組織之間最大程度的密實整合。 由于羥基苯取代大分子支架在交聯之前迅速地滲透入已經存在的軟骨 基質中，不僅與其它的羥基苯取代大分子支架材料發生交聯，還可能 與已存在于軟骨基質中的蛋白的酪氨酸殘基發生交聯，因此新的水凝 膠支架和天然軟骨基質的整合可以迅速發生。這樣就可以消除在使用 預先制成的基質栓時發現的典型問題，即它們很難整合進天然的軟骨 組織。能夠將水凝膠直接交聯在關節表面就不再需要在手術中將傷口 擴大以適應預先制好的栓，對于那些化學反應對病人有毒或否則就無 法在病人體內形成的水凝膠必須事先制栓。應當注意的是由關節炎引 起的大部分軟骨損傷表現為關節表面不同程度的變薄而不是具有一定 形狀的洞。
由于交聯反應需要過氧化物和過氧化物酶(優選山葵過氧化物 酶)，為了方便地應用于手術位點，可以制備含有所有組分而唯缺一種
組分的溶液。例如，可以制備含有酪胺(或其它含有羥基苯的種類) 取代聚羧酸酯(如酪胺取代透明質酸等)和過氧化物酶的溶液，并制 備含有過氧化物的第二溶液。可選地，第一和第二溶液中的過氧化物 和過氧化物酶可以交換，重要的是在交聯反應發生之前過氧化物和過 氧化物酶分開保存(即在分開的溶液中)。隨后，使用第一溶液，(例 如在體內手術位點)，并將第二溶液在體內使用或噴灑在第一溶液上， 在原位點形成酪胺殘基的交聯。交聯反應在體內發生。根據本發明的 記載，其它的組合對于本領域的普通技術人員將是顯而易見的。
此外，由于交聯反應在普通代謝條件下發生，因此可以將額外的 活細胞，如軟骨細胞、祖細胞、干細胞等，直接加入含有未交聯的羥 基苯取代聚羧酸酯或聚胺(或多酚)的培養基中，即前一節中的第一 或第二溶液，其中將富含細胞的培養基和大分子一起應用于體內位點， 分子隨后在加入過氧化物酶和過氧化物后發生交聯。于是交聯后的大 分子網絡中分散了理想的細胞。由于制備傳統基質時極端的溫度和pH 條件，這種富含細胞的網絡不可能在傳統組織置換基質中形成。此外， 如以下實施例5中所描述，已經證實上述發明基質中的細胞在根據本 發明發生酪胺取代透明質酸交聯(描述見下)生成網絡后仍然存活。
在特別適用于制備合成軟骨及其它合成或人工組織的優選實施方
案中，根據本發明用于生成網絡的大分子是透明質酸(HA)，且羥基苯
基團以酪胺的形式提供。
如圖3所示，HA由重復的以P-l，3糖苷鍵連接的葡萄糖醛酸 (glcA)和N-乙酰葡萄糖胺(glcNAc)殘基對組成。對于每一條透明 質酸鏈，該簡單的二糖重復多達10，000次，每個重復的二糖之間通過 P -1， 4糖苷鍵連接。每個glcA在其葡萄糖環的5位碳原子上連有一個 羧酸基團(C02H)。酪胺是帶有與苯環OH基團正對的乙胺基團的酚類分 子。當使用這些分子時，將酪胺取代至HA的C02H基團的單鍵氧原子上 的機制如下所示，是通過上述碳二亞胺介導的反應機制進行的。優選 的碳二亞胺類是所示的1-乙基_3- (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。<formula>formula see original document page 17</formula>其中
結構A是EDC;
結構B是透明質酸(雖然只表明了一個C02H);
結構C是反應A的產物1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)異脲；
結構D是酪胺； 結構E是酪胺取代透明質酸；
結構F是卜乙基-3- (3-二甲氨基丙基)尿素(EDU)。 在上述途徑中，透明質酸分子羧基基團上的電負性的氧原子通過 親核反應機制攻擊碳二亞胺分子(EDC)上缺電子的二酰亞胺碳原子生 成活化的0-酰基異脲(反應A)。于是HA羧酸酯基團中的碳原子對電 子的缺乏使得其易受酪胺分子中胺基團的孤對電子的攻擊(反應B)。 優選地，反應A由合適的催化劑催化在反應A中生成活化的酯，使得 反應可以在基本中性的pH (例如pH二6.5)下進行。合適的催化劑包括 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、次優的l-羥基苯并三唑(H0Bt)或N-羥基 磺基琥珀酰亞胺(NHSS)、次優的其它通過形成活化酯有效提高碳二亞 胺反應使得碳二亞胺在更高pH下的無效水解最小化的合適催化劑或它
們的混合物。除了 EDC外可以使用的其它次優的碳二亞胺包括卜環己
基-3-[2-(4-甲基嗎啡啉)乙基]碳二亞胺(CMC)以及二環己基碳二亞 胺(DCC)。
上述反應A生成了 0-酰基異脲取代透明質酸；EDC分子臨時取代 至HA分子中glcA殘基的羧酸基團上，使得羧酸基團的碳原子帶有弱 正電性。如上一節中所解釋的，酪胺分子末端胺基團的電子對隨后通 過親核取代反應取代至碳原子上(反應B)。反應B生成了酪胺取代HA 分子(T-HA)和副產品酰基異脲。應當了解的是反應A和B將在HA分 子的周期性glcA殘基上生成多個酪胺取代；出于簡單明了的考慮在此 只顯示了單個取代。
如以上說明和解釋，在生成T-HA之后，多個T-HA分子通過過氧 化物和過氧化物酶發生反應生成交聯的T-HA分子。即與HA分子相連 的酪胺殘基的羥基苯基團在過氧化物酶的存在下和過氧化物(優選 H202)發生反應從而去除了酚羥基的氫原子生成酪胺自由基，其中酚上 的氧原子帶有未配對電子。該自由基發生異構化或共振，生成的共振 結構(或自由基異構體)中未配對電子轉移至酚環上的鄰位碳原子。 在該位置，未配對電子迅速地和另一個酪胺自由基上相似位置上的未 配對電子生成共價鍵。其結果是在相同或不同的HA分子的不同glcA 上的不同酪胺自由基殘基之間發生自由基驅動的二聚化。該二聚體進 一步發生烯醇化生成相互連接的酪胺殘基，生成二酪胺鍵結構。應該 明確的是在相鄰的酪胺殘基間將發生很多所述的反應，生成本發明的 T-HA分子的交聯大分子網絡，該網絡具有如下交聯結構
交聯的T-HA網絡可以通過傳統方法如通過連接蛋白加入聚集蛋白 聚糖，生成的交聯T-HA網絡中聚集蛋白聚糖分子與HA鏈相連。于是， 根據本發明可以獲得與正常軟骨聚集體中的網絡相似的網絡，其中二 酪胺鍵取代正常軟骨中的膠原纖維將網絡連在一起并由此限制住所含 的聚集蛋白聚糖網絡。
由本發明可知，其它的粘多糖、多糖和聚羧酸也可被用作大分子 生成在此記載的交聯網絡。例如，除了HA以外的合適的粘多糖包括軟 骨素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素和肝磷脂。其它合適 的聚羧酸酯包括蛋白聚糖如多功能蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和由聚 集蛋白聚糖、透明質酸及連接蛋白組成的軟骨聚集體；聚糖醛酸如聚 果膠酸鹽(聚半乳糖醛酸)、聚葡萄糖醛酸、果膠(聚半乳糖醛酸甲基 酯)、聚唾液酸(聚[2，8-(N-乙酰神經氨酸)])和海藻酸鹽(甘露糖醛 酸和古洛糖醛酸共聚物)；以及符合上述聚羧酸酯的定義的氨基酸(具 有至少2個氨基酸單元)，如聚天冬氨酸和聚谷氨酸。采用在此記載的 碳二亞胺介導的反應途徑，本領域的普通技術人員通過正確的實驗方 法可以對所有這些大分子進行一個或多個羥基苯基團的取代。
如上所述，還應當了解的是天然多酚化合物已經含有兩個或多個 羥基苯基團，羥基苯基團可以通過所述酶催化化學反應交聯，因此多 酚化合物可以替代上述必須通過化學反應加上羥基苯基團的聚羧酸酯 和聚胺。
在另一個優選具體實施方案中，用酪胺交聯的硫酸軟骨素分子(獨 立地或作為聚集蛋白聚糖的一部分)網絡用于模擬或置換正常軟骨。 硫酸軟骨素與透明質酸相同，除了 1)重復的二糖結構包含的是N-乙酰半乳糖胺(galNAc)而不是glcNAc，唯一的差別在于接在4位碳 上的羥基基團(在圖3中用圓圈標明)；2) 0-硫酸鹽發生在galNAc殘 基的4和/或6位和/或glcA殘基的2位羥基上(圖3)以及3)硫酸 軟骨素的鏈長，比透明質酸少20 — 100個重復的二糖單位。(聚集蛋白 聚糖分子由多條——大約100條硫酸軟骨素鏈通過每條鏈的還原末端 的連接糖與核心蛋白相連)。在該具體實施方案中，相鄰的(交聯的) 硫酸軟骨素分子電負性的S042—基團產生的排斥力使得網絡聚集體具有
抗壓性而酪胺交聯防止硫酸軟骨素網絡斷裂或散裂。由此生成了與正 常軟骨中類似的不可替代的硫酸軟骨素網絡(以及伴隨著的不透水 性)，但是沒有正常軟骨中的胞外膠原纖維基質或HA鏈。事實上，通
過直接交聯硫酸軟骨素分子(而不是前述具體實施方案中的核心HA分
子)，相鄰硫酸軟骨素分子之間的排斥力增強，使得其對流體流的抵抗 力較正常軟骨更強。由于間隙內流體相的流動受到更大的限制，直接 交聯的硫酸軟骨素分子對于載荷力的吸收和分散能力比正常軟骨更 強。在硫酸軟骨素分子直接交聯的該具體實施方案中， 一些軟骨退化
的情況被徹底控制；例如某些情況下正常軟骨中與硫酸軟骨素分子正 常相連的核心蛋白在HA結合域(Gl)與第二個球形結構域(G2)之間 發生斷裂，于是軟骨素硫酸富集區從軟骨聚集體中擴散出去。在該具 體實施方案中，由于硫酸軟骨素分子之間直接交聯而沒有與聚集蛋白 聚糖或其它蛋白聚糖分子相連，它們不會像在正常軟骨中那樣被切斷 或運走。
然而，由于HA的可利用度高，優選酪胺交聯的T-HA網絡(帶有 聚集蛋白聚糖分子的HA骨架鏈，聚集蛋白聚糖分子包括硫酸軟骨素 鏈)。這在使用本發明進行軟骨置換或修復中可能是有益的，因為身體 生成軟骨的正常代謝途徑可以直接在植入的酪胺交聯T-HA網絡上形 成，以下將對此進行說明。
上述的二酪胺交聯T-HA網絡對于生產人工或合成軟骨具有特別的 用途。軟骨移植常用于頭和頸重建過程以修復外傷或先天畸形中的軟 骨或骨骼缺陷。專門針對于耳的應用包括耳廓和耳的重建，此應用經 常用于修復由于外傷、腫瘤(即鱗狀細胞癌、基底細胞癌和黑素瘤) 和先天形成的缺陷如小耳癥。專門針對鼻的應用包括鼻和鼻中隔的修 飾和重建過程。在鼻部美容整形中常用到鼻梁增高、鼻尖軟骨(tip graft)、罩軟骨(shield graft)和支撐軟骨(spreader graft)。對 外傷、腫瘤、自免疫疾病如Wegeners肉芽腫或先天性缺陷的鼻重建需 要軟骨進行修復。隔膜穿孔難以治療并經常治療失敗。將軟骨嫁接用 于這些治療非常理想，但是自體或捐贈的軟骨經常短缺。專門針對喉 的應用包括喉氣管的重建，對于兒童通常需要取肋軟骨，這也是危險
的。耳和隔膜軟骨對于這種應用而言經常是不夠的。因此在此描述的 交聯HA網絡形成的工程軟骨在解決這些問題上將產生重大影響。喉氣 管重建經常用于治療由于聲門下或氣管狹窄而引起的氣道狹窄。病源 可以是外傷(即插管損傷或氣管切開術)或先天性的。
其它應用還包括下巴和面頰增高、下眼瞼外翻修復以及大量的顱 面應用。應當注意的是在這些應用中的軟骨可能不需要和關節軟骨有 著完全一致的機械性質。同時可能希望其中可以包含細胞群或生物活 性試劑。
本發明的交聯網絡發揮主要作用的一個特別應用是生產人工腎。 腎臟通過兩種機制過濾血液 一種通過尺寸排除，另一種通過電荷排
除。已經設計出MEMS裝置用于人工腎裝置，裝置中包含了精確定義的
微孔，微孔只能有效地模擬腎臟的尺寸排除特征。在健康的腎臟中， 關于電荷排除的過濾是由于基底膜中存在硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，該 過濾將兩種不同類型的細胞分離，對于腎臟的其它相關功能非常重要。
為了在MEMS工程人工腎中模擬這種電荷屏障，可以制備含有硫酸乙酰 肝素或肝磷脂的水凝膠，水凝膠通過在此描述的二羥基苯(二酪胺) 聯結進行交聯，并且裝入MEMS裝置的孔中。該肝磷脂/硫酸乙酰肝素 水凝膠隨后可被夾入兩層在此所述的透明質酸水凝膠(如上述的T-HA) 中，兩層水凝膠分別含有正常功能腎臟中通常存在的一類細胞。中間 的肝磷脂/硫酸乙酰肝素水凝膠為該裝置提供了電荷排除的能力。外面 的兩層透明質酸水凝膠保護中間層免受免疫系統侵犯和正常細胞及分 子碎片的污染。在過濾屏障兩面包含的兩類細胞以正常的生理方向提 供了細胞組分。
在另一個具有前景的應用中，本發明的水凝膠可用于發展人工胰 腺。發展人工胰腺的一個問題是由于體內監測儀電極的污垢，MEMS工 程葡萄糖感應器的半衰期很短。在這些監測儀表面覆蓋上在此所述的 透明質酸水凝膠(即T-HA)將允許探測用的小分子量葡萄糖分子的擴 散，但同時可以保護感應器免受免疫系統侵犯和正常細胞及分子碎片 的污染。
總而言之，根據前述顯而易見的是用作形成水凝膠的支架材料的
大分子包括但不限于聚羧酸酯(含有自由羧基基團)、聚胺(含有自 由一級胺基團)、多酚(含有自由羥基苯基團)和它們的共聚體，以 上已經舉例描述。當使用多酚時，本發明上述制備網絡的第一步可以 省略，因為多酚己經包含了多個或周期性的羥基苯基團。相反地，聚 羧酸酯和聚胺都必須優選地通過上述碳二亞胺反應途徑在其中加上或 取代上羥基苯基團。為了形成交聯的結構，制備網絡的第二步是在相 鄰大分子(無論是聚羧酸酯、聚胺或多酚)上的兩個羥基苯基團間進 行酶驅動的二聚化反應。該步驟在代謝溫度和pH條件下，在合適的酶 (優選服P)存在下用過氧化物試劑(優選過氧化氫)進行。
在優選的二酪胺交聯T-HA網絡中，在第一步中高分子量透明質酸 (HA)上的羧基基團由酪胺取代，酪胺將活性的羥基苯基團引入HA分 子。該酪胺取代反應優選地由碳二亞胺，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基) 碳二亞胺(EDC)介導，HA上酪胺的取代程度由反應混合物中的酪胺、 EDC和HA的摩爾比例及絕對濃度決定。過量的反應試劑如未發生反應 的酪胺和EDC隨后通過透析去除，從而可以分離和恢復高分子量的酪 胺取代HA (T-HA)。在各T-HA制備中的酪胺取代百分比可以通過以下 測量簡單地計算l)制備中酪胺的濃度，根據酪胺在275nm特有的UV 吸收性質可以光譜定量(見以下實施例2);和2) HA制備中總的羧基 基團的濃度，通過標準的己糖醛酸分析光譜定量。通過該技術，僅含 有4-6%的酪胺取代的T-HA已經通過實驗常規合成。在此酪胺取代水平 上，HA分子中的大部分(優選的至少60、 70、 80、 90或95%)化學 上保持不變，由此仍然保持生物功能。基于該T-HA配方(即4-6%酪胺 取代)，通過簡單地改變過程第二步中使用的T-HA的濃度可以生成具 有廣泛的物理性質的廣泛的生物材料。
在交聯反應中，T-HA溶液通過酶(過氧化物酶)驅動反應交聯形 成水凝膠，反應催化相鄰HA分子上的兩個酪胺加合物間形成共價鍵， 生成單個二酪胺交聯。每個HA分子中通過生成數百個這樣的二酪胺交 聯從而生成了穩定的三維支架或水凝膠。交聯反應的起始需要加入非 常稀的過氧化物(優選HA)，因為過氧化物酶的真正底物是過氧化物， 而不是HA。過氧化物酶對過氧化物的反應產物是由酪胺的羥基苯環優
先獲取的自由基，從而生成二酪胺交聯。二酪胺連接結構具有藍色熒 光(見實施例2)，該性質可用于水凝膠成像和衡量水凝膠的交聯程度。 由于交聯反應是酶驅動的，水凝膠可以在生理條件下形成，因此在形 成中可以包含細胞或生物活性制劑，或直接與活體組織相鄰而保持細 胞和組織的活性。
生成的水凝膠視覺上是透明的，根據起始T-HA的濃度的不同可具 有各種物理性質。例如，實驗顯示通過含有6.25、 12.5、 25、 50和100 mg/ml T-HA的T-HA溶液形成的水凝膠分別具有果凍、凝膠、生面團、 類彈力橡膠合成物(類似于橡膠球)和類軟骨材料的物理性質——見 實施例3。這些材料在廣泛的臨床條件下具有應用潛力，包括用于整形 外科(即軟骨、骨骼、肌腱、半月板、椎間盤等)和非整形外科(腎、 肝、胰腺等)組織的組織工程、基因和藥物傳遞、體內移植的非生物 設備(即葡萄糖感應器、人工心臟等)的包被、傷口修復、生物感應 器設計和聲帶重建。
所述水凝膠的優良性質包括1)能夠簡單地進行鑒定和質量控制； 2)能夠與現存組織基質整合；3)能夠直接整合進新生成基質；4)能 夠直接包含細胞和生物活性因子；5)能夠保持生物相容性；6)能夠 控制生物重吸收；7)能夠簡單地在復雜的解剖形態中制膠(見以下實 施例6);和8)能夠呈現天然組織如關節軟骨的機械性質。
結合以下一個或多個實施例對本發明的各方面進行進一步了解， 實施例提供于此作為例證。
實施例 實施例1
實驗用量的本發明的具有二酪胺交聯的酪胺取代透明質酸水凝膠 按照如下方法制備。HA以基于己糖醛酸的1 mg/ml的濃度溶解于250 mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES) ， 150mMNaCl， 75 mM NaOH， p朋.5的溶 液中，溶液中含有相對于HA羧基基團的摩爾濃度10倍過量的酪胺。 隨后加入相對于HA羧基基團摩爾濃度10倍過量的EDC起始羧基基團 上的酪胺取代。將相對于EDC摩爾量的摩爾比為1/10的N-羥琥珀酰亞胺(NHS)加入反應通過形成活化酯協助EDC催化的酰胺化反應的進行。 反應在室溫進行24小時，隨后通過先后對150 mM NaCl和超純水進行 徹底的透析及凍干將大分子從未發生反應的小分子量反應試劑如酪 胺、EDC、 NHS和MES中恢復過來。在凍干后，根據所需的最終水凝膠 的硬度，將酪胺取代HA (T-HA)產物以5 — 100mg/ml之間的操作濃度 溶解于PBS (該緩沖液與細胞懸液、體內組織接觸以及交聯反應兼容) 中進行不同濃度的制備。可選擇的，溶劑可以是除了 PBS以外的其它 任何合適的溶劑，只要溶劑對酶活性基本沒有負面影響且不會通過選 擇性吸收由酶產生的自由基而干擾交聯反應的發生。合適的替換溶劑 包括水、傳統的生物組織培養基和細胞冷凍液(通常由大約90%的血 清和大約10%的二甲亞颯)。在將細胞懸浮(見實施例5)或在體內 與組織接觸之前，應將T-HA通過0. 2 Mm的濾器過濾。隨后在每一個 T-HA制備中加入10 U/ml II型山葵過氧化物酶(HRP)進行酪胺一酪 胺連接。加入小體積(卜5 W)的稀過氧化氫溶液(0.012%-0.00012Q/0 終濃度)起始交聯以生成最終具有理想硬度的水凝膠。為了制備更大 量或大體積的理想水凝膠，本領域的普通技術人員可以將本節中提供 的試劑量適當放大。
實施例2
進行實驗確定本發明的T-HA大分子網絡的酪胺取代(以及隨后的 二酪胺交聯)程度。首先，根據上述方法制備3種配方的(未交聯的) 酪胺取代透明質酸(T-HA)，命名為OX、 1X或10X。 OX配方的制備不 使用EDC (即不含有碳二亞胺)，意味著不存在碳二亞胺介導酪胺NH2 基團和HA分子C02H基團之間生成酰胺鍵的反應。因此，OX配方可被 視作對照。IX配方在反應混合物中含有與HA分子上的C02H基團量的 化學計量比為l: 1的EDC。 IOX配方在反應混合物中含有與HA分子上 的C02H基團量的化學計量比為10: 1 (或10倍過量)的EDC。在所有 三個配方中，酪胺的化學計量過量都是相對于HA的C02H基團的數量而 言的。在所有三個配方(OX、 IX和10X)中，反應試劑和配方中適量 的EDC在試劑瓶中混合并搖晃加速酪胺取代反應。所有的配方在室溫
反應24小時，隨后透析試劑瓶中的內容物去除未發生反應的酪胺分子、
EDC和反應副產物酰基脲(EDU)。由于酪胺、EDC和EDU的體積相對 于大分子HA而言比較小，通過透析很容易將這些分子與HA和任何已 生成的T-HA分子分離。 一旦去除了未發生反應的酪胺和EDC，對每個 配方的剩余物進行分析以確定對于HA分子上的所有可利用的C02H總數 的酪胺取代率。
酪胺在275 nm出現UV吸收峰，根據酪胺標準曲線可以容易地觀 察出酪胺取代程度。根據對上述三種T-HA配方的UV光譜分析發現在 沒有EDC存在時(配方0X)進行的HA-酪胺取代反應在HA分子上發生 的酪胺取代幾乎為0。該結果證實了在酪胺取代反應中使用碳二亞胺反 應途徑的重要性。但是，酪胺取代反應中以l: 1 EDC: C02H的化學計 量比制備的T-HA配方中的酪胺吸收顯示HA鏈上所有可用的C02H基團 中的酪胺取代率大約為1.7%。 IOX配方(10: 1 EDC: C02H)造成了大 約4. 7%的取代率。
隨后，將過氧化氫和山葵過氧化物酶(HRP)以5mg/ml的濃度分 別加入三個透析過的HA/T-HA配方中(0X、 IX和10X)，生成的配方 發生反應直至反應完全。在加入過氧化物和HRP的反應完成后觀察到 OX配方仍保持完全的液體，具有明顯的彎月面；沒有觀察到凝膠的形 成，證實了在沒有使用EDC的酪胺取代反應中沒有或基本沒有發生酪 胺取代的事實。IX配方只觀察到微弱的彎月面且試劑瓶中的內容物已 經凝膠化，證實發生了酪胺取代和交聯。IOX配方形成了較硬的凝膠， 事實上相對于容器中初始的液體體積發生了收縮，在其上部留有一定 量的液體(具有彎月面)。IOX配方制備的膠(有4.7%的酪胺取代率) 比具有1. 7%酪胺取代率的IX配方堅硬很多。
二酪胺結構暴露在UV光下呈現出藍色熒光。將上述各配方的產物 暴露于UV光下以觀察二酪胺交聯的存在。和預期的相同，IX和IOX水 凝膠均呈現出藍色熒光(IOX水凝膠的熒光比1X水凝膠的熒光更強)， 但是OX配方完全沒有藍色熒光。結果證實在IX和10X水凝膠中存在 二酪胺交聯，在較硬的水凝膠(10X)中生成的二酪胺比在較軟的水凝 膠(IX)中更多。
總的結果證明了碳二亞胺介導的反應途徑的重要性，證實了本發
明中由交聯T-HA網絡形成的水凝膠的相對硬度與二酪胺交聯程度成正 比，二酪胺交聯程度與HA上的酪胺取代程度成正比。相當驚人和出人 意料的結果是根據本發明，即使1.7%的酪胺取代率(以及隨后形成二 酪胺的連接率)仍可提供合適強度的T-HA凝膠(或水凝膠)。4.7%的 取代率(和交聯)甚至生成了更加堅固的T-HA凝膠。同樣驚人的是在 反應混合物中存在的相對于羧酸基團量以化學計量10倍過量的碳二亞 胺(EDC)(配方10X)僅造成了大約4.5_4.7%的酪胺取代率，雖然 可以得到穩定和粘著的酪胺交聯T-HA網絡。
這些結果意味著雖然生成的網絡是粘著穩定的水凝膠，HA分子上 的大部分羧酸基團沒有發生取代和酪胺交聯而基本保持與天然HA分子 中的一樣。因此，當本發明的網絡在體內用作軟骨取代物時，由于和 正常軟骨中的HA相比，本發明的T-HA網絡或凝膠中的大部分HA分子 基本沒有改變，人們相信身體的天然代謝途徑(需要或不需要T-HA網 絡中提供的細胞的幫助)可將本發明的網絡看作天然生物材料并能夠 進行與其相關的普通的合成和代謝功能。此外，人們注意到在身體內 HA是一種高度普遍存在的材料且在人體內不產生免疫性。因此，人們 相信本發明的含有大量未發生改變的天然HA的交聯大分子網絡將在廣 泛的希望或必須在人體中提供合成組織的組織工程應用中具有重要應 用。這標志著技術狀態的顯著進步。因此，非常讓人吃驚地，高度的 酪胺取代，例如大于大約10-20%的取代可能是不希望的；上述實驗證 明生成合適的T-HA網絡并不需要高度的取代。優選地，本發明的二羥 基苯(例如二酪胺)交聯聚羧酸酯(例如HA)網絡基于聚羧酸酯(HA) 分子上的C02H總量的羥基苯(酪胺)取代率的百分比低于50，優選地 低于40，優選地低于30，優選地低于20，優選地低于15,優選地低 于10，優選地低于9，優選地低于8，優選地低于7，優選地低于6， 優選地低于5。
實施例3
傳統地，人們已經相信天然軟骨具有粘彈性，并且主要由于聚集 蛋白聚糖基質中存在的相鄰硫酸軟骨素鏈上負電性的so42—基團之間的 排斥力，天然軟骨能夠抵抗變形和吸收壓縮載荷。進行試驗確定本發 明中只含有二酪胺交聯透明質酸分子(即沒有聚集蛋白聚糖和硫酸軟 骨素)的大分子網絡在沒有so42—基團的情況下與天然軟骨相比在抵抗 變形和吸收壓力方面的功效。根據實施例1制備和純化未交聯的具有
大約5%酪胺取代率的T-HA配方。基于該T-HA配方，制備五種不同的 T-HA濃度
濃度l: 6.25 mg T-HA/ml PBS;
濃度2: 12.5 mg T-HA/ml PBS;
濃度3: 25 mg T-HA/ml PBS;
濃度4: 50 mg T-HA/ml PBS;
濃度5: 100 mg T-HA/ml PBS。
以上各制備隨后在過氧化氫和山葵過氧化氫酶的存在下發生反 應，和實施例1中一樣在T-HA分子間形成二酪胺交聯從而相應地生成 水凝膠l、 2、 3、 4和5。令人吃驚和出乎意料地發現根據制備中T-HA 濃度的不同，五種水凝膠成為具有不同物理性質的穩定和基本粘著的 材料。例如，濃度1生成的水凝膠具有與凡士林或果凍相當的硬度和 流變學性質；水凝膠穩定且粘著，然而用諸如抹刀或其它傳統工具施 加外力可以引起流動或伸展。水凝膠1具有極佳的粘性，是外科手術 如眼外科手術中外科器械的非過敏性包被材料的理想候選材料。水凝 膠2比水凝膠1更加堅硬，這是由于制備中T-HA的濃度更高及隨后可 預見的T-HA濃度的增加引起的分子內交聯的減少和分子間交聯的增 加。水凝膠2呈現出凝膠特征性的流變學和硬度性質，以及對于外部 載荷一定程度的粘反彈力。在更大的載荷下，水凝膠2不會流動而是 破裂成小碎片，這也是凝膠材料的特征。水凝膠3具有生面團或可延 展面團的性質和一致性，在施加外部載荷力時也不會流動。和水凝膠l 和2相比，該材料顯示出更強的粘彈性。水凝膠4是高度堅硬和粘著 的凝膠，能夠很強地抵抗外力不會破裂。水凝膠4是具有高度彈力的 類橡膠合成物，在突然性壓力(如摔在地板上)下可以產生彈力。水 凝膠4這種對于突然性壓力產生彈力的能力使其在一些關節置換/修復
應用中成為理想的材料，這些關節要經受重復性的或周期性的壓力載 荷(如踝關節)。除了所述水凝膠4的性質外，水凝膠5具有類軟骨性 質，外觀類似關節軟骨且用手術刀片切割時具有軟骨的感覺。
進行封閉抗壓測試以定量地確定上述五種不同的水凝膠的壓縮機 械性質。封閉抗壓測試使用定制的聚碳酸酯封閉箱和多孔的聚丙稀濾
器滾筒(20 Mm孔，20%有孔率)。用封閉箱和以下實施例4所述的冷 凍一融解技術制備五個具有各水凝膠濃度的圓柱形栓(直徑為7. 1 mm， 厚度大約3mm)。隨后按照下列測試步驟進行封閉抗壓中的一系列應力 釋放實驗。所有實驗用Instron 5543測試儀在電腦控制下進行，機器 以10 Hz的頻率記錄時間一位移—載荷數據。每個實驗均使用士5 N或 ±50 N的荷重儀(Sensotec)對載荷量全程跟蹤。每一步使用30 Mm (30 Mm/秒)的速度，該速度相當于1%的張力，直至樣品達到平衡。 這被定義為弛豫率，當該弛豫率減慢至10 mN mirf i以下時，下一步自 動啟動直至完成20個循環(相當于大約20%的張力)。封閉抗壓測試 中各樣品的厚度采用機械法確定，通過Instron 5543儀測量抗壓反應 引起的樣品相對于箱底的位移。測試的厚度用于計算每一步的張力百 分比。
五種水凝膠的壓縮機械性質通過前一節所述的方法確定。載荷數 據用樣品橫剖面面積(39. 6 mm2)進行標準化以計算應力。每種材料配 方的平衡應力對所加張力描點作圖。每一步的聚集系數定義為平衡應 力除以所加張力。對于每種材料，聚集系數定義為平衡應力一張力數 據在線性最好的范圍內的斜率。圖4顯示了封閉抗壓測試的結果。所 有五種水凝膠均可以進行封閉抗壓測試并在測試中證明了典型的兩相 材料(如軟骨)特征性的張力弛豫反應。6. 25 mg/ml和12. 5 mg/ml H-TA 水凝膠的聚集系數比關節軟骨低1_2個數量級。25 mg/ml T-HA水凝 膠的聚集系數是關節軟骨的報道值的一半。50和100 mg/ml T-HA水凝 膠的聚集系數在線性區域小于關節軟骨的報道值，但是大于關節軟骨 在15 — 20%張力下的值。這些數據證明了用標準機械分析可以對水凝 膠進行鑒定，并且證明了可以生成與關節軟骨具有相似機械性質的水 凝膠。
基于以上實驗，驚人并出人意料地發現二酪胺交聯的透明質酸網 絡可以生成粘著的水凝膠材料，為了適應特定的應用，通過在對酪胺
基團進行交聯前變化T-HA的濃度可以改變水凝膠的硬度和其它物理性
質(流變學)。即使網絡中沒有(或基本沒有)任何so廣基團提供電荷
一電荷排斥力產生材料的抗壓性和彈性，仍然觀察到這些水凝膠的粘 著性和彈性。這個相當驚人和出乎意料的結果在組織工程應用中可能 具有相當積極的作用。透明質酸是在人體內發現的高度普遍存在和無 免疫反應性的分子。因此，由二酪胺交聯透明質酸網絡組成的水凝膠 可以成為非常合適的組織置換材料移植入人體內，其硬度可以根據應 用的需要加以調節。由于這些材料主要由沒有發生改變的無免疫反應 性的透明質酸組成，人們相信該材料可能引起的免疫反應為零或接近 于零。這是和很多傳統組織工程材料相比具有的重要優勢，傳統材料 由于在化學合成中苛刻的反應條件或反應試劑，其在體內的應用受到 阻礙，且材料最終的化學結構具有更大的誘發免疫反應的可能。
實施例4
己經發展了多種制備方法用于在事先確定的三維形狀中制備或形
成水凝膠，諸如上述實施例3中的水凝膠。這對于很多組織工程應用
非常重要，這些應用中必須將人工組織材料填入病人的天然組織缺陷 或空洞中。
第一種方法是采用原位點形成技術，在該技術中水凝膠在原位置 形成，即以最終應用的位置和結構的形狀形成。此原位點形成方法按
如下實驗方法進行。酪胺取代透明質酸(T-HA)通過在此描述的碳二 亞胺介導途徑制備。在透析去除未反應的酪胺、EDC、 NHS等以及將產 物以理想濃度溶解于PBS中后(見以上實施例l)，將小量山葵過氧化 物酶加入T-HA制備液體中形成第一溶液。將第一溶液加入內部具有特 定幾何形狀的實驗室容器中(模擬體內位點)。隨后，制備含有很稀的 過氧化氫的第二溶液(終濃度為0. 012%_0. 00012%)。隨后將相對于第 一溶液而言小體積的第二溶液注射進已經裝有第一溶液的容器從而起 始二酪胺交聯反應生成水凝膠。通過該技術制備的水凝膠具有以上實
施例3中所述的不同的硬度和流變學性質，并且很好地與制備容器的 內表面輪廓吻合。由于主要的試劑(H202、透明質酸和過氧化物酶)是
非過敏性分子或擴散性分子，并且由于交聯反應在代謝的溫度和pH下
進行，該技術可作為手術程序在病人體內的手術位點操作，從而生成 缺陷適配水凝膠。該方法對于面部重建手術特別具有吸引力，該手術
中外科醫生可以將未交聯的T-HA制備物(包含過氧化物酶)進行皮下 注射并操作以形成理想的面部輪廓，隨后通過注射小體積的過氧化氫 溶液使水凝膠發生交聯。
第二種方法是多孔模具技術，適合形成具有更復雜三維結構的水 凝膠。該技術中首先根據所需最終結構的形狀和輪廓制備多孔中空模 具。例如，如果需要立方形水凝膠，制備的模型可以具有立方體形的 內表面。模具可以用傳統的多孔材料通過傳統技術制備或澆鑄，例如 熟石膏、多孔或燒結塑料或金屬等。在特別優選具體實施方案中，模 具用纖維素透析膜制備。按以上方法制備第一和第二溶液，將第一溶 液裝入多孔模具中空的模巢中。隨后，將裝滿的模具用極稀的過氧化 物浴浸沒。大分子T-HA和過氧化物酶由于其分子尺寸不能從多孔模具 中擴散出模具，但是非常小的過氧化物分子(H202)能夠擴散進模具并 在過氧化物酶的存在下發生反應生成二酪胺交聯。在該方法中交聯自 外向內發生生成最終的水凝膠形狀，且在過氧化物浴中需要一定程度 的試錯法以決定最優的或充分的浸沒時間。本領域的普通技術人員有 能力確定這段時間的長短。通過這種多孔模具技術在實驗室實驗中已 經成功完成了三維水凝膠的制備。
第三種方法是冷凍—融解技術，該技術適用于制備具有預先確定 的高度復雜三維形狀的本發明的水凝膠，例如人耳內部折回。在該技 術中，模具用柔軟的或有延展性的材料制備，如具有低玻璃轉換溫度 的多聚體材料，例如低于一8(TC。優選的模具材料是具有低玻璃轉換 溫度的硅樹膠，如玻璃轉換溫度大約為一127。C的聚二甲基硅氧烷，當 然其它合適的低玻璃轉換溫度的硅樹膠(例如低于一8(TC)及其它多 聚體也可以使用。首先通過傳統或適用技術(即模壓成形法、雕刻法 等)制備硅樹膠(首選材料)，使其內部模巢和所需的水凝膠部分的表
面形狀、輪廓和體積吻合。如上制備第一和第二溶液并將第一溶液加 入硅樹膠模的內部模巢中。充填后的硅樹膠模隨后通過與固體C02 (干 冰)接觸冷凍至大約一8(TC。由于第一溶液主要是水，溶液冷凍成固 態冰的形式與模具的內表面的形狀和輪廓吻合。但是，玻璃轉移溫度
低于一8(TC的硅樹膠模仍然是柔軟且有延展性的，可以輕易地將第一
溶液的固態冰形式取出。由于第一溶液在冷凍時發生膨脹，應當使用 合適的機械器材確保在溶液膨脹時硅樹膠模不會變形或膨脹。優選地， 在模中提供出入孔，當第一溶液在冷凍過程中膨脹時允許溶液的膨脹 及釋放。
一旦第一溶液的固態冰形式被制成模，三維結構中微小的缺陷或 瑕疵可以使用合適的工具通過雕刻加以修復，且可以加入更多的液態 第一溶液充填表面空洞，液體通過和固態冰形式接觸瞬間凍結。同樣 地，如果希望保證一致的溫度以及確保所有加入的第一溶液材料的凍 結，可以將冰放回干冰表面。 一旦冰的三維形狀完美形成，將其浸沒 于液態過氧化物溶液中自外而內地起始冰凍水的融化及二酪胺的交 聯。由于交聯反應的快速動力學，這種方法是可行的。當形成的水凝 膠的中心最后剩余的冰凍水融化時認為交聯完成，由于形成的水凝膠 基本透明，所以很容易觀察到交聯的完成。
根據該冷凍一融解技術已經進行了非常成功的實驗生成了人耳形 狀的本發明的固體水凝膠。通過這種方法可以形成的其它結構，如椎 間盤、半月板等，對于本領域的技術人員而言是顯而易見的。在該冷
凍一融解技術中應當注意的是，模具材料的臨界玻璃轉移溫度一8(TC 是大致根據固體C02 (干冰)的表面溫度選擇的，從而確保在第一溶液 冷凍生成固態冰的形式時模具材料不會變得易碎。但是如果使用C02 以外的其它冷凍材料，合適的模具材料的臨界玻璃轉移溫度可以相應 的調整。
對于上述生成水凝膠的三種方法，第一溶液含有過氧化物酶和 T-HA，而第二溶液含有過氧化物。盡管可以交換第一和第二溶液中的 過氧化物酶和過氧化物，但將過氧化物與T-HA加入第一溶液并非優選。 這是因為一旦將過氧化物、過氧化物酶和T-HA混合，T-HA迅速地開始形成交聯的大分子網絡。如果過氧化物酶(過氧化物酶是大分子)還
沒有均勻地分布于T-HA內，過氧化物酶可能不能或基本難以通過形成 的水凝膠的孔擴散，難以在整個T-HA/過氧化物溶液中生成均一的交 聯。結果可能導致T-HA不均一的和/或不完全的交聯和不均一的水凝 膠。相反地，相對小的過氧化物分子(過氧化氫只比水大一個氧原子) 可以相對容易地通過水凝膠的孔結構進行擴散，生成均一的水凝膠結 構。
此外，過氧化物酶的大分子量使得其與T-HA類似地保留在多孔模 具中，該模具只對小分子量過氧化物具有滲透性，過氧化物可以通過 模具和新生成的大分子網絡(即水凝膠)輕松且均一地發生擴散。由 于這些原因，優選在第一溶液中均一分布過氧化物酶和T-HA，在第二 溶液中單獨提供過氧化物。
第四種方法是交互噴霧層覆或刷涂層覆技術。按上述方法制備第 一溶液并包含過氧化物酶和T-HA。但是，第二溶液不僅含有上述的過 氧化物，并且含有與第一溶液相同濃度的T-HA。隨后將第一溶液的薄 層涂在所需位點(原位點)隨后覆蓋上第二溶液的薄層。重復該步驟 連續交替噴刷第一和第二溶液層直至缺陷或使用位點充填完成。非常 薄的第一和第二溶液的交替層促進了二酪胺交聯的完成，確保了最終 水凝膠的高度一致性，且水凝膠具有理想的由兩溶液的起始T-HA濃度 決定的流變學性質。理想的液體層很薄，以確保第一溶液層中過氧化 物酶生成的自由基能夠完全滲透進相鄰的第二溶液層并完成交聯，該 交聯不依賴于過氧化物酶向第二溶液層的擴散(見上)。在兩溶液中均 包含T-HA從而保證在最終水凝膠中均一的T-HA濃度。在實驗室實驗 中已經完成了該技術并生成了輪廓吻合和大量充填的均一的水凝膠。 當需要生成薄而變化的酪胺交聯HA層時該技術高度適用，如在骨關節 炎裸露的關節的表面，在病人的移植位點幾乎沒有健康的軟骨。
以上所有四種技術對二酪胺交聯透明質酸進行描述，但是應該知 道在本發明的范圍內的其它組合(其它二羥基苯交聯大分子，如聚羧 酸酯、聚胺、聚羥基苯分子和它們的共聚物)可以通過以上技術制模。
實施例5
將大鼠的軟骨細胞埋入(交聯的)T-HA水凝膠中以測試它們在交 聯反應中的存活能力。將活細胞加入第一溶液與T-HA和過氧化物酶共 同分散，隨后加入含有過氧化物的第二溶液起始二酪胺交聯，于是分 離得到的軟骨細胞被懸浮于實施例2中描述的1. 7%和4. 7%的T-HA水 凝膠中。埋有軟骨細胞的1. 7%和4. 7%T-HA水凝膠中均一地分布了軟骨 細胞，且凝膠視覺透明，整個凝膠具有可視性。采用葡萄糖利用作為 交聯形成水凝膠后細胞活力的指示劑，因為軟骨細胞對于葡萄糖消耗 巨大，在少于24小時內耗盡葡萄糖培養基。結果顯示埋于T-HA水凝 膠中的軟骨細胞與在單層中培養的相同的軟骨細胞在24小時中具有基 本相同的葡萄糖消耗情況(圖5)。該情況持續長達7天，說明細胞是 活的且代謝活躍。培養基葡萄糖通過標準己糖激酶分析進行測試。
對于含有軟骨細胞和軟骨組織的T-HA水凝膠的凍結部分還進行了 熒光成像。水凝膠骨架和軟骨基質的HA樣品通過生物素標記的HA結 合蛋白(b-HABP)試劑熒光染色成像，而細胞核用標準的DAPI染色成 像。b-HABP試劑用純化的軟骨聚集蛋白聚糖(只含G1結構域)和連接 蛋白制備，該試劑識別并不可逆地與天然HA片斷結合，這些片斷正常 情況下與軟骨中的聚集蛋白聚糖和連接蛋白相結合。結果顯示b-HABP 對T-HA水凝膠的染色比對軟骨染色效果更強，因為組織中的透明質酸 已經結合了天然聚集蛋白聚糖和連接蛋白。在水凝膠T-HA骨架和懸浮 的軟骨組織基質之間沒有明顯分別意味著嚴密的整合。這些結果證明 了在水凝膠交聯反應中保持軟骨細胞活性的可行性，以及水凝膠嚴密 地整合進己存在的軟骨基質的能力，兩者均對軟骨修復的應用非常有 利。結果還證明T-HA中足夠多的片段在化學上保持不變，并可以在原 位點與新合成的聚集蛋白聚糖和連接蛋白結合。結果還證實氧氣、二 氧化碳、葡萄糖和胰島素可以在本發明的T-HA水凝膠中以一定速率擴 散，該速率對軟骨細胞代謝不發生限制，這不僅對于軟骨置換物非常 重要，而且對于其它應用如葡萄糖感應器設計和人工腎的發展非常重 要。
為了將細胞如軟骨細胞加入用實施例4中的冷凍/融解技術以復雜
的組織形態制模的水凝膠中，人們希望酶驅動交聯反應在標準的細胞
冷凍溶液的存在下進行，比如包含10%二甲亞砜(DMS0) /90%胎牛血 清(FBS)的細胞冷凍溶液。這一點己在實驗室中通過實施例3中描述 的所有T-HA水凝膠配方加以了證實。能夠直接加入含有90%FBS的溶 液也證明了反應中可以包含生物活性因子，如生長因子、荷爾蒙和控 制細胞分化的因子，因為這些因子是FBS的正常組分。
雖然上述具體實施方案組成了優選實施方案，應該清楚的是，在 不悖離所附權利要求書中所述的本發明的精神和范圍的情況下，可以 對本發明進行各種改變或修正。
權利要求
1.一種制備水凝膠的方法，所述方法包括的步驟有a)提供含有過氧化物酶或過氧化物的第一溶液，但溶液中不同時含有上述兩種物質，溶液中還含有選自羥基苯取代聚羧酸酯、羥基苯取代聚胺、其它聚羥基苯分子以及它們的共聚物的大分子；b)提供第二溶液，該溶液含有所述第一溶液中沒有提供的所述過氧化物酶或過氧化物中的一種；以及c)混合所述第一和第二溶液促使二羥基苯交聯以形成所述水凝膠。
2. 如權利要求1中所述的方法，所述方法進一步包含無孔模具， 所述模具的內模巢與所需水凝膠部分的形狀、輪廓和體積吻合，所述 方法還包括在所述內模巢中混合第一和第二溶液生成具有內模巢形狀 的所述水凝膠。
3. 如權利要求1中所述的方法，所述方法進一步包含的步驟有d) 提供用多孔材料制作的模具，所述模具具有與所需水凝膠部分 的形狀、輪廓和體積吻合的內模巢；e) 在所述模具的所述內模巢中提供所述第一溶液；以及f) 將其中含有所述第一溶液的所述多孔模具浸沒于所述第二溶液浴中從而促使所述的二羥基苯交聯和所述水凝膠的生成。
4. 如權利要求1中所述的方法進一步包含的步驟有d) 提供用柔韌材料制作的模具，所述模具具有與所需水凝膠部分 形狀、輪廓和體積吻合的內模巢；e) 在所述模具的所述內模巢中加入所述第一溶液；f) 冷卻所述模具，凍結內模巢中的所述第一溶液，生成具有所述 內模巢形狀的固態冰形式；以及 g)將所述固態冰形式浸沒于所述第二溶液浴中由此促使凍結水 的融解和二羥基苯的交聯以形成所述水凝膠。
5.如權利要求1中所述的方法，所述第二溶液進一步包含所述大 分子，所述步驟進一步包含在位點交替使用第一和第二溶液層由此促 使所述二羥基苯交聯和所述水凝膠的形成。
全文摘要
本發明提供了二羥基苯交聯的大分子網絡，該網絡可用于人工組織和組織工程應用中，如人工或合成軟骨中。在該網絡制備中首先提供聚胺或聚羧酸酯大分子(在分子鏈上分別帶有多個胺基或羧酸基團)，該大分子若是聚胺，則將其與帶有自由羧酸基團的羥基苯化合物反應，若是聚羧酸酯，則與帶有自由一級胺基團的羥基苯化合物反應，通過碳二亞胺介導的反應途徑將羥基苯化合物取代至大分子上生成羥基苯取代大分子。隨后在代謝的溫度和pH條件下，在分別與不同大分子相連的兩個羥基苯基團間發生酶催化二聚化反應，從而將該大分子連接至另一大分子上。在優選具體實施方案中，大分子網絡由通過二酪胺鍵連接的酪胺取代透明質酸分子組成，從而提供了具有理想物理性質的穩定、粘著的水凝膠。本發明還提供了制備該網絡的方法。
文檔編號C08G63/91GK101366974SQ200810088049
公開日2009年2月18日 申請日期2004年1月9日 優先權日2003年1月10日
發明者安東尼·卡拉布羅, 安尼克·B·達爾, 理查德·A·格羅斯 申請人:克利夫蘭臨床基金會