專利名稱：篩分型吸附樹脂的制備及在分離人參皂甙單體Rb1中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及吸附樹脂的合成和中藥有效成分的分離技術領域，特別是合成平均孔徑小而且孔徑分布均勻的高選擇性聚苯乙烯吸附樹脂，使其具有篩分和吸附的協同作用，能夠按照分子尺寸的差別進行精確篩分，最后將其用于分離人參總皂甙、三七總皂甙提取物中的單體皂甙Rb1。
背景技術：
含有人參皂甙類有效成分的中藥材在民間傳統用藥和現代藥物開發研究中都表現出顯著的生物活性，例如人參、西洋參、三七等。多年的實踐表明，它們對于心血管系統、血液和造血系統、中樞神經系統、免疫系統均有很好的藥理活性，可以延緩人體衰老。人參皂甙中的藥理成分主要含有幾種結構相近的單體皂甙成分，如人參皂甙Rb1，人參皂甙Rg1，人參皂甙Re，另外三七中還含有一種特殊的單體皂甙三七皂甙R1。它們的結構如下 一般的，單體皂甙幾乎可以再現總皂甙的全部生物學活性，但是隨著研究的深入，人們發現有些單體皂甙具有獨特的藥理作用，甚至發現有些單體皂甙具有相反的藥理活性，如Rg1有較強的溶血作用，而Rb1則具有抗溶血作用，Rb1促進血小板聚集，而Rg1、Re抑制血小板聚集。在膽固醇代謝的影響研究中，有人認為原人參二醇為甙元的人參皂甙Rb1等刺激膽固醇合成的作用較強，而以原人參三醇為甙元的人參皂甙Rg1、Re則作用較弱，因此單體皂甙的不同配比能夠實現不同的藥效。
在人參總皂甙中單體皂甙Rb1的藥理研究引起人們的極大關注，江沛等人的研究結果證實，Rb1的抗模擬移植肺缺血再灌注損傷作用效果明顯，而Rg1對肺缺血再灌注損傷無明顯抑制作用[江沛，等.人參皂苷Rb1和Rg1對模擬移植肺的保護作用，中山醫科大學學報，1997，18(2)85～88]，所以Rb1是一種很有前途的保護移植肺的藥物，值得進一步研究。另外更為重要的是Rb1可以經過化學轉化方法對其進行化學結構的修飾改造，得到某些次生甙的純品。次生甙一般具有明顯的藥理活性，如Rh2是一種新近發現的抗腫瘤、抗轉移的天然植物成分，化療增效減毒的首選藥物[全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編上冊[M]，北京人民衛生出版社，1992.20.]；次生甙Rg3具有抑制腫瘤新生血管形成的作用[1，潘子民，葉大風，謝興，等.人參皂甙Rg3對荷瘤卵巢癌的嚴重聯合免疫缺陷鼠的抗腫瘤血管生成作用的研究[J].中華婦產科雜志，2002，37(4)227-230；2，高勇，王杰軍，許青.人參皂甙Rg3抑制腫瘤新生血管形成的研究[J].第二軍醫大學學報，2001，22(1)40-42]。因此，次生甙具有極高藥用價值和應用前景。二十世紀80年代開始，國際上很多學者努力開發次生甙產品。但是這些次生甙一般含量甚微或者植物中不含有，只是一種代謝產物，所以極大的限制了它的應用開發，因此若能從含量較高的人參皂甙單體通過化學結構的修飾或改造得到所需的次生甙，(例如從人參中提取人參二醇類皂甙Rb1，水解法改變二醇類皂甙糖基制備低極性人參皂甙[章春芳，低極性人參皂甙的制備研究，安徽化工，2005，(3)25])，對于人參皂甙的藥用研究必將更加深入。目前單體皂甙的主要來源仍然是從天然植物中提取分離，一般是溶劑萃取法，反復過硅膠柱和Sephadex柱，步驟繁瑣，耗費大量的溶劑且得到的產品僅限于定量分析用。其對分離差別小的化合物分離差，操作時間長，溶劑耗費量大。有的用正相或者反相的HPLC來對單體皂甙進行分離，雖然得到的產品純度較高，但是一般得到的量也是比較少，僅限用于分析用，且成本比較高，且HPLC所以的流動相一般有乙腈，毒性也是很大的。因此建立一種過程簡單、成本較低、環境友好的分離方法以制備高純度的單體皂甙是非常有意義的。大孔吸附樹脂具有穩定性高，吸附容量大，選擇性好和容易再生等優點，在許多中藥的有效成分提取和分離中取得了很好的效果，成為推進中藥現代化不可缺少的分離技術，用樹脂法來分離總皂甙中的單體皂甙Rb1的研究還未見報道。由于總皂甙中幾種主要單體皂甙的結構相似，分子量以及極性差別不大，用一般的大孔吸附樹脂難于分離。
發明內容本發明目地是解決現有技術中存在的上述問題，提供一種高選擇性的聚苯乙烯型吸附樹脂的制備方法，并將其用于人參總皂甙、三七總皂甙提取物中單體皂甙Rb1的分離，以市售的提取物為原料，只經“吸附一脫附”一步簡單工藝，即可達到人參皂甙Rb1與其他單體皂甙的完全分離。
本發明為解決上述問題所采用的方案是，改變傳統的大孔吸附樹脂由非良溶劑經相分離致孔的方法，采用傅氏烷基化后交聯方法合成一種平均孔徑較小且孔徑分布均勻的新型孔結構的吸附樹脂，此類樹脂兼具篩分和吸附雙重功能，可實現總皂甙中分子尺寸較大的單體皂甙Rb1的分離。
本發明提供的篩分型聚苯乙烯吸附樹脂的具體制備方法，通過以下步驟實現
(1)低交聯聚苯乙烯吸附樹脂的制備在常溫下，將明膠或聚乙烯醇溶解于水中，配成0.5％-5％的水相，加熱至30-50℃，以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應油相(二乙烯苯占混合單體總質量的0.5-1.5％)，其中水相與油相體積比為3∶1，以過氧化苯甲酰為引發劑，用量為混合單體總質量的1-3％，經懸浮聚合，緩慢升溫至70-80℃反應3小時以上，再緩慢升溫至85℃反應3小時，再緩慢升溫至95℃以上反應3小時，經過濾、洗滌處理后，制備出低交聯凝膠型聚苯乙烯樹脂，簡稱白球。
(2)低交聯氯甲基化的苯乙烯樹脂的制備常溫下在三口瓶中加入白球，以氯甲醚和二氯乙烷的混合溶液充分溶脹，混合溶液用量為白球質量的6-8倍，氯甲醚和二氯乙烷的體積比為1∶2。加入ZnCl2作催化劑，用量為低交聯聚苯乙烯質量的40-80％，充分混勻，然后升溫到30-40℃，反應8-12小時，經過濾、洗滌處理后，制備出低交聯氯甲基化的苯乙烯樹脂，簡稱氯球。
(3)篩分型聚苯乙烯吸附樹脂的制備常溫下在三口瓶中加入氯球，用二氯乙烷充分溶脹，用量為氯球質量的8-10倍，在攪拌下滴加四氯化錫和二氯乙烷混合溶液，用量為低交聯氯甲基化苯乙烯樹脂質量的50-70％，且四氯化錫和二氯乙烷的體積比為1∶1-2∶1，以0.5-2.0℃/min的速度將溫度升至80-100℃，反應8-10小時，停止反應，過濾，洗滌，得到的樹脂于索氏提取器中用無水乙醇提取6-8小時，將樹脂取出晾干，真空干燥，得到本發明所需的篩分型聚苯乙烯吸附樹脂。
其外觀特征和結構參數為樹脂為紅棕色半透明的球形顆粒，粒徑0.3-1.0mm，比表面積為1200-1600m2/g干樹脂，含水量為50-70％，平均孔徑為2-3nm，孔隙率50-80％。
上述篩分型聚苯乙烯吸附樹脂在分離三七總皂甙、人參總皂甙提取物中單體皂甙Rb1的應用(1)將市售人參皂甙、三七皂甙提取物用水溶解，制得吸附溶液。
(2)將以上制備的吸附樹脂裝入吸附柱中，吸附柱的規格為柱直徑/柱長為1/8-1/20。
(3)室溫下，將吸附溶液以0.3-1.0BV/小時的流速通過樹脂柱，其中Rb1無法擴散進入樹脂孔中被有效吸附而隨吸附溶液從樹脂柱中流出，其它皂甙被完全吸附在樹脂柱上。
(4)每次吸附時，樹脂的處理量為8-19mg總皂甙粗提物/ml濕樹脂，粗提物中總皂甙含量為60％-75％，其中Rb1含量為20％-35％。
(5)吸附完成后，收集吸附流出液，樹脂柱以70％乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，流出液和洗脫液分別經減壓蒸餾回收溶劑，濃縮、真空干燥，得到兩種固體產品，分別經Waters484高效液相色譜儀檢測，流出液蒸干后的固體產品中只含有人參皂甙Rb1，基本不含其余單體皂甙，而洗脫液蒸干后的固體產品中不含人參皂甙Rb1而只含其余單體皂甙。
本發明的優點和積極效果本發明根據單體皂甙的結構特征和尺寸大小差別，合成了一種孔徑小而均勻、且孔徑在一定范圍內可調的新型孔結構的聚苯乙烯型吸附樹脂，利用該樹脂所具有的篩分和吸附雙重功能，可實現分子極性差別不大，結構相似，但是在分子尺寸上有差別的分子的分離。由于Rb1的尺寸較大而無法進入樹脂孔道被吸附，從而在吸附過程中隨吸附溶液從樹脂柱中流出，其余單體皂甙由于尺寸較小，可以進入樹脂孔道被吸附，吸附完成后，樹脂柱用一定濃度的乙醇解吸，這幾種單體皂甙隨洗脫液流出，因此我們只通過“吸附-洗脫”一步簡單工藝，既可實現Rb1和其它單體皂甙的完全分離，避免了現有分離工藝中使用大量強毒性、易揮發、易燃的有機溶劑且分離工藝煩瑣的缺陷，本發明工藝簡單，不使用毒性有機溶劑，環境友好，樹脂可再生使用，生產成本低，人參皂甙Rb1的純度高于50％，且不含有其它單體皂甙，可為進一步的藥用開發提供大量試驗樣品。
具體實施方式
實施例1篩分型吸附樹脂的制備方法，通過以下步驟實現在常溫下，將聚乙烯醇溶解于水中，配成濃度1.0％的水溶液450ml，于1000ml三口瓶中水浴加熱至45℃；將148.5g苯乙烯、1.5g二乙烯苯、1.5g過氧化苯甲酰混合均勻后加入三口瓶中，開動攪拌，調節油珠大小適宜，經懸浮聚合，78℃反應3小時以上，再緩慢升溫至85℃反應3小時，再緩慢升溫至95℃以上反應3小時，停止反應，經過濾、洗滌處理后，制備出低交聯凝膠型聚苯乙烯樹脂，簡稱白球。
在1000ml三口瓶中加入40g的白球，以240g氯甲醚和480g二氯乙烷的混合溶劑作溶脹劑，將白球充分溶脹后，25g無水ZnCl2，混合均勻后，升溫至35℃，反應10小時，經過濾、洗滌處理后，制備出低交聯氯甲基化苯乙烯樹脂，簡稱氯球。
在1000ml三口瓶中加入50g的氯球，以500g二氯乙烷使其充分溶脹后，在攪拌下滴加15g四氯化錫和15g二氯乙烷的混合溶液，以1.0℃/min的速度將溫度升至80℃，反應10小時，經過濾，洗滌，于索氏提取器中用無水乙醇提取8小時，取出樹脂，晾干后真空干燥，得到所需的篩分型吸附樹脂，其外觀特征和結構參數為樹樹脂為紅棕色半透明的球形顆粒，粒徑0.4-0.8mm，比表面積為1255m2/g干樹脂，含水量為59％，平均孔徑為2.17nm，孔隙率56.5％。
實施例2
篩分型吸附樹脂的制備方法，通過以下步驟實現在常溫下，將聚乙烯醇溶解于水中，配成濃度1.0％的水溶液4.5升，于10升三口瓶中水浴加熱至45℃；將1.5Kg苯乙烯、0.15Kg二乙烯苯、30g過氧化苯甲酰混合均勻后加入三口瓶中，開動攪拌，調節油珠大小適宜，經懸浮聚合，78℃反應3小時以上，再緩慢升溫至85℃反應3小時，再緩慢升溫至95℃以上反應3小時，停止反應，經過濾、洗滌處理后，制備出低交聯凝膠型聚苯乙烯樹脂，簡稱白球。
在10升三口瓶中加入400g的白球，以2.8Kg氯甲醚和5.6Kg二氯乙烷的混合溶劑作溶脹劑，將白球充分溶脹后，300g無水ZnCl2，混合均勻后，升溫至30℃，反應12小時，經過濾、洗滌處理后，制備出低交聯氯甲基化苯乙烯樹脂，簡稱氯球。
在三口瓶中加入50g的低交聯氯甲基化苯乙烯樹脂，以10倍低交聯氯甲基化苯乙烯樹脂量的二氯乙烷使其充分溶脹后，在攪拌下滴加四氯化錫和二氯乙烷混合溶液，用量均為低交聯氯甲基化苯乙烯樹脂量的55％，并以一定速度將溫度升至90℃，反應8.5小時，經過濾，洗滌，于索氏提取器中提取7小時，取出樹脂，晾干后真空干燥，得到所需的篩分型吸附樹脂，其外觀特征和結構參數為樹樹脂為紅棕色半透明的球形顆粒，粒徑0.3-1.0mm，比表面積為1128m2/g干樹脂，含水量為65％，平均孔徑為2.21nm，孔隙率58.2％。
實施例3上述篩分型吸附樹脂在分離三七總皂甙中單體皂甙Rb1的應用將純度為66.3％的市售三七總皂甙提取物165.0mg(其中人參皂甙Rb1含量為20.6％，人參皂甙Rg1、Re和三七皂甙R1的總含量為45.7％)，溶解于40ml水中，配成吸附溶液，通過裝有上述篩分型吸附樹脂的樹脂柱(柱長20cm，內徑1.5cm，裝有20ml濕樹脂)，吸附速度為1BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脫，流速為1BV/h，流出液和洗脫液分別經減壓蒸餾、真空干燥得固體物，經Waters484高效液相色譜儀檢測，吸附流出液中人參皂甙Rb1含量為53.6％，其它三種單體皂甙未檢出，洗脫液中三種單體皂甙的含量為87.4％，Rb1未檢出。
實施例4將純度為66.3％的市售三七總皂甙提取物357.6mg(其中人參皂甙Rb1含量為20.6％，人參皂甙Rg1、Re和三七皂甙R1的總含量為45.7％)，溶解于40ml水中，配成吸附溶液，通過裝有上述篩分型吸附樹脂的樹脂柱(柱長20cm，內徑1.5cm，裝有20ml濕樹脂)，吸附速度為1BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脫，流速為1BV/h，吸附流出液和洗脫液分別經減壓蒸餾、真空干燥得固體物，經Waters484高效液相色譜儀檢測，吸附流出液中人參皂甙Rb1含量為50.1％，其它三種單體皂甙未檢出，洗脫液中三種單體皂甙的含量為81.2％，Rb1的含量為0.8％。
實施例5將純度為66.3％的市售三七總皂甙提取物362.0mg(其中人參皂甙Rb1含量為20.6％，人參皂甙Rg1、Re和三七皂甙R1的總含量為45.7％)，溶解于40ml水中，制成三七總皂甙溶液以待吸附，通過裝有上述篩分型吸附樹脂的樹脂柱(柱長20cm，內徑1.5cm，裝有20ml濕樹脂)，吸附速度為0.5BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脫，流速為0.5BV/h，吸附流出液和洗脫液分別經減壓蒸餾、真空干燥得固體物，經Waters484高效液相色譜儀檢測，吸附流出液中人參皂甙Rb1含量為55.8％，其它三種單體皂甙未檢出，洗脫液中三種單體皂甙的含量為88.6％，Rb1未檢出。
實施例6將純度為68.5％的市售人參總皂甙提取物357.3mg(其中人參皂甙Rb1含量為31.2％，人參皂甙Rg1和Re的總含量為37.3％)，溶解于40ml水中，配成吸附溶液，通過裝有上述篩分型吸附樹脂的樹脂柱(柱長20cm，內徑1.5cm，裝有20ml濕樹脂)，吸附速度為0.5BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脫，流速為0.5BV/h，吸附流出液和洗脫液分別經減壓蒸餾、真空干燥得固體物，經Waters484高效液相色譜儀檢測，吸附流出液中人參皂甙Rb1含量為62.5％，Rg1和Re未檢出，洗脫液中Rg1和Re的總含量為89.3％，Rb1未檢出。
實施例7將純度為66.3％的市售三七總皂甙提取物801.2mg(其中人參皂甙Rb1含量為20.6％，人參皂甙Rg1、Re和三七皂甙R1的總含量為45.7％)，溶解于100ml水中，配成吸附溶液，通過裝有上述篩分型吸附樹脂的樹脂柱(柱長50cm，內徑2.5cm，裝有100ml濕樹脂)，吸附速度為0.45BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脫，流速為0.45BV/h，吸附流出液和洗脫液分別經減壓蒸餾、真空干燥得固體物，經Waters484高效液相色譜儀檢測，吸附流出液中人參皂甙Rb1含量為58.9％，其它三種單體皂甙未檢出，洗脫液中三種單體皂甙的含量為90.1％，Rb1未檢出。
實施例8將純度為66.3％的市售三七總皂甙提取物1588.4mg(其中人參皂甙Rb1含量為20.6％，人參皂甙Rg1、Re和三七皂甙R1的總含量為45.7％)，溶解于100ml水中，配成吸附溶液，通過裝有上述篩分型吸附樹脂的樹脂柱(柱長50cm，內徑2.5cm，裝有100ml濕樹脂)，吸附速度為0.3BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脫，流速為0.3BV/h，吸附流出液和洗脫液分別經減壓蒸餾、真空干燥得固體物，經Waters484高效液相色譜儀檢測，吸附流出液中人參皂甙Rb1含量為54.3％，其它三種單體皂甙未檢出，洗脫液中三種單體皂甙的含量為87.2％，Rb1未檢出。
實施例9將純度為68.5％的市售人參總皂甙提取物40.0g(其中人參皂甙Rb1含量為31.2％，人參皂甙Rg1和Re的總含量為37.3％)，溶解于4升水中，配成吸附溶液，通過裝有上述篩分型吸附樹脂的樹脂柱(柱長150cm，內徑25cm，裝有2Kg濕樹脂)，吸附速度為0.5BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脫，流速為0.5BV/h，吸附流出液和洗脫液分別經減壓蒸餾、真空干燥得固體物，經Waters484高效液相色譜儀檢測，吸附流出液中人參皂甙Rb1含量為59.3％，Rg1和Re未檢出，洗脫液中Rg1和Re的總含量為91.3％，Rb1未檢出。
權利要求
1.一種篩分型聚苯乙烯吸附樹脂的制備方法，其特征是通過以下步驟實現(1)低交聯聚苯乙烯吸附樹脂的制備在常溫下，將明膠或聚乙烯醇溶解于水中，配成0.5％-5％的反應水相，加熱至30-50℃，以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應油相，二乙烯苯占混合單體總質量的0.5-1.5％，其中水相與油相體積比為3∶1，以過氧化苯甲酰為引發劑，用量為混合單體總質量的1-3％，經懸浮聚合，緩慢升溫至70-80℃反應3小時以上，再緩慢升溫至85℃反應3小時，再緩慢升溫至95℃以上反應3小時，經過濾、洗滌處理后，制備出低交聯凝膠型聚苯乙烯樹脂，簡稱白球；(2)低交聯氯甲基化的苯乙烯樹脂的制備常溫下在三口瓶中加入白球，以氯甲醚和二氯乙烷的混合溶液充分溶脹，混合溶液用量為白球質量的6-8倍，氯甲醚和二氯乙烷的體積比為1∶2，加入ZnCl2作催化劑，用量為低交聯聚苯乙烯質量的40-80％，充分混勻，然后升溫到30-40℃，反應8-12小時，經過濾、洗滌處理后，制備出低交聯氯甲基化的苯乙烯樹脂，簡稱氯球；(3)篩分型聚苯乙烯吸附樹脂的制備常溫下在三口瓶中加入氯球，用二氯乙烷充分溶脹，用量為氯球質量的8-10倍，在攪拌下滴加四氯化錫和二氯乙烷混合溶液，用量為低交聯氯甲基化苯乙烯樹脂質量的50-70％，且四氯化錫和二氯乙烷的體積比為1∶1-2∶1，以0.5-2.0℃/min的速度將溫度升至80-100℃，反應8-10小時，停止反應，過濾，洗滌，得到的樹脂于索氏提取器中用無水乙醇提取6-8小時，將樹脂取出晾干，真空干燥，得到本發明所需的篩分型聚苯乙烯吸附樹脂。
2.根據權利要求1所述的篩分型聚苯乙烯吸附樹脂的制備方法，其特征是所述的吸附樹脂的外觀特征和結構參數為樹脂為紅棕色半透明的球形顆粒，粒徑0.3-1.0mm，比表面積為1200-1600m2/g干樹脂，含水量為50-70％，平均孔徑為2-3nm，孔隙率50-80％。
3.一種權利要求1所述的篩分型聚苯乙烯吸附樹脂在分離三七總皂甙、人參總皂甙提取物中單體皂甙Rb1的應用，其特征是(1)將市售人參皂甙、三七皂甙提取物用水溶解，制得吸附溶液；(2)將以上制備的篩分型聚苯乙烯吸附樹脂裝入吸附柱中，吸附柱的規格為柱內徑/柱長為1/5-1/20；(3)室溫下，將吸附溶液以0.3-1.0BV/小時的流速通過樹脂柱，其中Rb1無法擴散進入樹脂孔中被有效吸附而隨吸附溶液從樹脂柱中流出，其它皂甙被完全吸附在樹脂柱上；(4)每次吸附時，樹脂的處理量為8-19mg總皂甙粗提物/ml濕樹脂，粗提物中總皂甙含量為60％-75％，其中Rb1含量為20％-35％；(5)吸附完成后，收集吸附流出液；樹脂柱以70％乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；流出液和洗脫液分別經減壓蒸餾回收溶劑，濃縮、真空干燥，得到兩種固體產品，分別經Waters484高效液相色譜儀檢測，流出液蒸干后的固體產品中只含有人參皂甙Rb1，基本不含其余單體皂甙，而洗脫液蒸干后的固體產品中不含人參皂甙Rb1而只含其余單體皂甙。
全文摘要
一種篩分型吸附樹脂的制備及在分離人參皂甙單體Rb1中的應用。本發明采用傅氏烷基化后交聯方法合成一種平均孔徑較小且孔徑分布均勻的新型孔結構的吸附樹脂，此類樹脂兼具篩分和吸附雙重功能，可實現分子極性差別不大，結構相似、但在分子尺寸上有差別的物質的分離。由于Rb1的尺寸較大而無法進入樹脂孔道被吸附，其余單體皂甙由于尺寸較小，可以進入樹脂孔道被吸附，因此本發明只通過“吸附—洗脫”一步簡單工藝，既可實現Rb1和其它單體皂甙的完全分離，避免了現有分離工藝中使用大量強毒性、易揮發、易燃的有機溶劑且分離工藝煩瑣的缺陷。本發明分離的人參皂甙Rb1的純度高于50％，且不含有其它單體皂甙，可為進一步的藥用開發提供大量試驗樣品。
文檔編號C08F212/36GK101016357SQ20071005675
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月9日 優先權日2007年2月9日
發明者王春紅, 施榮富, 武春密, 任萍 申請人:南開大學