專利名稱：：疏水蛋白用作可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒的包被劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及具有含疏水蛋白包被的可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，和其制備方法。
背景技術：
：為了使可發型聚苯乙烯能夠無故障的運輸，并減少預發泡聚苯乙烯泡沫顆粒上的靜電荷，通常用抗靜電物質涂布EPS顆粒。時常由于包被劑從顆粒表面被刮掉或洗掉而導致抗靜電性質不令人滿意。抗靜電包被也會導致顆粒結塊和流動性能較弱。EP-A470455描述了具有含季銨鹽和細粒二氧化硅包被的串珠狀抗靜電可發型苯乙烯聚合體，其具有良好的流動性能。疏水蛋白是約100-150個氨基酸的小蛋白，其為絲狀真菌(例如普通裂褶菌(^/^印/^//"附"附附"加))的特征蛋白。它們通常含有8個半胱氨酸單位。疏水蛋白對于接觸面有顯著的親和力，因此適合用于包被表面。因此可能通過用疏水蛋白涂布例如聚四氟乙烯(Teflon)來獲得親水表面。疏水蛋白可以從天然物質中分離出來。我們先前的申請DE102005007480.47>開了制備疏水蛋白的方法。疏水蛋白對于多種應用的用途也已經在現有技術中提出。WO96/41882提出疏水蛋白作為乳化劑、增稠劑、表面活性劑，用于使疏水表面親水、改良親7JC底物的抗水性、制備水包油型乳劑或油包水乳劑的用途。也提出了在藥物上的應用，例如制備軟膏或乳膏，還有在化妝品上的應用，例如護膚或制備洗發香波或洗發劑。WO01/57528公開了在30-80。C溫度下用含有疏水蛋白的溶液涂布窗戶、隱性眼鏡、生物傳感器、醫療器械、用于實驗或儲存的器皿、船外殼、固體顆粒或載客運輸工具的底盤或車體。WO03/53383公開了疏水蛋白用于處理化妝品應用中的角蛋白材料的用途。WO03/10331公開了疏水蛋白包被的傳感器，(例如測量電極)，該傳感器上非共價連有其他物質如電活性物質、抗體或酶。
發明內容因此本發明的主題是除去所提及的缺點，并找到可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒的抗靜電包被劑，其減少顆粒在發泡前或發泡過程中結塊而降低密度的趨勢。相應地，找到了上述的可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒。根據熱塑性聚合體，包被優選包含1-5000ppm、尤其10-1000ppm的疏水蛋白。包被可能還包含防靜電劑和/或包被輔劑，或者可能被應用于含有不同包被劑的進一步涂布。尤其優選只由疏水蛋白或疏水蛋白混合物組成的包被，并且其在可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒上形成單分子層。優選用于可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒苯乙烯聚合體，例如聚苯乙烯(EPS)，或聚烯烴(polyolefin)，例如聚乙烯(EPE)或聚丙烯(EPP)。可發型熱塑性聚合體顆粒是那些能夠例如借助熱空氣或蒸汽而發泡產生膨"長的熱塑性聚合體顆粒。它們通常包含化學的或物理的發泡劑，其量為熱塑性聚合體重量的2-10%，優選3-7%。優選的物理發泡劑是氣體，例如氮或二氧化碳或具有2-7個碳原子的脂肪族烴、乙醇、酮、醚或鹵代烴。尤其優選使用異丁烷、(正)-丁烷、異戊烷、(正)-戊烷、新戊烷、己烷或其混合物。可發和膨脹型熱塑性聚合體顆粒可能還包含有效量的常用輔劑，例如染料、色素、填充劑、IR吸收劑(例如碳黑、鋁或石墨)、穩定劑、阻燃劑例如六溴環十二烷(HBCD)、增效阻燃劑例如二異丙苯或過氧化二異丙苯、成核劑或助流劑。依賴于制造過程，根據本發明的可發型熱塑性聚合體顆粒可能是球形、小珠形或圓柱形的，且通常其平均顆粒直徑在0.05-5mm范圍內，尤其在0.3-2.5mm范圍內，而且如果適當可以通過篩選分為獨立的部分。膨脹型熱塑性聚合體顆粒的平均顆粒直徑在1-10mm范圍內，尤其在2-6mm范圍內，且相應于膨脹程度其密度在10-200kg/m3范圍內。可發型熱塑性聚合體顆粒可以例如通過將熱塑性聚合體顆粒用發泡劑在池中壓力浸漬而獲得，通過在發泡劑存在下進行懸浮聚合或通過在擠壓機或靜電混合機中進行融解浸漬并且隨后在水下進行壓力成粒而獲得。膨脹型熱塑性聚合體顆粒可以通過將可發型熱塑性聚合體顆粒使用例如熱空氣或蒸汽在壓力預起泡機中發泡而獲得，通過將熱塑性聚合體顆粒用發泡劑在池中壓力浸漬并且隨后還原壓力而獲得，或通過包含發泡劑的融解擠壓發泡和隨后的成粒而獲得。術語"疏水蛋白"根據本發明指具有如下通用結構式(l)的蛋白質Xn-G、Xi隱5o-G2-Xo-5—G3-Xi.ioo畫G4-Xi-ioo一C!5"X"5o-G6"Xo-5—G7-Xi-5o-G8-!Xm(1)，其中X可能是任意的20個天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、絲氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、組氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、異亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、蘇氨酸Thr、天冬酰胺Asn、賴氨酸Lys、纈氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)。X也可能在各情況下是相同或不同的。X旁邊的指數表示在各情況下的氨基酸數，C是半胱氨酸，指數n和m是不依賴于彼此的0-500，優選15-300之間的自然數。此外，根據公式(l)的多肽的特征在于，相對于相同大小的水滴與未包被的玻璃表面形成的接觸角，該多肽的特性可使(玻璃表面包被后)水滴接觸角增加至少20。，優選至少25。，和尤其優選30。，其中每一測量均在室溫進行。表示為d到C8的半胱氨酸可以是還原狀態或者彼此形成二硫鍵。尤其優選在分子內形成C-C橋，尤其至少l個，優選2個，尤其優選3個和特別尤其優選4個分子內二石充鍵。本發明優選應用具有通式(ll)的疏水蛋白進行，Xn-C1-X3-25-C2-Xo-2-C3-X5_50-C4-X2-35-C5-X2-i5-C6-Xo-2-C7-X3_35-C8-Xm(II)其中X、C及X和C旁邊的指數與上述定義一致，然而指數n和m在0-300之間，而且通過上述接觸角的變化來區分蛋白質。尤其優選應用具有通式(lll)的疏水蛋白Xn-C、Xs-9一C2匪C3-Xii一39-C4-X2-23—C5-X5-9-C6-C7-X6陽i8—C8-Xm(III)其中X、C及X和C旁邊的指數與上述定義一致，指數n和m在0-200之間，而且通過上述接觸角的變化來區分蛋白質。Xn和Xm殘基可能是天然連接于疏水蛋白的肽序列。然而，也可能其各自或兩者都不是天然連接于疏水蛋白的肽序列。也包括那些疏水蛋白中天然存在的肽序列由非天然存在于疏水蛋白中的肽序列所延長的Xn和/或X加殘基。如果Xn和/或Xm不是天然連接于疏水蛋白的肽序列，此類序列通常長度為至少20個氨基酸，優選至少35個，尤其優選至少50個和特別尤其優選至少100個氨基酸。此類非天然連接于疏水蛋白的殘基也指下文中的融合配偶體。這是為了說明所述蛋白質可能由至少一個疏水蛋白部分和一個融合配偶體組成，自然條件下它們并不以這種形式共同存在。融合配偶體可能選自多種蛋白質。對于多數融合配偶體，其也可能連接一個疏水蛋白部分，例如連接于所述疏水蛋白部分的氨基端(Xn)和羧基端(XJ。然而，也可能例如兩個融合配偶體連接于本發明蛋白質的一個位點(Xn或Xm)。尤其合適的融合配偶體部分是在微生物、特別是大腸桿菌(ECO/Z)或枯草芽孢桿菌(5fl"7/wssw/^7/s)中天然存在的蛋白質。此類融合配偶體部分的實例是序列yaad(SEQIDNO:15和16)、yaae(SEQIDNO:17和18)、和硫氧還蛋白。同樣高度適用的是前述序列的片段或衍生物，其只含有所述序列的部分、優選70-99%、尤其優選80-98%，或相對于所述序列其中個別氨基酸或核苷晚t生了改變，在各情況中所述百分比指M酸數。還可另外修飾根據本發明使用的蛋白質的多肽序列，例如通基化、乙酰化，或者化學交聯(例如通過戊二醛交聯)。根據本發明使用的蛋白質的一個特征是當使用所述蛋白包被表面時，該表面性質改變。通過測量用蛋白質包#_表面前后的水滴接觸角并確定兩次測量之差，可以試驗性確定表面特性的改變。接觸角的測量原則上是技術人員所公知的。測量基于室溫和5升水的小水滴。適合于實施例的用于測量接觸角的方法的精確實驗條件在實驗部分說明。在其中所述的條件下，根據本發明使用的蛋白質與未包被的玻璃表面與同樣大小水滴的接觸角相比具有增加接觸角至少20。，優選至少25°,尤其優選30。的特性。目前已知的疏水蛋白中，疏水蛋白部分的極性和非極性氨基酸的位置是保守的，導致特征性的疏水性圖譜。根據生物物理學性質和疏水性的差異將目前已知的疏水蛋白分為兩類，I類和II類(Wessels等人1994，Ann.Rev.Phytopathol.，32，413-437)。I類疏水蛋白組裝的膜高度不可溶(即使是升高溫度在1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)中也是如此)，并且只能通過濃縮的三氟乙酸(TFA)或曱酸而再次解離。與之相反，II類疏水蛋白的組裝形式較不穩定。它們通過60%濃度的乙醇或1。/oSDS(在室溫)即可再次解離。氨基酸序列的比較揭示，在II類疏水蛋白中(:3和C"半胱氨酸之間區域的長度明顯小于I類疏水蛋白。此外，II類疏水蛋白比I類疏水蛋白具有更多帶電荷的氨基酸。實施本發明尤其優選的疏水蛋白是dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2型的疏水蛋白，下文的序列表對其進行了結構表征。它們也可能僅為所述類型的部分或衍生物。也可能將多個相同或不同結構的多個疏水蛋白部分(優選2個或3個)一起連接于并非天然連接疏水蛋白的相應適宜多肽序列上。實施本發明尤其適合的還有具有SEQIDNO:20、22、24中所示多肽序列的融合蛋白質及其編碼核酸序列，尤其是根據SEQIDNO:19、21、23的序列。尤其優選的實施方案還包括由SEQIDNO:20、22或24所示多肽序列起始，通過取代、插入或缺失至少l個至多10個、優選5個、更優選所有氨基酸的5%而產生的蛋白質，所述蛋白質仍然具有起始蛋白質至少50%的生物特性。此處蛋白質的生物學特性指上述接觸角至少增加20。。根據本發明使用的蛋白質可以通過肽合成的成熟技術化學制備，例如通過Merrifidd固相合成。可以通過合適的手段將天然存在的疏水蛋白從天然來源分離出來。例如可見W6sten等人，Eur.JCellBio.63，122-129(1994)或WO96/41882。融合蛋白質優選通過基因工程方法制備，其中一個編碼融合配偶體的核酸序列(特別是DNA序列)與一個編碼疏水蛋白部分的核酸序列(特別是DNA序列)組合，從而通過組合核^列的基因表達在宿主生物體中產生所需要的蛋白質。在我們的在先申請DE102005007480.4中公開了此類制備方法。此處用于所述構建方法的合適的宿主生物體(生產生物體)是原核生物(包括古細菌04rc/^"efl))或真核生物，尤其是細菌包括嗜鹽菌(/ifl/o^cteWfl)和甲烷球菌(柳e溈fl朋cd)，真菌，昆蟲細胞，植物細胞和哺乳動物細胞，尤其優選大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(5fl"7/船/M"flteWM柳)、米曲霉(/4s/7e/"gz7/MS、構巢曲霉(y45/7^^7/附肌V/w/flW力、黑曲霉045/;erg///MSZger)、巴斯德畢赤酵母(尸Zc/iZfl/mstoWs)、假單胞菌屬物種(i^wfifo附o"as15/7ec.)、乳酸軒菌(/flcto6a"7//)、多形漢遜酵母(^Tam^"w/fl/7((K附or/^fl)、里氏木霉(rnV^otife/7Wffzr^"〕、SF9(或相關細胞)等等。本發明還涉及表達構建體的用途，所述表達構建體包含在調控核列的遺傳控制下編碼根據本發明使用的多肽的核酸序列，并且本發明也涉及包含至少一個此類表達構建體的載體。所用構建體優選包含特定編碼序列的5，上游啟動子和3，下游終止序列，適用的情況下還包含各自與編碼序列有效連接的其他常用調控元件。"有效連接，，指啟動子、編碼序列、終止子和適用情況下的其他調控元件的有序排列，從而使每個調控元件能夠實現其表達編碼序列所需的功能。有效連接序列的實例為尋耙序列以及增強子、多腺苷酸化信號等等。其它調控元件包含可選標記、擴增信號、復制起點等等。合適的調控元件在例如Goeddel，基因表達技術酶學方法185，學術出版社，SanDiego，CA(19卯)中描述。除這些調控序列以外，可能在實際結構基因的上游仍存在對這些序列的天然調控，且適用的情況下可對之進行遺傳修飾，從而通過關閉天然調控而增強基因表達。優選的核酸構建體最好還包含一個或多個與啟動子功能性連接的上述增強子序列，以增強核酸序列的表達。其他有利的序列，例如其他的調控元件或終止子也可插入到DNA序列的3，末端。構建體中可能具有一個或多個拷貝的核酸。如果為篩選所述構建體所需，構建體也可能包含其他標記，例如抗生素抗性或營養缺陷型補償基因。例如，所述方法有利的調控序列存在于啟動子如cos、tac、trp、tet、trp、tet、lpp、lac、lpp匪lac、lacIq醒T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、入-PR啟動子或U啟動子中，這些啟動子最好在革蘭氏陰性菌中使用。其他有利的調控序列存在于例如革蘭氏陽性啟動子amy和SP02,和酵母或真菌啟動子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。也可以〗吏用人工啟動子進行調控。為了在宿主生物體中表達的目的，有利地是將核酸構建體插入例如能夠使基因在宿主細胞中最優表達的載體(例如質粒或噬菌體)。除質粒和噬菌體以外，載體也指技術人員所公知的任何其它載體，即例如病毒(如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒)，轉座子，IS元件，噬粒，粘粒，和線性或環狀DNA，以及農桿菌系統。這些載體可以在宿主生物體中自主復制或隨染色體復制。這些載體構成本發明的其他實施方案。合適質粒的實例是大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pIN國III，，3-Bl、tgtll或pBdCI,鏈霉菌(5^印to附j;cey)的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，桿菌的pUB110、pC194或pBD214，棒狀桿菌(C。/j"Wfl"eWw附)的pSA77或pAJ667,真菌的pALSl、pIL2或pBB116，酵母中的2ot、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23，或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述質粒是可能質粒的一小部分選擇。其它質粒是技術人員所公知的，并且能夠在例如《克隆載體》(Eds.PouwelsP.H.等人Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)中找到。為了表達其它存在的基因，核酸構建體也有利地包含3，-末端和/或5，-末端調控序列來增強表達，所述序列根據宿主生物和基因的選擇而加以選擇，以達到最佳表達。這些調控序列旨在使基因和蛋白質特異性表達。這意味著取決于宿主生物體，例如基因只在誘導后表達或過表達，或者立即表達和/或過表達。在這點上，優選引入的調控序列或因子具有正面影響，并且增強其被引入的基因的表達。因此，使用強轉錄信號(例如啟動子和/或增強子)在轉錄水平增強調控元件是有利的。然而，除此之外，也可能通過例如改良mRNA穩定性來增強翻譯。在載體的另一實施方案中，包含本發明核酸構建體或本發明核酸的載體也可能以線性DNA的形式被有利地引入微生物中，并通過異源或同源重組的方式整合到宿主生物體的基因組中。此線性DNA可能由線性化載體(例如質粒)組成，或僅由核酸構建體或核酸組成。為實現生物中異源基因的最佳表達，最好根據生物中特定的密碼子使用來修飾核酸序列。通過計算機分析所研究生物的其他已知基因，可以確定密碼子的使用。將合適的啟動子與合適的編碼核苷酸序列和終止信號或多聚腺苷酸信號融合來制備表達盒。常規重組和克隆技術見于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室操作手冊，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)和T.J.Silhavy，M丄.Berman和L.W.Enquist，基因融合實驗，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及在Ausubel，F.M.等人，現代分子生物學實驗方法，GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987)中的描述。為了實現在合適宿主生物體中的表達，最好將重組核酸構建體或基因構建體插入宿主特異性載體中，這可使基因在宿主中最優表達。載體是技術人員所熟知的，并且能夠在例如"克隆載體"(PouwelsP.H.等人，Eds.，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。可以利用載體制備例如由至少一個載體轉化的可用于生產本發明所用多肽的重組4敫生物。最好將上述重組構建體引入合適的宿主系統并表達之。在此情況下，優選使用技術人員熟知的常用克隆和轉染方法，例如共沉淀、原生質體融合、電穿孔法、逆轉錄病毒轉染等等，以引起所述核酸在特定表達系統中表達。合適的系統在例如現代分子生物學實驗方法，F.Ausubel等人編輯，WileyInterscience,NewYork1997,或Sambrook等人，分子克隆實驗室操作手冊，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中描述。也可以制備同源重組微生物。為此，可制備包括至少一部分本發明所用基因或編碼序列的載體，適用的情況下，所述編碼序列中引入至少一個氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸取代，從而修飾(例如功能性破壞)該序列(敲除載體)。引入的序列可為例如相關微生物的同源物或由哺乳動物、酵母或昆蟲來源衍生而來。或者，可設計用于同源重組的載體，從而使內源性基因在同源重組時發生突變或其他改變，但仍然編碼功能性蛋白質(例如改變上游調控區域由此改變內源性蛋白質的表達)。本發明所用的基因的改變的部分位于同源重組載體中。適合同源重組的載體的構建在例如Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51:503中描述。適合本發明4吏用的核酸或核酸構建體的重組宿主生物體原則上是任何原核或真核生物體。最好使用微生物例如細菌、真菌或酵母作為宿主生物體。革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌，優選腸桿菌科(五"fe/Y/^ctef7'flceae)、假單胞菌科(i^ew/o附o/ia^iceae)、根瘤菌科(及/^oMfl"ae)、鏈霉菌科(5^印to附ycetoc^^)或諾卡氏菌科(iVoainftVice"e)的細菌，特別優選使用的細菌為埃希氏菌屬(E^&Wc/t/fl)、假單胞菌屬、鏈酶菌屬、諾卡氏菌屬、伯克霍爾德菌屬(5"rA:Ao/rfeW")、沙門氏菌屬(5^/附0^//")、農桿菌屬或紅球菌屬(及/^&C0CC做)的細菌。依據宿主生物體，按技術人員公知的方法生長或培養制備融合蛋白質的過程中使用的生物體。微生物通常生長在液體培養基中，其中包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有機氬源的形式例如酵母提取物，或例如疏酸銨等鹽類)、微量元素(例如鐵鹽、錳鹽和鎂鹽)、以及適用情況下的維生素，生長溫度在0。C到100。C之間，優選10。C到60。C,同時供以氧氣。此種情況培養液pH值可以維持或不維持在固定值，即在培養過程中可以調節或不調節。可以進行分批發酵、半分批發酵或連續培養。可以在發酵最初開始時引入營養素，或以半連續或連續方式進行隨后加料。可以通過實施例中所描述的方法從生物體中分離酶，或者在反應中使用酶粗提物。可以用重組方法制備本發明使用的蛋白質或其功能生物活性片段，通過培養產生蛋白質的微生物，適用的情況下誘導表達蛋白質，而且從培養液中分離所述蛋白質。如杲需要，也可以通過此種方法在工業上生產蛋白質。可以通過已知方法培養和發酵重組孩1生物。例如細菌可以在20-40。C,pH6-9條件下，在TB培養基或LB培養基中繁殖。合適的培養條件例如在T.Maniatis,E.F.Fritseh和J.Sambrook，分子克隆實驗室操作手冊，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中詳細描述。如果本發明使用的蛋白質并非分泌至培養基中，那么就要破壞細胞，通過已知的蛋白質分離方法從溶菌產物中獲得產品。正如所預期的，通過高頻超聲、高壓(例如在弗氏壓碎器中)、滲透、使用去污劑、水解酶或有機溶劑、勻漿等手段，或通過所列出的方法中兩個或更多的組合來破壞細胞。本發明使用的蛋白質可以用已知的層析方法純化，例如分子篩層析(凝膠過濾法)，例如Q瓊脂糖層析，離子交換層析和疏水層析，以及使用其它常用方法，例如超濾、結晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳。合適的方法在例如Cooper,F.G"BiochemischeArbeitsmethoden，VerlagWalterdeGruyter,Berlin,NewYorkorinScopes,R.，蛋白質純化，SpringerVerlag，NewYork,Heidelberg,Berlin中描述。通過載體系統或寡核苷酸分離重組蛋白質可能有利，所述寡核苷酸以特定核苷酸序列延伸了cDNA,從而編碼改變的多肽或融合蛋白質，可用于例如簡化純化。此類合適的修飾的實例是作為錨起作用的"標簽"，例如六組氨酸錨的修飾、或能夠作為抗原被抗體識別的表位(例如在Harlow,E.和Lane,D.，1988，抗體:實驗室操作手冊，ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中描述)。其它合適的標簽是例如HA、鉤調節蛋白-BD、GST、MBD;幾丁質-BD、鏈霉親和素-BD-avi-標簽、Flag-標簽、T7等等。這些錨可以用于將蛋白質附著在固體栽體上，例如聚合體基質，例如其可填充到層析柱中，或用于微孔滴定板或其它載體。相應的純化方法可以從商品化的親和標簽供應商那里獲得。如所述制備的蛋白質可以作為融合蛋白直接使用或切割除去融合配偶體后以"純化的"疏水蛋白使用。當需要移除融合配偶體時，推薦在融合蛋白中疏水蛋白部分和融合配偶體部分之間摻入潛在的切割位點(蛋白酶的特定識別位點)。合適的切割位點具體包括通過生物信息學工具能夠確定的那些否則將既不存在于疏水蛋白部分也不存在于融合配偶體部分中的肽序列。尤其合適的是例如在甲硫氨酸的BrCN切割或蛋白酶介導的Xa因子切割、腸激酶切割、凝血酶、TEV切割(煙草蝕紋病毒蛋白酶)。可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒可以在發泡之前或之后涂布疏水蛋白，例如通過用L6dige攪拌混合器在圓筒中涂布疏水蛋白，或者通過例如浸漬或噴霧法用含有疏水蛋白的溶液接觸所述聚合體顆粒表面。通過擠壓含有發泡劑的熔化物的制備方式還包括向水下裝置的水回路中加入疏水蛋白。可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒優選用濃度為1-100g/l和pH值在5-9范圍內的疏水蛋白的水溶液包被。含有疏水蛋白的溶液通常在0-140。C溫度范圍，優選在30-80'C范圍內應用。根據本發明的可發和膨脹型熱塑性聚合體顆粒是抗靜電的，其在發泡過程中結塊的傾向較低，但是當發泡后塑形時有很好的融合性。實施例實施例1克隆yaad-HisJyaaE-His^的準備工作用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)進行多聚酶鏈式反應。所使用的模板DNA是枯草芽孢桿菌基因組DNA。獲得的PCR片段包含枯草芽孢桿菌yaaD/yaaE基因的編碼序列，和分別在其末端的Ncol和BglII限制性切割位點。純化PCR片段，并用限制性內切酶NcoI和BglII切割。此DNA片段用作插入片段克隆到來自Qiagen的載體pQE60中，該載體預先用限制性內切酶Ncol和BglII線性化。這樣獲得的載體pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5分別用于表達含有YAAD::HIS6和YAAE::HIS6的蛋白質。Hal570:gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagecgcgttcttgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc實施例2yaad疏水蛋白DewA-Hist的克隆用寡核苷酸KaM416和KaM417進行多聚酶鏈式反應。所使用的模板DNA是構巢曲霉基因組DNA。獲得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的編碼序列，和N-末端因子Xa蛋白酶切割位點。純化PCR片段，并用限制性內切酶BamHI切割。此DNA片段用作插入片段克隆到載體pQE60YAAD#2中，該載體預先用限制性內切酶BglII線性化。這樣獲得的載體#508用于表達含有YAAD::Xa::dewA::HIS6的融合蛋白質。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC實施例3vaad疏水蛋白RodA-His^的克隆質粒#513的克隆類似于質粒#508,使用寡核苦酸KaM434和KaM435。KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG實施例4vaad疏水蛋白BASF1-His^的克隆質粒#507的克隆類似于質粒#508，4吏用寡核苷酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成DNA序列-疏水蛋白BASFl-(見附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實施例5vaad疏7jC蛋白BASF2-His^的克隆質粒#506的克隆類似于質粒#508,4吏用寡核苦酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成DNA序列-疏水蛋白BASF2(見附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實施例6vaad疏7jC蛋白SC3-His^的克隆質粒#526的克隆類似于質粒#508，使用寡核芬酸KaM464和KaM465。使用的模板DNA是SchyzophyllumcommunecDNA(見附錄)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT實施例7vaad疏水蛋白DewA-Hisi重組大腸桿菌菌林的發酵將含有表達yaad疏水蛋白DewA-His6的大腸桿菌菌林的3mlLB液體培養基接種于15mlGreiner管中。于37。C在振蕩器上以200rpm培養8小時。將1ml此預培養液各自接種于2個1升有塞子錐形瓶中的250mlLB培養基中(+100ng/ml氨節青霉素)，在37。C以180rpm振蕩培養9小時。將0.5升的預培養液(相對于水測量OD6。。^nl:10)接種于13.5升的LM培養基(+100網/ml氨芐青霉素)中，置于20升的發酵罐。在OD咖腿約3.5時添加140ml的100mMIPTG。3小時以后，將發酵罐冷卻到10°C，并通過離心除去發酵液。細胞沉淀用于進一步的純化。實施例8重組疏水蛋白融合蛋白的純化f帶有C-末端His6標簽的疏水蛋白融合蛋白的純化)100g的細胞沉淀(100-500mg的疏水蛋白)用50mMpH7.5的磷酸鈉緩沖液補足到總體積為200ml，并將沉淀重懸。懸浮液用T25型高速分散器UItraturrax(Janke和Kunkel;IKA-Labortechnik)處理10分鐘，隨后為了降解核酸，再與500單位benzonase核酸酶(Merck，Darmstadt;orderNo.1.01697.0001)在室溫培育1小時。在破壞細胞之前使用玻璃萃取柱(P1)進行過濾。為了破壞細胞和剪斷剩余的基因組DNA,用勻漿器在1500巴進4亍2次處理(MicrofluidizerM-110EH;MicrofluidicsCorp.)。將勻漿液離心(SorvallRC-5B，GSA轉子，250ml離心筒，60分鐘，4°C，12000rpm，23000g)，上清置于水上，用100mlpH7.5的磷酸鈉緩沖液重懸沉淀。重復3次離心和重懸，在第3次重復時磷酸鈉緩沖液中包含1%SDS。重懸以后，將溶液攪拌1小時，然后進行最終離心(SorvallRC-5B，GSA轉子，250ml離心筒，60分鐘，4。C，12000rpm，23000g)。根據SDS-PAGE分析，疏水蛋白存在于最終離心的上清液部分(圖1)。實驗顯示疏水蛋白可以以包涵體的形式存在于相應大腸桿菌中。50ml含疏水蛋白的上清液應用于以50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液平衡的50ml鎳-瓊脂糖高性能17-5268-02柱(Amersham)。用50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液洗柱，隨后用包含200mM咪唑的50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液洗脫疏水蛋白。為了去除咪唑，溶液用50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液透析。圖1描述所制備的疏水蛋白的純化1泳道應用于鎳-瓊脂糖柱的溶液(l:10稀釋)2泳道流出液=清洗步驟的洗脫液3-5泳道洗脫級分的OD280峰圖1的疏水蛋白分子量約為53kD。一些較小條帶代表疏氷蛋白的降解產物。實施例9性能測試疏水蛋白改變水滴在玻璃上接觸角的特性基質玻璃(窗玻璃，SttddeutscheGIas，Mannheim,Germany):-疏7jc蛋白濃度100pg/mL畫玻璃片在50mMpH4的醋酸鈉+0.1%聚氧乙烯(20)去水山梨醇單月桂酸S旨(Tween⑧20)中培育過夜(溫度80°C)-隨后包被，在蒸餾水中清洗-然后于80。C在1。/。十二烷基琉酸鈉(SDS)的蒸餾水溶液中培育10分鐘-在蒸餾水中清洗樣品在空氣中干燥，且在室溫下測定5水滴的接觸角(單位為度)。接觸角的測量用03131^8^接觸角系統(^^15+儀器，軟件為SCA20.2.0.(2002年11月)。根據制造商的說明書進行測量。未處理的玻璃接觸角為30±5。，以根據實施例8的功能性疏水蛋白(yaad-dewA-his6)包被的玻璃接觸角為75±5。。實施例10和11以疏水蛋白pQE60+YaaD+Xa+dewA+HIS6包被EPS小珠包4皮劑疏水蛋白pQE60+YaaD+Xa+dewA+HIS6(SEQIDNO:19)的水溶液，根據實施例8進4亍預處理(50mMNaH2P04，pH7.5，疏水蛋白濃度6.08g/l)。未包被的可發型聚苯乙烯(EPS)小珠直徑在0.7-1.0mm范圍內，其通過懸浮聚合(StyroporF315/N)的方法制備，按如下方法進行干燥和包被稱量50gEPS小珠置于500ml有旋轉瓶蓋的玻璃瓶中，分別與10ml和20ml的疏水蛋白溶液混合，并且在滾筒混合器中室溫攪拌24小時。然后用濾紙濾出疏水蛋白包被的EPS小珠，在室溫干燥5小時。比較實驗VI重復實施例IO，但是不同之處在于用10ml蒸餾水代替疏水蛋白溶液。實施例10和11以及比較實驗中包被的EPS小珠，各自在預膨脹器(Rauscher)中于100。C預發泡2分鐘，以形成聚苯乙烯泡沫珠，并且在存儲3天后融合塑形。通過在存儲2天以后破壞塑形的一半來評估塑形的品質。通過測量預發泡和干燥的聚苯乙烯泡沫珠的表面電阻來評估抗靜電特性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>序列表中DNA和多肽序列的序列名<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>權利要求1.具有含疏水蛋白的包被的可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒。2.根據權利要求l的可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其中基于熱塑性聚合體，該包被包含1-5000ppm的疏水蛋白。3.根據權利要求l的可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其中熱塑性聚合體由聚苯乙烯或聚烯烴組成。4.根據權利要求1到3的任一項的可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其平均顆粒直徑在0.05-5mm范圍內。5.根據權利要求1到4的任一項的可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其中該包被包含通式(II)的疏水蛋白(11)，其中X是任意的20個天然存在的氨基酸，n和m是0-500之間的數值，C是半胱氨酸。6.根據權利要求4的可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其中該包被包含通式(III)的疏水蛋白Xn-C、X5-9-C2-C3-Xu-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm(III)。7.根據權利要求1到4的任一項的可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其中該包,皮包含dewA、rodA、hjypA、hypB、sc3、basfl或basf2型疏水蛋白。8.包^f皮可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒的方法，其中將聚合體顆粒的表面與含疏水蛋白的溶液接觸。9.根據權利要求1到4的任一項的方法，其中所使用的含疏水蛋白的溶液是疏水蛋白濃度為1-100g/1且pH值在5-9范圍內的水溶液。10.根據權利要求1到5的任一項的方法，其中將該表面在0-140。C溫度范圍內與含疏7JC蛋白的溶液接觸。全文摘要本發明涉及具有包被的可發或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，所述包被包含疏水蛋白，尤其是通用結構式(I)的蛋白質X<sub>n</sub>-C<sup>1</sup>-X<sub>1-50</sub>-C<sup>2</sup>-X<sub>0-5</sub>-C<sup>3</sup>-X<sub>1-100</sub>-C<sup>4</sup>-X<sub>1-100</sub>-C<sup>5</sup>-X<sub>1-50</sub>-C<sup>6</sup>-X<sub>0-5</sub>-C<sup>7</sup>-X<sub>1-50</sub>-C<sup>8</sup>-X<sub>m</sub>(I)，其中X代表任意的20個天然存在的氨基酸，n和m代表0-500之間的數值，且C代表半胱氨酸。本發明還涉及所述顆粒作為抗靜電劑的用途。文檔編號C08J9/00GK101189290SQ200680020055公開日2008年5月28日申請日期2006年6月9日優先權日2005年6月10日發明者C·博爾施韋勒,C·埃克斯納,H-G·勒邁爾,J·霍洛赫,M·考羅什,T·薩布科夫斯基,U·鮑斯申請人:巴斯福股份公司