專利名稱：：通過ph操作將污染物與肺炎鏈球菌多糖分離的制作方法
技術領域：
：本發明涉及從用于生產肺炎球菌多糖(pneumococcalpolysaccharide)的肺炎鏈球菌(&r印tococcwj/wewTOom'ae，51.pwew/wow/ae)血清型的細胞溶解產物中去除過量可溶性蛋白質的方法。
背景技術：
：用于疫苗產品的各肺炎鏈球菌血清型的莢膜多糖通過使有機體在復雜液體培養基中生長產生。有機體群體通常從菌種小瓶到菌種瓶按比例增加且經由一個或一個以上具有遞增體積的菌種發酵罐傳代直到達到生產規模發酵體積。生長周期的終點可通過數種方法中的一種確定，此時通過添加有助于細胞壁分解和在細胞達到穩定期時引起細胞溶解的自溶素(autolysin)釋放的洗滌劑使細胞溶解。然后，收集溶解產物肉湯用于下游(純化)加工。所述純化包括數個管柱色譜和滲濾步驟以回收包圍細菌細胞的莢膜多糖。當將多糖與諸如CRM197的高分子量蛋白質接合且調配為含有具有多種血清型的接合物的疫苗時，在將其注射入諸如嬰兒和幼兒的目標群體時，其有助于給予免疫性(對肺炎鏈球菌)。巳設定各血清型的純化多糖中蛋白質含量的規格以降低因疫苗導致的不利結果的危險。舉例來說，在當前銷售的7價肺炎球菌接合物(7vPnC)疫苗(Prevnar)中，純化血清型4多糖中蛋白質含量的規格為以干重計不大于3%且純化血清型6B多糖中蛋白質含量的規格為以干重計不大于2%。在一些情況下，己證明難以移除在整個純化過程后仍存在的殘余蛋白質。通過改變細胞溶解產物的純化過程解決這一問題所做的努力僅獲得中等成果。因此，決定在這一過程的上游側著手解決這一問題。確定主要污染蛋白質為細胞生長和完整性的關鍵。因此，可用于降低總蛋白質的剩余選擇由改變生長和/或收集條件組成。發酵過程相當簡單。將細胞(菌種)在具有大豆基培養基的瓶中擴大，然后經由一或兩個菌種發酵罐傳代，且最終傳代至生產規模發酵罐中。在各步驟中，嚴密監測溫度和pH值，其中pH值通過添加堿性物質(20%碳酸鈉)加以控制。當生長達到某一點時，通過引入啟始細胞溶解過程的諸如脫氧膽酸鈉(DOC)的洗滌劑結束操作。一段保持時間后，將溶解產物肉湯的pH值調節到6.6以使脫氧膽酸鹽和細胞膜復合物沉淀。將這一物質保持直到可通過離心和過濾加工以移除固體。然而，大量蛋白質仍溶解于澄清溶解產物中，從而使得純化多糖中的殘余蛋白質含量超出規格。因此，對在發酵或純化過程中降低數種肺炎球菌血清型中的可溶性蛋白質含量存在需要。
發明內容本發明通過提供一種在純化之前降低復雜細胞肺炎鏈球菌溶解產物肉湯中的蛋白質含量且保持其中莢膜多糖含量的方法滿足這一需要。這一方法包含以下步驟(a)使選定肺炎鏈球菌血清型在大豆基培養基中生長，其包括(i)向含有大豆基培養基的第一個容器接種選定血清型的菌種儲備物，且培育第一個容器直到生長要求得到滿足，和(ii)向含有大豆基培養基的第二個容器接種來自步驟(i)的培養物，同時在第二個容器中維持穩定的pH值和溫度，和———(b)用洗滌劑溶解步驟(a)中所產生的細菌細胞，從而產生含有可溶性蛋白質、細胞碎片、核酸和多糖的溶解產物；(c)攪拌細胞溶解產物歷時足以確保完全溶解和多糖釋放的時間；(d)將細胞溶解產物的pH值降低到小于5.5以使洗滌劑和大部分可溶性蛋白質沉淀析出；(e)在不攪拌的情況下將步驟(d)中所形成的溶液和沉淀保持歷時足以使沉淀沉降的時間；和(f)通過離心和/或過濾加工溶液和沉淀，由此溶液中的莢膜多糖得以保留且可溶性蛋白質得以有效減少。選擇作為本發明的這一實施例的例示性非限制性肺炎鏈球菌血清型為1、4、5、6A、6B、7F和19A。在本發明的一特定實施例中且視步驟(a)中所生長的血清型而定，通過氫氧化鈉、碳酸鈉或其組合的堿饋入維持步驟(a)中的發酵pH值。在另一實施例中，將步驟(d)中的pH值降低到4.5與小于5.5之間。在又一實施例中，洗滌劑為脫氧膽酸鈉。本發明也涉及一種在純化之前降低復雜細胞肺炎鏈球菌溶解產物肉湯中的蛋白質含量且保持其中莢膜多糖含量的方法。這一方法包含以下步驟(a)在大豆基培養基中使選定肺炎鏈球菌血清型從開始容器到生產規模容器以遞增體積擴大且在細胞生長期間維持穩定的pH值和溫度；(b)用洗滌劑溶解步驟(a)中所產生的細菌細胞，從而產生含有可溶性蛋白質、細胞碎片、核酸和多糖的溶解產物；(c)攪拌細胞溶解產物歷時足以確保完全溶解和多糖釋放的時間；(d)將細胞溶解產物的pH值降低到小于5.5以使洗滌劑和大部分可溶性蛋白質沉淀析出；(e)在不攪拌的情況下將步驟(d)中所形成的溶液和沉淀保持歷時足以使沉淀沉降的時間；和(f)通過離心和/或過濾加工溶液和沉淀，由此溶液中的莢膜多糖得以保留且可溶性蛋白質得以有效減少。選擇作為本發明的這一實施例的例示性非限制性肺炎鏈球菌血清型為1、4、5、6A、6B、7F和19A。在本發明的一特定實施例中且視步驟(a)中所生長的血清型而定，通過氫氧化鈉、碳酸鈉或其組合的堿饋入維持步驟(a)中的發酵pH值。在另一實施例中，將步驟(d)中的pH值降低到4.5與小于5.5之間。在又一實施例中，洗滌劑為脫氧膽酸鈉。在又一實施例中，當血清型為血清型5或19A時，用碳酸氫鈉補充大豆基培養基。本發明允許從細胞溶解產物中移除大量過量蛋白質污染物，從而產生供純化用的較潔凈產物(無細胞肉湯(CellFreeBroth)或CFB)，這一產物通常將獲得比使用先前發酵和回收法可能的多糖回收率和總多糖產量高的多糖回收率和總多糖產量。圖1為肺炎鏈球菌型4的展示在用乙酸使pH值降低時，以每升溶解產物的克數計可溶性蛋白質顯著減少的SDS-PAGE凝膠。39kDa和48kDa組分為細胞壁表面蛋白。也展示多糖產量。圖2為pH值向下調節到pH5的肺炎鏈球菌型6B的結果圖，其展示由SDS-PAGE所測定的蛋白質降低和用折射率(RI)檢測器由HPLC-SEC所測定的多糖(Ps)產量。圖3為pH值向下調節到pH5的肺炎鏈球菌型1的結果圖，其展示由SDS-PAGE所測定的蛋白質降低和用RI檢測器由HPLC-SEC所測定的多糖產量。圖4為pH值向下調節到pH4.1的肺炎鏈球菌型5的結果圖，其展示由SDS-PAGE所測定的蛋白質降低和用RI檢測器由HPLC-SEC所測定的多糖產量。圖5為兩種不同發酵操作的pH值向下調節到pH4.5的肺炎鏈球菌型6A的結果圖，其展示由SDS-PAGE所測定的蛋白質降低和用RI檢測器由HPLC-SEC所測定的多糖產且里o圖6為pH值向下調節到pH4.8的肺炎鏈球菌型7F的結果圖，其展示由SDS-PAGE所測定的蛋白質降低和用RI檢測器由HPLC-SEC所測定的多糖產量。具體實施方式肺炎鏈球菌為通常成對(雙球菌)出現，但以短鏈或單細胞形式出現的革蘭氏陽性柳葉形球菌。其在血液瓊脂板上容易生長為反光菌落，且除非無氧生長(此時其展示(3溶血現象)，否則其顯示a溶血現象。其對可在細胞自身的酶自溶素存在下分解細胞壁的膽汁鹽敏感。所述有機體為兼性厭氧菌且不易生長，因為其具有復雜營養需求。大部分肺炎球菌血清型細胞具有作為包圍各細胞的多糖鞘的莢膜。這一莢膜在人類中為病毒性的決定子，因為其通過阻止抗體附著于細菌細胞而干擾吞噬作用。當前存在90種己鑒別的血清型，其中23種血清型引發約90%的侵襲性疾病。雖然作為疫苗的多糖鞘在具有己發育或未受損傷的免疫系統的個體內可給予合理程度的免疫性(對肺炎鏈球菌)，但具有多糖的接合蛋白質使也處于受肺炎球菌感染的最大危險中的嬰兒和年長者產生免疫反應。重要的是能夠從溶解(殺死)的細菌中分離出這一莢膜多糖且移除盡可能多的細胞碎片。如本文所述，這一移除在一系列發酵過程變化中實現。3個已大大改良下游加工的主要變化如下(1)可能時將發酵堿饋入由碳酸鈉改為氫氧化鈉；(2)在脫氧膽酸鹽保持間隔期間，在發酵罐中維持攪拌；和(3)在脫氧膽酸鹽溶解產物保持后，將pH值降低到小于5.5。最初的發現為通過將pH值降低到小于5.5，在后續加工(純化)之前，可從細胞溶解產物中移除50-90%的不想要的可溶性蛋白質。雖然其為極重要的方法提高，但在發酵操作期間使用大量碳酸鈉維持設定點的pH值導致在用乙酸將pH值調節到5.0時，引起嚴重的發泡問題。也發現調節后難以維持穩定的pH值，因為溶液中存在的多種形式的碳酸鹽。此導致著眼于在發酵肉湯中不會產生碳酸鹽堆積的替代堿饋入。因為在接種之前已使用氫氧化鈉調節培養基和菌種瓶的pH值，所以選擇氫氧化鈉。高達100L發酵的研究表明其為可行的替代物，以光密度(OD)計生長僅略微降低。這一堿也解決發泡問題。除氫氧化鈉外，也可使用其他堿，且在已確定諸如血清型5和19A的有機體需要某種形式的碳酸鹽來維持生長的情況下可使用碳酸氫鈉作為補充物。如果使用碳酸鈉作為(諸如)血清型19A的主要堿饋入，那么溶解后pH值調節(到小于5.5的pH值)需要減緩的多小時受控酸添加以避免發泡。最終，基于實驗室觀察，確定如果在不攪拌的情況下進行脫氧膽酸鹽保持(如在先前方案中)，那么膠狀沉淀會沉降在發酵罐壁和pH值探針上。當調節pH值時，此產生不可靠的原位pH值讀數。攪拌步驟阻止這一沉淀形成且使pH探針的完整性得以維持。因此，在本發明中，使選定肺炎鏈球菌血清型在包含(例如)經酶消化的大豆基產物、氯化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈣和選定氨基酸的無菌培養基中從開始菌種小瓶以遞增體積擴大。在液體培養基中使用具有硫酸鎂的右旋糖作為碳源來維持生長。所述培養基中也可補充有特定血清型或方法所需要的其他添加劑。培養在諸如菌種瓶的第一個容器中開始，在基于對流的培育箱中的生長一段時間后，使用所述第一個容器給諸如菌種發酵罐的第二個容器接種，所述第二個容器轉而又可用于給(必要時)至少一個諸如生產發酵罐的逐漸增加的更大容器接種，直到達到生產規模。在一實施例中，使選定肺炎鏈球菌血清型從開始菌種小瓶到菌種瓶到20L發酵罐到200L發酵罐到2000L生產發酵罐以遞增體積擴大。就光密度、溫度和pH值嚴密監測生長參數以確定何時將培養物轉移到下一發酵規模中以及何時終止分批操作。當細菌進入穩定期時，通過添加諸如陰離子型或陽離子型洗滌劑的洗滌劑迫使生產發酵罐中的細胞溶解。所述洗滌劑的代表性實例包括脫氧膽酸鈉、N-月桂基肌氨酸、鵝脫氧膽酸鈉和皂角苷。在7t:與13。C之間的溫度下攪拌細胞溶解產物歷時足以確保完全細胞死亡，例如8小時與24小時之間的時間后，方法的第二階段為用諸如50%乙酸的酸溶液將細胞溶解產物的pH值降低到小于pH5.5。實際pH值降低隨血清型變化，目的為能夠低于穩固生產方法所需的一致基礎上的最終純化蛋白質規格。在本發明的一特定實施例中，將pH值降低到4.5與小于5.5之間。pH值降低步驟引起原先可溶性蛋白質的"鹽析"(沉淀)。此為當蛋白質達到其等電點時，蛋白質眾所周知的化學效應。使這一步驟在本發明中獨特的是其在高度復雜的細胞溶解產物肉湯中用作純化步驟。肉湯定義為"復合體"，因為其含有培養基組分、DNA、蛋白質、多糖、RNA和其他細胞碎片。除乙酸外，也展示所主張的方法也可用硫酸和磷酸起作用，且這些酸為一部分的Hofmeister系列后應以不同功效起作用。Hofmeister系列為多種陰離子和陽離子的組合且其具有使蛋白質混合物沉淀析出的能力。溶液中這些化合物(Hofmeister系列)的最終濃度決定多種蛋白質的最終溶解度。在不攪拌的情況下，在15'C與25'C之間的溫度下保持一段足以使沉淀沉降且從而有助于連續離心過程的諸如12小時與24小時之間的時間后，先前可溶的蛋白質的極大部分(和可能一些其他先前可溶的污染物組分)以固體沉淀形式析出溶液，其中保留在溶液中的多糖產物幾乎未損失或降解。然后，經由連續離心機或通過標準瓶離心加工這一具有沉淀的溶液。收集含有多糖的上清液且在轉移用于下游濃縮和純化之前經由顆粒物和微米過濾器過濾。使用本發明的方法的結果描繪在以下各圖中。圖l展示使用乙酸將pH值從6.8降低到5.0，肺炎鏈球菌血清型4的細胞溶解產物肉湯中所觀察到的蛋白質減少的代表性SDS-PAGE凝膠。最左泳道為用作蛋白質重量參考的分子量標記。樣品泳道l("C")為pH值未經調節的對照。數字展示兩個主要蛋白質污染物帶(48kDa和39kDa)以及整個泳道中的總蛋白質的近似值(溶解肉湯中g/L)。也展示提供用于HPLC-SEC分析的樣品等分試樣中所含有的總多糖產量。泳道2-8展示pH值經調節的樣品的相同信息。泳道9-11為用于由基本線性回歸分析確定蛋白質產量的BSA標準物。Ps分析不對pH6.8的樣品進行。在這一特定血清型中，存在一些適度的多糖(Ps)損失，但速率比經由降低pH值導致的蛋白質損失的速率低得多。圖2為說明當細胞溶解產物的pH值降低到5.0時肺炎鏈球菌血清型6B的細胞溶解產物中蛋白質的減少以及多糖產量穩定性的區塊圖。這一血清型未見多糖的損失。相反，總蛋白質減少超過一半。圖3為說明當細胞溶解產物的pH值降低到5.0時肺炎鏈球菌血清型1的細胞溶解產物中蛋白質的減少以及多糖產量穩定性的區塊圖。幾乎觀察不到多糖濃度的變化。相反，總蛋白質減少超過90%。圖4為說明當細胞溶解產物的pH值降低到4.1時肺炎鏈球菌血清型5的細胞溶解產物中蛋白質的減少以及多糖產量穩定性的區塊圖。在極低pH值之前幾乎觀察不到多糖濃度的變化，其歸因于由酸添加量引起的稀釋效應。相反，在pH4.5下，總蛋白質減少超過75%。圖5為說明當細胞溶解產物的pH值降低到4.5時肺炎鏈球菌血清型6A的細胞溶解產物中蛋白質的減少以及多糖產量穩定性的兩種不同發酵操作的區塊圖。幾乎觀察不到多糖濃度的變化。這一圖也展示當使用NaOH而不是Na2C03時，多糖濃度得以維持而蛋白質濃度降低。圖6為說明當細胞溶解產物的pH值降低到4.8時肺炎鏈球菌血清型7F的細胞溶解產物中蛋白質的減少以及多糖產量穩定性的區塊圖。幾乎觀察不到多糖濃度的變化。相反，在pH4.8下，總蛋白質減少超過80%。下表1表示使用本發明的方法后，最終純化多糖的一些蛋白質減少和多糖獲得量。表l.數種肺炎鏈球菌血清型的蛋白質濃度和多糖產量<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>f發酵過程展示DOC溶解物質的80%的蛋白質減少，但其他蛋白質移除不如純化過程期間高效。上述發酵過程變化用于在純化加工之前大大降低溶解產物肉湯的蛋白質含量。在無需顯著修改用于多糖回收的當前純化過程的情況下，其使純化產物符合蛋白質規格。這些變化的意外效益為即使如由OD所測定生長略有下降，但總純化多糖產量提高25-100%。其為可大大增加肺炎球菌多糖產量的發酵/回收過程的穩固改良。以上揭露內容大體上描述本發明。通過參考以下特定實例可獲得更完全的理解。僅出于說明的目的描述這些實例且不希望這些實例限制本發明的范疇。實例實例l肺炎鏈球菌血清型l、6A和7F的細胞溶解產物中的蛋白質減少制備母液和工作細胞庫肺炎鏈球菌血清型1是獲自美國典型微生物菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),ATCC，菌株6301。肺炎鏈球菌血清型6A和7F是獲自紐約州立大學(theStateUniversityofNewYork)的GeraldShiftman博士。產生數代菌種儲備物以使菌株擴大且移除動物來源的組分(Fl代、F2代和F3代)。再生產兩代菌種儲備物。附加第一代由F3小瓶制備，且隨后的代由附加第一代的小瓶制備。將菌種小瓶以作為冷凍保護劑的合成甘油冷凍儲藏(<-70°C)。除冷凍小瓶外，也為F4代制備冷凍干燥小瓶。就細胞庫制備來說，使所有培養物在大豆基培養基中生長。在冷凍之前，通過離心濃縮細胞，移除用過的培養基，且將細胞小球再懸浮于含有諸如合成甘油的冷凍保護劑的新鮮培養基中。發酵和回收使用來自工作細胞庫的培養物給含有大豆基培養基(表2)的菌種瓶接種。在不攪拌的情況下，將瓶在36'C土2'C下培育直到生長要求得到滿足。使用菌種瓶給含有大豆基培養基的菌種發酵罐接種。用3NNaOH將pH值維持在約7。達到目標光密度后，使用菌種發酵罐給含有大豆基培養基生產發酵罐接種。用3NNaOH維持pH值。終止生長后或當達到發酵罐的工作體積時，終止發酵。將適當量的無菌12%脫氧膽酸鈉添加到培養物中以獲得于肉湯中的0.12%-0.13%濃度，溶解細菌細胞且釋放細胞結合的多糖。溶解后，在7'C與13'C之間的溫度下將發酵罐內含物攪拌8小時與24小時之間的時間間隔以確保出現完全細胞溶解和多糖釋放。在這一保持時間期間的攪拌阻止溶解產物沉積物沉降到發酵罐壁和pH探針上，從而得以維持pH探針的完整性。接著，用50%乙酸將溶解培養物肉湯的pH值調節到約pH5.0。在不攪拌的情況下，在15'C與25'C之間的溫度下保持12小時與24小時之間的時間間隔的時間后，極大部分先前可溶的蛋白質以固體沉淀形式析出溶液，其中保留在溶液中的多糖幾乎未損失或分解。然后，將具有沉淀的溶液通過連續流動離心，接著深度過濾和0.45nm微過濾澄清。在較小規模情況下，上述方法也產生血清型4和6B(圖I和2)的總蛋白質的明顯減少，此表明就這兩種血清型來說，這一方法在較大規模的情況下會起作用。(肺炎鏈球菌血清型4和6B也是獲自紐約州立大學的GeraldShiffman博士。)表2.大豆基培養基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>肺炎鏈球菌血清型5的細胞溶解產物中的蛋白質減少肺炎鏈球菌血清型5是獲自紐約州立大學(theStateUniversityofNewYork,Brooklyn,NewYork)的GeraldSchiffman博士。關于細胞庫系統的制備，請參見實例l。發酵和回收使用來自工作細胞庫的培養物給含有上述大豆基培養基(表2)的菌種瓶接種，所述培養基補充有10mM濃度的無菌NaHC03溶液。在不攪拌的情況下，將瓶在36。C士2'C下培育直到滿足生長要求。使用菌種瓶給含有大豆基培養基的菌種發酵罐接種，其中培養基中NaHC03濃度為10mM。用3NNaOH將pH值維持在約7.0。達到目標光密度后，使用菌種發酵罐給含有大豆基培養基的生產發酵罐接種，其中培養基中的NaHC03濃度為10mM。用3NNaOH維持pH值。生長終止后或當達到發酵罐的工作體積時，終止發酵。將適當量的無菌12%脫氧膽酸鈉添加到培養物中以獲得于肉湯中的0.12%-0.13%濃度，溶解細菌細胞且釋放細胞結合的多糖。溶解后，在7'C與13'C之間的溫度下將發酵罐內含物攪拌在8小時與24小時之間的一段時間以確保出現完全細胞溶解和多糖釋放。在這一保持時間期間的攪拌阻止溶解產物沉積物沉降到發酵罐壁和pH探針上，從而得以維持pH探針的完整性。接著，用50呢乙酸將溶解培養物肉湯的pH值調節到約pH4.8。在不攪拌的情況下，在15'C與25'C之間的溫度下保持在12小時與24小時之間的一段時間的時間后，極大部分先前可溶的蛋白質以固體沉淀形式析出溶液，其中多糖幾乎未損失或分解而保留在溶液中。然后，將具有沉淀的溶液通過連續流動離心并接著深度過濾和0.45pm微過濾而澄清。應了解上述討論和實例僅僅給出某些實施例的詳細描述。因此，對所屬領域的技術人員來說顯而易見的是，在不悖離本發明的精神和范疇的情況下，可產生多種修改和等效物。權利要求1.一種在純化之前降低復雜細胞肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)溶解產物肉湯中的蛋白質含量且保持其中莢膜多糖含量的方法，所述方法包含以下步驟(a)使選定肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型在大豆基培養基中生長，其包括(i)向含有所述大豆基培養基的第一個容器接種所述選定血清型的菌種儲備物，且培育所述第一個容器直到生長要求得到滿足，(ii)向含有所述大豆基培養基的第二個容器接種來自步驟(i)的培養物，同時在所述第二個容器中維持穩定的pH值和溫度，和(b)用洗滌劑溶解步驟(a)中所產生的細菌細胞，從而產生含有可溶性蛋白質、細胞碎片、核酸和多糖的溶解產物；(c)攪拌所述細胞溶解產物歷時足以確保完全溶解和多糖釋放的時間；(d)將所述細胞溶解產物的pH值降低到小于5.5以使所述洗滌劑和大部分所述可溶性蛋白質沉淀析出；(e)在不攪拌的情況下將步驟(d)中所形成的溶液和沉淀保持歷時足以使所述沉淀沉降的時間；和(f)通過離心和/或過濾加工所述溶液和沉淀，由此溶液中的所述莢膜多糖得以保留且所述可溶性蛋白質得以有效減少。2.根據權利要求l所述的方法，其中所述選定肺炎鏈球菌血清型為1、4、5、6A、6B、7F或19A。3.根據權利要求l所述的方法，其中所述洗滌劑為脫氧膽酸鈉。4.根據權利要求l所述的方法，其中將步驟(d)中的所述pH值降低到4.5與小于5.5之間。5.根據權利要求l所述的方法，其中步驟(a)中的所述pH值通過氫氧化鈉、碳酸鈉或其組合的堿饋入維持。6.一種在純化之前降低復雜細胞肺炎鏈球菌溶解產物肉湯中的蛋白質含量且保持其中莢膜多糖含量的方法，所述方法包含以下步驟(a)在大豆基培養基中使選定肺炎鏈球菌血清型從開始容器到生產規模容器以遞增體積擴大且在細胞生長期間維持穩定的pH值和溫度；(b)用洗滌劑溶解步驟(a)中所產生的細菌細胞，從而產生含有可溶性蛋白質、細胞碎片、核酸和多糖的溶解產物；(C)攪拌所述細胞溶解產物歷時足以確保完全溶解和多糖釋放的時間；(d)將所述細胞溶解產物的pH值降低到小于5.5以使所述洗滌劑和大部分所述可溶性蛋白質沉淀析出；(e)在不攪拌的情況下將步驟(d)中所形成的溶液和沉淀保持歷時足以使所述沉淀沉降的時間；和(f)通過離心和/或過濾加工所述溶液和沉淀，由此溶液中的所述莢膜多糖得以保留且所述可溶性蛋白質得以有效減少。7.根據權利要求6所述的方法，其中所述選定肺炎鏈球菌血清型為1、4、5、6A、6B、7F或19A。8.根據權利要求6所述的方法，其中所述洗滌劑為脫氧膽酸鈉。9.根據權利要求6所述的方法，其中將步驟(d)中的所述pH值降低到4.5與小于5.5之間。10.根據權利要求6所述的方法，其中步驟(a)中的所述pH值通過氫氧化鈉、碳酸鈉或其組合的堿饋入維持。11.一種在純化之前降低復雜細胞肺炎鏈球菌溶解產物肉湯中的蛋白質含量且保持其中莢膜多糖含量的方法，所述方法包含以下步驟(a)使選自由血清型l、4、6A、6B和7F組成的群組的肺炎鏈球菌血清型在大豆基培養基中從開始容器到生產規模容器以遞增體積擴大，且在細胞生長期間維持穩定的pH值和溫度，所述pH值用氫氧化鈉維持；(b)用洗滌劑溶解步驟(a)中所產生的細菌細胞，從而產生含有可溶性蛋白質、細胞碎片、核酸和多糖的溶解產物；(c)攪拌所述細胞溶解產物歷時足以確保完全溶解和多糖釋放的時間；(d)將所述細胞溶解產物的pH值降低到小于5.5以使所述洗滌劑和大部分所述可溶性蛋白質沉淀析出；(e)在不攪拌的情況下將步驟(d)中所形成的溶液和沉淀保持歷時足以使所述沉淀沉降的時間；和(f)通過離心和/或過濾加工所述溶液和沉淀，由此溶液中的所述莢膜多糖得以保留且所述可溶性蛋白質得以有效減少。12.根據權利要求ll所述的方法，其中所述洗滌劑為脫氧膽酸鈉。13.根據權利要求11所述的方法，其中將步驟(d)中的所述pH值降低到4.5與小于5.5之間。14.一種在純化之前降低復雜細胞肺炎鏈球菌溶解產物肉湯中的蛋白質含量且保持其中莢膜多糖含量的方法，所述方法包含以下步驟(a)使肺炎鏈球菌血清型5在補充有碳酸氫鈉的大豆基培養基中從開始容器到生產規模容器以遞增體積擴大，且在細胞生長期間維持穩定的pH值和溫度，所述pH值用氫氧化鈉維持；(b)用洗滌劑溶解步驟(a)中所產生的細菌細胞，從而產生含有可溶性蛋白質、細胞碎片、核酸和多糖的溶解產物；(c)攪拌所述細胞溶解產物歷時足以確保完全溶解和多糖釋放的時間；(d)將所述細胞溶解產物的pH值降低到小于5.5以使所述洗滌劑和大部分所述可溶性蛋白質沉淀析出；(e)在不攪拌的情況下將步驟(d)中所形成的溶液和沉淀保持歷時足以使所述沉淀沉降的時間；和(f)通過離心和/或過濾加工所述溶液和沉淀，由此溶液中的所述莢膜多糖得以保留且所述可溶性蛋白質得以有效減少。15.根據權利要求14所述的方法，其中所述洗滌劑為脫氧膽酸鈉。16.根據權利要求14所述的方法，其中將步驟(d)中的所述pH值降低到4.5與小于5.5之間。17.—種在純化之前降低復雜細胞肺炎鏈球菌溶解產物肉湯中的蛋白質含量且保持其中莢膜多糖含量的方法，所述方法包含以下步驟(a)使肺炎鏈球菌血清型19A在補充有碳酸氫鈉的大豆基培養基中從開始容器到生產規模容器以遞增體積擴大，且在細胞生長期間維持穩定的pH值和溫度，所述pH值用碳酸鈉維持；(b)用洗滌劑溶解步驟(a)中所產生的細菌細胞，從而產生含有可溶性蛋白質、細胞碎片、核酸和多糖的溶解產物；(c)攪拌所述細胞溶解產物歷時足以確保完全溶解和多糖釋放的時間；(d)將所述細胞溶解產物的pH值降低到小于5.5以使所述洗滌劑和大部分所述可溶性蛋白質沉淀析出；(e)在不攪拌的情況下將步驟(d)中所形成的溶液和沉淀保持歷時足以使所述沉淀沉降的時間；和(f)通過離心和/或過濾加工所述溶液和沉淀，由此溶液中的所述莢膜多糖得以保留且所述可溶性蛋白質得以有效減少。18.根據權利要求17所述的方法，其中所述洗滌劑為脫氧膽酸鈉。19.根據權利要求17所述的方法，其中將步驟(d)中的所述pH值降低到4.5與小于5.5之間。全文摘要本發明描述一種在純化之前降低復雜細胞肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)溶解產物肉湯中的蛋白質含量且保持其中的莢膜多糖含量的方法。細胞溶解后利用pH值的降低產生始終符合蛋白質規格的純化多糖和純化過程中的較高多糖回收產量。文檔編號C08B37/00GK101155833SQ200680011379公開日2008年4月2日申請日期2006年3月31日優先權日2005年4月8日發明者布賴恩·巴勒爾,帕梅拉·休·芬克·沙博諾,李初順,賈森·阿諾德·洛特溫,馬克·愛德華·魯彭申請人:惠氏公司