專利名稱：利血平分子印跡聚合物的制備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物工程技術領域的制備方法，具體是一種利血平分子印跡聚合物的制備方法。
背景技術：
利血平(Reserpine，簡稱RSP)即[11，17-二甲氧基-18-(3，4，5-三甲氧基苯甲酰)氧]育亨烷-16甲酸甲酯，又名血安平，蛇根堿，是存在于我國及印度產蘿芙木中的主要生物堿，具有降血壓和安定作用，常被用作鎮靜劑來減少家畜、家禽的運動量，以達到降低機體能量物質消耗、增加能量積累的目的，從而達到催肥和增加蛋雞產蛋率的作用。利血平作為藥物具有良好的降壓、鎮靜作用，但是在動物源性食品和水產品中的殘留可能對人類的健康造成損害，如大劑量長期應用可誘發帕金森綜合癥和抑郁癥、腹瀉等疾病。
目前常用利血平的檢測方法主要有熒光法、化學發光法、紫外分光光度法、毛細管電泳法、高效液相色譜法等，通常這些方法均存在樣品前處理步驟繁瑣，純化困難等問題。基于分子印跡技術的分子印跡固相萃取技術具有選擇性好，操作簡便等優點，其高選擇性使固相萃取可用于痕量分析。
分子印跡聚合物是仿照抗體的形成機理，選擇帶有與模板分子發生作用的功能基的功能單體、交聯劑、引發劑、致孔劑，從而通過聚合反應將功能單體有利于與模板分子結合的排列和構象固定下來，然后通過物理或化學的方法除去模板分子后，在聚合物的高度交聯結構中留下能夠與模板分子發生特異結合反應的基團，從而對模板分子及其結構類似物表現高度的特異識別性能。
經對現有技術的文獻的查新，至今尚未發現與本發明主題利血平分子印跡聚合物的制備方法的相關報道。
發明內容
本發明的目的在于針對現有固相萃取分離純化技術的不足，提供一種利血平分子印跡聚合物的制備方法，使其能夠簡單、快速、高效分離純化、富集生物樣品中的利血平殘留，可直接用于對利血平的特異選擇性分離、高效富集。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明所述的利血平分子印跡聚合物的制備方法，具體包括以下步驟1)首先將交聯劑、功能單體、模板分子和引發劑溶解在致孔劑中；2)將1)中的混合溶劑，超聲脫氣；3)混合均勻后，通入氮氣，氮氣狀態或抽真空狀態下密封；4)采用熱引發進行聚合反應；5)聚合反應結束后，將合成的分子印跡聚合物取出研磨、篩分后用有機溶劑除去模板分子，通過高效液相色譜—紫外檢測，直到檢測不到模板分子；6)將除去模板分子的聚合物，真空干燥，得到利血平特異的分子印跡聚合物。
所述的1)中，模板分子、功能單體和交聯劑的摩爾比為1∶2～8∶25；致孔劑用量與反應混合物總體積比1∶1.5～2。
所述的2)中，超聲作用時間為5～10min。
所述的3)中，通入氮氣時間為10～15min。
所述的4)中，將分子印跡聚合物在60～70℃熱引發聚合20～36h。
所述的5)中，索氏萃取的有機溶劑為甲醇和醋酸的混合溶液，甲醇和醋酸的混合溶液中甲醇∶醋酸的體積比為80∶20。
所述的6)中，真空干燥溫度為50℃，干燥時間為24h。
所述的模板分子，為利血平。
所述的功能單體，為甲基丙烯酸(MAA)、三氟甲基丙烯酸(TFMAA)、丙烯酸(AA)、苯乙烯(St)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)中的一種或兩種，當功能單體為兩種物質時，兩者物質的量比為0.2～1。
所述的致孔劑，為氯仿。
所述的交聯劑，為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)或乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)。
所述的引發劑，為過氧化苯甲酰(BPO)或偶氮二異丁腈(AIBN)。
本發明制備的利血平分子印跡聚合物，平均粒徑為25～61μm，在分子印跡聚合物表面有許多小孔。將利血平分子印跡聚合物采用濕法裝柱的方法填充到聚丙烯固相萃取小柱，得到利血平特異的分子印跡固相萃取小柱，將生物樣品利血平提取液通過分子印跡固相萃取小柱進行分離純化富集，用淋洗劑除去干擾雜質，通過特異的有機溶劑洗脫，收集洗脫溶液。
本發明通過本體聚合法制備的利血平分子印跡聚合物為塊狀，需經研碎并過篩后使用。本發明以利血平違禁獸藥為模板分子，制備得到具有特定“記憶功能”的利血平分子印跡聚合物，該分子印跡聚合物對模板分子有特異的親和性，具有較高的選擇性和靈敏度。
同時，本發明所提供的利血平分子印跡聚合物可作為固相萃取和液相色譜柱的填料，實現對利血平的分離、富集和純化。
圖1為本發明實施例制得的利血平分子印跡聚合物圖(一)圖2為本發明實施例制得的利血平分子印跡聚合物圖具體實施方式
實施例1.
將功能單體甲基丙烯酸(MAA)2mmol和模板分子利血平1mmol溶解在致孔劑氯仿5ml中，加入交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol、引發劑偶氮二異丁腈(AIBN)超聲脫氣5min，混合均勻后，通入氮氣10min，氮氣狀態或抽真空狀態下密封。60℃下反應36h；聚合反應結束后，將合成的聚合物取出研磨、過篩后用甲醇∶乙酸(80∶20，V/V)通過索氏萃取除去模板分子，通過高效液相色譜紫外檢測，直到檢測不到模板分子為止；將除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)24h，最后獲得平均粒徑大小為25～61μm的分子印跡聚合物，其發明效果如圖1、2所示。
實施例2.
將功能單體甲基丙烯酸(MAA)5mmol和模板分子利血平1mmol溶解在致孔劑氯仿5ml中，加入交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol、引發劑偶氮二異丁腈(AIBN)超聲脫氣10min，混合均勻后，通入氮氣15min，氮氣狀態或抽真空狀態下密封。70℃下反應20h；聚合反應結束后，將合成的聚合物取出研磨、過篩后用甲醇∶乙酸(80∶20，V/V)通過索氏萃取除去模板分子，通過高效液相色譜紫外檢測，直到檢測不到模板分子；將除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)24h，最后獲得平均粒徑大小為25～61μm的分子印跡聚合物，其發明效果基本等同于圖1、2所示。
實施例3.
將功能單體甲基丙烯酸(MAA)8mmol和模板分子利血平1mmol溶解在致孔劑氯仿5ml中，加入交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol、引發劑偶氮二異丁腈(AIBN)超聲脫氣10min，混合均勻后，通入氮氣15min，氮氣狀態或抽真空狀態下密封。65℃下反應28h；聚合反應結束后，將合成的聚合物取出研磨、過篩后用甲醇∶乙酸(80∶20，V/V)通過索氏萃取除去模板分子，通過高效液相色譜紫外檢測，直到檢測不到模板分子；將除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)24h，最后獲得平均粒徑大小為25～61μm的分子印跡聚合物，其發明效果基本等同于圖1、2所示。
實施例4.
將功能單體甲基丙烯酸(MAA)2mmol和模板分子利血平1mmol溶解在致孔劑氯仿5ml中，加入交聯劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)25mmol、引發劑過氧化苯甲酰(BPO)超聲脫氣8min，混合均勻后，通入氮氣12min，氮氣狀態或抽真空狀態下密封。60℃下反應36h；聚合反應結束后，將合成的聚合物取出研磨、過篩后用甲醇∶乙酸(80∶20，V/V)通過索氏萃取除去模板分子，通過高效液相色譜紫外檢測，直到檢測不到模板分子；將除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)24h，最后獲得平均粒徑大小為25～61μm的分子印跡聚合物，其發明效果基本等同于圖1、2所示。
實施例5.
將功能單體甲基丙烯酸(MAA)8mmol和模板分子利血平1mmol溶解在致孔劑氯仿5m1中，加入交聯劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)25mmol、引發劑過氧化苯甲酰(BPO)超聲脫氣10min，混合均勻后，通入氮氣10min，氮氣狀態或抽真空狀態下密封。70℃下反應20h；聚合反應結束后，將合成的聚合物取出研磨、過篩后用甲醇∶乙酸(80∶20，V/V)通過索氏萃取除去模板分子，通過高效液相色譜紫外檢測，直到檢測不到模板分子；將除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)24h，最后獲得平均粒徑大小為25～61μm的分子印跡聚合物，其發明效果基本等同于圖1、2所示。
實施例6.
將功能單體甲基丙烯酸甲酯(MMA)2mmol和模板分子利血平1mmol溶解在致孔劑氯仿5ml中，加入交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmol、引發劑過氧化苯甲酰(BPO)超聲脫氣10min，混合均勻后，通入氮氣15min，氮氣狀態或抽真空狀態下密封。70℃下反應20h；聚合反應結束后，將合成的聚合物取出研磨、過篩后用甲醇∶乙酸(80∶20，V/V)通過索氏萃取除去模板分子，通過高效液相色譜紫外檢測，直到檢測不到模板分子；將除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)24h，最后獲得平均粒徑大小為25～61μm的分子印跡聚合物，其發明效果基本等同于圖1、2所示。
實施例7.
將功能單體甲基丙烯酸甲酯(MMA)8mmol和模板分子利血平1mmol溶解在致孔劑氯仿5ml中，加入交聯劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)25mmol、引發劑過氧化苯甲酰(BPO)超聲脫氣5min，混合均勻后，通入氮氣15min，氮氣狀態或抽真空狀態下密封。60℃下反應36h；聚合反應結束后，將合成的聚合物取出研磨、過篩后用甲醇∶乙酸(80∶20，V/V)通過索氏萃取除去模板分子，通過高效液相色譜紫外檢測，直到檢測不到模板分子；將除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)24h，最后獲得平均粒徑大小為25～61μm的分子印跡聚合物，其發明效果基本等同于圖1、2所示。
實施例8.
將功能單體甲基丙烯酸(MMA)4mmol、苯乙烯(St)4mmol和模板分子利血平1mmol溶解在致孔劑氯仿5ml中，加入交聯劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)25mmol、引發劑過氧化苯甲酰(BPO)超聲脫氣5min，混合均勻后，通入氮氣15min，氮氣狀態或抽真空狀態下密封。60℃下反應36h；聚合反應結束后，將合成的聚合物取出研磨、過篩后用甲醇∶乙酸(80∶20，V/V)通過索氏萃取除去模板分子，通過高效液相色譜紫外檢測，直到檢測不到模板分子；將除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)24h，最后獲得平均粒徑大小為25～61μm的分子印跡聚合物，其發明效果基本等同于圖1、2所示。
實施例9.
將功能單體甲基丙烯酸(MMA)1.67mmol、苯乙烯(St)0.33mmol和模板分子利血平1mmol溶解在致孔劑氯仿5ml中，加入交聯劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)25mmol、引發劑過氧化苯甲酰(BPO)超聲脫氣5min，混合均勻后，通入氮氣15min，氮氣狀態或抽真空狀態下密封。60℃下反應36h；聚合反應結束后，將合成的聚合物取出研磨、過篩后用甲醇∶乙酸(80∶20，V/V)通過索氏萃取除去模板分子，通過高效液相色譜紫外檢測，直到檢測不到模板分子；將除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)24h，最后獲得平均粒徑大小為25～61μm的分子印跡聚合物，其發明效果基本等同于圖1、2所示。
權利要求
1.一種利血平分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)首先將利血平、交聯劑、功能單體和引發劑溶解在致孔劑中；其中a.模板分子、功能單體和交聯劑的摩爾比為1∶2～8∶25；b.致孔劑用量與反應混合物總體積比1∶1.5～2；c.致孔劑為氯仿；2)將1)中的混合溶劑，超聲脫氣5～10min；3)混合均勻后，通入氮氣10～15min，氮氣狀態或抽真空狀態下密封；4)進行聚合反應，分子印跡聚合物采用熱引發，聚合溫度為60～70℃，聚合反應時間為20～36h；5)聚合反應結束后，將合成的分子印跡聚合物取出研磨、篩分后采用索氏萃取方法除去模板分子，通過高效液相色譜—紫外檢測，直到檢測不到模板分子；6)將除去模板分子的聚合物，真空干燥，得到利血平特異的分子印跡聚合物。
2.根據權利要求1所述的利血平分子印跡聚合物的制備方法，其特征是，所述的交聯劑，為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯。
3.根據權利要求1所述的利血平分子印跡聚合物的制備方法，其特征是，所述的功能單體，為甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、丙烯酸、苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯中的一種或兩種。
4.根據權利要求3所述的利血平分子印跡聚合物的制備方法，其特征是，當功能單體為兩種物質時，兩者物質的量比為0.2～1。
5.根據權利要求1所述的利血平分子印跡聚合物的制備方法，其特征是，所述的引發劑，為過氧化苯甲酰或偶氮二異丁腈。
6.根據權利要求1所述的利血平分子印跡聚合物的制備方法，其特征是，篩分后分子印跡聚合物的粒徑為25～61μm。
7.根據權利要求1所述的利血平分子印跡聚合物的制備方法，其特征是，索氏萃取的有機溶劑為甲醇和醋酸的混合溶液，甲醇和醋酸的混合溶液中甲醇∶醋酸的體積比為80∶20。
8.根據權利要求1所述的利血平分子印跡聚合物的制備方法，其特征是，所述的6)中，真空干燥溫度為50℃，干燥時間為24h。
全文摘要
一種利血平分子印跡聚合物的制備方法，屬于生物工程技術領域。具體為首先將交聯劑、功能單體、模板分子和引發劑溶解在致孔劑中，得到混合溶劑；將混合溶劑超聲脫氣；混合均勻后，通入氮氣，氮氣狀態或抽真空狀態下密封；進行聚合反應，分子印跡聚合物采用熱引發；聚合反應結束后，將合成的分子印跡聚合物取出研磨、過篩后用有機溶劑除去模板分子，通過高效液相色譜－紫外檢測，直到檢測不到模板分子；將除去模板分子的聚合物，真空干燥，得到利血平特異的分子印跡聚合物。本發明制得的分子印跡聚合物能夠簡單、快速、高效分離純化、富集生物樣品中的利血平殘留，可直接用于對利血平的特異選擇性分離、高效富集。
文檔編號C08F12/08GK1884314SQ20061002666
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月18日 優先權日2006年5月18日
發明者張大兵, 武愛波, 史西志, 李榮秀, 楊立桃 申請人:上海交通大學