專利名稱：阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的制備方法
技術領域：
本發明是關于阿拉伯半乳聚糖硫酸酯(Arabinogalactan Sulfate，簡寫AGS)的一種制備及純化方法。
背景技術：
a.阿拉伯半乳聚糖免疫活性技術的背景阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan，簡寫AG)是從樹木和植物中獲得的一種重要的生物活性多糖，具有水溶性和生物可利用性。阿拉伯半乳聚糖有明顯提高肌體免疫抗原中單核細胞、巨噬細胞、T細胞和自然殺傷細胞的免疫反應活性，激發免疫抗原產生非特異性的細胞殺傷作用，并誘導體內產生內源性干擾素IFN和腫瘤壞死因子TNF。阿拉伯半乳聚糖和特異性凝集素受體結合作為具有潛在療效的免疫促進劑，可用于控制各種腫瘤引起的胸水、腹水，也可用于肺癌、肝癌、食道癌、膀胱癌、惡性淋巴瘤、晚期胃癌和黑色素瘤的治療。阿拉伯半乳聚糖已經通過美國藥品和食品監督委員會(FDA)的批準，廣泛應用在醫藥、食品、化妝品等多個行業。
b.阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的研發背景興安落葉松(Larix gmelinii Rupr.)木材中含有大量的阿拉伯半乳聚糖(10-25％)，落葉松是東北林區的主要樹種，木材及加工剩余物不僅污染環境，且浪費資源，因此阿拉伯半乳聚糖衍生物是一類制備原料來源豐富、產品成本低的高科技含量、高價值的天然生物制品。此外，在自然界中一些天然的多糖硫酸酯有抗艾滋病病毒(HIV)、抗腫瘤、抗凝血等生物活性功能，據報道有些不具生物活性的天然多糖采用化學方法合成其硫酸酯的衍生物后表現出抗病毒活性，目前人工合成多糖硫酸酯獲得抗病毒、抗腫瘤的新型藥物的研究，已受到人們的廣泛關注。采用氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺法、三氧化硫—吡啶法等可制備人工合成的多糖硫酸酯衍生物。本研究通過磺化反應得到一定酯化度的阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，目的是通過引入硫酸基團形成多糖硫酸酯結構，以強化阿拉伯半乳聚糖的免疫功效。
發明內容
本發明以由興安落葉松提取的阿拉伯半乳聚糖為原料，其主鏈的基本結構單元是1，3連接的β-D半乳糖且其6位連接著以L-阿拉伯糖為主的側鏈。本發明采用三氧化硫—吡啶復合物與阿拉伯半乳聚糖主要在半乳糖單元中C2和C4位的醇羥基以及阿拉伯糖單元中C2和C5位醇羥基發生磺化反應。在阿拉伯半乳聚糖母體上引入了水溶性的硫酸根基團，制備了阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其結構示意式為AG-SO4R；其合成路徑見附圖1。本發明提供了阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的制備法，其特征在于在三口瓶中加入自制的磺化試劑和溶劑，攪拌形成清液，加入自制阿拉伯半乳聚糖，恒溫攪拌，直至形成懸濁液。設置反應溫度及時間，然后加入預冷的蒸餾水冷卻至室溫，用堿中和至pH＝6.0～7.5，中和用的堿性試劑可以用NaOH、KOH、K2CO3和KHCO3等。經透析、冷凍干燥的純化過程，得到淡黃色粉末，形成阿拉伯半乳聚糖硫酸酯。
本發明制備方法中所述多糖硫酸酯的磺化方法可以采用氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法和氯磺酸吡啶法等。磺化試劑可以是濃硫酸、哌啶-N-磺酸、氯磺酸、三氧化硫-吡啶的配合物等。除上述磺化試劑外，本制備方法使用氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺法，并加入吡啶改良磺化試劑，該磺化試劑于-20℃下封存，可以保存一周。
本發明首次合成了阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，以硫酸根平均取代度表示阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的酯化程度。上述硫酸根平均取代度是指每克阿拉伯半乳聚糖硫酸酯中含有硫酸根基團的質量百分含量。硫酸根基團的質量是使用1mol/L的鹽酸水解阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，采用外標法建立濁度-硫酸根濃度的工作曲線，對阿拉伯半乳聚糖硫酸酯所含硫酸根進行定量。產率是指阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的質量占原料阿拉伯半乳聚糖的質量百分數。
本發明純化過程阿拉伯半乳聚糖原料主要成份分子量在6,000Da-200,000Da的特點，將透析技術應用于阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的純化過程，將反應體系中的小分子一次性去處，縮短阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的分離流程，簡單易行。發明純化過程中所述透析技術采用的是截流分子量為6,000Da-14,000Da的透析袋。
本發明制備的阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的特征在于1)本方法制備阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的原料是由興安落葉松提取的水溶性阿拉伯半乳聚糖。2)阿拉伯半乳聚糖硫酸酯是通過磺化反應機理在阿拉伯半乳聚糖中引入了水溶性的硫酸根基團。3)阿拉伯半乳聚糖硫酸酯是人工合成的一種多糖硫酸酯衍生物。4)阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的結構示意式為AG-SO4-R，R1-Na；R2-K；R3-H。5)采用硫酸根平均取代度表示阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的酯化程度。
本發明的優點1)首次合成了阿拉伯半乳聚糖硫酸酯。2)采用透析技術將產物阿拉伯半乳聚糖硫酸酯與氯磺酸、N，N-二甲基甲酰胺、吡啶等小分子一次性分離，簡化了分離步驟。3)引入水溶性硫酸根基團，形成多糖硫酸酯結構，強化阿拉伯半乳聚糖的免疫功效。
附圖1 阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的合成路徑附圖2 阿拉伯半乳聚糖硫酸酯與阿拉伯半乳聚糖的紅外對照圖附圖3 阿拉定伯半乳聚糖硫酸酯的GPC圖具體實施方式
實例1在帶有攪拌裝置和冷凝裝置的三口燒瓶中加入預冷的0.25ml無水吡啶，將燒瓶置于冰水浴中，逐滴加入0.25ml氯磺酸，劇烈攪拌，生成淡黃色固體。此時在三口瓶中加入30ml的無水N，N-二甲基甲酰胺，攪拌形成淡黃色清液，再加入阿拉伯半乳聚糖0.5g，室溫下攪拌30min，形成懸濁液。設定反應溫度為65℃，時間為60min，然后加入預冷的50ml蒸餾水冷卻至室溫，用NaOH中和至pH＝7.5。經透析、冷凍干燥的純化過程，得到乳白色粉末即為阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其硫酸根平均取代度14.92％，產率85.38％。
實例2在帶有攪拌裝置和冷凝裝置的三口燒瓶中加入預冷的0.5ml無水吡啶，將燒瓶置于冰水浴中，逐滴加入0.5ml氯磺酸，劇烈攪拌，生成淡黃色固體。此時在三口瓶中加入30ml的無水N，N-二甲基甲酰胺，攪拌形成淡黃色清液，再加入阿拉伯半乳聚糖0.5g，室溫下攪拌30min，形成懸濁液。設定反應溫度為95℃，時間為60min，其余操作同實例1，得到黃色粉末即為阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其硫酸根平均取代度59.78％，產率85.34％。
實例3在帶有攪拌裝置和冷凝裝置的三口燒瓶中加入預冷的5ml無水吡啶，將燒瓶置于冰水浴中，逐滴加入5ml氯磺酸，劇烈攪拌，生成淡黃色固體。此時在三口瓶中加入30ml的無水N，N-二甲基甲酰胺，攪拌形成淡黃色清液，再加入阿拉伯半乳聚糖0.5g，室溫下攪拌30min，形成懸濁液。設定反應溫度為85℃，時間為30min，其余操作同實例1，得到黃色粉末即為阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其硫酸根平均取代度21.66％，產率53.68％。
實例4在帶有攪拌裝置和冷凝裝置的三口燒瓶中加入預冷的5ml無水吡啶，將燒瓶置于冰水浴中，逐滴加入5ml氯磺酸，劇烈攪拌，生成淡黃色固體。此時在三口瓶中加入30ml的無水N，N-二甲基甲酰胺，攪拌形成淡黃色清液，再加入阿拉伯半乳聚糖0.5g，室溫下攪拌30min，形成懸濁液。設定反應溫度為85℃，時間為75min。其余操作同實例1，得到黃色粉末即為阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其硫酸根平均取代度28.22％，產率88.1％。
實例5對實例1中阿拉伯半乳聚糖進行部分理化性質測定。阿拉伯半乳聚糖硫酸酯各元素含量C31.97％，H5.35％，S4.05％，O58.64％。阿拉伯半乳聚糖原料各元素含量C42.074％，H6.332％，S0％O，53.594％。與阿拉伯半乳聚糖紅外譜圖對比，其唯一顯著差異是在1255.24cm-1處有強S＝O鍵的伸縮振動特征峰，見附圖2。阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的分子量分布范圍為6,000Da-200,000Da，其重均分子量為6.45×104Da，數均分子量為1.02×104Da，分散系數為6.36，詳見附圖3。
實例6在帶有攪拌裝置和冷凝裝置的三口燒瓶中加入預冷的0.5ml無水吡啶，將燒瓶置于冰水浴中，逐滴加入0.5ml氯磺酸，劇烈攪拌，生成淡黃色固體。此時在三口瓶中加入30ml的無水N，N-二甲基甲酰胺，攪拌形成淡黃色清液，再加入阿拉伯半乳聚糖0.5g，室溫下攪拌30min，形成懸濁液。設定反應溫度為85℃，時間為60min，然后加入預冷的50ml蒸餾水冷卻至室溫，用KOH中和至pH＝7.5。得到黃色粉末即為阿拉伯半乳聚糖硫酸鉀鹽酯，其硫酸根平均取代度15.46％，產率82.44％。
權利要求
1.本發明制備的阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其特征是在阿拉伯半乳聚糖分子中引入了硫酸根基團。其結構示意式為AG-SO4-R，R1-Na；R2-K；R3-H。
2.權力要求1所述阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的制備方案，其過程的特征包括如下步驟在三口瓶中加入自制的磺化試劑和溶劑，攪拌形成清液，加入自制阿拉伯半乳聚糖，恒溫攪拌，直至形成懸濁液。設置反應溫度及時間，然后加入預冷的50ml的蒸餾水冷卻至室溫，用堿中和至pH＝6.0～7.5。經透析、冷凍干燥的純化，得到淡黃色粉末即為阿拉伯半乳聚糖硫酸酯。
3.權力要求1所述阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，以硫酸根平均取代度表示阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的酯化程度。上述硫酸根平均取代度是指每克阿拉伯半乳聚糖硫酸酯中含有硫酸根的質量百分含量。
4.權力要求2所述透析過程目的是將阿拉伯半乳聚糖硫酸酯與反應體系中小分子的溶劑及磺化試劑分離，將反應體系中的小分子一次性除去，減少阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的純化步驟。發明純化過程中所述透析技術采用的是截流分子量為6,000Da左右的透析袋。
5.權力要求2所述多糖硫酸酯的磺化方法可以采用氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法和氯磺酸吡啶法等。中和用的堿性試劑可以用NaOH、KOH、K2CO3和KHCO3等。
6.權力要求3所述磺化試劑可以是濃硫酸、哌啶-N-磺酸、氯磺酸、三氧化硫-吡啶的配合物等。除上述磺化試劑外，本制備方案使用氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺法，并加入吡啶改良磺化試劑，該磺化試劑于-20℃下封存，可以保存一周。
全文摘要
本發明公開阿拉伯半乳聚糖硫酸酯(Arabinogalactan Sulfate，簡寫AGS)的一種制備方法。本發明的原料是由興安落葉松提取的具有免疫作用的阿拉伯半乳聚糖，其主鏈的基本結構單元是1，3連接的β－D半乳糖且其6位連接著以L－阿拉伯糖為主的側鏈。采用作用較為緩和的三氧化硫－吡啶復合物，主要與原料半乳糖單元中C
文檔編號C08B37/00GK101054420SQ200610010479
公開日2007年10月17日 申請日期2006年9月1日 優先權日2006年9月1日
發明者方桂珍, 馬艷麗 申請人:東北林業大學, 方桂珍, 馬艷麗