專利名稱：交聯包封的磷光分子的制作方法
背景技術：
磷光是三階過程的結果。在第一階段，通過外源例如白熾燈或激光供給能量，由磷光化合物吸收，引起受激的電子三線態(與熒光相反，它只有受激的單線態)。在第二階段，受激態存在有限的時間，在此期間磷光化合物經歷構象變化，也遭受大量的與其分子環境可能的相互作用。在這段時間內，受激態的能量部分散逸，產生松弛態，磷光發射從其中發起。第三階段是磷光發射階段，其中能量發射，磷光化合物回復到它的基態。發射能比它的激發能(光或激光)小，因而波長較長。能量或波長的這種變化或差異允許將發射能從激發能中檢測和分離。
磷光猝滅是各種反應物與三線態結合而減少可供使用的磷光化合物的有效量，因而干擾磷光信號的現象。氧和水是三線態的強猝滅劑，可能導致磷光信號衰減，因而限制其在例如許多實用生物檢定應用中的用途。為了獲得強的磷光，在磷光測量期間通常必須除去氧。
一種避免磷光氧猝滅的方法是將磷光分子包封在固體基質中使其與猝滅劑例如氧和水分子隔離。包封基質的選擇很重要。基質應具有較低的氧滲透性和較高的磷光分子溶解度以便可以達到高裝載的磷光分子和可以獲得強磷光。許多應用要求不同尺寸的單分散磷光顆粒。在那些情況下，基質應能夠形成單分散粒子。對于其他應用，也可能要求磷光分子具有各種表面官能團以允許進一步表面改性。
不同類型的基質已經用于磷光分子的包封以形成磷光粒子。這些基質包括無機物和聚合物。用于磷光分子包封以形成粒子的聚合物中，商業上已經使用了聚苯乙烯(PS)和聚丙烯腈(PAN)及其衍生物。然而，這些聚合物系統不允許在環境條件下最大的磷光強度。現有的系統也不提供交聯包封磷光粒子的能力。聚苯乙烯對磷光分子的包封是不理想的，因為許多磷光分子(有時稱作“磷光染料”或“染料”)在聚苯乙烯中溶解性差，造成低染料裝載和較低的磷光。聚苯乙烯的氧溶解度也較高。已經發現PAN及其衍生物具有低的氧滲透性，但是它們對許多磷光分子也具有有限的溶解度，也限制它們應用于那些磷光分子的包封。
需要新基質系統用于磷光分子的包封以提供高磷光強度。新基質系統是交聯系統因此它們可比非交聯的相應系統更穩定，也更耐溫度、表面活性劑和有機溶劑。
發明概述本發明涉及交聯磷光微米和納米粒子的制備和那些粒子的應用。
本發明使用含鹵聚合物和共聚物(HCPs)作為有機和有機金屬磷光化合物的包封基質以形成微米或納米粒子。這些包封磷光粒子的磷光在環境條件下基本上不受磷光猝滅劑例如氧和水分子的影響。
本發明提供交聯磷光粒子的制備方法。交聯粒子比非交聯的相應物更穩定，更耐溫度、表面活性劑和有機溶劑。
本發明也提供具有可官能化表面的交聯粒子的制備方法，其中可官能化表面能與生物分子作用。那些磷光微米/納米粒子可得到廣泛的應用，例如在生物檢定中生物分子和種的檢測。
附圖簡述
圖1是含鹵聚合物圖。
圖2是含鹵共聚物圖。
圖3是含鹵共聚物圖。
圖4是含鹵共聚物圖。
圖5是含鹵共聚物圖。
圖6是氯乙烯-醋酸乙烯酯-馬來酸共聚物(PVCMA)圖。
圖7是氯乙烯-醋酸乙烯酯-環氧單體其聚物(PVCEM)圖。
圖8是PVCMA、PVCEM和交聯20/80 PVCEM/PVCMA粒子的傅立葉變換紅外光譜(FTIR)圖。
圖9是由PAN、20/80 PVCEM/PVCMA包封的2％Pt-MTPFP和對照物的磷光強度的比較圖。
圖10是未交聯的PVCMA/PVCEM Pt-TMFPP粒子的掃描電鏡(SEM)圖象。
圖11是交聯的PVCMA//PVCEM Pt-TMFPP粒子的掃描電鏡(SEM)圖象。
發明詳述本發明涉及制備交聯的和表面可官能化的磷光粒子，其中含鹵聚合物和共聚物(HCPs)包封磷光分子以制得磷光微米和納米粒子。磷光可以通過讀出器或檢測器檢測。本發明也涉及磷光粒子的應用，特別是生物學應用例如生物分子和種的檢測。
本文使用的“包封”包括固體溶質(例如固體磷光材料)在固體溶劑(例如聚合物基質)中的溶液。這樣的包封可以通過制備包含液體磷光材料和液體聚合物的液體溶液，然后共沉淀磷光材料和聚合物生成，以便固體磷光材料分散在固體聚合物材料的基質中。這樣沉淀的粒子可看作磷光材料溶解(或分散)在固體聚合物基質溶劑中的固體溶液。
本文的術語“鹵”指周期表的VII A族元素，包括氟、氯、溴和碘。對本發明目的來說，術語“鹵”也指包含氟、氯、溴和碘原子的分子，可包括但不限于鹵代化合物例如鹵代烴。
術語“含鹵聚合物”和“含鹵共聚物”(也稱作“HCPs”)指通過單體化合形成的大分子，其中至少部分是含鹵單體。HCPs的例子包括但不限于含鹵聚乙烯化合物，含鹵聚亞乙烯基化合物及其各種共混物、混合物和組合。
本發明制備磷光粒子的方法和工藝包括以下步驟(1)將含鹵聚合物或共聚物(HCPs)和磷光分子任選加熱溶解在溶解溶劑中以制備第一混合物；(2)將第一混合物與沉淀溶劑混合制備第二混合物，聚合物和磷光分子在其中的溶解性都很差；(3)清洗形成的粒子；和(4)干燥粒子或使粒子懸浮在貯存溶劑中。
已經發現HCPs例如聚氟乙烯(PVF)和聚氯乙烯(PVC)對許多磷光分子提供高裝載，例如那些通常在大多數有機溶劑和固體基質中溶解性差的具有有機配體的金屬螯合物。HCPs(正如碳鹵化物溶劑例如氯仿和二氯甲烷)具有與許多有機化合物(包括帶有機配體的金屬螯合物)非常優良的相容性。盡管本發明不應遵循任何具體操作理論，但是相信使用HCPs作為包封基質能夠增加裝載、減少分子聚集和增加基質中包封分子的均勻分布，當要求高磷光強度的磷光粒子時此特性是極其有益的。相反，使用與包封磷光分子相容性和溶解性差的基質極可能造成分子聚集、低磷光強度和它們光譜特性的可能畸變。
HCPs應具有至少1％重量的鹵原子。HCPs可具有如圖1中顯示的一般結構，其中鹵含量合乎要求地為5至80％重量，更合乎要求地10至60％重量。在圖1的結構中，X1-X4中至少一個含有一個或多個鹵原子。X1-X4中其他的可以是其他原子或基團，例如氫原子和甲基。一些HCPs的具體實例包括但不限于聚氟乙烯(PVF)、聚氯乙烯(PVC)、聚溴乙烯(PVB)、聚碘乙烯(PVI)、聚偏氟乙烯、聚偏氯乙烯、聚偏溴乙烯、聚偏碘乙烯和其衍生物。
含鹵共聚物可以具有如圖2中顯示的一般結構，其中聚合物的鹵含量為5至80％重量，更合乎要求地10至60％重量。X13-X16中至少一個含有一個或多個鹵原子，單體I代表例如乙烯、丙烯或其他化學部分。
具有圖3的一般結構的共聚物是更合乎要求的，其中X1-X4中至少一個含有一個或多個鹵原子。X1-X4中其他的可以是其他原子或基團，例如氫原子和甲基。圖3的結構中，X5-X8中至少一個是親水基團。親水基團的實例包括但不限于羧酸基、乙醇胺基、羥基、胺和氨基、亞胺基和聚乙二醇基。具體的含鹵共聚物的實例包括但不限于氟乙烯、氯乙烯、溴乙烯和碘乙烯與其他單體例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物。含鹵單體合乎要求地為共聚物的重要部分(大于50％重量)。
含鹵共聚物也可以具有如圖4和圖5中顯示的一般結構，其中鹵含量為5至80％重量，更合乎要求地10至60％重量。共聚物由至少三種不同的單體組成，其中具有鹵含量的單體(X13-X16)優選為主要組分(大于50％重量)。三種單體的兩種可以是與圖2中顯示的共聚物中的單體相同的，另外一種單體可以基于粒子要求的特性變化。圖5的結構中，X17-X20中至少一個是如上文通常討論的親水基團。
可以用于含鹵聚合物和共聚物包封的磷光分子可以具有各種結構。它們可以是有機化合物、有機/無機混合材料和帶有機配體的金屬螯合物。適于包封的磷光分子包括但不限于可與各種配體絡合的鉑、鈀、釕、鋨、銥、銦、鉬、锝、銅、鐵、鉻、鎢、鋅和錸。用于這樣絡合的配體包括卟啉及其衍生物、卟吩及其衍生物、聚吡啶基及其衍生物、吡啶、吡嗪、異煙酰胺、咪唑、聯吡啶、三聯吡啶(terpyridine)、菲咯啉和二吡啶并吩嗪。
合適的配體可以用烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧化物、羧基醛(carboxaldehyde)、羧基酰胺(carboxamide)、氰基、氨基、羥基、亞氨基、羥基羰基、氨基羰基、脒、胍鹽、酰脲、含硫基團、含磷基團和N-羥基-琥珀酰亞胺的羧酸酯。
卟啉和卟吩金屬絡合物具有用亞甲基橋偶合在一起的吡咯基，以形成具有金屬螯合內空穴的環結構。許多這樣的分子在室溫、合適的溶劑(例如水)和無氧環境下展示強磷光特性。一些合適的能展示磷光特性的卟啉絡合物包括但不限于鉑(II)糞卟啉-I和III、鈀(II)糞卟啉、釕糞卟啉，鋅(II)糞卟啉-I、它們的衍生物等。類似地，一些合適的能展示磷光特性的卟吩絡合物包括但不限于鉑(II)四-內消旋-氟苯基卟吩和鈀(II)四-內消旋-氟苯基卟吩。
如上文所示，聯吡啶金屬絡合物也可用于本發明。一些合適的聯吡啶絡合物的實例包括但不限于雙[(4，4′-甲酯基)-2，2′-聯吡啶]2-[3-(4-甲基-2，2′-聯吡啶-4-基)丙基]-1，3-二氧戊環合釕(II)；雙(2，2′-聯吡啶)[4-(丁-1-醛)-4′-甲基-2，2′-聯吡啶]合釕(II)；雙(2，2′-聯吡啶)[4-(4′-甲基-2，2′-聯吡啶-4′-基)-丁酸]合釕(II)；三(2，2′-聯吡啶)合釕(II)；(2，2′-聯吡啶)[雙-雙(1，2-二苯基膦)亞乙基]2-[3-(4-甲基-2，2′-聯吡啶-4′-基)丙基]-1，3-二氧戊環合鋨(II)；雙(2，2′-聯吡比啶)[4-(4′-甲基-2，2′-聯吡啶)-丁胺]合釕(II)；雙(2，2′-聯吡啶)[1-溴-4(4′-甲基-2，2′-聯吡比啶-4-基)丁烷]合釕(II)；雙(2，2′-聯吡啶)馬來酰亞胺己酸，4-甲基-2，2′-聯吡啶-4′-丁基酰胺合釕(II)等。
溶解溶劑應對包封聚合物/共聚物和磷光分子二者都具有非常優良的溶解性。溶解溶劑可以是單獨的化學物質或幾種化學品的混合物。溶解溶劑的實例包括但不限于二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)、甲醇、乙醇、丙醇、戊烷、戊烯、己烷、甲乙酮、丙酮、乙腈、二氯甲烷、環己烷、氯仿和其混合物。
沉淀溶劑應對聚合物/共聚物和磷光分子二者都具有不良的溶解性，可以是極性的或非極性的。沉淀溶劑也可以是一種化學物質或幾種化學品的混合物。沉淀溶劑可以從與溶解溶劑相同的清單選擇，盡管在任何具體的情況下它們當然不可能是相同的化學品。例如，如果水用作溶解溶劑，它就不能用作沉淀溶劑。
溶解溶劑和沉淀溶劑的選擇不僅取決于HCPs和磷光分子的特性，而且取決于要求的粒子表面特性和尺寸。溶解溶劑彼此可能完全或可能不完全地互溶。
本文選擇鉑和鈀四甲基五氟苯基卟吩(Pt-TMFPP和Pd-TMFPP，得自Frontier Scientific Inc.，Logan，Utah，USA)作為用于包封的磷光化合物。在氧或空氣的存在下，這兩種化合物具有非常微弱的磷光。在沒有氧存在時，當它們在約390nm受激發時，它們展示非常強的磷光，對Pt-TMFPP約650nm和對Pd-TMFPP約670nm。這兩種磷光分子可溶于許多有機溶劑例如甲苯、苯、甲醇、DMF和DMSO，但是不溶于水。
聚合物的交聯是提供增加的結構整體性的有用方法。這樣交聯的磷光分子比它們未交聯的相應物更穩定，因而更耐溫度、化學品、有機溶劑等。
HCPs可以通過作為聚合物一部分的連接部分直接交聯，或者通過其他分開的橋連或交聯材料交聯。實例包括但不限于由不飽和二羧酸例如馬來酸酐、馬來酸、富馬酸和衣康酸制備的不飽和聚合物，不飽和聚合物如聚二甘醇雙烯丙基碳酸酯、聚酰亞胺和聚雙馬來酰亞胺，具有兩個相同活性末端的均雙官能交聯劑如辛二酸雙(磺基琥珀酰亞胺)酯、酒石酸二琥珀酰亞胺酯和酒石酸二磺基琥珀酰亞胺酯，具有兩個不同活性末端的其他雜-雙官能交聯劑如間-馬來酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯，[N-(E-馬來酰亞胺基己酰氧基)-琥珀酰亞胺]和馬來酰亞胺PEG酰肼聚合物或能交聯含鹵聚合物的小分子。通過使用兩種或多種HCPs的另外交聯方法產生了非常穩定的粒子，其中至少一種是主要包封基質，一種或多種是交聯聚合物。
再一種交聯方法，其中聚合物體系由包含嵌段共聚物的一種或多種HCPs和一種或多種交聯小分子組成，也在本發明的范圍內。嵌段共聚物可以是無規和嵌段的。嵌段共聚物可以選自二嵌段、三嵌段、星型嵌段和多嵌段。嵌段與嵌段的排列可以是頭-尾、頭-頭、尾-尾和端基俘獲。至少一種共聚物應具有親水官能團以提供生物制劑結合。實例包括但不限于通過甲基丙烯酸甲酯和馬來酸酐、馬來酸二乙酯和富馬酸二乙酯單體形成的共聚物。
粒子交聯的另一方法是通過使用可以用含鹵聚合物包封的交聯磷光材料。另一方法是使用含鹵磷光材料和分開的交聯材料。分開的交聯材料的實例包括但不限于伯胺反應性交聯劑如亞氨酸酯和N-羥基琥珀酰亞胺酯；硫基(sulhydryl)反應性交聯劑如馬來酰亞胺、鹵乙酰和吡啶二硫化物；羰基反應性交聯劑如酰肼、碳二亞胺；和光反應性交聯劑如對-疊氮苯甲酰肼、4-(對-疊氮水楊酰胺基)丁胺和N-羥基琥珀酰亞胺基-4-疊氮水楊酸。最后，可以使用交聯的含鹵磷光材料。
粒子的交聯可以通過本領域熟知的方法實現，例如通過加熱、光引發和自由基交聯。
其中可能使用交聯粒子的產品包括成像儀、熒光計(fluorescetometer)和診斷設備。實例包括但不限于定性和/或定量側向流動、點滴試驗/指示系統、膠乳凝集試驗、過濾分離試驗、基于粒子的ELISA試驗、流式細胞術、細胞染色或相關方法、印跡或凝膠染色和微陣列。
用于制備可交聯磷光粒子的共聚物的實例包括但不限于聚氯乙烯與丙烯酸、馬來酸、乙烯基吡啶、具有氨基和亞胺基的單體和具有磺酸酯基的單體的共聚物。適合用作官能團的其他部分包括環氧基、異氰酸酯基、蜜胺基金屬醇化物、羧基、可水解的有機甲硅烷基和β-酮酸酯基。
HCP和共聚物的一個實例是與不飽和化合物和/或飽和單體共聚的鹵乙烯。這些單體的實例包括但不限于羧酸、丙烯酸類、甲基丙烯酸類和醋酸乙烯酯。磷光粒子包封的一類聚合物體系是由自氯乙烯、醋酸乙烯酯和含環氧單體制備的環氧官能三元共聚物和馬來酸改性的乙烯聚合物和共聚物組成。
用于磷光分子包封的含鹵共聚物的一種類型可以表示為例如聚(氯乙烯)-(單體I)-(單體II)，舉例說明于圖4和圖5中。人們認為氯乙烯部分為憎水分子例如Pd-TMFPP和Pt-TMFPP提供良好的相容性和高溶解度。單體I部分要求是親水的以提供表面官能團，單體II部分可以用于其他目的例如交聯。這樣的共聚物的具體實例是氯乙烯-醋酸乙烯酯-馬來酸共聚物(PVCMA)(提供在表面具有羧酸的磷光粒子)和氯乙烯-醋酸乙烯酯-環氧單體共聚物(PVCEM)。
在某些實例中使用的PVCMA(圖6)包含81％氯乙烯、17％醋酸乙烯酯和2％馬來酸。馬來酸能提供表面官能團和水相容性，醋酸乙烯酯可以用于交聯。發現PVCMA為高裝載的Pt-MTFPP提供優良的基質并擔當氧防護屏，這導致粒子的非常高的磷光強度。PVCMA市售得自Dow Chemical Company of Midland，MI，商品名UCARVMCA。
在某些實例中使用的PVCEM(圖7)包含82％氯乙烯、9％醋酸乙烯酯和9％環氧單體。PVCEM市售得自Dow Chemical Company，商品名UCAR VERR-40。
具有表面官能團的磷光粒子可以通過本發明使用含鹵共聚物制備。表面官能團通過使粒子成為化學活性的提供粒子與其他材料相互作用的能力，例如通過成為親水的、憎水的、酸性的、堿性的等。共聚物具有至少兩種不同的單體，一種有鹵原子是憎水的，例如氯乙烯，另一種要求有親水基團例如甲基丙烯酸、丙烯酸、乙醇胺、聚乙二醇(PEG)、吡啶側鏈、銨側鏈或其它。
在親水官能團的情況下，為了一些親水單體留在粒子表面，水或水混合溶劑作為沉淀溶劑是合乎要求的。在這種情況下，包含鹵原子的憎水部分與包封的憎水磷光分子一起形成粒子核，親水基部分位于憎水核相和親水相分隔的界面。
為制備表面官能化的粒子，要將聚合物和磷光分子例如Pt-TMFPP和Pd-TMFPP溶解在水混溶的溶劑例如DMF或THF中。根據要求的粒子尺寸，在攪拌下溶液可以加入到水中，或者水可以加入溶液以共沉淀聚合物和磷光分子。形成的粒子可以進一步處理或分析。
粒子的機械穩定性和親水表面通過粒子的幾個特征顯示；粒子可以容易地沉淀和再懸浮在水中，進行許多循環而不改變尺寸。而且，表面官能團已經通過使用碳二亞胺作為偶聯劑將抗體共價地連接到粒子證實。
被覆抗體的磷光粒子已用于檢測c-反應蛋白(CRP)，在側向流動診斷設備上使用時間-分辨磷光測量。粒子達到的檢測靈敏度非常高。本發明通過下列實施例可以較好地理解。所有在實施例中使用的水是經過濾和去離子的。
實施例步驟1-溶液的制備5mg/ml PVCEM(Dow’s UCAR VERR-40)和PVCMA(Dow’s UCAR VMCA)溶液是通過在8支分開的小瓶中分別將125mg的每種聚合物溶解到25 ml的THF、丙酮、DMF和DMSO中制備。將小瓶攪拌并簡單地加熱以確保聚合物完全溶解。以0/100、20/80、50/50、80/20和100/0的不同重量比制備混合的600μlPVCEM和PVCMA的溶液。一邊強力攪拌每個混合溶液，一邊向每個小瓶滴加3ml水，引起粒子形成。粒子尺寸使用ZetaPALS Particle SizeAnalyzer(Brookhaven Instruments，Co.，Holtsville，NY)測量。測量時，使用2.20的粒子折射率，使用90°角。粒子尺寸和多分散性(nm/PD)結果在表1中給出。
步驟2-粒子交聯將在THF中的20/80 PVCEM/PVCMA溶液在150℃加熱20分鐘為了將它交聯。加熱后，進行紅外(IR)分析，將光譜與每種組分的純光譜對比。圖8顯示三個光譜，表明成功制備了交聯粒子。圖8中，最上線是PVCMA，中間線是PVCEM，最下線是交聯的PVCEM/PVCMA。圖8中y軸上的刻度是吸光度(nm)，x軸上的刻度是波數(cm-1)。
步驟3-磷光染料包封選擇鉑四甲基五氟苯基卟吩(Pt-TMFPP)進行包封。通過將20mg染料粉末溶解在5ml DMF中制備4mg/ml的Pt-TMFPP溶液。如表2所指示將不同量的此染料溶液加入600ul20/80混合PVCEM/PVCMA溶液。一邊強力攪拌混合溶液，一邊向每個小瓶滴加3ml水，引起染料包封粒子形成。此混合物在150℃加熱20分鐘為了將它交聯，粒子尺寸和多分散性如上文相同的方式測量。結果在表2中給出。
步驟4-機械穩定性將步驟3制備的粒子放入1.5ml小瓶中，在14,000rpm下離心20分鐘。丟棄上層清液，向每個小瓶加入與丟棄的清液相同體積的水。將小瓶放在超聲浴中5分鐘，使粒子再懸浮，然后將小瓶在烘箱中于85℃放置過夜(約10小時)以交聯它們。粒子尺寸和多分散性如上文測試，結果在表3中給出，結果顯示粒子未分解成較小的粒子，因而顯示良好的機械穩定性。
步驟5-磷光強度將20μl的每個步驟4中制備的懸浮液用500μl蒸餾水稀釋進行磷光強度的測量。使用的儀器是Fluorog SPEX 1934D磷光計(得自JoBin Yvon Horiba，Edison，NJ)。測量中使用的參數為激發光為390nm，磷光為650nm，掃描數為1，初始延遲為0.01ms，樣品窗口為3ms，每次閃光的時間為50ms，閃光數為20。結果以千光子計數(k)的單位給出。
作為比較，用125mg PAN在DMF中制備的5mg/ml聚丙烯腈(PAN)溶液進行比較。此溶液以步驟3中教授的方法用來包封Pt-TMFPP。此外，制備了沒有任何聚合物的溶液作為對照。
圖9顯示經聚合物包封的染料粒子的強度。最上線是PVCEM/PVCMA體系的強度，中間線是PAN體系的強度，最低線是單獨磷光材料的強度。X軸上的刻度為600至700波長，Y軸為0至60000計數每秒。很清楚PVCEM/PVCMA體系比PAN或對照體系具有高得多的強度。
下面的表4顯示經聚合物包封的染料粒子的強度。很清楚當相同水平的染料濃度下對比時，從0.1％至2.0％變化，PVCEM/PVCMA體系比PAN體系具有高得多的強度。
表4
步驟6-耐化學性將步驟3中制備的粒子放入1.5ml小瓶中，在14,000rpm下離心20分鐘。丟棄上層清液，向每個小瓶加入與丟棄的清液相同體積的水。將小瓶放在超聲浴中5分鐘，使粒子再懸浮。然后將再懸浮的粒子分成等量的兩份。一份在烘箱中于85℃放置過夜(約10小時)以交聯它們。另外一份用作未交聯粒子。將過量的有機溶劑如DMSO或THF加入交聯的和未交聯的粒子溶液中。溶液靜置10分鐘后，按步驟1測試粒子尺寸和多分散性，結果在下面的表5和表6中給出。結果顯示未交聯的染料粒子在與DMSO或THF接觸時分別損傷膨脹成較大的粒子，這造成粒子尺寸分布(PD)寬得多，而交聯的染料粒子顯示DMSO或THF的影響小得多，表明交聯的染料粒子良好的耐化學性。
表5
表6
步驟7-耐表面活性劑性將步驟3中制備的粒子放入1.5ml小瓶中，在14,000rpm下離心20分鐘。丟棄上層清液，向每個小瓶加入與丟棄的清液相同體積的水。將小瓶放在超聲浴中5分鐘，使粒子再懸浮。然后將再懸浮的粒子分成等量的兩份。一份在烘箱中于85℃放置過夜(約10小時)以交聯粒子。另外一份用作未交聯粒子。將過量的表面活性劑(例如TWEEN20)加入交聯的和未交聯的粒子溶液。溶液靜置10分鐘后，按步驟1測試粒子尺寸和多分散性，結果在表7中給出。結果顯示加入2％的TWEEN20表面活性劑時，未交聯的染料粒子破裂成平均粒子尺寸大約為42nm的較小粒子，這也造成粒子尺寸分布寬得多(PD＝0.326)，而交聯的染料粒子事實上是未受影響的(平均粒子尺寸大約為123nm)，是窄尺寸分布(PD＝0.167)。這表明交聯粒子具有良好的耐表面活性劑性。
表7
SEM結果步驟5的交聯的和未交聯的染料包封粒子的SEM圖象顯示在圖10和圖11中。SEM圖象的粒子平均尺寸與通過ZetaPALS Particle Size Analyzer獲得的尺寸相似。交聯粒子顯示非常均勻和穩定的球形粒子形態，而一些未交聯粒子聚集和融合在一起，導致較不均勻的粒子形態。
步驟8-光穩定性50ul步驟3的交聯磷光分子Pt-TMPFP包封的染料包封粒子(染料濃度分別為0.1％、0.5％、1.0％和2.0％)用水清洗一次，在450ul水中再懸浮。用390nm的光連續地照射粒子，通過Fluorolog III熒光計在650nm處監測磷光。照射10分鐘后低于2％的磷光減少。此實驗表明不同染料裝載的交聯磷光粒子都是非常光化學穩定的。
步驟9-抗體共價結合到交聯磷光粒子6ml步驟3的交聯磷光分子Pt-TMPFP包封粒子(染料濃度為0.1％)經離心用水清洗一次，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(Polysciences，Inc)清洗。清洗過的粒子通過浴槽式超聲處理(10分鐘)，接著10秒的探針式超聲處理懸浮在500ul PBS中。向粒子懸浮液中加入在50ul PBS中的3mg碳二亞胺，將混合物震動15分鐘。然后通過離心用硼酸鹽緩沖液將粒子清洗兩次，清洗過的粒子懸浮在400ul硼酸鹽緩沖液中。向粒子懸浮液加入35ul CRP單克隆抗體(6.4mg/ml，CRP Mabl得自BioSpacific，A5811)，將混合物震動過夜。然后向混合物加入200ul乙醇胺(Polysciences，Inc)和50ul牛血清白蛋白(BSA)(1mg/ml)，將混合物震動半小時。然后用hepes緩沖液(N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-(2-乙磺酸)，自Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.of St.Louis，MO，pH7.4)將粒子清洗兩次。將清洗過的粒子通過10分鐘的浴槽式超聲處理，接著10秒的探針式超聲處理懸浮在1000ul包含0.02mg/ml BSA的Hepes中。懸浮的粒子在4℃儲存。
步驟10-使用綴合物檢測CRP將20ul步驟9中制備的綴合物用具有1％TWEEN20的180ul TBS緩沖液稀釋以制備綴合物懸浮液。在微量滴定板上的11個孔的每個孔中加入20ul綴合物懸浮液。CRP(自Biodesign Inc.)在三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水(TBS)中稀釋。孔也分別標記為孔1、2、3和4。向孔1、2、3和4分別加入20ul TBS、19ul TBS和1ul CRP(12.5ng/ml)、18ul TBS和2ul CRP(25ng/ml)以及15ul TBS和5ul CRP(62.5 ng/ml)。向每個孔中插入具有1mg/mlCRP Mab2檢測線(CRP Mab2CRP單克隆抗體，A5804，自BioSpacificInc)和金線對照線的半浸棒(half dipstick)。使浸棒顯色半小時。然后每個裝置的檢測線上650nm的磷光通過在390nm激發在FluorologIII上測量。孔1至4中裝置在650nm的磷光強度分別為10.4K、24.1K、29.9K和39.5K。相信磷光部分與聚合物基質是共價結合的。
如本領域技術人員所知，認為對本發明的改變和變更是在本領域技術人員的能力之內。這樣改變的實例包含在上文確認的專利中，其中每個以與本說明書一致的程度通過引用結合到本文中。發明人認為這樣的改變和變更在本發明的范圍之內。當按照前述公開閱讀時，也可以理解本發明的范圍不是解釋為局限于在此公開的具體實施方案，而只是依照附加的權利要求。
權利要求
1.一種磷光粒子，所述粒子包含包封在交聯含鹵聚合物基質中的磷光材料，其中所述交聯含鹵聚合物基質具有至少1％重量的鹵原子。
2.權利要求1的粒子，其中所述交聯含鹵聚合物基質是通過連接部分交聯一種含鹵聚合物形成。
3.權利要求1的粒子，其中所述交聯含鹵聚合物基質是通過連接部分交聯兩種或多種聚合物形成，其中至少一種所述聚合物具有鹵原子。
4.權利要求1的粒子，其中所述鹵原子包括氟、氯、溴和碘。
5.權利要求1的粒子，其中所述交聯含鹵聚合物基質具有約5至80％重量的鹵原子。
6.權利要求1的粒子，其中所述交聯含鹵聚合物基質具有約10至60％重量的鹵原子。
7.權利要求3的粒子，其中所述連接部分選自羧酸基團、乙醇胺基團、羥基基團、胺基團、氨基基團、亞胺基團、環氧基團、異氰酸酯基團、蜜胺基團、金屬醇化物、可水解的有機甲硅烷基基團、β-酮酸酯基團和聚乙二醇基團。
8.權利要求3的粒子，其中一種所述聚合物是氯乙烯-醋酸乙烯酯-馬來酸共聚物。
9.權利要求3的粒子，其中一種所述聚合物是氯乙烯-醋酸乙烯酯-環氧單體共聚物。
10.權利要求1的粒子，其中所述交聯含鹵聚合物基質是通過交聯氯乙烯-醋酸乙烯酯-環氧單體共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯酯-環氧單體共聚物形成。
11.權利要求3的粒子，其中至少一種所述聚合物是嵌段共聚物，所述嵌段選自二嵌段、三嵌段、星型嵌段和多嵌段。
12.權利要求11的粒子，其中所述嵌段是選自頭-尾、頭-頭、尾-尾和末端基團的排列。
13.權利要求1的粒子，其中所述交聯含鹵聚合物基質是經選自加熱、光引發和自由基交聯的方法通過交聯聚合物和共聚物形成。
14.權利要求1的粒子，所述粒子存在于選自成像儀、熒光計和診斷設備的產品中。
15.權利要求1的粒子，所述粒子是經磷光交聯劑通過交聯合鹵聚合物形成。
16.權利要求1的粒子，所述粒子是經非磷光交聯劑通過交聯磷光含鹵聚合物形成。
17.權利要求1的粒子，所述粒子是經交聯劑通過交聯含鹵聚合物和磷光分子形成。
18.一種磷光粒子，所述磷光粒子包含在交聯含鹵聚合物基質中的磷光部分，其中所述磷光部分與所述聚合物基質共價結合。
全文摘要
本發明提供交聯的磷光微米和納米粒子以及那些粒子的應用。本發明使用含鹵聚合物和共聚物(HCPs)作為有機和有機金屬磷光化合物的包封基質以形成微米和納米粒子。這些包封磷光粒子的磷光在環境條件下實質上不受磷光猝滅劑例如氧和水分子的影響。本發明提供交聯磷光粒子的制備方法。HCPs可以通過作為聚合物一部分的連接部分直接交聯，或者通過其他分開的橋連或交聯材料交聯。交聯粒子比非交聯的相應物更穩定，更耐溫度、表面活性劑和有機溶劑。
文檔編號C08K5/00GK1973017SQ200580021208
公開日2007年5月30日 申請日期2005年5月24日 優先權日2004年6月29日
發明者L·黃, X·宋, B·吳, R·M·凱洛 申請人:金伯利-克拉克環球有限公司