專利名稱：一種酸溶性魚皮膠原蛋白及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種利用海水魚加工的廢棄物——魚皮，提取酸溶性膠原蛋白及其制備方法，屬于生物制品領域。
背景技術：
膠原蛋白是構成動物支持組織的結構蛋白質，其制品已廣泛應用于醫藥、保健、食品加工、化妝品等眾多領域，迄今其制品主要是從一些陸生哺乳動物如牛、豬等的皮膚中提取。近年來，由于瘋牛病和口蹄疫的影響，人們開始尋求從水產動物如魚類中提取安全、衛生、無害的膠原蛋白，這成為近年來各國研究的一項熱門課題。因此從魚加工廢棄物中提取膠原蛋白并加以利用，既能促進加工廢棄物的綜合利用、變廢為寶，增加附加值，又將是一種新型膠原資源的開發。
以往對膠原蛋白的制備，主要采取堿法、鹽法、酸法、酶法、或者是酸法和酶法相結合來提取。堿性條件下處理，易造成肽鍵水解，故在以獲得完整膠原為目的的提取中應用很少；鹽法提取的工藝不易穩定，且膠原分子結構不及酸溶膠原合適；酸法在低離子濃度酸性條件下，能引起纖維膨脹，溶解，且經酸提后的膠原蛋白的氨基酸組成、晶體長度和性質都與膠原相同；酶法采用對膠原作用較弱的酶(主要用組織蛋白酶如胃蛋白酶)在酸性條件下可使膠原溶解，且只催化水解膠原的端肽非螺旋區，仍能保持膠原的完整螺旋區段。故對膠原采取酸法與酶法的研究比較多。但是，酶法提取膠原蛋白用于工業生產成本較高，酸法提取則會相對降低成本。然而采用單一的酸溶液提取，也會使提取得率受到限制。傅燕鳳等對淡水魚魚皮提取了膠原蛋白，分別用醋酸、檸檬酸、乳酸對鰱、鳙、草魚的魚皮進行膠原蛋白的提取，但其得到的膠原蛋白略有魚腥味，且鰱魚皮和鳙魚皮制品的潔白度略差。王瑾曄等(中國專利申請號02111683.0)通過堿溶液處理魚皮，又用限制性酶解上述魚皮，堿性條件易造成肽鍵水解，不易獲得完整的大分子膠原蛋白，而且酶使成本提高。秦玉清等研究了影響魷魚皮膠原蛋白提取的部分影響因素，并確認通過水提和酶解方法都可得到膠原蛋白含量較高的溶液，但是熱水提取將膠原蛋白變性，最終是作為小分子量的明膠提取出來的，而低溫條件下用胃蛋白酶提取對魚皮膠原蛋白來說成本較高。陳申如等對幾種淡水魚采用醋酸水解得到膠原蛋白，并進行了電泳分析，得出的膠原蛋白純度很高。G·A·麥克唐納等(中國專利申請號00816385.5)從冷水魚皮膚中提取了一種膠原產品，及膠原產品的生產方法，并發明了一種新的檢測蛋白質溶液中天然膠原含量的方法。
哺乳動物豬、牛等的皮膚膠原經稀酸處理得到的酸溶性膠原蛋白的含量很低，而魚皮經稀酸處理后，得到的酸溶性膠原蛋白含量占總膠原的比例相當高。因此較之哺乳動物，從魚皮中提取酸溶性膠原蛋白用于工業生產可節約成本。然而從魚皮-特別是海魚-的魚皮中提取酸溶性膠原蛋白的高效工藝方法尚未見到報導。
發明內容
本發明的目的在于提供一種從海水魚的魚皮中提取酸溶性膠原蛋白的高效工藝方法，并制得一種新的酸溶性膠原蛋白。
提供以魚皮為原料制備的純度高、溶解性好、無不良氣味、質量穩定、成本低廉、色澤良好(符合產品色澤呈白色或乳白色的質量要求)的膠原蛋白產品。
提供制備上述膠原蛋白產品的方法。以海水魚加工廢棄物——魚皮為原料，在適當的低溫條件下，經除雜、脫脂后，將魚皮置于兩種復合酸溶液的最適作用環境中充分溶脹提取，最終得到了最大限度的酸溶性膠原蛋白。
本發明的魚皮膠原蛋白的制備方法的工藝為原料處理、提取、鹽析、純化干燥，具體操作步驟如下一、原料處理a、取新鮮或冷凍魚皮經解凍，瀝干，將其切成小塊，最好是切成小于0.5cm3的碎塊。
b、加入魚皮重量5～25倍的1～10％的NaCl溶液，于4～10℃浸泡4～24h，于4℃以3000～5000rpm的速度離心5～20min，將離心后的上清液除去，即除去了非膠原蛋白及雜質；
c、再將上述處理的魚皮放入-20℃預冷過的，魚皮重量5～25倍的丙酮與乙醇(1∶1)的混合液中脫脂4～24h，倒掉處理液，于通風廚內晾干。
二、魚皮膠原蛋白的提取將上述處理的魚皮溶解于魚皮重量5～25倍的0.1mol/L檸檬酸與0.5mol/L醋酸的混合液中，其中檸檬酸與醋酸的體積比為1.0∶0.1～10.0，4～10℃下浸泡10～24h，于4℃溫度條件下以10000～20000rpm的速度離心20～60min，分離的上清液得酸溶性膠原溶液，于4℃溫度條件下保存；也可以將分離所得的沉淀再重復此步驟提取1～2次，合并上清液，于4℃溫度條件下保存。
三、鹽析向上述酸溶性膠原溶液中直接加入NaCl固體進行鹽析，使NaCl最終濃度達到1～4mol/L，鹽析1～36h，然后于4～10℃以6000～12000rpm的速度冷凍離心10～20min，得到酸溶性膠原蛋白沉淀。
四、純化干燥可以用如下兩種純化干燥的方法中的任一方法均可得到本發明的產品1、鹽析后得到的膠原沉淀溶解于0.5mol/L的醋酸溶液中，然后在0.02mol/L的pH8.6的Na2HPO4中透析，所得膠原沉淀，真空冷凍干燥即得到高純度的產品。
2、鹽析后得到的膠原沉淀溶解于0.5mol/L的醋酸溶液中，用分子量大于6萬的醋酸纖維中空纖維膜進行超濾處理，得到的產物真空冷凍干燥即可得到高純度產品。
本發明提取得到的膠原蛋白潔白，無腥味，冷凍干燥后呈海綿狀。魚皮膠原蛋白純度較高，達≥97％。魚皮膠原蛋白在低溫下可溶于中性鹽溶液或酸性溶液，容易調制得到可溶性膠原溶液。所提的膠原蛋白為天然的、未變性的大分子膠原蛋白，同原膠原具有相同的形狀、大小及氨基酸組成。膠原蛋白中含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸，其水解產物中還有生理活性肽。膠原蛋白分子量大于60000，含有3條異種α鏈，即α1(I)α2(I)α3(I)。
與現有技術相比本發明具有如下優點1、本發明提供了一種以海水魚皮為原料的提取酸溶性膠原蛋白非常有效的方法。工藝簡單、合理、有效，產品得率達12％以上，產品純度高達97％以上，有的甚至超過99％，其色澤潔白，無腥味，可廣泛使用。
2、哺乳動物豬、牛等的皮膚膠原經稀酸處理得到的酸溶性膠原蛋白的含量很低，而魚皮經稀酸處理后，得到的酸溶性膠原蛋白含量占總膠原的比例相當高。因此較之哺乳動物，從魚皮中提取可溶性膠原蛋白用于工業生產可節約成本。
3、本發明中除非膠原蛋白的方法能最大限度的除去總的粗蛋白，而且膠原蛋白損失量最小，除非膠原蛋白效果好。
4、本發明所用的脫脂方法，既能充分脫除脂肪，膠原蛋白未變性，亦不影響鹽析和后續回收膠原蛋白，又有效的除去了魚腥味和一部分魚皮色素，使膠原蛋白產品質量好、純度高。
5、魚皮膠原蛋白由于其抗原性比其它蛋白質弱、生物相容性好而被廣泛應用于生物制品，廣泛用于創傷和燒傷的修復、整形美容、神經再生及血瓣膜手術等。魚皮膠原蛋白特別是深海魚皮膠原蛋白變性溫度低，不能限制細胞的增值，它能促進細胞的粘著和增值，不會誘發細胞的癌變。
6、不同的酸對膠原鏈的作用位點不同，所以使用兩種復合酸比單獨使用一種酸對魚皮的作用更徹底，經濟效益好。然而，還沒有用復合酸來提取膠原蛋白的報道。
7、本發明綜合利用了低溫提取技術、低溫過濾技術、冷凍離心技術及冷凍干燥技術，能充分保持膠原蛋白的生物活性。
具體實施例方式
實施例一取1Kg冷凍魚皮經解凍，瀝干，將其切成小于0.5cm3的碎塊。加入10L2％的NaCl溶液，于4℃浸泡18h，然后3000rpm離心20min，棄去混濁的上清液。再將魚皮放入-20℃預冷過的5L丙酮與5L乙醇的混合液中，作用4h后，取出魚皮，于通風廚內晾干。然后將魚皮溶解于13.7L 0.1mol/L檸檬酸與1.36L0.5mol/L醋酸的混合液中(10∶1共15L)，于4℃下浸泡24h，4℃，10000rpm離心40min，將沉淀再重復此步驟提取2次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性膠原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固體1.75Kg，使最終濃度達1mol/L，進行鹽析4h，然后于4℃，6000rpm離心20min，將膠原沉淀復溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，然后在0.02mol/L的Na2HPO4(pH8.6)中透析，真空冷凍干燥即可得到純度為97％的高純度產品132.1g，得率13.21％(按濕重計)。
實施例二取1Kg冷凍魚皮經解凍，瀝干，將其切成小于0.5cm3的碎塊。加入10L4％的NaCl溶液，于4℃浸泡20h，然后3000rpm離心20min，棄去混濁的上清液。再將魚皮放入-20℃預冷過的7.5L丙酮與7.5L乙醇的混合液中，作用8h后，取出魚皮，于通風廚內晾干。然后將魚皮溶解于17.5L 0.1mol/L檸檬酸與2.5L0.5mol/L醋酸的混合液中(7∶1共20L)，于4℃下浸泡22h，4℃，12000rpm離心20min，將沉淀再重復此步驟提取1次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性膠原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固體4.68Kg，使最終濃度達2mol/L，進行鹽析12h，然后于4℃，8000rpm冷凍離心15min，將膠原沉淀復溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，進行超濾處理，再經真空冷凍干燥即可得到純度為97.52％的高純度產品128g，得率為12.8％(按濕重計)。
實施例三取1Kg冷凍魚皮經解凍，瀝干，將其切成小于0.5cm3的碎塊。加入20L 5％的NaCl溶液，于4℃浸泡12h，4℃，4000rpm離心10min，棄去混濁的上清液。再將魚皮放入-20℃預冷過的12.5L丙酮與12.5L乙醇的混合液中，作用12h后，取出魚皮，于通風廚內晾干。然后將魚皮溶解于5L 0.1mol/L檸檬酸與5L 0.5mol/L醋酸的混合液中(1∶1共10L)，于4℃下浸泡20h，4℃，10000rpm離心50min，得到上清液，于4℃保存，即得酸溶性膠原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固體3.5Kg，使最終濃度達3mol/L，進行鹽析1h，然后4℃，6000rpm冷凍離心15min，將膠原沉淀復溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，然后在0.02mol/L的Na2HPO4(pH8.6)中透析，真空冷凍干燥即可得到純度為98％的高純度產品130g，得率為13％(按濕重計)。
實施例四取1Kg冷凍魚皮經解凍，瀝干，將其切成小于0.5cm3的碎塊。加入25L 8％的NaCl溶液，于4℃浸泡4h，然后5000rpm離心10min，棄去混濁的上清液。再將魚皮放入-20℃預冷過的10L丙酮與10L乙醇的混合液中，作用16h后，取出魚皮，于通風廚內晾干。然后將魚皮溶解于12.5L 0.1mol/L檸檬酸與2.5L0.5mol/L醋酸的混合液中(5∶1共15L)，于4℃下浸泡12h，4℃，12000rpm離心40min，得到上清液，于4℃保存，即得酸溶性膠原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固體7Kg，使最終濃度達4mol/L，進行鹽析18h，然后4℃，10000rpm冷凍離心10min，將膠原沉淀復溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，進行超濾處理，再經真空冷凍干燥即可得到純度為97.3％的高純度產品126g，得率為12.6％(按濕重計)。
實施例五取1Kg冷凍魚皮經解凍，瀝干，將其切成小于0.5cm3的碎塊。加入5L 1％的NaCl溶液，于4℃浸泡24h，然后5000rpm離心5min，棄去混濁的上清液。再將魚皮放入-20℃預冷過的2.5L丙酮與2.5L乙醇的混合液中，作用20h后，取出魚皮，于通風廚內晾干。然后將魚皮溶解于6.2L 0.1mol/L檸檬酸與18.8L0.5mol/L醋酸的混合液中(1∶3共25L)，于4℃下浸泡10h，4℃，18000rpm離心20min，將沉淀再重復此步驟提取1次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性膠原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固體5.84Kg，使最終濃度達2mol/L，進行鹽析16h，然后4℃，12000rpm冷凍離心10min，將膠原沉淀復溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，然后在0.02mol/L的Na2HPO4(pH8.6)中透析，真空冷凍干燥即可得到純度為98.5％的高純度產品124.6g，得率為12.46％(按濕重計)。
實施例六取1Kg冷凍魚皮經解凍，瀝干，將其切成小于0.5cm3的碎塊。加入15L 10％的NaCl溶液，于10℃浸泡4h，然后4000rpm離心20min，棄去混濁的上清液。再將魚皮放入-20℃預冷過的10L丙酮與10L乙醇的混合液中，作用24h后，取出魚皮，于通風廚內晾干。然后將魚皮溶解于0.8L 0.1mol/L檸檬酸與4.2L0.5mol/L醋酸的混合液中(1∶5共5L)，于4℃下浸泡20h，4℃，20000rpm離心20min，將沉淀再重復此步驟提取2次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性膠原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固體2.3Kg，使最終濃度達4mol/L，進行鹽析24h，然后4℃，10000rpm冷凍離心15min，將膠原沉淀復溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，進行超濾處理，再經真空冷凍干燥即可得到純度為99％的高純度產品135g，得率為13.5％(按濕重計)。
實施例七取1Kg冷凍魚皮經解凍，瀝干，將其切成小于0.5cm3的碎塊。加入25L6％的NaCl溶液，于6℃浸泡8h，4℃，4000rpm離心10min，棄去混濁的上清液。再將魚皮放入-20℃預冷過的12.5L丙酮與12.5L乙醇的混合液中，作用12h后，取出魚皮，于通風廚內晾干。然后將魚皮溶解于1.2L 0.1mol/L檸檬酸與8.8L0.5mol/L醋酸的混合液中(1∶7共10L)，于4℃下浸泡20h，4℃，10000rpm離心50min，將沉淀再重復此步驟提取1次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性膠原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固體3.5Kg，使最終濃度達3mol/L，進行鹽析36h，然后4℃，6000rpm冷凍離心15min，將膠原沉淀復溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，然后在0.02mol/L的Na2HPO4(pH8.6)中透析，真空冷凍干燥即可得到純度為99.4％的高純度產品118g，得率為11.8％(按濕重計)。
實施例八取1Kg冷凍魚皮經解凍，瀝干，將其切成小于0.5cm3的碎塊。加入15L 3％的NaCl溶液，于8℃浸泡20h，然后4000rpm離心15min，棄去混濁的上清液。再將魚皮放入-20℃預冷過的5L丙酮與5L乙醇的混合液中，作用10h后，取出魚皮，于通風廚內晾干。然后將魚皮溶解于1.8L 0.1mol/L檸檬酸與18.2L0.5mol/L醋酸的混合液中(1∶10共20L)，于4℃下浸泡12h，4℃，10000rpm離心40min，將沉淀再重復此步驟提取2次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性膠原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固體2.33Kg，使最終濃度達1mol/L，進行鹽析20h，然后4℃，10000rpm冷凍離心10min，將膠原沉淀復溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，進行超濾處理，再經真空冷凍干燥即可得到純度為98.8％的高純度產品137g，得率為13.7％(按濕重計)。
權利要求
1.一種酸溶性魚皮膠原蛋白，其特征在于是以海水魚的魚皮為原料，通過魚皮切碎、除去非膠原蛋白和雜質、脫脂、提取、鹽析、純化、干燥而得的膠原蛋白；膠原蛋白潔白，無腥味，冷凍干燥后呈海綿狀，純度達97％以上，分子量大于60000，含有3條異種α鏈，即α1(I)α2(I)α3(I)；(魚皮膠原蛋白在低溫下可溶于中性鹽溶液或酸性溶液，容易調制得到可溶性膠原溶液；膠原蛋白為天然的、未變性的大分子膠原蛋白，同原膠原具有相同的形狀、大小及氨基酸組成；膠原蛋白中含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸，其水解產物中還有生理活性肽。
2.一種酸溶性魚皮膠原蛋白的制法，其特征在于工藝步驟為原料處理，提取，鹽析，純化干燥；其中所述原料處理為常溫下的魚皮切成小塊，而后進行①浸入5～25倍4～10℃的1～10％Nacl溶液，浸泡4～24h；②于4℃以3000～5000rpm速度離心分離5～20min，分出魚皮；③將魚皮置入5～20倍，經-20℃預冷過的1∶1的丙酮和乙醇溶液中脫脂4～24h，脫脂魚皮晾干；所述提取為①脫脂晾干魚皮置入5～20倍1∶0.1～10的0.1mol/L檸檬酸和0.5mol/L醋酸的混合液體中，4～10℃浸泡10～24h；②于4℃以10000～20000rpm速度離心分離20～60min；上清液于4℃保存得酸溶膠原溶液；所述鹽析為在酸溶膠原溶液中加入固體NaCl，攪拌使其溶解，其最終濃度1～4mol/L，鹽析1～36小時，于4～10℃，以6000～12000rpm離心分離10～20min得酸溶膠原沉淀；所述純化干燥為；將所得酸溶膠原沉淀溶入0.5mol/L的醋酸溶液中，而后在0.02mol/L的pH為8.6的磷酸氫二鈉溶液中透析，所得的膠原沉淀真空冷凍干燥而得產品。
3.根據權利要求2所述酸溶性魚皮膠原蛋白的制法，其特征在于所述原料處理中魚皮切成小塊為切成≤0.5cm3。
4.根據權利要求2所述酸溶性魚皮膠原蛋白的制法，其特征在于所述提取步驟中提取后的離心分離所得的沉淀重復提取1～2次，上清液合并，4℃保存得酸溶膠原溶液。
5.根據權利要求2所述酸溶性魚皮膠原蛋白的制法，其特征在于所述純化干燥步驟中將得酸溶膠原沉淀溶入0.5mol/L的醋酸溶液中，用分子量大于6萬的醋酸中空纖維膜進行超濾處理，得到產物真空冷凍干燥而得產品。
全文摘要
一種酸溶性魚皮膠原蛋白，是以海魚皮為原料，經切碎、NaCl溶液浸泡去雜質、乙醇丙酮脫脂的處理，進而用檸檬酸和醋酸的混合液浸泡提取后離心分離得酸溶性魚皮膠原溶液，再經NaCl固體鹽析得酸溶性魚皮膠原蛋白沉淀，最后將酸溶性魚皮膠原蛋白沉淀溶解于醋酸溶液中，而后在Na
文檔編號C08H1/06GK1749296SQ200510047408
公開日2006年3月22日 申請日期2005年10月11日 優先權日2005年10月11日
發明者朱蓓薇, 董秀萍, 劉兆芳, 閆雪, 徐美玲, 孫玉梅 申請人:大連輕工業學院