專利名稱：交聯殼聚糖－季銨化水解膠原蛋白制備方法
技術領域：
本發明涉及抗菌生物材料制備，特別涉及殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白制備方法二、技術背景隨著人們物質生活水平和對消費品質量及環保要求的提高，具有抗菌功能的用品應運而生，有廣闊的市場前景及重大的經濟效益和社會效益。殼聚糖是一種天然多聚陽離子多糖，從甲殼類動物和其他無脊椎動物外殼及藻類、菌類細胞壁中制得，其自然資源非常豐富，據統計年生成量為109～1011噸，是僅次于纖維素的第二大可再生資源。殼聚糖具有優秀的廣譜抗菌性，對幾十種細菌和霉菌的生長都有明顯的抑制作用，有良好的生物相容性，無毒、無刺激性及無抗原性等特點。殼聚糖化學改性聚合物在許多方面都顯示出獨特的功能特性，在紡織、印染、造紙、食品、化工、環保、農業及生物醫學領域都有很高的實用價值。
中國專利公開號為1395968的發明專利公開了一種用于人體皮膚創傷、燒傷及體表潰瘍的生物敷料的“殼聚糖生物流體敷料膜及其制備方法”。該發明以殼聚糖為主要原料，經酸解、添加甘油，再用碳酸氫鈉進行中和及過濾而成的生物敷料。但是，因殼聚糖是由D-葡萄糖通過β-1-4糖苷鍵形成的鏈狀高分子，雖然成膜性好，能形成凝膠，但是，由于組成殼聚糖的基本結構單元-氨基葡萄糖與組成皮膚的蛋白質的基本單元-氨基酸明顯不同，因此僅由殼聚糖制備的膜與皮膚的親和力不強，干燥后極易起殼脫落；由于殼聚糖鏈之間相鄰氨基葡萄糖之間存在大量氫鍵連接，氫鍵鍵能較高，使線性殼聚糖分子緊密結合，成膜后幾乎無孔穴，透氣性差，脆性大，致使其抗菌的游離氨基也被大量屏蔽，使殼聚糖膜的抗菌效果不如其溶液；由于線性殼聚糖分子間大量氫鍵的緊密結合，使殼聚糖形成的凝膠致密，孔穴少，不能容納分子量較大的物質，因此，不利于在殼聚糖凝膠中添加活性生物大分子，影響生物敷料的使用效果。
發明內容
本發明的目的是針對現有生物敷料的不足之處，提供一種交聯殼聚糖-季胺化水解膠原蛋白制備方法，用本發明制備的產品或用本發明產品添加功能生物大分子等后涂抹于人體皮膚，毛發或傷口創面上，具有營養性，附著力強、抗菌性及透氣性好，并能被酶水解等特性，可廣泛用于創傷傷口的修復、殺菌及毛發、皮膚的營養、抗結及抗菌，也可用來制作抗菌面料、抗靜電織物等。
本發明的目的是這樣實現的交聯殼聚糖-季胺化水解膠原蛋白制備方法，利用水解膠原蛋白具有良好的成膜性及組成水解膠原蛋白的18種氨基酸的比例與人體皮膚、毛發接近，而對皮膚和毛發有很好的親和性，故小分子水解膠原蛋白在人體皮膚和毛發上形成膜后不會起殼脫落，并可滲入皮膚和毛發改善其營養等理化特性；利用殼聚糖含有大量親水羥基和氨基、具有成膜性、透氣性及抗菌性的特點；利用水解膠原蛋白中的蘇氨酸、絲氨酸、羥基脯氨酸及酪氨酸羥基被季胺化劑(如N-十二烷基-二甲基-羥丙基氯化銨等)醚化改性后形成的季銨化改性水解膠原蛋白衍生物帶有正電荷、保留水解膠原蛋白原有理化特性，并能與附著于皮膚和毛發的微生物帶負電荷蛋白結合，從而具有顯著的抗菌功能的作用特點，因此，本發明方法以蠶蛹殼聚糖和水解膠原蛋白為主要原料，先分別制備成平均分子量為3850D的季銨化水解膠原蛋白溶液和平均分子量為5000-6000D的蠶蛹殼聚糖溶液，然后按比例將兩種溶液混合均勻，加入交聯劑二環己基碳化二亞胺進行交聯反應，獲得交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白，再經透析膜除去未反應的殼聚糖和季銨化水解膠原蛋白原料，然后進行膜濃縮，獲得交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白濃縮液，將上述膜濃縮液調節pH值并定容，獲得交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白液成品；或將調節pH值并定容的交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白液成品進行噴霧干燥，獲得交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白粉末成品。
本發明的方法步驟如下1.制備季銨化水解膠原蛋白濃縮液或粉取蛋白質濃度為25％-35％，平均分子量為3500-4000D的水解膠原蛋白原料，用氫氧化鈉(NaOH)溶液，調節并控制其pH為8.0-9.0后，按照水解膠原蛋白∶季銨化試劑體積比為2.5-3.0∶1的比例(v/v)混合均勻后，在60-75℃溫度下，加入活性物濃度為30％-40％的季銨化試劑(如N-十二烷基-二甲基-羥丙基氯化銨等)，連續反應1.5-2小時，用稀鹽酸(HCl)調節其pH值為4.5-5.0，再進行真空抽濾，其抽濾液在真空下濃縮成濃度為25％-30％、平均分子量為3800-4300D的季銨化水解膠原蛋白濃縮液；或將抽濾液在進風溫度為155-165℃、出風溫度控制在85-95℃，噴霧電機轉速控制在9000-10000轉/分條件下進行干燥為平均分子量為3800-4300D的季銨化水解膠原蛋白粉。
2.配制季銨化水解膠原蛋白液取制備的平均分子量為3800-4300D的季胺化水解膠原蛋白粉，加入4-5倍重量的純凈水，攪拌下溶解，配制成25％-30％的季銨化水解膠原蛋白濃縮液；或取濃度為25％-30％的季銨化水解膠原蛋白濃縮液；3.制備蠶蛹殼聚糖將蠶蛹甲殼素粉末原料分散于重量為其10-15倍、濃度為40％-50％的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，在100℃-110℃溫度下進行回流處理，每2-3小時更換一次NaOH溶液，共換液4-5次，對蠶蛹甲殼素進行脫乙酰基處理，當蠶蛹甲殼素脫乙酰基處理完成后，用熱水洗滌至中性，再用重量為蠶蛹甲殼素粉末5-8倍的20％-25％HCl溶液在80℃-90℃下處理13-14小時，然后，用NaOH溶液中和，過濾，并在60℃-70℃溫度下烘干，獲得脫乙酰度為66％-76％、平均分子量為5000-6000D的蠶蛹殼聚糖；4.制備殼聚糖溶液將第3步制備獲得的蠶蛹殼聚糖用重量為其50-100倍、濃度為1％-2％的HCl溶液溶解后，并用NaOH溶液調節其pH值為4.75-5.25，獲得脫乙酰度為66％-76％的、平均分子量為5000-6000D的蠶蛹殼聚糖溶液；5.制備交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液將第2步配制獲得的季銨化水解膠原蛋白濃縮液和第4步制備獲得的蠶蛹殼聚糖溶液按照季銨化水解膠原蛋白濃縮液∶蠶蛹殼聚糖溶液的體積比為1-2∶1(v/v)混合均勻，逐漸加入相當于季銨化水解膠原蛋白濃縮液重量0.5％-1.0％的交聯劑(如二環己基碳二亞胺等)，在溫度為25℃-40℃攪拌下反應0.5-1.0小時，以充分進行交聯反應，然后用轉速3000r/min-4000r/min的離心機分離20-30分鐘，除去不溶物，將分離出的溶液裝入截留分子量為8000-10000D的透析管中，用pH為4.75-5.25的乙酸緩沖溶液透析，除去未交聯的殼聚糖和季銨化水解膠原蛋白，最后，用分子量為20000D-30000D的聚乙二醇進行膜濃縮，將其濃縮成交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白濃縮液；6.制備交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白成品由于殼聚糖溶液在pH6.4以下時為溶液，當溶液pH超過6.4后轉變為凝膠，而交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白液在pH7.35以下為溶液，當溶液pH超過7.35后即轉變為凝膠，這個過程是可逆的，因此，用5％-10％乙酸鈉調節交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液的pH值為6.5-7.0并用純凈水定容，獲得交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白的溶液成品；或將調節pH值并定容的交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白的溶液成品在進風溫度為180℃-200℃、出風溫度為90℃-80℃、噴霧電機轉速控制在9000-10000轉/分條件下進行噴霧干燥，獲得交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白粉末成品。
本發明采用上述技術方案后，可方便靈活地制備出呈溶液或凝膠狀的交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白成品，在該溶液中可添加各種水溶性的功能因子，如皮膚生長因子、保濕因子、維生素等，可衍生出多種功能性生物敷料，其產品具有附著力強，抗菌性及透氣性均好，并能被酶降解等特性，可廣泛用于人體皮膚、創傷傷口、毛發等的營養與修復及殺菌、保濕等，因此，該方法是一種制備生物敷料的好方法。
四
圖1為本發明的工藝流程圖。
五具體實施例方式
下面結合具體的實施方式，進一步說明本發明。
一種交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白液的制備方法的步驟如下1.制備季銨化水解膠原蛋白液取蛋白質濃度為30％、平均分子量為3500D的水解膠原蛋白1000克，用NaOH溶液調節并控制其pH值為8.0，在60℃溫度下，1小時內緩慢加入60克濃度為40％的N-十二烷基二甲基羥丙基氯化銨季銨化劑溶液，連續反應1.5小時后，用稀HCl調節pH值為4.0，再進行真空抽濾，其濾液為季銨化水解膠原蛋白液，季銨化水解膠原蛋白平均濃度為25％；也可以將該濾液在進風溫度控制在155℃、出風溫度控制在85℃、噴霧電機轉速為9000r/min條件下進行噴霧干燥，獲得平均分子量為3800D的季銨化水解膠原蛋白粉360克；2.制備季銨化水解膠原蛋白液將第1步制備獲得的季銨化水解膠原蛋白粉125克，加入400mL純凈水，攪拌下溶解，并用NaOH溶液調節pH等于4.75；3.制備蠶蛹殼聚糖將蠶蛹甲殼素粉末200克分散于2000mL40％的NaOH溶液中，在110℃溫度下回流處理，每2小時換NaOH溶液一次，共換液4次，每次換液2000mL，對蠶蛹甲殼素進行脫乙酰基處理，脫乙酰基處理完成后用熱水洗滌至中性，再用濃度為20％的HCl溶液1000mL在90℃溫度下回流處理14小時，然后用NaOH中和至中性，過濾，洗滌后在60℃溫度下烘干，獲得脫乙酰度為66％、平均分子量為5000D的蠶蛹殼聚糖164克；4.制備殼聚糖溶液取脫乙酰度為66％、平均分子量為5000D的蠶蛹殼聚糖25克，用重量為其50倍、濃度為1％的HCl溶解后，用NaOH溶液調節殼聚糖溶液的pH值為4.75；5.制備交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液；將第2步制備獲得的季銨化水解膠原蛋白溶液500mL和第4步制備獲得的蠶蛹殼聚糖溶液500mL，按照體積比為1∶1的比例混合均勻，逐漸加入3g二環己基碳二亞胺交聯劑，在溫度為25℃攪拌下反應1小時，以充分進行交聯反應，然后用轉速為3000r/min的離心機分離20分鐘，分離除去不溶物，將分離出的清液裝入截留分子量為8000D的透析管中，用pH值為4.75的乙酸緩沖溶液進行透析，除去未交聯的殼聚糖、季銨化水解膠原蛋白和HCl，獲得交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液，最后用分子量為20000D的聚乙二醇濃縮至體積為450mL的交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液；
6.制備交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白成品用10％乙酸鈉調節交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液的pH值為6.5，最后定容至500mL，獲得殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白液成品，其中交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白濃度為25％；或將調節pH值并定容的交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白的溶液成品在進風溫度為180℃、出風溫度為90℃、噴霧電機轉速控制在9000r/min條件下進行噴霧干燥，獲得交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白粉末成品。
權利要求
1.一種交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白制備方法，其特征在于制備的方法步驟如下(1)制備季銨化水解膠原蛋白濃縮液或粉取蛋白質濃度為25％-35％，平均分子量為3500-4000D的水解膠原蛋白原料，用氫氧化鈉溶液，調節并控制其pH為8.0-9.0后，按照水解膠原蛋白∶季銨化試劑體積比為2.5-3.0∶1的比例混合均勻后，在60-75℃溫度下，加入活性物濃度為30％-40％的季銨化試劑，連續反應1.5-2小時，用稀鹽酸調節其pH值為4.5-5.0，再進行真空抽濾，其抽濾液在真空下濃縮成濃度為25％-30％、平均分子量為3800-4300D的季銨化水解膠原蛋白濃縮液，或將抽濾液在進風溫度為155-165℃、出風溫度控制在85-95℃，噴霧電機轉速控制在9000-10000轉/分條件下干燥成粉；(2)配制季銨化水解膠原蛋白液取制備的平均分子量為3800-4300D的季胺化水解膠原蛋白粉，加入重量為其4-5倍的純凈水，攪拌下溶解，配制成25％-30％的季銨化水解膠原蛋白濃縮液，或取濃度為25％-30％的季銨化水解膠原蛋白濃縮液；(3)制備蠶蛹殼聚糖將蠶蛹甲殼素粉末原料分散于重量為其10-15倍、濃度為40％-50％的氫氧化鈉溶液中，在100℃-110℃溫度下進行回流處理，每2-3小時更換一次NaOH溶液，共換液4-5次，用熱水洗滌至中性，再用重量為蠶蛹甲殼素粉末5-8倍的20％-25％ HCl溶液在80℃-90℃下處理13-14小時，然后用NaOH溶液中和，過濾，并在60℃-70℃溫度下烘干；(4)制備殼聚糖溶液將第(3)步制備獲得的蠶蛹殼聚糖用重量為其50-100倍、濃度為1％-2％的HCl溶液溶解后，并用NaOH溶液調節其pH值為4.75-5.25；(5)制備交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液將第(2)步配制獲得的季銨化水解膠原蛋白濃縮液和第(4)步制備獲得的蠶蛹殼聚糖溶液按照季銨化水解膠原蛋白濃縮液∶蠶蛹殼聚糖溶液的體積比為1-2∶1混合均勻，逐漸加入相當于季銨化水解膠原蛋白濃縮液重量0.5％-1.0％的交聯劑，在溫度為25℃-40℃攪拌下反應0.5-1.0小時，然后用轉速3000r/min-4000r/min的離心機分離20-30min，將分離出的溶液裝入截留分子量為8000-10000D的透析管中，用pH為4.75-5.25的乙酸緩沖溶液進行透析，最后，用分子量為20000D-30000D的聚乙二醇進行膜濃縮；(6)制備交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白成品用5％-10％乙酸鈉調節交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液的pH值為6.5-7.0并用純凈水定容，或將調節pH值并定容的交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白的溶液成品在進風溫度為180℃-200℃、出風溫度為90℃-80℃、噴霧電機轉速控制在9000-10000轉/分條件下進行噴霧干燥成粉。
2.按照權利要求1所述的交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白制備方法，其特征在于一種交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白制備方法的方法步驟如下(1)制備季銨化水解膠原蛋白液取蛋白質濃度為30％、平均分子量為3500D的水解膠原蛋白1000克，用NaOH溶液調節并控制其pH值為8.0，在60℃溫度下，1小時內緩慢加入60克濃度為40％的N-十二烷基二甲基羥丙基氯化銨季銨化劑溶液，連續反應1.5小時后，用稀HCl調節pH值為4.0，再進行真空抽濾，獲得濃度為25％季的銨化水解膠原蛋白濾液，或將該濾液在進風溫度控制在155℃、出風溫度控制在85℃、噴霧電機轉速為9000r/min條件下進行噴霧干燥為粉；(2)制備季銨化水解膠原蛋白液將第1步制備獲得的季銨化水解膠原蛋白粉125克，加入400mL純凈水，攪拌下溶解，并用NaOH溶液調節pH為4.75；(3)制備蠶蛹殼聚糖將蠶蛹甲殼素粉末200克分散于2000mL40％的NaOH溶液中，在110℃溫度下回流處理，每2小時換NaOH溶液一次，共換液4次，每次換液2000mL，用熱水洗滌至中性，再用濃度為20％的HCl溶液1000m/L在90℃溫度下回流處理14小時，然后用NaOH中和至中性，過濾，洗滌后在60℃溫度下烘干；(4)制備殼聚糖溶液取脫乙酰度為66％、平均分子量為5000D的蠶蛹殼聚糖25克，用重量為其50倍、濃度為1％的HCl溶解后，用NaOH溶液調節殼聚糖溶液的pH值為4.75；(5)制備交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液將第(2)步制備獲得的季銨化水解膠原蛋白溶液500mL和第(4)步制備獲得的蠶蛹殼聚糖溶液500mL，按照體積比為1∶1的比例混合均勻，逐漸加入3g二環己基碳化二亞胺交聯劑，在溫度為25℃攪拌下反應1小時，然后用轉速為3000r/min的離心機分離20分鐘，將分離出的清液裝入截留分子量為8000D的透析管中，用pH值為4.75的乙酸緩沖溶液進行透析，最后用分子量為20000D的聚乙二醇濃縮至體積為450mL的交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液；(6)制備交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白成品用10％乙酸鈉調節交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白溶液的pH值為6.5，定容至500mL；或將調節pH值并定容的交聯殼聚糖-季銨化水解膠原蛋白的溶液成品在進風溫度為180℃、出風溫度為90℃、噴霧電機轉速控制在9000r/min條件下噴霧干燥成粉末。
全文摘要
一種交聯殼聚糖－季銨化水解膠原蛋白制備方法，涉及抗菌生物材料制備方法。本發明方法以蠶蛹甲殼素和水解膠原蛋白為原料，按比例將兩種溶液混合均勻，加入交聯劑進行交聯反應后，再進行膜濃縮，調節其pH值并定容或噴霧干燥成粉末。用本發明方法可方便靈活地制備出呈溶液或凝膠狀的產品，在其成品溶液中可添加各種水溶性的功能因子，如皮膚生長因子、保濕因子、維生素等，可衍生出多功能生物敷料，具有附著力強，抗菌性及透氣性均好，并能被酶降解等特性，可廣泛用于人體皮膚、創傷傷口、毛發等的營養與修復及殺菌、保濕等，因此，本發明是一種制備生物敷料的新方法。
文檔編號C08H1/00GK1640913SQ20041008157
公開日2005年7月20日 申請日期2004年12月20日 優先權日2004年12月20日
發明者周小華, 李海軍, 駱輝 申請人:重慶大學