專利名稱：含多肽的多分散混合物的組合物及其藥物組合物的制作方法
本申請是申請日為1995年5月23日、發明創造名稱為“共聚物組成改進的共聚物-1”的中國專利申請(國家申請號為95194101.1，國際申請號為PCT/US95/06551)的分案申請。
本申請是1994年11月23日遞交的U.S.S.N.08/344248的部分后續申請，該申請是1994年5月24日遞交的U.S.S.N.08/248037的后續。
背景技術：
共聚物-1是髓鞘堿性蛋白(MBP)的合成多肽類似物，髓鞘堿性蛋白是髓鞘的天然成分。已表明其是多發性硬化癥的有效的治療劑(歐洲免疫學雜志1242；神經科學雜志31433)。本文所引用的所有參考文獻都引入本文以供參考。早在50年代，在多發性硬化癥的免疫療法中對共聚物-1的觀察表明髓鞘堿性蛋白成分，如MBP可阻止或控制實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)。EAE是一種誘發于敏感動物的類似于多發性硬化癥的疾病。
共聚物-1是由Drs.Sela、Arnon及其合作者在Weizmann研究所(Rehovot，以色列)研究的。據示它可抑制EAE(歐洲免疫學雜志1242；美國專利3,849,550)。最近表明共聚物-1有利于緩解多發性硬化癥的惡化(新英格蘭醫學雜志317406)。采用每日注射共聚物-1治療的患者與對照組患者相比幾乎沒有惡化并且他們的殘疾加劇較輕微。
共聚物-1是多肽的混合物，由丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸組成，摩爾比約為6∶2∶5∶1。它是通過化學聚合四種氨基酸形成的產物(平均分子量為23000道爾頓)而合成的(美國專利3849550)。
本發明的目的是提供一種改進組成的共聚物-1。
發明概述本發明涉及一種共聚物-1組合物，該組合物基本上不含分子量大于40千道爾頓(KDa)的共聚物-1種類。
本發明另外涉及一種在分子量約為2KDa至20KDa范圍內摩爾分級超過75％的共聚物-1。
另外，本發明涉及一種平均分子量約為4至8.6KDa的共聚物-1。
此外，本發明涉及一種藥物組合物的以及用上述共聚物-1治療多發性硬化癥的方法。
附圖簡述
圖1表示三批共聚物-1的分子量分布，顯示出分子量大于40KDa種類的比例。圖2表示與摩爾分級有關的相似數據。
發明詳述本發明涉及一種共聚物-1組合物，該組合物基本上不含分子量大于40千道爾頓(KDa)的共聚物-1種類。優選地，該組合物含有少于5％的分子量為40KDa或更高的共聚物-1種類。更優選該組合物含有少于2.5％的分子量為40KDa或更高的共聚物-1種類。
本發明另外涉及一種在分子量約為2KDa至20KDa范圍內摩爾分級超過75％的共聚物-1。
此外，本發明涉及一種平均分子量約為4至8.6KDa的共聚物-1。更具體地說，本發明涉及一種平均分子量約為4至8KDa的共聚物-1以及平均分子量約為6.25至8.4KDa的共聚物-1。
本發明的共聚物-1可以通過本領域已知的方法制備，例如美國專利3849550中公開的方法，其中于環境溫度將酪氨酸、丙氨酸、γ-谷氨酸芐酯以及E-N-三氟乙酰賴氨酸的N-羧酸酐在無水二噁烷中聚合，二乙胺作為引發劑。用溴化氫的冰醋酸溶液脫去谷氨酸的γ-羧基，然后用1M哌啶從賴氨酸殘基上除去三氟乙酰基。對于本發明的目的而言，術語“環境溫度”和“室溫”應理解成從約20至約26℃的溫度。
具有所需范圍分子量的共聚物-1可以通過已知方法獲得。該類方法包括將含有高分子量種類的共聚物-1進行色譜并收集不含非所需種類的部分，或者通過部分酸或酶水解除去高分子量的種類，其后通過透析或超濾進行純化。另外獲得所需分子量范圍的共聚物-1的方法是通過制備氨基酸是被保護的所需種類，然后直接除去保護即得所需種類。本發明的組合物可以通過本領域常規的已知方法配制。優選地，將組合物凍干并制成適于皮下注射用的水溶液。可任選地，也可將共聚物-1配制成本領域已知的用于制備肽類藥物的口服、鼻用、口腔用或直腸用制劑的各種形式。
典型地，每日以20mg的劑量將共聚物-1給予多發性硬化癥患者。
本發明通過下述實施例說明，但并非限定本發明。
實施例1制備低毒性共聚物-1的色譜法按照本領域已知的方法如美國專利3849550的方法制備兩組共聚物-1。
如下文所述將一組用色譜分離。
在Superformance 26 Merck藥筒中按照生產商的說明制備凝膠過濾用柱-FRACTOGEL TSK HW55(600×26mm)。將此柱用水平衡，注射丙酮溶液用于總體積測定。用0.2M的乙酸銨緩沖液(pH5.0)平衡該柱。將30ml共聚物-1樣品(20mg/ml，在0.2M pH值為5.0的乙酸銨中)裝上柱，每10分鐘收集一次級分。在120-130分鐘之間分離含有平均分子量為7-8KDa的級分(A批)。
分子量分析在UVIKON 810分光光度計上測定275nm的紫外吸收。將樣品稀釋以獲得低于1個吸收單位的紫外吸收。在校準后的凝膠過濾柱(Superose 12)上測定兩批產品的分子分布。
發明共聚物-1的A批平均分子量為7-8KDa。該批產品的2.5％具有高于32KDa的分子量，但是在該批產品中不存在分子量高于40KDa的共聚物-1種類。
共聚物-1的另一批(不進行色譜法)平均分子量為12KDa。該批產品的2.5％具有高于42KDa的分子量，該批產品中總共聚物-1種類的5％具有高于40KDa的分子量。
實施例2毒性分析A體內將平均分子量為7.3和8.4KDa(低于2.5％的共聚物-1種類超過40KDa)和22KDa(多于5％的共聚物-1種類超過40KDa)的三批共聚物-1進行如下毒性試驗。在每種情況下每個實驗組使用5只小鼠。
方法將共聚物-1溶于蒸餾水中得到含2mg/ml的活性成分的溶液。將0.5ml測試溶液注射到每只小鼠的外側尾靜脈。觀察48小時期間中小鼠的死亡率和相關臨床癥狀。注射后10分鐘、24小時和48小時記錄觀察結果。如果在48小時后，全部動物仍存活并且沒有觀察到不良癥狀，則指明該組為“無毒”。但是，如果有一只或多只的小鼠死亡或者表現出不痕癥狀，則指明該組為“毒性”。
平均分子量為7.3和8.4KDa批的產品都被指明是“無毒”，而平均分子量為22KDa的組在48小時后，5只小鼠中有3只死亡，因此指明其為“毒性”。
B體外RBL-脫顆粒試驗I.引言噬堿細胞釋放的組胺(或者5-羥色胺)是一種直接過敏性的體外模型。將大鼠噬堿白細胞系(RBL-2H3)培養成特征為高敏、均一、易于在培養物及再生體系中維持的細胞系(E.L.Basumian，C.Isersky，M.G.petrino和R.P.Siraganian.歐洲免疫學雜志11，317(1981))。組胺釋放的生理刺激包括抗原結合到膜結合IgE分子上，導致后者交聯，然后引發復雜的生化級聯。除了這些生理性免疫球蛋白介導的引發劑以外，也可通過不同的非IgE介導刺激誘導脫粒。其中有各種肽類和合成聚合物，例如聚賴氨酸(R.P.Siraganian.藥理學動向，10月，432(1983))。因此，用RBL脫粒試驗篩選出可引起脫粒從而導致有害的局部和/或全身副作用的共聚物-1。
II.試驗方法原理將大鼠噬堿白細胞(RBL-2H3)用[3H]-5-羥色胺加載，然后與100μg待測共聚物-1一起培養。可誘導非特異性脫粒的共聚物-1組可將[3H]-5-羥色胺釋放到培養基中。通過液閃計數儀計數培養基中的放射性，在沉淀細胞中測定結合到細胞中的總放射標記的5-羥色胺。脫粒百分數是以從總結合中的釋放出的5-羥色胺百分比計算的。
III.結果分析平均分子量在6,250-14,500之間的四批共聚物-1的分子量大于40KDa種類的和RBL脫粒的百分數％。結果匯總于下表。
從中可看出，當高分子量種類的百分數低時(＜2.5)，5-羥色胺的釋放百分數(表示毒性)則低，反之亦然。
實施例3三氟乙酰基-共聚物-1的制備按照Teitelbaum等在《歐洲免疫學雜志》第1卷第242頁(1971)中描述的方法由溶于3.5升二噁烷中的酪氨酸的N-羧酸酐(18g)、丙氨酸(50g)、γ-谷氨酸芐酯(35g)的N-羧酸酐和三氟乙酰賴氨酸制備保護起來的共聚物-1。
通過加入0.01-0.02％二乙胺引發聚合過程。將反應混合物于室溫攪拌24小時，然后倒入10升水中。過濾產物(被保護的共聚物-1)，用水洗滌并干燥。室溫下用33％氫溴酸的冰醋酸溶液攪拌處理被保護的共聚物-1 6至12小時以除去谷氨酸鹽中γ芐基保護基。將產物倒入過量水中，過濾，洗滌并干燥，得到三氟乙酰基-共聚物-1。
實施例4三氟乙酰基-共聚物-1的制備按照Teitelbaum等在《歐洲免疫學雜志》第1卷第242頁(1971)中描述的方法由溶于3.5升二噁烷中的酪氨酸的N-羧酸酐(18g)、丙氨酸(50g)、γ-谷氨酸芐酯(35g)和三氟乙酰賴氨酸制備保護起來的共聚物-1。
通過進入0.01-0.02％二乙胺引發聚合過程。將反應混合物于室溫攪拌24小時。然后倒入10升水中。過濾產物(被保護的共聚物-1)，用水洗滌并干燥。
用33％HBr的冰醋酸溶液處理被保護的共聚物-1以從谷氨酸殘基的5-甲酸酯中除去Ω芐基保護基并且將聚合物分裂成較小的多肽。獲得分子量為7,000±2,000道爾頓的共聚物-1所需時間取決于反應溫度和被保護的共聚物-1的大小。在20-28℃之間的溫度于不同時間段如10-50小時對每批產品進行測試反應。計算有關這些小規模反應的分子量結果，描繪分子量對時間的曲線。由該曲線計算獲得平均分子量為7000±2,000道爾頓的共聚物-1所需時間并將其應用于較大規模的反應中。平均而言，在26℃操作的時間為17小時。將產物倒入過量水中，過濾，洗滌并干燥，得到三氟乙酰基-共聚物-1。低毒性共聚物-1的制備將20g三氟乙酰基-共聚物-1分散在1升水中，加入100g哌啶。室溫攪拌混合物24小時，過濾。將粗共聚物-1溶液分配到透析袋中，于10-20℃水中透析，直至達到pH＝8。然后將其在約0.3％乙酸中透析，再用水透析直至達到pH＝5.5-6.0。然后將溶液濃縮并凍干。
權利要求
1.一種組合物，包含多肽的一種多分散混合物，所述多肽由谷氨酸、賴氨酸、丙胺酸和酪氨酸組成，其中所述混合物具有的平均分子量為約4-9千道爾頓。
2.權利要求1的組合物，其中以摩爾分級為基的所述多肽混合物中超過75％具有的分子量在約為2-20千道爾頓范圍內。
3.權利要求1的組合物，其中少于5％的多肽混合物具有的分子量超過40千道爾頓。
4.權利要求3的組合物，其中以摩爾分級為基的所述多肽混合物中超過75％具有的分子量在約為2-20千道爾頓范圍內。
5.權利要求4的組合物，其中所述混合物具有的平均分子量為6.25-8.4千道爾頓。
6.權利要求1的組合物，其中所述混合物具有的平均分子量為約4-8.6千道爾頓。
7.權利要求1的組合物，其中所述混合物具有的平均分子量為約5-9千道爾頓。
8.權利要求1的組合物，其中少于2.5％的多肽混合物具有的分子量超過40千道爾頓。
9.權利要求8的組合物，其中以摩爾分級為基的所述多肽混合物中超過75％具有的分子量在約為2-20千道爾頓范圍內。
10.權利要求9的組合物，其中所述混合物具有的平均分子量為6.25-8.4千道爾頓。
11.權利要求1的組合物，其中所述混合物具有基本上如附圖1或附圖2的曲線所示的分子量分布，其中平均分子量為約7.7千道爾頓。
12.一種藥物組合物，其包含治療有效劑量的用于治療多發性硬化癥的權利要求1-11中任一項的組合物。
13.一種用于治療患有多發性硬化癥患者的方法，所述方法包括向需要治療的患者施予權利要求12的組合物。
全文摘要
本發明提供了一種組合物，該組合物包含多肽的一種多分散混合物，所述多肽由谷氨酸、賴氨酸、丙胺酸和酪氨酸組成，其中所述混合物具有的平均分子量為約4－9千道爾頓。本發明還提供了一種用于治療多發性硬化癥的藥物組合物，其包含治療有效劑量的上述組合物。
文檔編號C08G69/48GK1626238SQ20041006429
公開日2005年6月15日 申請日期1995年5月23日 優先權日1994年5月24日
發明者E·康菲諾, M·塞拉, D·泰特包姆, R·阿農 申請人:耶達研究及發展有限公司