專利名稱：一種當歸多糖及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種當歸多糖及其制備方法和用途。
背景技術：
當歸屬補益藥，為傘形科(umbuiferae)當歸屬多年生草本植物當歸[AngelicaSinensis(Oliv)Diels]的干燥根。當歸有補血和血，活血化瘀，調經止痛之功效，臨床上常依癥將當歸與其它藥物配伍使用，用于月經不調、痛經、血虛頭痛、腰腹疼痛等癥。
當歸的化學組成包括揮發油和水溶性組分兩大部分。早期研究曾指出當歸油對各種動物離體子宮，不論受孕者或未孕者都有弛緩作用。它在一定程度上為當歸用于痛經治療做出了解釋。
當歸多糖存在于當歸水溶性部位，它是由分子量不同的高分子化合物組成的同系混合物。近年來，當歸多糖已被證明具有復雜的生物活性，能夠調節機體的免疫功能，對抗皮質激素所引起的抑制，防止外周白細胞的減少和輻射損傷中的照射后效應，增強機體造血功能和抗腫瘤作用。
疼痛是常見的臨床癥狀，尋找安全有效的非成癮性鎮痛藥物一直是藥物工作者十分重視的問題。“痛經”更是婦科常見病，中醫認為其發病機理主要是氣血受阻，血行不暢所致。當歸作為中醫的婦科要藥，如何尋找到其有效治療成分以進行中藥現代化改革，使其符合現代劑型要求，是藥物學界的研究熱點。
《中國藥學雜志》2002；37(10)746-8“當歸粗多糖鎮痛作用的實驗研究”揭示當歸粗多糖具有鎮痛作用，但所用當歸粗多糖中糖含量相對較低，還含有其它成分，且鎮痛效果不明顯。
發明內容
本發明所要解決的問題是提供一種當歸多糖制備方法和用途，所得當歸多糖具有明顯鎮痛作用，尤其是治療“痛經”有明顯的效果。
本發明提供的技術方案是一種當歸多糖，由下法制得將當歸醇沉物溶于蒸餾水，用Sevag法去蛋白直至紫外檢測無280nm的蛋白質吸收峰，離心除去沉淀；保留水相，加入無水乙醇，沉淀多糖，棄上清液，所得沉淀物以無水乙醇洗滌，經冷凍干燥后，凝膠分子排阻層析分離，收集相對分子質量范圍在1,0000-11,0000之間的分離產物，再經冷凍干燥后得到當歸多糖。
本發明還提供了上述當歸多糖的制備方法，將當歸醇沉物溶于蒸餾水，用Sevag法去蛋白直至紫外檢測無280nm的蛋白質吸收峰，離心除去沉淀；保留水相，加入無水乙醇，沉淀多糖，棄上清液，所得沉淀物以無水乙醇洗滌至洗滌液呈無色，棄去洗滌液，洗滌后的沉淀物經冷凍干燥，凝膠分子排阻層析分離，收集相對分子質量范圍在1,0000-11,0000之間的分離產物，再經冷凍干燥后得到當歸多糖。
本發明中的上述原料當歸醇沉物可來自中藥制備過程中中藥材常用提取方法所得當歸醇沉物即當歸經水煮得到水提取物，水提取物經乙醇提取后的沉淀物。
本發明所得到的上述當歸多糖屬于聚合物，其分子量代表的是相似鏈長的平均配布。經鑒定本發明的當歸多糖的物化性質為相對分子質量范圍在1,0000-11,0000之間(采用凝膠滲透色譜-激光光散射聯用技術)，易溶于水，糖含量大于95％，經HPLC檢測表明主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和木糖組成，并且紫外吸收光譜顯示192nm處有明顯吸收峰；紅外吸收光譜分析，在3352cm-1、2940cm-1、1747cm-1、1626cm-1、1414cm-1、1237cm-1、1021cm-1及536cm-1處表現為典型的多糖吸收峰。
本發明的上述當歸多糖在制備鎮痛藥物尤其是治療痛經藥物中的用途。如將本發明的當歸多糖用于制備膠囊、片劑、顆粒劑以及注射劑，所得藥物具有明顯的鎮痛作用，尤其是治療“痛經”效果顯著。
按背景技術中的當歸粗多糖(糖含量為65.5％)一次性口服給藥0.25g/kg時，對化學物質和熱刺激引起疼痛的模型有明顯鎮痛作用，而本發明的當歸多糖在一次性口服給藥0.025g/kg時即可產生相當作用，使用劑量下降90％，并且隨劑量增加鎮痛作用增強。
具體實施例方式
以下結合具體的實例對本發明的技術方案作進一步說明本發明中的上述原料當歸醇沉物可來自中藥制備過程中中藥材常用提取方法所得當歸醇沉物即當歸經水煮得到水提取物，水提取物經乙醇提取后的沉淀物。
當歸醇沉物也可由下法得到所述當歸醇沉物按下法制得，取當歸飲片，加入5～7倍當歸飲片重量的水煎煮30～60分鐘，濾過；將所得藥渣加入3～6倍重量(藥渣)的水進行煎煮30～50分鐘，濾過；所得藥渣加入3～6倍重量(藥渣)的水煎煮30～50分鐘，濾過；合并三次濾液，并將濾液濃縮；合并三次濾液，濃縮，冷卻至室溫，加入乙醇至乙醇含量為40％～60％(體積比，下同)，2～4℃冷藏24～48小時，濾過，得沉淀物；再次濃縮，加入乙醇至乙醇含量為70％～80％，2～4℃冷藏24～48小時，濾過，得沉淀物；第三次濃縮，加入乙醇至乙醇含量為80％～90％，2～4℃冷藏24～48小時，濾過，得沉淀物；合并三次沉淀物得當歸醇沉物。
本發明當歸多糖的制備將當歸醇沉物溶于蒸餾水，加入乙醇至乙醇含量為70％～80％抽提，2～4℃冷藏24～48小時，棄上清，保留沉淀，重復進行此步驟直至上清液無色，保留沉淀。再次將沉淀重新溶于蒸餾水，用Sevag法去蛋白直至紫外檢測無280nm的蛋白質吸收峰，離心除去變性蛋白。保留水相，加入3～4倍體積的無水乙醇，于2～4℃冷藏24～48小時，棄上清。沉淀部分以無水乙醇洗滌至洗滌液呈無色，棄去洗滌液，待乙醇自然揮發后，冷凍干燥5～20小時，所得產物屬于聚合物，其分子量代表的是相似鏈長的平均配布。經凝膠分子排阻層析分離，收集相對分子質量范圍在1,0000-11,0000之間的分離產物，再經冷凍干燥后得到當歸多糖。經鑒定本發明所得當歸多糖的物化性質為相對分子質量范圍在1,0000-11,0000之間(采用凝膠滲透色譜-激光光散射聯用技術)，易溶于水，糖含量大于95％，經HPLC檢測表明主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和木糖組成，并且紫外吸收光譜顯示192nm處有明顯吸收峰；紅外吸收光譜分析，在3352cm-1、2940cm-1、1747cm-1、1626cm-1、1414cm-1、1237cm-1、1021cm-1及536cm-1處表現為典型的多糖吸收峰。
實施例1取當歸飲片加入5倍(重量比)水煎煮30分鐘，濾過；將所得藥渣加入3倍(重量比)水進行煎煮30分鐘，濾過；所得藥渣加入3倍(重量比)水煎煮30分鐘，濾過；合并三次濾液，并將濾液濃縮。合并三次濾液，濃縮，冷卻至室溫，加入乙醇至乙醇含量為40％(v/v)，4℃冷藏24小時，濾過，保留沉淀即當歸醇沉物；再次濃縮，加入乙醇至乙醇含量為70％(v/v)，4℃冷藏24小時，濾過，保留沉淀即當歸醇沉物；第三次濃縮，加入乙醇至乙醇含量為80％(v/v)，4℃冷藏24小時，濾過，保留沉淀即當歸醇沉物。合并沉淀即合并當歸醇沉物，將其重新溶于蒸餾水，加入乙醇至乙醇含量為70％(v/v)抽提，4℃冷藏24小時，棄上清，保留沉淀，重復進行此步驟直至上清液無色，保留沉淀。再次將沉淀重新溶于蒸餾水，用Sevag法去蛋白直至紫外檢測無280nm的蛋白質吸收峰，離心除去變性蛋白。保留水相，加入4倍體積的無水乙醇，于4℃冷藏24小時，棄上清。沉淀部分以無水乙醇洗滌至洗滌液呈無色，棄去洗滌液，待乙醇自然揮發后，冷凍干燥5小時；以TSK-Gel4000H型柱(細孔孔徑600埃)，柱尺寸250×10mm，以蒸餾水為流動相，流量10ml/min，收集5-60min的分離產物；再經冷凍干燥后得到當歸多糖。采用凝膠滲透色譜-激光光散射聯用技術，HPLC以及紅外吸收光譜分析鑒定上述當歸多糖的得率為10％，純度為96％。
實施例2取當歸飲片加入7倍(重量比)水煎煮60分鐘，濾過；將所得藥渣加入5倍(重量比)水進行煎煮40分鐘，濾過；所得藥渣加入3倍(重量比)水煎煮40分鐘，濾過；合并三次濾液，并將濾液濃縮。合并三次濾液，濃縮，冷卻至室溫，加入乙醇至乙醇含量為60％(v/v)，2℃冷藏48小時，濾過，保留沉淀即當歸醇沉物；再次濃縮，加入乙醇至乙醇含量為80％(v/v)，2℃冷藏48小時，濾過，保留沉淀即當歸醇沉物；第三次濃縮，加入乙醇至乙醇含量為80％(v/v)，2℃冷藏48小時，濾過，保留沉淀即當歸醇沉物。合并沉淀即合并當歸醇沉物，將其重新溶于蒸餾水，加入乙醇至乙醇含量為80％(v/v)抽提，2℃冷藏48小時，棄上清，保留沉淀，重復進行此步驟直至上清液無色，保留沉淀。再次將沉淀重新溶于蒸餾水，用Sevag法去蛋白直至紫外檢測無280nm的蛋白質吸收峰，離心除去變性蛋白。保留水相，加入3倍體積的無水乙醇，于2℃冷藏48小時，棄上清。沉淀部分以無水乙醇洗滌至洗滌液呈無色，棄去洗滌液，待乙醇自然揮發后，冷凍干燥10小時；以TSK-Gel4000H型柱(細孔孔徑600埃)，柱尺寸250×10mm，以蒸餾水為流動相，流量10ml/min，收集5-60min的分離產物；再經冷凍干燥后得到當歸多糖。采用凝膠滲透色譜-激光光散射聯用技術，HPLC以及紅外吸收光譜分析鑒定上述當歸多糖的得率為30％，純度為97％。
實施例3取當歸飲片加入6倍(重量比)水煎煮50分鐘，濾過；將所得藥渣加入6倍(重量比)水進行煎煮50分鐘，濾過；所得藥渣加入6倍(重量比)水煎煮50分鐘，濾過；合并三次濾液，并將濾液濃縮。合并三次濾液，濃縮，冷卻至室溫，加入乙醇至乙醇含量為50％(v/v)，4℃冷藏48小時，濾過，保留沉淀即當歸醇沉物；再次濃縮，加入乙醇至乙醇含量為80％(v/v)，4℃冷藏48小時，濾過，保留沉淀即當歸醇沉物；第三次濃縮，加入乙醇至乙醇含量為90％(v/v)，4℃冷藏48小時，濾過，保留沉淀即當歸醇沉物。合并沉淀即合并當歸醇沉物，將其重新溶于蒸餾水，加入乙醇至乙醇含量為70％(v/v)抽提，4℃冷藏48小時，棄上清，保留沉淀，重復進行此步驟直至上清液無色，保留沉淀。再次將沉淀重新溶于蒸餾水，用Sevag法去蛋白直至紫外檢測無280nm的蛋白質吸收峰，離心除去變性蛋白。保留水相，加入4倍體積的無水乙醇，于4℃冷藏24小時，棄上清。沉淀部分以無水乙醇洗滌至洗滌液呈無色，棄去洗滌液，待乙醇自然揮發后，冷凍干燥20小時；以TSK-Gel4000H型柱(細孔孔徑600埃)，柱尺寸250×10mm，以蒸餾水為流動相，流量10ml/min，收集5-60min的分離產物；再經冷凍干燥后得到當歸多糖。采用凝膠滲透色譜-激光光散射聯用技術，HPLC以及紅外吸收光譜分析鑒定上述當歸多糖的得率為40％，純度為96％。
實施例4用本發明當歸多糖制備鎮痛的藥物當歸多糖加入賦形劑，按常規方法制成片劑。
實施例5用本發明當歸多糖制備鎮痛的藥物當歸多糖加入賦形劑，按常規方法制成膠囊。
實施例6用本發明當歸多糖制備鎮痛的藥物當歸多糖溶解于注射用水中，按常規方法制成針劑。
動物試驗1.藥物己烯雌酚注射液，上海第九制藥廠，批號020906。縮宮素注射液，南京生物化學制藥廠，批號030409。
(2)主要儀器GL-8402型熱板測痛儀，浙江寧海醫藥儀器廠生產。
(3)動物健康昆明種小鼠，除“痛經模型”選用♂小鼠作為陰性對照外，其它實驗均用♀小鼠，體重18±1g，由武漢大學動物實驗中心提供，合格證號SCXK(鄂)2003-2004。
2.方法(1)本發明當歸多糖對醋酸所致雌性小鼠扭體反應的影響動物分組和藥物劑量見表1，實驗前1小時經口給藥背景技術中的當歸粗多糖(糖含量為65.5％)或本發明的當歸多糖，模型組給予等容量生理鹽水。給藥后1小時腹腔注射1％醋酸0.2ml/只，觀察給藥小鼠扭體反應潛伏期及30min內扭體次數，并計算保護百分率。
(2)本發明當歸多糖對熱板法鎮痛作用的影響預先以55℃熱板對♀小鼠進行篩選，在10～30秒內出現舔足反應的為合格小鼠。實驗分組和藥物劑量見表2。實驗前1小時經口灌胃(ig)給予受試藥，模型組給予等容量生理鹽水。為避免痛閾周期性波動的影響，實驗均在上午8～10時進行，室溫25±1℃。記錄各組痛閾的變化，并計算痛閾提高百分率。若60秒內末出現舔足反應，痛閾計為60秒。
(3)本發明當歸多糖對己烯雌酚和縮宮素誘發小鼠子宮痙攣的影響各組動物于實驗前皮下注射己烯雌酚0.2mg/只，連續3天。實驗當日，動物經口灌胃(ig)給予當歸粗多糖或本發明所述的一種當歸多糖，模型組給予等容量生理鹽水，1小時后ip縮宮素0.3u/只。觀察各組動物扭體反應潛伏期及30min內扭體次數。若30min內不出現扭體反應，潛伏期計為30min。
3.結果(1)本發明當歸多糖對疼痛模型——醋酸所致雌性小鼠扭體反應的影響實驗，結果見表1。
表1 本發明當歸多糖對醋酸所致扭體反應的影響.n(例數)＝10，x±s(均數±標準差)扭體反應分組 劑量(g·kg-1)潛伏期(min)次數(次/30min) 保護率(％)模型組/ 5.2±1.8 34.2±8.8 /當歸粗多糖0.075 6.9±1.51)22.9±6.92)33.00.250 19.3±6.82)7.4±5.02)78.4一種當歸多糖 0.025 14.1±7.82)10.3±5.32)69.90.075 23.1±6.92)5.9±4.82)82.7注與模型對照組比較，1)P＜0.05，2)P＜0.01.
結果表明，本發明的當歸多糖在僅為當歸粗多糖1/10劑量時即可明顯產生對醋酸所致疼痛的保護作用，并且隨劑量增加作用增強。
(2)本發明當歸多糖對熱板法致痛作用的影響實驗。結果見表2。
表2 本發明當歸多糖對雌性小鼠熱板法致痛的影響.n(例數)＝10，x±s(均數±標準差)給藥前痛閾時劑量 給藥后痛閾時 痛閾提高時 痛閾提高分組 間(g·kg-1)間(s) 間(s) 率(％)(s)模型組 / 20.8±6.421.2±6.81.3±1.5 1.9當歸粗多糖 0.075 21.5±6.324.9±7.74.4±5.4 15.80.250 23.4±4.434.6±9.311.7±8.21)47.9一種當歸多糖0.025 20.7±5.229.4±9.19.1±8.11)42.00.075 21.3±6.234.8±8.713.7±9.61)63.4注與對照組比較，1)P＜0.01.
結果表明，本發明的當歸多糖在僅為當歸粗多糖1/10劑量時即可顯著保護熱刺激所致疼痛，并且隨劑量增加作用增強。
(3)本發明當歸多糖對“痛經模型”——己烯雌酚和縮宮素誘發小鼠子宮痙攣的影響實驗，結果見表3。
表3 本發明當歸多糖對己烯雌酚和縮宮素所致小鼠子宮痙攣的影響.
n(例數)＝10，x±s(均數±標準差)扭體反應分組 劑量(g·kg-1)潛伏期(min) 次數(次/30min) 發生率(％)模型組 / 12.3±3.86.3±4.0100當歸粗多糖 0.075 21.1±9.01)2.0±2.11)600.250 23.2±8.82)1.3±1.92)401)一種當歸多糖 0.025 25.4±6.62)0.9±1.32)401)0.075 27.7±4.92)0.6±1.32)302)注與模型組比較，1)P＜0.05，2)P＜0.01.
上述結果表明，本發明的當歸多糖一次性口服給藥0.025g/kg和0.075g/kg對化學物質和熱刺激引起疼痛的模型有明顯鎮痛作用，并明顯抑制“痛經”所致小鼠扭體反應即能有效對抗雌性激素誘發“痛經”所引起的疼痛反應。實驗說明，本發明的當歸多糖在當歸粗多糖1/10劑量下即有明顯作用，并且隨劑量增加作用增強。
權利要求
1.一種當歸多糖，由下法制得將當歸醇沉物溶于蒸餾水，用Sevag法去蛋白直至紫外檢測無280nm的蛋白質吸收峰，離心除去沉淀；保留水相，加入無水乙醇，沉淀多糖，棄上清液，所得沉淀物以無水乙醇洗滌，經冷凍干燥后，凝膠分子排阻層析分離，收集相對分子質量范圍在1,0000-11,0000之間的分離產物，再經冷凍干燥后得到當歸多糖。
2.根據權利要求1所述的當歸多糖，其特征在于所述當歸醇沉物按下法制得，取當歸飲片，加入5～7倍當歸飲片重量的水煎煮30～60分鐘，濾過；將所得藥渣加入3～6倍重量的水進行煎煮30～50分鐘，濾過；所得藥渣加入3～6倍重量的水煎煮30～50分鐘，濾過；合并三次濾液，并將濾液濃縮；合并三次濾液，濃縮，冷卻至室溫，加入乙醇至乙醇含量為40％～60％，2～4℃冷藏24～48小時，濾過，得沉淀物；再次濃縮，加入乙醇至乙醇含量為70％～80％，2～4℃冷藏24～48小時，濾過，得沉淀物；第三次濃縮，加入乙醇至乙醇含量為80％～90％，2～4℃冷藏24～48小時，濾過，得沉淀物；合并三次沉淀物得當歸醇沉物。
3.權利要求1所述當歸多糖的制備方法，其特征在于將當歸醇沉物溶于蒸餾水，用Sevag法去蛋白直至紫外檢測無280nm的蛋白質吸收峰，離心除去沉淀；保留水相，加入無水乙醇，沉淀多糖，棄上清液，所得沉淀物以無水乙醇洗滌至洗滌液呈無色，棄去洗滌液，洗滌后的沉淀物經冷凍干燥，凝膠分子排阻層析分離，收集相對分子質量范圍在1,0000-11,0000之間的分離產物，再經冷凍干燥后得到當歸多糖。
4.權利要求1或2所述的當歸多糖在制備鎮痛藥物中的用途。
5.權利要求1或2所述的當歸多糖在制備治療痛經藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種當歸多糖，由下法制得將當歸醇沉物溶于蒸餾水，用Sevag法去蛋白直至紫外檢測無280nm的蛋白質吸收峰，離心除去沉淀；保留水相，加入無水乙醇，沉淀多糖，棄上清液，所得沉淀物以無水乙醇洗滌，經冷凍干燥后，凝膠分子排阻層析分離，收集相對分子質量范圍在1,0000－11,0000之間的分離產物，再經冷凍干燥后得到當歸多糖。本發明的當歸多糖對化學物質和熱刺激引起的疼痛有明顯鎮痛作用，并能有效對抗雌性激素誘發“痛經”所引起的疼痛反應；可用于制備鎮痛藥物尤其是治療痛經藥物。
文檔編號C08B37/00GK1631902SQ200410061139
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月18日 優先權日2004年11月18日
發明者彭仁琇, 樂江, 劉娟, 汪暉, 楊靜 申請人:武漢大學