專利名稱：重組人復合干擾素－聚乙二醇偶聯物的制備及其偶聯產物的制作方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質化學領域，特別涉及蛋白質的聚乙二醇化學修飾方法和修飾產物。
背景技術：
現代生物技術的迅猛發展使得人們把多肽和蛋白質作為藥物使用的夢想成為現實[1]。自從1982年FDA批準第一個用于治療人類糖尿病的生物藥物——重組人胰島素(rhInsulin)以來已經有幾百種生物藥應用于臨床治療中，包括生長因子、集落刺激因子、激素、干擾素、白細胞介素、單克隆抗體等等。據估計，在2000年，有大約500個生物藥物制品在進行臨床試驗，并且蛋白質制品(糖蛋白，非糖蛋白，和抗體)的年增長率大約將在10-35％[2]。盡管較以前相比，有更多的生物藥品正在開發，但是所有這些蛋白藥物用于人體時都具有多肽類藥物的典型問題明顯的免疫原性和抗原性，容易被體內蛋白酶降解，可以被腎臟清除，體內的循環半壽期短，穩定性差和溶解度低等。因此多肽類生物藥的配方設計(formulation)和給藥方式(Administration)成為制約生物藥發展的關鍵。多年的臨床應用經驗發現現有的大部分生物藥物存在以下的缺點[3]1.給藥途徑單一，大部分生物藥是通過靜脈注射或皮下注射的方式進行給藥的，口服的生物藥非常少。
2.在體內的循環半壽期太短，這主要是由于被體內蛋白酶的降解，以及網狀內皮系統清除和腎臟清除等原因造成的。
3.某些藥在體內有明顯的抗原-抗體反應。
4.由于以上的原因造成其在體內的藥代動力學較差，從而影響了藥效的發揮。
為了改善蛋白質等生物藥劑的藥代動力學和藥效學性質人們采用了幾種策略來解決這些問題1)通過基因工程手段改變天然蛋白的氨基酸的順序以減小其免疫原性和抗原性以及增加其抗蛋白酶降解的能力。
2)通過化學或者基因工程手段將其與免疫球蛋白或血清白蛋白偶聯或者融合。
3)通過藥物釋放載體實現藥物蛋白質的保護和緩釋。
4)通過化學手段將藥物蛋白質與天然或者合成的高分子相偶聯。用高分子增加蛋白質的表觀分子量，遮蔽蛋白質表面以達到減小其免疫原性和抗原性，以及增加其抗蛋白酶降解的能力。
但是，迄今為止最為成功的方法是采用方法4)，通過將聚乙二醇與藥物蛋白共價偶聯來實現的，即蛋白質的PEG化技術(PEGylation Technology)[4-5]。
干擾素(IFN，Interferon)是一類具有廣譜的抗病毒、抗增殖和免疫調節，可以激活自然殺傷細胞(NK cell)等多種功能的細胞素的總稱。其為由多種誘導劑誘導細胞產生的結構類似、功能相近、具有生物活性的低分子糖蛋白，是一類重要的細胞因子。干擾素一般分為I型和II型，I型包括IFN-α、IFN-β和IFN-ω，其中IFN-α又可分成25種以上一級結構存在差異的亞型；II型包括IFN-γ。這些干擾素分別由不同的基因編碼產生，生物活性各異。目前臨床上使用的干擾素大都是通過基因重組技術生產得到。DNA重組技術生產干擾素的優點在于此方法可以高純度、大批量地生產干擾素。
1981年，美國安進(Amgen)公司的研究人員首次合成了一種非天然的I型干擾素(Consensus interferon，IFN-α-conl，復合干擾素)。這種復合干擾素結構上與普通干擾素相近，具有166個氨基酸殘基，其中大約30％位置上的氨基酸與IFN-β相同，60％以上的氨基酸與IFN-γ相同，只有20個位置上的氨基酸與臨床上最常使用的IFN-α2a的相應位置的氨基酸不同。但是復合干擾素的生物活性卻是普通干擾素的2-20倍。因而成為研究的熱點。美國專利4695623、4897471、5372808已公開了復合干擾素具有廣譜的干擾素活性，有較強的抗病毒和抗腫瘤以及激活NK細胞的活性，可以用于治療疾病。中國專利97193506公開了應用復合干擾素治療丙型肝炎的方法，中國專利98114663公開了重組復合干擾素的制備方法和治療乙型肝炎和丙型肝炎的用途。這些已有的研究都表明復合干擾素治療慢性丙型肝炎效果顯著，特別是在降低血清病毒負荷和治療其它干擾素治療無效或復發的病人方面，優于其它類型的干擾素。
但是復合干擾素與其它蛋白質藥物相同，具有穩定性差，體內半衰期短，藥代動力學差等缺點，因此用PEG修飾復合干擾素，提高其熱穩定性，并通過提高其表觀分子量以及在體內抗酶解能力，來提高其在體內的半衰期，達到復合干擾素的長效作用具有重要的意義。
蛋白質PEG化原理20世紀50年代末期，用化學修飾的方法研究蛋白質分子的結構與功能的關系成為生物化學和分子生物學領域的熱點。自20世紀70年代末以來，有關用合成高分子聚乙二醇(PEG)及其衍生物進行蛋白質化學修飾的研究報道越來越多。蛋白質PEG化學修飾主要應用于生物醫學和生物技術領域。在生物醫學方面，PEG化學修飾可以降低免疫原性的免疫反應性、抑制免疫球蛋白的產生，延長藥物蛋白在體內的循環半壽期等；在生物技術領域，酶經過化學修飾后能夠在有機溶劑中高效地發揮催化作用，并表現出新穎的催化性能。蛋白質的免疫原性由蛋白質分子表面的抗原決定簇決定。PEG是一種線性、親水、柔軟且不帶電的分子，當它與蛋白質的非必需基團共價結合時，可作為一種屏障，遮蔽蛋白質表面的抗原決定簇，使該蛋白作為異源物質而不會被識別，避免相應抗體的產生，或者阻止抗體與抗原的結合從而抑制相應的免疫反應。由于PEG修飾可以消除蛋白質的免疫原性，因而不會通過免疫反應而被清除；也由于PEG在蛋白質表面的遮蔽作用，使得蛋白質不易被蛋白酶降解；還由于蛋白質被修飾以后，其分子量大大增加，不易被腎小球過濾。上述幾個因素作用的結果，使修飾之后的蛋白質在體內的循環半壽期明顯延長。
PEG的化學性質PEG是一種兩端帶羥基的線型聚合物，結構式如下 PEG是通過由氫氧離子親核攻擊環氧化物引發的乙撐氧陰離子開環聚合反應合成的。PEG化技術中最常用的PEG是單甲氧基PEG(mPEG)，結構式如下 mPEG是通過由甲氧離子引發的乙撐氧陰離子開環聚合反應合成的。PEG的一些特性可以簡單的歸納如下1)雙親性——既溶于水又溶于大部分有機溶劑，不溶于乙醚和脂肪族烴；2)無毒性(MW＞1000)，FDA批準可以內服；3)極弱的免疫原性；4)高濃度時可以促使細胞融合；5)與其他高分子，例如右旋糖酐，形成雙水相體系；6)可以用作蛋白質和核酸的沉淀劑。
與其他的高分子聚合物相比，PEG的多分散性(Mw/Mn)比較窄對于低分子量PEG(＜5kd)Mw/Mn小于1.01；對于高分子量PEG(＞50kd)Mw/Mn小于1.1。由于PEG在水和大部分有機溶劑中良好的溶解性，一般被認為是雙親性分子。研究表明PEG在水溶液中每個乙基氧單元可以結合2～3個水分子。由于PEG鏈具有高度的柔韌性和結合水分子的能力，因此，在溶液中PEG與相同分子量的球形蛋白相比，其水力學半徑是后者的5～10倍。這個特性被認為是PEG沉淀蛋白質；表面排斥蛋白質和細胞；降低蛋白質的免疫原性和抗原性；增加蛋白質抗酶解能力的主要原因。
PEG的分子量范圍很寬，適合用作修飾劑或修飾劑出發原料的PEG的相對分子質量一般為300-100,000。PEG通常沒有免疫原性和毒性，不會破壞生物分子的活性，其生物相容性已通過美國食品和藥物管理局(FDA)的認證。特別是當蛋白質經過PEG類修飾劑修飾后，修飾劑的許多優良性質也會在修飾蛋白中得到體現。PEG分子末端有兩個能被活化的-OH基團，化學修飾時則多采用單甲氧基聚乙二醇(mPEG)的衍生物為修飾劑。除了線形mPEG，還有分支mPEG(即通過賴氨酸、三嗪等將兩個或更多的PEG鏈連接在一起)和星形mPEG。多數情況下PEG衍生物與蛋白質的共價結合是以蛋白質分子上的氨基和巰基作為修飾位點，這主要是因為氨基和巰基具有親核性，并且大多存在于蛋白質分子的表面。
在蛋白質的PEG化過程中，PEG末端的羥基是其化學反應的功能基團。但它的反應活性差，只能在較激烈的條件下與其它基團發生化學反應，而這樣的條件常常為蛋白質所不能忍受。因此，必需將PEG改造成各種活化中間體，以便能夠在溫和的條件下以較高的反應速率與蛋白質相偶聯，這便是PEG的活化，即在PEG的一個末端或兩個末端上接上一個可以反應的官能團。官能團的選擇根據欲被連接的分子上可用的反應基團來決定。對于蛋白質來說，典型的反應性氨基酸包括賴氨酸，半胱氨酸，組氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，N-末端氨基和C-末端羧基。如果是糖蛋白，鄰位的羥基可以被高碘酸鹽氧化形成兩個可反應的甲醛成分。PEG與蛋白質的偶聯最通用的路徑是用官能團活化PEG使之適合與賴氨酸和N-末端的氨基反應。關于PEG活化方法，Samuel Zalipsky6，7和J.M.Harris8作了較詳細的綜述。
修飾反應的影響因素蛋白質與修飾劑作用所要求的反應條件，除修飾過程能夠順利進行外，還必須滿足如下要求一是不引起蛋白質的不可逆變性，二是有利于選擇性地修飾蛋白質。為此，反應物配比、pH、反應溫度和反應介質等都要控制在一定的范圍。在所有影響蛋白質分子的化學修飾反應的條件中，pH值是最重要的一個條件，因為它決定了具有潛在反應能力的功能基所處的可反應和不可反應的離子狀態。一般情況下，增加pH可以提高反應速率，降低pH可以減小反應速率。反應活性較高的修飾劑可以在生理pH下與蛋白質耦合；而反應活性較低的修飾劑通常需要較高的pH。而修飾反應的專一性則對應于一個優化pH值。通過改變修飾劑與蛋白質的摩爾比和改變pH可以迅速地給出對應于特定修飾度的實驗條件。溫度也是一個必須要注意的條件，因為溫度可以影響到活性巰基的微環境。恰當選擇溫度可以減少或防止一些競爭的基團反應。有些蛋白質屬于熱敏性蛋白質，修飾反應需要在低溫下進行。在此情形下，反應時間要適當延長。反應介質可改變蛋白質的構象或封閉反應部位，因而影響修飾反應。通過基于正交實驗設計的實驗結果，可以容易地得到適宜的修飾反應條件。通過對一個或多個操作因素的控制，就可以得到所需的連有單個、兩個、三個或多個修飾劑的蛋白質耦合物。
公開的聚乙二醇修飾蛋白質形成蛋白-聚乙二醇偶聯物的方法和由所述方法而產生的偶聯物存在一些問題。其中包括，形成偶聯物所采用的化學修飾方法可能使蛋白質變性或完全失活；此外，由于偶聯反應本身的特性往往會使反應體系的pH值降低，不利于偶聯產物的質量控制。使用先前公開的方法來控制此pH值的降低可能造成pH更大范圍的波動和蛋白質生物活性的損失；另外，先前公開的蛋白質-聚乙二醇偶聯物的分離、純化方法并不總是能夠達到很好的效果，特別是在大規模制備的情況下；最后，聚乙二醇和蛋白質之間的化學鍵不穩定，可能發生水解裂解。如果給藥后發生這樣的裂解，聚乙二醇對蛋白質的修飾將達不到預期的效果本發明通過選用化學性質優良的聚乙二醇修飾劑以及完全可控的修飾反應條件來制備高質量的蛋白質-聚乙二醇偶聯物，并通過色譜分離方法來分級、純化聚乙二醇-蛋白質偶聯物的不同成分。
1)Ame M.Ryan，Timothy G.Terrell“Biotechnology and its products”in (Eds)Handbookof Toxicologic pathology，Second Edition，Volume 1，Acadamic Press，New York，20022)Walsh G.Biopharmaceutical Benchmarks.Nat.Biotechnol.，2000，18831-833.
3)EF.Davis，a.m.Kazo，M.L.Nucci，A.Abuchowski，Reduction of immunogenicity andextension of circulating half-life of peptide and protein，inV.H.L Lee(Ed.)，Peptide andProtein Drug Delivery，Marcel Dekker，New york，19904)J.M.Harris，S.Zalipsky(Eds)，Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications，ACS Symposium Series NO.680，American Chemical Society，Washington，DC，19975)Veronese F M，Harris J M.Introduction and Overview of Peptide and Protein PegylationAdvanced Drug Delivery Reviews，2002，54453-4566)Zalipsky，Functionalized poly(ethylene glycol)for preparation of biologically relevantconjugates，Bioconjugate Chem，6；150-165，19957).Zalipsky，Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically active molecules，Advanced Drug deliveryreviews，16；157-180，19958)M.J.Roberts，M.D.Bentley，J.M.Harris，Chemistry for peptide and protein PEGylation，54；459-476，2002發明內容本發明提供了具有生理活性的如下圖所示的重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物
其中，R1為低級烷基，例如甲基、乙基、丙基等；R2為-O-或-NH-；R3為N-R4、S、O；R4為低級烷基或氨基酸；m和n為大于等于1的整數。
定義在本發明的上下文中應用了以下的定義術語“重組人復合干擾素”是指通過基因重組技術合成的I型干擾素，具有166個氨基酸殘基，其中大約30％位置上的氨基酸與IFN-β相同，60％以上的氨基酸與FN-γ相同，只有20個位置上的氨基酸與臨床上最常使用的IFN-α2a的相應位置的氨基酸不同。
術語“偶聯物”是指由一個或多個多肽，通常為單獨一個多肽與一個或多個非多肽分子，例如聚合物分子，共價連接形成的分子。術語“共價連接”是指多肽組分與非多肽組分通過化學反應在兩者之間形成共價鍵而將兩者連接在一起。
術語“聚合物分子”是由多個單體分子共價連接形成的大分子，可以是人或動物的血清白蛋白或免疫球蛋白，也可以是人工合成的高分子材料，例如聚乙二醇。
術語“多肽分子上的可反應基團”是指多肽分子表面的各種可以與非多肽組分發生化學反應的化學基團，例如賴氨酸殘基的α和ε氨基、N末端氨基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基等。
術語“體內功能半壽期”是指在體內多肽或偶聯物仍然存在50％生物學活性的時間。確定體內功能半壽期的另一種方法是確定“血清半壽期”，即50％的多肽或偶聯物在被清除之前在血液循環中時間。“血清半壽期”與其它術語同義，例如“血漿半壽期”、“循環半壽期”、“血液清除率”、“血漿清除率”、“清除半壽期”等等。
關于“體內功能半壽期”或“血清半壽期”所用的術語“增加的”是指偶聯物的相應的半壽期經可比條件下的測定，相對于參考分子，例如未經修飾的重組人干擾素的半壽期在統計學意義上是增加的。例如，相應半壽期可能至少增加大約25％、或50％、或100％等等。
術語“腎臟清除”是指腎臟通過腎小球的過濾，腎小管的分泌或腎小管的排泄進行的任何清除。腎臟清除依賴于多肽或偶聯物分子的物理特征，例如分子大小(直徑)、對稱性、剛性和電荷。
制備本發明重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物所選用的聚合物與多肽分子偶聯的聚合物分子可以是任何一種適當的聚合物分子，例如均聚物或雜聚物，通常與多肽偶聯的聚合物的分子量在300到100,000Da，例如500-20,000Da，優選1000-15,000Da，更優選2000-12,000Da。
適當的聚合物分子的實例包括各種聚環氧烷(PAO)，例如聚亞烷基二醇(PAG)，聚乙二醇(PEG)和聚丙烯乙二醇(PPG)，聚乙烯醇(PVA)等。通常選用的聚合物是生物相容的、無毒、無抗原性、無免疫原性的水溶性高分子。
聚乙二醇(PEG)是優選的聚合物分子，單甲氧基聚乙二醇(mPEG)是更優選的聚合物分子。由于mPEG一端的羥基被甲氧基取代，所以可以避免在與多肽偶聯反應時造成多肽分子之間的交聯。所選用的聚乙二醇可以是線性的或者是具有分支或者星行結構的聚乙二醇。
為了實現聚合物分子和多肽分子的共價連接，提供的聚乙二醇分子的末端羥基必需先轉變為某種形式的活潑基團，以利于聚合物分子和多肽分子的偶聯反應。適當的活化聚乙二醇分子可以是芳基化聚乙二醇試劑，例如mPEG-二氯三嗪(mPEG-dichlorotriazine)和2，4-二(單甲氧基聚乙二醇)-6-氯-均-三嗪(2，4-bis-(methoxypolyethylene glycol)-6-chloro-s-triazine)；酰基化聚乙二醇試劑，例如SucCINFnimidyl SucCINFnate-mPEG、SucCINFnimidylCarboxymethylate-mPEG、SucCINFnimidyl Amino aCINFd-mPEG、p-Nitro phenylCarbonate-mPEG；烷基化聚乙二醇試劑，例如Tresylate-mPEG、mPEG-acetaldehyde、FMP-mPEG。適當的活化聚乙二醇分子還可以是分支形的或星形的聚乙二醇，例如mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、mPEG2-MAL、multi-armsmPEG。為了得到特異性修飾的偶聯產物，優選mPEG-acetaldehyde、mPEG-MAL等。為了以最少的修飾位點得到最大的分子量，優選mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、mPEG2-MAL、multi-arms mPEG等。
制備本發明重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物的方法多肽和活化的聚乙二醇分子的偶聯可通過任何適用的方法，例如液相自由修飾和固相輔助修飾等。對于本領域的技術人員來講，根據選用的活化聚乙二醇試劑而采用適當的修飾反應是非常容易的。聚乙二醇與多肽的偶聯可以是發生在任何可反應基團上的，也可以特異性發生在某個或某些可反應基團上的。
為了制備最佳的偶聯物，針對偶聯的PEG分子的數量，每個分子的分子量和形狀(例如，這些分子是線性還是分支)，PEG與多肽的偶聯位置等因素可以對PEG修飾進行設計。對使用的聚乙二醇的分子量的選擇要考慮到期望達到的效果。例如如果偶聯的主要目的是獲得高分子量和較大分子量的偶聯物(例如降低腎臟清除速率)，那么可以選擇與一個或兩個高分子量的聚乙二醇分子偶聯。但是，如果多肽分子上存在多個免疫位點需要遮蔽，可以應用足夠數量的低分子量聚乙二醇分子以有效地遮蔽所有或大部分多肽表面的免疫位點。
通常，聚乙二醇與多肽分子的偶聯是在使盡可能多的可反應基團與聚乙二醇分子反應的條件下進行的。這可以通過使聚乙二醇的摩爾數適當的超過多肽的摩爾數的方式達到。通常，活化聚乙二醇與多肽的摩爾比可以是1000∶1～1∶1，例如，大約100∶1，優選大約50∶1～1∶1，更優選大約10∶1～2∶1。
本發明對聚乙二醇和多肽的偶聯反應進行了優化。可以理解，大部分的修飾反應是通過針對多肽分子上的親核基團進行的親核攻擊進行的。因此，大部分的修飾反應是在稍微堿性的環境下進行的，例如pH7.0～10.0。而且在反應的過程中不斷產生酸性物質，使得反應體系的pH值降低。而反應體系pH值的波動不利于保持修飾反應的重復性，從而不利于偶聯物的質量控制。與以前公開的方法不同，例如通過向修飾體系中加入堿性物質的方法抑制溶液pH值的降低，本發明通過將堿性物質，例如硼砂，和聚乙二醇按一定比例壓縮成致密的片狀固體，并通過其在反應緩沖液中緩慢溶解的過程中逐漸釋放出活化聚乙二醇試劑和堿性物質而實現活化聚乙二醇試劑與多肽的偶聯反應同時抑制緩沖溶液pH值的降低。使用本發明的方法可以保持修飾反應的重復性，從而有利于偶聯物的質量控制。
偶聯反應進行到預期的程度時，可以通過向反應體系中加入過量的伯胺化合物，例如賴氨酸，的方法來終止偶聯反應，也可以通過調節反應體系pH值的方法，例如將溶液pH值用酸調節到4.0以下，來終止偶聯反應。
本發明重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物的分離、純化方法聚乙二醇與多肽的偶聯反應除了可以產生期望的偶聯產物之外，也會產生一些不希望的副產物，例如從活化聚乙二醇試劑上脫離的游離小分子、水解失活的聚乙二醇、未經修飾的多肽分子等。在應用多肽-聚乙二醇偶聯物之前，這些物質是必需除去的。另外，偶聯反應通常產生各種不同形式的偶聯物，例如一個多肽分子上偶聯一個聚乙二醇分子的偶聯物、一個多肽分子上偶聯兩個聚乙二醇分子的偶聯物等，在應用這些偶聯物之前，最好將它們分離成單一的成分。本發明另一個方面是關于多肽-聚乙二醇偶聯物的色譜分離、純化方法的。與以前公開的分離、純化方法不同，例如，通過透析或超濾的方法除去小分子游離基團和水解失活的聚乙二醇。通過凝膠過濾色譜或超濾將偶聯物和未反應的多肽分離開。但是這些方法存在一些問題，例如通過透析或超濾的方法往往不能將小分子和多余的聚乙二醇分子去除完全，而凝膠過濾色譜的處理量有限，這可能限制制備規模的放大。本發明通過離子交換色譜去除反應副產物并分離不同的偶聯產物，例如，利用脫鹽色譜柱可以很快地將游離小分子基團完全去除，同時將產物的緩沖體系置換為下一步色譜分離所需的緩沖液；利用陽離子交換色譜柱可以簡便地將偶聯產物和未經修飾的多肽分子分開；利用陰離子交換色譜柱可以很容易的將多余的聚乙二醇分子去除，并分級、純化不同形式的偶聯物。該方法具有快速、高效、對蛋白活性無傷害的優點，并且可以很容易進行更大規模的分離制備。
本發明的重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物可以用SDS-PAGE或MALDI-TOF等方法進行分析、鑒定。偶聯物的生物學活性通過中國生物制品規程的方法進行測定，即通過Wish細胞(人羊膜傳代細胞)-VSV病毒(濾泡性口腔炎病毒)系統測定各種偶聯物的抗病毒活性。
本發明重組人干擾素-聚乙二醇偶聯物的用途本發明的聚乙二醇修飾的重組人復合干擾素的用途是用于制備抗病毒藥物、抗癌藥物以及治療免疫功能低下和干擾素缺乏綜合癥的藥物。
本發明的聚乙二醇修飾的重組人復合干擾素能夠保持人天然干擾素的抗病毒活性，同時它又比人天然干擾素具有更好的熱穩定性和抗酶解穩定性，它的血漿清除率更低，體內循環半衰期更長。因此，作為抗病毒、抗癌的藥物，它比天然的干擾素更加有效。
FIG.1聚乙二醇化復合干擾素的SDS-PAGE電泳圖譜，其中第一泳道是分子量標準；第二泳道是復合干擾素；第三泳道是聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯修飾復合干擾素的產物；第四泳道是FMP-PEG修飾復合干擾素的產物。
具體實施方法在此列出的實施方案的目的僅僅是為了更好地說明本發明，而不具有任何限制本發明范圍的意義。對于本領域的技術人員來講，對本發明的方法、應用進行更改、修改、重組的可能性都是顯而易見的，但是任何針對本發明的更改、修改和重組都不超出本發明的范圍和精神，其將在本發明的權利要求書部分進一步得到明確。
實施例1單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(SC-PEG)的制備稱取5克單甲氧基聚乙二醇5000，并將其溶于25毫升無水二氧六環中，加熱將聚合物完全溶解；將6毫摩爾N，N’-二琥珀酰亞胺碳酸酯溶于10毫升無水乙睛中；將6毫摩爾4-(二甲胺)吡啶溶于10毫升無水乙睛中；在攪拌條件下，將N，N’-二琥珀酰亞胺碳酸酯的乙睛溶液緩慢的加到單甲氧基聚乙二醇的二氧六環溶液中，然后，再慢慢地向上述溶液中加入溶有4-(二甲胺)吡啶的乙睛溶液；反應持續至少6個小時；反應結束之后，用乙醚將單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(SC-PEG)沉淀出來。用乙酸乙酯或異丙醇重結晶上述活化酯；用真空干燥器干燥活化酯，并在4℃下避光干燥的環境中保存。
FMP-mPEG的制備將250ml甲苯和50gmPEG5000加到1000ml的圓底燒瓶中，在圓底燒瓶上依次接上分水器、回流冷凝管和干燥塔，然后加熱甲苯溶液到140℃。保持回流狀態兩個小時。然后將回流裝置改為減壓蒸餾裝置，蒸出200ml甲苯。再向圓底燒瓶中加入500ml乙醚，在攪拌的條件下自然降溫，直到固體完全沉淀出來。然后過濾除去乙醚，并將沉淀物放到真空干燥器中把殘余的乙醚除去。得到干燥的無水mPEG5000。然后用卡氏水分測定儀測定干燥后無水mPEG5000中的水分含量，要求水分含量低于50ppm。用量筒稱量干燥25ml乙腈倒入500ml的圓底燒瓶中，將567mg FMP溶解于乙腈中。然后向燒瓶中加入10g分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。攪拌溶液的同時緩慢地向燒瓶中滴加三乙胺以維持溶液pH值在8～9之間。在常溫常壓的條件下反應15分鐘。反應結束后向乙腈溶液中加入足量的乙醚，直到沒有白色固體生成為止。用漏斗過濾乙醚和乙腈的混合溶液，并用300ml乙醚洗滌沉淀物。然后，將白色的固體重新溶于250ml異丙醇中，并加熱到55℃完全溶解固體。在攪拌的條件下自然降溫，直到固體完全沉淀出來。然后過濾除去異丙醇，并將沉淀物放到真空干燥器中干燥3個小時把殘余的異丙醇除去。得到蓬松的白色固體。
實施例2將重組人復合干擾素溶解于pH值為7.0-9.0，濃度為25mM-100mM的硼酸-硼砂緩沖液或磷酸鹽緩沖液中。將活化的聚乙二醇試劑，例如琥珀酰亞胺碳酸酯聚乙二醇(SC-PEG)和硼砂按一定的比例，例如1∶1～1∶10，混合并用強大的壓力將兩者壓成致密的片狀或其它形狀的固體。然后向蛋白溶液中加入該致密的片狀物，并緩慢攪拌蛋白溶液使其緩慢溶解。反應在4-37℃下進行，反應時間為30-120分鐘。反應結束通過向上述體系中加入過量的甘氨酸來終止反應。
實施例3將反應混合物進行色譜分離。首先用凝膠過濾柱脫去反應產生的游離小分子并將蛋白的緩沖體系置換為pH值為4.0-5.0，濃度為25mM-100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液。然后將收集到的蛋白組分用陽離子交換色譜將聚乙二醇修飾的重組人復合干擾素和未修飾的重組人干擾素分開，色譜條件為以pH為4.0-5.0，濃度為25mM-100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液為A流動相，以pH為4.0-5.0，濃度為25mM-100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液加0.2M NaCl為B流動相。在此色譜條件下重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物不與色譜填料發生靜電相互作用，因此在色譜的穿過峰中可以收集到偶聯物，而未反應的重組人復合干擾素可以被吸附于色譜填料之上，用B液可以將其洗脫下來，并收集重新利用。最后用陰離子交換色譜去除多余的聚乙二醇分子并分級、純化不同形式的重組人復合干擾素-聚乙二醇修飾偶聯物，例如聚乙二醇單修飾的重組人復合干擾素，聚乙二醇雙修飾的重組人復合干擾素以及聚乙二醇多修飾的重組人復合干擾素。色譜條件為以pH為8.0-10.0，濃度為25mM-100mM的磷酸鹽緩沖液為A流動相；以pH為8.0-10.0，濃度為25mM-100mM的磷酸鹽緩沖液加1M NaCl為B流動相。在此色譜條件下多余的聚乙二醇不與色譜填料發生靜電相互作用，因此在色譜的穿過峰中可以收集到聚乙二醇，而各種不同形式的重組人復合干擾素可以被吸附于色譜填料之上，并可以利用B流動相中的NaCl梯度將其分級、純化得到單一成分。
實施例4按中國生物制品規程(中華人民共和國衛生部，中國生物制品規程一部，1995年版，北京中國人口出版社，1995268-269)的方法測定。
用Wish細胞(人羊膜傳代細胞)-VSV病毒(濾泡性口腔炎病毒)系統測定各種偶聯物的抗病毒活性。采用CPE(細胞致病效應)抑制為基礎的抑制微量測定法，以每毫升干擾素檢品的最高稀釋度仍能保護半數細胞(50％)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數為干擾素單位。以國際單位(IU)表示，并用國家IFNα標準品進行校正。
實施例5熱穩定性取rhCINF、mono-mPEG-rhCINF、di-mPEG-rhCINF、poly-mPEG-rhCINF各1毫摩爾，分別置于4℃、37℃、56℃條件下，定時取樣測定干擾素的抗病毒活性。結果表明rhCINF在56℃下4-6小時，活性喪失73％；mono-mPEG-rhCINF活性喪失52％；di-mPEG-rhCINF活性喪失37％；poly-mPEG-rhCINF活性喪失22％。rhCINF在37℃下10-12小時，活性喪失51％；mono-mPEG-rhCINF活性喪失33％；di-mPEG-rhCINF活性喪失17％；poly-mPEG-rhCINF活性喪失6％。rhCINF在4℃下1周-2周，活性喪失45％；mono-mPEG-rhCINF活性喪失11％；di-mPEG-rhCINF活性喪失4％；poly-mPEG-rhCINF活性喪失0％。上述穩定性試驗是在液體狀態，無任何穩定劑和保護劑的條件下進行的，因此可以初步認為重組人復合干擾素與聚乙二醇偶聯之后可以增加其熱穩定性。
抗酶解穩定性取0.1％胰蛋白酶溶液(pH8.0)2.5毫升，各加入0.3毫升rhCINF、mono-mPEG-rhCINF、di-mPEG-rhCINF、poly-mPEG-rhCINF樣品中，25℃保溫，分別在0、10、30、50、70、90分鐘的時間間隔取樣測定抗病毒活性。結果表明，rhCINF在5～7分鐘之內活性迅速降低到原來的50％，30分鐘活性幾乎完全喪失；mono-mPEG-rhCINF在10～13分鐘之內活性降低到原來的50％，50分鐘活性幾乎完全喪失；di-mPEG-rhCINF在50～54分鐘之內活性降低到原來的50％，90分鐘活性幾乎完全喪失；poly-mPEG-rhCINF在82～85分鐘之內活性降低到原來的50％。
權利要求
1.一種重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物，其結構如下圖所示 其中，R1為低級烷基，例如甲基、乙基、丙基等；R2為-O-或-NH-；R3為N-R4、S、O；R4為低級烷基或氨基酸；m和n為大于等于1的整數。CINF為復合干擾素，其特征是一級結構的氨基酸中20％與INF-β相同，78％與INF-γ相同；并且與現有的任何天然干擾素相比其活性高6～11倍。
2.一種重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物，其特征是包含具有重組人復合干擾素生理活性的多肽，并且至少有一個非多肽組分與多肽組分的可反應基團相偶聯。
3.一種制備權利要求1、2所述的重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物的方法，其特征是偶聯反應可以是液相自由偶聯或固相輔助偶聯。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征是將聚乙二醇和堿性物質被壓縮成為致密的片狀或其他形狀的固體。
5.根據權利要求4的制備方法，其特征是通過致密固體在反應緩沖液中的緩慢溶解來實現偶聯反應和抑制反應體系pH值的降低。
6.一種權利要求1、2所述的重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物的分離、純化方法，其特征是通過色譜過程去除反應副產物和分級、純化偶聯物。
7.根據權利要求6的分離、純化方法，其特征是通過脫鹽色譜或透析的方法去除反應產生的游離小分子。
8.根據權利要求6的分離、純化方法，其特征是通過陽離子交換色譜過程去除未反應的蛋白質，并收集利用。
9.根據權利要求6的分離、純化方法，其特征是通過陰離子交換色譜過程去除多余的聚乙二醇分子，并分級、純化各種不同的重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物。
10.根據權利要求6所述的方法得到的純化重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物，其特征是能夠保持人天然干擾素的抗病毒活性，同時又比天然的干擾素具有更好的熱穩定性和抗酶解穩定性，血漿清除率更低，體內循環半衰期更長。
11.根據權利要求1、2所述的重組人復合干擾素-聚乙二醇偶聯物，其特征是可以和其他藥物一起制備成為藥物組合物，可以單獨作為藥物應用，以及可以用上述藥物組合物治療各種病毒性感染、癌癥、免疫功能低下以及干擾素缺乏綜合癥的等疾病的方法。
全文摘要
本發明涉及一種重組人復合干擾素－聚乙二醇偶聯物，其包含具有重組人復合干擾素生理活性的多肽和非多肽組分。本發明通過可控修飾反應來制備高質量的蛋白質－聚乙二醇偶聯物，并通過色譜分離方法來分分離、純化聚乙二醇－蛋白質偶聯物。本發明的聚乙二醇修飾的重組人復合干擾素能夠保持人天然干擾素的抗病毒活性，同時它又比人天然干擾素具有更好的熱穩定性和抗酶解穩定性，它的血漿清除率更低，體內循環半衰期更長。
文檔編號C08G65/00GK1673230SQ20041002957
公開日2005年9月28日 申請日期2004年3月24日 優先權日2004年3月24日
發明者蘇志國, 馬光輝, 贠強, 楊瑞娥, 陳婷 申請人:中國科學院過程工程研究所