專利名稱：具有高谷胱甘肽過氧化物酶活性的含碲透明質酸的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物化學領域，涉及制備具有較高谷胱甘肽過氧化物酶活性的人工酶的方法，具體而言，本發明涉及碲化透明質酸的化學制備方法。
背景技術：
透明質酸有很強的保水作用；在化妝品中能起到增稠和穩定的作用；在皮膚中可清除活性氧自由基，起到防曬作用。因此，透明質酸在化妝品領域中有諸多方面的應用。透明質酸及其衍生物又作為基礎藥物與各類治療藥物組成的復方制劑中的載體，把不同的治療藥物導向并保留在人體的病理部位，使藥物作用到更精確的靶位上，大大增加療效的同時，避免了藥物的全身性副作用。以透明質酸為載體的抗癌靶向藥物如透明質酸-氟尿嘧啶，透明質酸-二氯滅痛等，已經進入了三期臨床階段。
碲屬于類金屬元素，碲醇具有較高分解氫過氧化物的能力。無機碲的毒性很小。對有機碲研究表明其生物學作用類似于谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性。碲酵母菌產生的亞碲氨酸可作為抗癌劑應用到臨床治療中。有機碲化物(AS101)具有抑制白血病細胞增殖作用，增加脾細胞NK活性，提高外周血白細胞吞噬功能及氧化殺菌能力。
谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)在機體的活性氧代謝中具有防止畸變、預防衰老及參與前列腺素合成等重要生理作用。理論上人源GPX應是最有效的抗氧化藥物，但由于來源極其有限；從動物中提取GPX不能完全解決來源有限、價格昂貴的弊端。于是，人們開始應用化學合成法人工模擬GPX酶。如中國專利03119444.3公開了環糊精衍生物在化妝品中的應用，但與透明質酸比較，環糊精為小分子化合物，缺乏化妝品應具有的保濕和營養作用，而且不具有潤滑性和增稠性。中國專利03119443.5公開了環糊精衍生物的藥物用途及其藥物組合物，但與透明質酸比較，環糊精不具備靶向性藥物載體的作用，而且以環糊精為底物合成的含硒化合物應用于臨床治療，具有副作用大，藥物療效低的特點。
與本發明相近的現有技術是中國專利03127134.0公開的，名稱為“化學修飾法制備具有谷胱甘肽過氧化物酶活性的含硒透明質酸化合物”，介紹了采用簡單的化學合成法，制備含硒透明質酸的方法，硒化后的透明質酸具有較高的GPX活性，而且還具有較好的抗氧化活性。所說的含硒透明質酸為硒和透明質酸的化合物。其制備工藝為NaHSe與透明質酸水溶液進行硒化反應生成含-she的透明質酸；反應結束后將反應體系暴露于空氣中氧化，除去過量的硒；產物經乙醇沉淀、離心，收集沉淀，用乙醇、丙酮反復洗滌，揮去有機溶劑，樣品冷凍干燥，得含硒透明質酸純品。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，提供一種簡單工藝，以NaHTe作為修飾劑，修飾透明質酸分子中的-OH部位，制備具有GPX活性及抗氧化活性的含碲透明質酸。
本發明的含碲透明質酸為碲和透明質酸的化合物。含碲透明質酸為淡黃色粉末狀物。所含碲價態為-1價。GPX活性為80.2～174.2U/umol。
本發明的具有谷胱甘肽過氧化物酶活性的含碲透明質酸化合物的制備工藝過程有透明質酸的活化、碲氫化鈉(NaHTe)的制備、透明質酸的碲化反應、碲化透明質酸的氧化、后處理。所說的透明質酸的活化，用對甲苯磺酰氯活化透明質酸，制備出透明質酸苯磺酰酯，再在蒸餾水中透析；所說的碲氫化鈉的制備，所說的碲氫化鈉的制備，是將碲粉和硼氫化鈉加入無水乙醇，在密閉體系反應，得到碲氫化鈉的乙醇溶液；所說的透明質酸的碲化反應，是用碲氫化鈉的乙醇溶液與透明質酸苯磺酰酯水溶液反應，生成含-TeH的透明質酸。所說的碲化透明質酸的氧化，是將生成含-TeH的透明質酸反應體系暴露在空氣中氧化；所說的后處理，是產物經離心、乙醇沉淀，離心收集沉淀，分別用乙醇和丙酮反復洗滌，揮去有機溶劑，樣品冷凍干燥，得到含碲透明質酸純品。
與背景技術相比，原料使用了碲氫化鈉，增加了透明質酸的活化過程。碲化透明質酸的氧化和后處理過程與背景技術的相應過程相同。
碲氫化鈉的制備的具體過程，是將碲粉和硼氫化鈉加入無水乙醇，在通氮氣使體系保持無氧條件下加熱回流0.6～1.5小時，冷卻至室溫再加入無氧冰醋酸，加熱至沸騰，有黑色沉淀產生，得到碲氫化鈉的乙醇溶液。碲氫化鈉的制備可以參考《合成化學》第4卷第1期(1996)P73～75的文章，題目是“碲氫化鈉存在于3-氧代硫代羧酸酯的一步合成法”。
透明質酸的活化具體過程，是將透明質酸溶于NaOH溶液中，室溫滴加濃度為0.4g/ml的對甲苯磺酰氯(p-TsCL)乙腈溶液，使體系的pH＞12.5，滴加完畢經攪拌再用HCl調至中性，加入甲醇，濾去不溶物，減壓蒸去甲醇在5℃環境下析出鹽，濾去不溶物，制得透明質酸苯磺酰酯，再在蒸餾水中透析1～3天，備用。透明質酸與對甲苯磺酰氯用量的質量比為1∶2～5。
透明質酸的碲化反應的具體過程，是將透明質酸苯磺酰酯用水溶解至濃度為8～15mg/ml，通氮氣使反應體系在惰性環境下加入碲氫化鈉醇溶液，密閉反應體系并置于30～70℃水浴中，反應12～60小時。透明質酸苯磺酰酯與NaHTe的用量摩爾比為1∶1000～15000，其最佳摩爾比為1∶5000。
本發明的有益效果是本發明的方法制備的含碲透明質酸，具有較原透明質酸更高的抗氧化活性，還增添了GPX活性。含碲透明質酸的理化性質穩定。并且，碲與硒屬于同一主族元素，他們具有相同的氧化還原特性，且碲醇更易分解氫過氧化物。無機碲的毒性明顯小于無機硒的毒性。含碲透明質酸作為藥物或化妝品的添加劑可以克服天然GPX的不穩定，來源有限，分子量大會引起人體免疫反應等缺點。因此，含碲透明質酸在化妝品領域和醫藥領域有巨大應用潛力。含碲透明質酸國內外未見報道，本發明合成了含碲透明質酸，為酶的模擬物開發提供了一條新的思路。
透明質酸作為主要的生產原料，可通過生物體內提取和微生物發酵大量制備，這就很好的解決了成本高的問題。對甲苯磺酰氯是較為廉價的活化劑，以該物質活化透明質酸，碲化后純化產物，這樣就簡化了產品的制備、分離提純等步驟，使模擬物的成本大大降低，而生物活性較環糊精碲化產物提高近4倍。因此，本發明的含碲透明質酸的制備工藝簡單，合成步驟少，產率高，產品易純化，可大量生產。
具體實施例方式
實施例1 含碲透明質酸的合成路線(1)透明質酸苯磺酰酯的制備取2.0g透明質酸溶于80ml NaOH(0.15mol/L)溶液中，室溫滴加p-TsCL的乙腈溶液(8.0g/20ml)滴加過程中不斷加入1mol/L的NaOH使溶液pH＞12.5，3小時滴加完畢再攪拌1小時，用1mol/LHCl調至中性，加入100ml甲醇，濾去不溶物，減壓蒸去甲醇至80ml，放入5℃冰箱，八天后有鹽析出，濾去不溶物，在蒸餾水中透析2天，備用。
(2)碲氫化鈉(NaHTe)的制備將2.54g碲粉、1.8g硼氫化鈉加入40ml無水乙醇，有氣體產生，并伴隨有熱量放出。通氮氣數分鐘使體系保持無氧。小火加熱回流約1小時，冷卻至室溫，加入2.4ml無氧冰醋酸，加熱至沸騰。有黑色沉淀產生，溶液呈無色透明。冷卻后，溶液即可使用。
(3)將活化的透明質酸苯磺酰酯用水充分溶解至濃度為10mg/ml，取100ml該水溶液在容器中通高純氮氣25分鐘，保證反應體系的惰性環境，將制備好的碲氫化鈉醇溶液迅速加入該容器中，迅速密閉反應體系，防止碲氫化鈉被氧化，開始碲化反應。
將碲化反應體系置于60℃水浴中，反應48小時。
(4)透明質酸碲化反應后，產物充分暴露于空氣中，使過量的碲氫化鈉充分氧化。用12000rpm離心10分鐘，收取含有碲化透明質酸黃色上清液。
(5)將碲化透明質酸用1mol/L的NaOH調pH值至7.0。用乙醇將含碲透明質酸沉淀，收集沉淀，經乙醇、丙酮反復洗滌后，冷卻干燥，得含碲透明質酸純品。
實施例2 碲化透明質酸活性的測定1、碲化透明質酸的GPX活性測活體系500ul，含50mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.0、1mmol/L疊氮鈉。1mmol/L谷胱甘肽，0.25mmol/L輔酶(NADPH)，1U谷胱甘肽還原酶，加入0.5mmol/L過氧化氫啟動反應，在340nm處監測NADPH被氧化的吸光度變化。測定酶活時，以蒸餾水代替含碲多糖作為空白對照。酶活力單位定義為每分鐘每微摩爾含碲多糖消耗1微摩爾NADPH為一個活力單位。最終測定在上述條件下得到的含碲多糖的比活力為174.2U/umol。
2、碲化透明質酸的抗氧化活性研究測活體系為3ml，取用上述制備的碲化透明質酸溶液100ul，加入2ml蒸餾水，依次加入20mmol/L的水楊酸鈉300ul，0.5mmol/L的硫酸亞鐵300ul，最后加入60mmol/L的過氧化氫300ul，將反應體系在32℃的水浴中反應1小時后，在752分光光度計上測定其在510nm處的吸光度值。測定活力時以蒸餾水代替糖溶液作參比，以相同濃度的純透明質酸水溶液代替糖溶液作對照，最終測定其抗-OH的活性在15ug/ml時的抑制率達到81％，是未經修飾的透明質酸的460多倍。
實施例3 活化條件對產物GPX活力的影響按實施例1的工藝過程，只是將透明質酸與對甲苯磺酰氯用量的質量比分別為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5。對得到的含碲透明質酸按實施例2的檢測方法分別測得其GPX活力，結果為62.5，91.3，130.5，174.2，178.3U/umol。除了1∶1的配比外，結果均大于背景技術的75.2 U/umol的結果。最終得到在活化過程中，透明質酸與對甲苯磺酰氯最佳質量比為1∶4，其產物含碲透明質酸兼具GPX活力高和對甲苯磺酰氯利用率高的特點。
實施例4 碲化條件對產物GPX活力的影響按實施例1的工藝過程，只是將透明質酸苯磺酰酯用水溶解至不同濃度，濃度分別為，5mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，15mg/ml。取100ml該水溶液進行碲化反應，對得到的含碲透明質酸按實施例2的檢測方法測得其GPX活力分別為51.3，95.6，135.7，174.2，152.3。透明質酸苯磺酰酯的水溶液濃度除了5mg/ml比外，GPX活力結果均大于背景技術的結果。最后得到在透明質酸苯磺酰酯水溶液最佳濃度為10mg/ml時，其產物含碲透明質酸兼具GPX活力高和溶解性好的特點。
將10mg/ml的透明質酸苯磺酰酯與NaHTe的用量摩爾比分別配制成1∶1000，1∶2500，1∶5000，1∶10000，1∶15000，用不同的透明質酸苯磺酰酯與NaHTe用量摩爾比按實施例1的工藝過程進行碲化反應，對得到的含碲透明質酸按實施例2的檢測方法測得其GPX活力分別為120.1，140.3，171.5，178.2，180.2。上述比例的結果均好于背景技術。在活化的透明質酸苯磺酰酯與碲氫化鈉的用量摩爾比為1∶5000時為最佳配比，其產物含碲透明質酸兼具GPX活力高和碲利用率高的特點。
將10mg/ml的活化的透明質酸苯磺酰酯進行碲化，反應時間分別為12，24，36，48，60小時，用不同的透明質酸碲化時間按實施例1的工藝過程進行碲化反應，產品按實施例2的檢測方法測得其GPX活力分別為80.2，110.3，140.8，174.5，176.3。上述反應時間的結果均好于背景技術。并確定透明質酸碲化反應最佳時間為48小時，其產物含碲透明質酸具有GPX活力高的特點。
將10mg/ml的活化的透明質酸苯磺酰酯進行碲化，反應溫度分別為20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，用不同的透明質酸碲化溫度按實施例1的工藝進行碲化反應，所得含碲透明質酸按實施例2方法測得其GPX活力分別為40.1，76.1，90.5，135.8，172.5，176.1。可以確定透明質酸碲化反應溫度在30～70℃均能達到本發明的效果。并且可以確定透明質酸碲化反應最佳溫度為60℃，其產物含碲透明質酸兼具GPX活力高和透明質酸降解程度小的特點。
權利要求
1.一種具有高谷胱甘肽過氧化物酶活性的含碲透明質酸的制備方法，工藝過程有碲化透明質酸的氧化、后處理；所說的碲化透明質酸的氧化，是將生成含-TeH的透明質酸反應體系暴露在空氣中氧化；所說的后處理，是產物經離心、乙醇沉淀，離心收集沉淀，分別用乙醇和丙酮反復洗滌，揮去有機溶劑，樣品冷凍干燥，得到含碲透明質酸純品；其特征在于，在碲化透明質酸的氧化之前，有透明質酸的活化、碲氫化鈉的制備、透明質酸的碲化反應的工藝過程；所說的透明質酸的活化，用對甲苯磺酰氯活化透明質酸，制備出透明質酸苯磺酰酯，再在蒸餾水中透析；所說的碲氫化鈉的制備，是將碲粉和硼氫化鈉加入無水乙醇，在密閉體系反應，得到碲氫化鈉的乙醇溶液；所說的透明質酸的碲化反應，是用碲氫化鈉的乙醇溶液與透明質酸苯磺酰酯水溶液反應，生成含-TeH的透明質酸。
2.按照權利要求1所述的具有高谷胱甘肽過氧化物酶活性的含碲透明質酸的制備方法，其特征在于，所說的透明質酸的活化，是將透明質酸溶于NaOH溶液中，室溫滴加濃度為0.4g/ml的對甲苯磺酰氯乙腈溶液，使體系的pH＞12.5，滴加完畢經攪拌再用HCl調至中性，加入甲醇，濾去不溶物，減壓蒸去甲醇在5℃環境下析出鹽，濾去不溶物，制得透明質酸苯磺酰酯，再在蒸餾水中透析1～3天；透明質酸與對甲苯磺酰氯用量的質量比為1∶2～5。
3.按照權利要求1或2所述的具有高谷胱甘肽過氧化物酶活性的含碲透明質酸的制備方法，其特征在于，所說的透明質酸的碲化反應，是將透明質酸苯磺酰酯用水溶解至濃度為8～15mg/ml，通氮氣使反應體系在惰性環境下加入碲氫化鈉醇溶液，密閉反應體系并置于30～70℃水浴中，反應12～60小時；透明質酸苯磺酰酯與碲氫化鈉的用量摩爾比為1∶1000～15000。
全文摘要
本發明的具有高谷胱甘肽過氧化物酶活性的含碲透明質酸的制備方法屬于制備具有GPX活性的人工酶的方法。工藝過程有透明質酸的活化、碲氫化鈉的制備、透明質酸的碲化反應、碲化透明質酸的氧化和后處理。先用對甲苯磺酰氯活化透明質酸，制得透明質酸苯磺酰酯，在蒸餾水中透析；將碲粉和硼氫化鈉加入無水乙醇，在通氮氣體系加熱回流，再加入無氧冰醋酸，制得碲氫化鈉的乙醇溶液；再用碲氫化鈉的乙醇溶液與透明質酸苯磺酰酯水溶液反應，生成含—TeH的透明質酸；最后反應體系暴露在空氣中氧化離心、乙醇沉淀，洗滌。本發明制備的含碲透明質酸，具有更高的抗氧化活性和GPX活性；并且工藝簡單，產率高，產品易純化，可大量生產。
文檔編號C08B37/08GK1644588SQ200410011380
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月23日 優先權日2004年12月23日
發明者陳智博, 劉蘭英, 馮德日, 洪水聲, 陳佳, 初雨卓 申請人:吉林大學