專利名稱：一種生物活性聚乳酸的制備方法、產品及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物活性聚乳酸的制備方法，更確切地說，本發明涉及一種采用生物活性物質為原料，在馬來酸酐改性聚乳酸的基礎上，進一步改性聚乳酸的制備方法、以及其產品及應用。
背景技術：
(1)聚乳酸及其化學改性研究聚乳酸材料的突出優點是具有良好的生物相容性、可降解性和比較適中的機械性能，它在體內或體外水解的產物為生物可代謝的乳酸，并最終分解成二氧化碳和水，是一種美國FDA同意在體使用的合成聚合物材料。由于聚乳酸的優良性質，它是一種優良的環境友好材料，受到環境保護工作者的青睞；更為突出的是它在目前的修復醫學及藥學領域也受到關注，特別受到組織工程和藥物緩釋研究者們的青睞。但是由于聚乳酸材料本身的化學結構簡單，所含的化學活性基團少，更不具有組織工程研究中所需的對細胞粘附、生長起調節作用的細胞信號，也不具有靶向藥物緩釋研究中所需的靶向信號，因而它僅僅只能作為一種普適性的惰性材料在各個領域中應用。
為此，很多學者研究具有生物活性的聚乳酸化合物的制備。包括物理方法和化學方法，分別敘述如下物理方法主要有以下兩種方式①與生物活性蛋白質、多肽進行簡單的混合；②在聚乳酸材料表面通過物理吸附作用吸附生物活性蛋白或多肽。物理方法能夠使材料的表面生物活性、親水性/疏水性等性能得到一定程度的改善，但往往可能存在以下幾方面的問題①共混不均勻，使材料與細胞接觸表面的性質不均勻，從而導致材料上細胞的生長狀態不相同；②物理吸附方法通常是由范德華力維持吸附分子與聚乳酸材料間的作用，結合力弱，被吸附的分子易于脫落，從而影響材料的生物活性。
化學方法的研究開始于20世紀90年代之后，它主要有以下兩種方式①以共聚的方式在聚乳酸主鏈上引入側鏈帶活性反應基團的其它鏈段，并以此活性反應基團為媒介，接枝生物活性分子。Langer R實驗室在1993年發表的了乳酸-賴氨酸共聚的化合物，它在聚乳酸主鏈上引入了聚賴氨酸鏈段，他們利用聚賴氨酸側鏈上的氨基為反應性活性基團，通過交連反應，再引入了其它的生物活性分子，如RGD肽段[1、2、3]。通過在聚乳酸主鏈上引入其它鏈段和活性基團的方法，可以在聚乳酸材料上引入生物活性的物質，同時研究表明引入的生物活性分子具有生物活性，促進了與細胞之間的信息交換，有利于細胞的粘附和生長[1、2]。但是以這種方式引入生物活性分子時，在產物的主鏈結構中引入了其它鏈段，這樣可能使聚合物的聚合度降低，分子量下降，降解性改變，影響材料的力學強度等使用性能。②通過聚乳酸的鏈端引入生物活性分子。Langer R實驗室于1998年報道了一種新型的生物活性聚乳酸材料，它是由(α-生物素，ω-OH)聚乙二醇與L-丙交酯聚合成的鏈端帶生物素分子的聚乳酸，通過生物素分子為媒介，以抗生物素為偶聯劑，可再引入其它的與生物素相連的生物活性物質[4](抗生物素分子是生物素的配體，它們之間的親合性很高，一個抗生物素分子可結合四個生物素分子)。另外的改性有日本Kataoka K實驗室于2000年報道的研究，他們采用鏈端為乙縮醛二乙醇基團的乙二醇-乳共聚物為原料，再經過酸處理將乙縮醛二乙醇基團轉變為醛基，通過醛基與氨基酸或多肽上的氨基反應生成Schiff堿，經還原，將生物活性分子引入到聚乳酸分子的鏈端[5]。通過在聚乳酸鏈端的活性基團，可以將生物活性的物質引入到聚乳酸材料上，但是它只能在聚乳酸的鏈端引入，引入的量和位置不能任意調節。目前尚未見到國內關于采用化學方法對聚乳酸進行生物活化改性的研究。
(2)聚乙二醇(PEG或PEO)及其阻止非特異性蛋白吸附的作用研究表明，目前僅有為數不多的幾種物質具有阻止非特異性蛋白吸附的作用，包括高度親水性的不帶電荷的水凝膠，如聚丙烯酰和瓊脂糖胺、聚乙二醇(PEG)等，而在聚乙二醇、纖維素衍生物和氟化物表面具有阻止細胞粘附的作用。PEG是一種常采用來形成可阻止蛋白非特異性吸附表面的物質。在蛋白或多肽的特異性生物作用研究時，常利用PEG的這個性質，將蛋白或多肽與PEG共價連接。此外，在藥物緩釋研究方面，發現藥物緩釋微球表面涂覆PEG可增加微球在血液循環系統中停留的時間，有助于藥物的緩釋，這種微球包括聚乳酸和免疫脂質體，這可能也與它可阻止蛋白的非特異性吸附的性能有關。
人們對采用PEG改性聚乳酸也作了很多的研究，主要通過與聚乳酸共聚、在聚合物鏈端的交連，如在上部分提到的與聚乳酸共聚再連接生物活性分子的研究，以及PEG和聚乳酸分別與不飽和雙鍵連接成新單體，再通過自由基引發聚合的研究。
發明內容
本發明的目的針對現有技術存在的不足，提供一種采用化學方法對聚乳酸進行生物活化改性的制備方法，本發明方法在聚乳酸本體化學結構中引入生物活性物質，達到以下幾方面的目的①在幾乎不改變聚乳酸的主鏈結構和不降低聚合物的分子量的前提下，在聚乳酸聚合物的側鏈上將生物活性物質引入到聚合物的結構中；②使引入的量可根據需要進行調節；③使引入的生物活性物質在整個聚乳酸分子鏈上的分布較均勻；④使引入生物活性物質的反應條件溫和，可確保生物活性分子在反應后活性的維持；⑤使制備的材料在一定程度上可消除或減少對其它的未接枝的生物活性分子的物理吸附(即非特異性吸附)，從而有利于發揮接枝生物活性分子的特異性生物作用；⑥使本發明所設計的化合物的水解pH值更接近中性，克服聚乳酸材料降解使環境的pH值降低的現象。
為達到上述目的采用以下的措施制備生物活性的聚乳酸化合物采用馬來酸酐改性聚乳酸(如本專利申請人的專利01129046.X)為原料，①直接加入有機二胺或二醇或羥胺或水進行反應；②產物經分離純化后，在有機交聯劑的作用下，加入生物活性物質反應，從而獲得生物活性聚乳酸。
在制備步驟②中，產物經分離純化后，也可在有機交聯劑的作用下，先加入聚乙二醇(也稱聚環氧乙烷)或其衍生物反應；然后，③將產物經分離純化后，在有機交聯劑的作用下，再加入生物活性物質反應，同樣獲得生物活性聚乳酸產物。
方法中所涉及生物活性物質包括各種細胞及組織生長因子、調節因子、靶向因子等所有具有生物活性的蛋白質、寡聚糖、DNA片段及藥物等。加入的生物活性物質的物質量為改性聚乳酸中馬來酸酐摩爾用量的1～50％，反應溫度為-20～60℃，時間為10分鐘～48小時，pH值范圍為5～9，反應過程根據使用的交聯劑種類，選擇其特征的催化劑，如有機胺或有機金屬化合物。
有機交聯劑可為二元或多元的碳亞胺如二環己基碳二亞胺、1-乙基-3(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺，二元或多元異氰酸酯如1，6-六亞甲基二異氰酸酯、甲苯二異氰酸酯、4，4’-二苯基甲烷二異氰酸酯等，二元或多元環氧化合物如1，2，5，6-二環氧己烷、1，2，7，8-二環氧辛烷等，有機金屬化合物如鈦、鋁、鋯、錫的醇鹽、堿式無機酸鹽等，及其這些物質的衍生物，其它的一些偶聯劑如3(2-吡啶乙基)丙酸-N-琥珀酰亞胺酯、間(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯、S-乙酰巰基琥珀酐、N-羥基琥珀酰亞胺、1，1’-羰基二咪唑等。
聚乙二醇衍生物包括其端基的氨基、羧基、醛基等衍生物；有機二胺或二醇或羥胺或水或聚乙二醇的加入量為改性聚乳酸中馬來酸酐摩爾用量的1～50％，反應溫度為0～100℃，時間為10分鐘～24小時。
采用本制備方法所得到的生物活性聚乳酸產品的結構式為 R為 或 其中R1為有機二胺或二醇或羥胺或水，R2為有機交聯劑，R3為聚乙二醇，L為生物活性物質；采用本發明所設計的方法，通過接枝不同的生物活性物質，可制備具有更好的細胞親和性，或具有細胞生長的調節性，或具有組織細胞特異性識別等特殊性能的生物活性聚乳酸材料，其產物可用作組織工程的支架材料、藥物緩釋的靶向載體材料或制作高分子化的藥物。與聚乳酸相比，是一類新型的具有生物活性、生物可降解性和良好生物相容性的材料。
本發明方法在聚乳酸本體化學結構中引入生物活性物質，所具有的優點有①在幾乎不改變聚乳酸的主鏈結構和不降低聚合物的分子量的前提下，在聚乳酸聚合物的側鏈上將生物活性物質引入到聚合物的結構中；②引入的量可根據需要進行調節；③引入的生物活性物質在整個聚乳酸分子鏈上的分布較均勻；④引入生物活性物質的反應條件溫和，可確保生物活性分子在反應后活性的維持；⑤本發明所設計的材料可在一定程度上消除或減少對其它的未接枝的生物活性分子的物理吸附(即非特異性吸附)，從而有利于接枝生物活性分子的特異性作用；⑥本發明所設計的化合物的水解pH值更接近中性可克服聚乳酸材料降解使環境的pH值降低的現象。
圖1是采用美國Perkin-Elmer公司的LS-50B熒光分光光度計測試的，以FITC熒光素標記的抗生物素(也叫親和素)標記并用H2O/THF混合溶劑分離純化后的生物素改性聚乳酸(1)和有機二胺改性聚乳酸(2)的熒光發射光譜圖。
具體實施例方式
實施例1取原料100克采用10％重量比的馬來酸酐改性的聚乳酸(MPLA)，溶解于400ml THF中，再將此溶液加入12克羥甲胺中，于室溫下反應10分鐘，產物經分離純化干燥后，再溶解于400ml的THF(四氫呋喃)/DMF(二甲基甲酰胺)(3∶1)混合溶劑中，將25克分子量為1000的聚乙二醇和8克的1，6-六亞甲基二異氰酸酯(HDI)溶解于混合溶劑中，將三種成分混合均勻后在60℃下反應2小時，產物經分離純化后，用混合溶劑溶解，加入用混合溶劑溶解的50克半乳糖(一種可被肝組織識別的糖類物質)，于60℃反應2小時，產物為接枝半乳糖的聚乳酸。
實施例2取原料100克采用5％重量比的馬來酸酐改性聚乳酸(MPLA)，溶解于400ml THF中，再將此溶液加入蒸餾水中，8小時內收集沉淀，經干燥后再用400ml THF溶解。加入14克N-羥基琥珀酰亞胺和5克DCC在0℃反應2小時再在室溫下放置20小時，產物經過濾去除沉淀后加入用50ml THF溶解的60克抗瘤胺酸(一種抗癌藥物，作用于慢性粒細胞型白血病)，在室溫下反應20小時得產物，該產物分離純化后為高分子化的抗瘤胺酸。
實施例3取原料100克采用15％重量比的馬來酸酐改性聚乳酸(MPLA)，溶解于400ml THF中，加入丁二胺35克，于室溫下反應60分鐘，產物經分離純化干燥后，用400ml THF/DMF(3∶1)的混合溶劑溶解，再分別用50ml和100ml該混合溶劑溶解30克DCC和300克水解膠原蛋白，將三種成分混合均勻后于-20℃反應24小時，室溫反應24小時得反應產物，該產物分離純化后為水解膠原蛋白改性的聚乳酸。
實施例4取原料100克采用5％重量比的馬來酸酐改性聚乳酸(MPLA)，溶解于400ml THF中，再將此溶液加入0.01N的氫氧化鈉溶液中，2小時內收集沉淀，經干燥后再用400ml THF溶解。再加入用100ml THF溶解的30克DCC和干擾素基因0.02克于0℃反應24小時，并用N-甲級嗎啉調節溶液的pH值為8-9，在室溫反應12小時，分離純化后得產物，該產物為接枝了基因片段的聚乳酸。
實施例5取原料100克采用5％重量比的馬來酸酐改性聚乳酸(MPLA)，溶解于200ml THF中，加入乙二胺8克，于室溫下反應30分鐘，產物經分離純化干燥后，用200ml THF溶解，再加入用10ml DMSO(二甲亞砜)溶解的IgG抗體的F(ab’)2片段和15克1，2，5，6-二環氧己烷，用N-甲級嗎啉調節溶液的pH值為9，并于50℃反應4小時，分離純化后得產物，該產物為接枝了抗體的聚乳酸。
實施例6取原料100克采用10％重量比的馬來酸酐改性的聚乳酸(MPLA)，溶解于400ml THF中，再將此溶液加入蒸餾水中，5小時內收集沉淀，經干燥后再用400mlTHF溶解。分別加入5ml重量比為1％的堿式硫酸鋁的水溶液和1ml含濃度為5PPM的內皮細胞生長因子水溶液，在40℃反應2小時，分離純化后得產物，該產物為接枝了內皮細胞生長因子的聚乳酸。
實施例7取原料100克采用10％重量比的馬來酸酐改性的聚乳酸(MPLA)，溶解于400ml THF中，再將此溶液加入90克分子量為300的α，ω氨基取代的聚乙二醇于60℃反應4小時，產物經分離純化干燥后，用400ml THF/DMF(3∶1)的混合溶劑溶解，再分別用50ml和100ml該混合溶劑溶解10克DCC和3克抗CD33單抗，將三種成分混合均勻后于0℃反應24小時，室溫反應24小時，分離純化后得產物，該產物為接枝了抗CD33單抗的聚乳酸。
實施例8取原料100克采用15％重量比的馬來酸酐改性的聚乳酸(MPLA)，溶解于400ml THF中，加入5克抗IV型膠原酶單抗3G11，于60℃反應4小時，分離純化后得產物，該產物為接枝了抗IV型膠原酶單抗3G11的聚乳酸。
上述馬來酸酐改性的聚乳酸(MPLA)采用專利01129046.X中涉及到產物。
發明效果證明參見圖1，采用生物素為反應原料，經過該發明方法，制備了生物素改性的聚乳酸。產物將多次分離純化后，用四氫呋喃(THF)溶解，采用FITC熒光素標記的抗生物素(也稱親和素，Sigma公司產品)標記(標記方法按該試劑盒的說明)，分離純化后，采用美國Perkin-Elmer公司的LS-50B熒光分光光度計測試生物素改性聚乳酸和有機二胺改性的聚乳酸的熒光發射光譜圖。從圖中可以看出生物素改性聚乳酸(1)在510nm左右有明顯的發射峰，它是FITC的特征發射峰，而在有機二胺改性的聚乳酸(2)上則不明顯。證明經過該發明方法，生物素已接枝到聚乳酸上。
權利要求
1.一種生物活性聚乳酸的制備方法，系在馬來酸酐改性聚乳酸的基礎上，采用以下步驟制備①直接加入有機二胺或二醇或羥胺或水進行反應；②產物經分離純化后，在有機交聯劑的作用下，加入生物活性物質反應，獲得生物活性聚乳酸產物。
2.根據權利要求1所述的生物活性聚乳酸的制備方法，其特征在于在步驟②中，產物經分離純化后，也可在有機交聯劑的作用下，先加入聚乙二醇或其衍生物反應；然后，③產物經分離純化后，在有機交聯劑的作用下，再加入生物活性物質反應，獲得生物活性聚乳酸產物。
3.如權利要求書1或2所述的制備方法中，其特征在于所述的生物活性物質選自生物活性多肽、寡聚糖、DNA片段或藥物。
4.如權利要求書1或2所述的制備方法中，其特征在于產物的分離純化方法為采用四氫呋喃溶劑溶解后，再加入水溶液中沉淀，收集沉淀物進行真空干燥。
5.如權利要求書1或2所述的制備方法中，其特征在于有機二胺或二醇或羥胺或水或聚乙二醇的加入量為改性聚乳酸中馬來酸酐摩爾用量的1～50％，反應溫度為0～100℃，時間為10分鐘～24小時。
6.如權利要求書1或2所述的制備方法中，其特征在于有機交聯劑可以為二元或多元的碳亞胺、異氰酸酯、環氧化合物、有機金屬化合物、酰亞胺、酯等。
7.如權利要求書1或2所述的制備方法中，其特征在于加入的生物活性物質的物質量為改性聚乳酸中馬來酸酐摩爾用量的1～50％，反應溫度為-20～60℃，時間為10分鐘～48小時，pH值范圍為5～9，反應過程根據使用的交聯劑種類，選擇其特征的催化劑。
8.如權利要求書1或2所述制備方法中得到的生物活性聚乳酸產品的結構式為 R為 或 其中R1為有機二胺或二醇或羥胺或水，R2為有機交聯劑，R3為聚乙二醇，L為生物活性物質；
9.按權利要求1所述的方法制備的生物活性聚乳酸的應用，其特征在于用作組織工程的支架材料、藥物緩釋的靶向載體材料或制作高分子化的藥物。
全文摘要
本發明提供了一種采用馬來酸酐改性的聚乳酸和生物活性物質為原料，制備生物活性聚乳酸材料的方法及其產物和應用，方法步驟①直接加入有機二胺或二醇或羥胺或水進行反應；②產物經分離純化后，在有機交聯劑的作用下，加入聚乙二醇(也稱聚環氧乙烷)或其衍生物反應；然后，③產物經分離純化后，在有機交聯劑的作用下，再加入生物活性物質反應，或在步驟②在有機交聯劑的作用下，直接加入生物活性物質反應，獲得生物活性聚乳酸產物。采用本方法，通過改變生物活性物質的種類，可制備具有不同生物活性的聚乳酸材料；也可通過本方法，選擇一些藥物為反應原料制備高分子藥物。這種生物活性聚乳酸可很好的用作組織工程支架、藥物靶向緩釋載體等。
文檔編號C08G63/00GK1556130SQ20031012103
公開日2004年12月22日 申請日期2003年12月31日 優先權日2003年12月31日
發明者潘君, 王遠亮, 潘 君 申請人:潘君, 潘 君