微生物培養和檢測的設備和方法

專利名稱:微生物培養和檢測的設備和方法
本發明是關于微生物培養和檢測的設備和方法，更具體地說是適用于活動細菌，例如沙門氏菌、凱普勒菌屬、李司忒氏菌屬、弧菌屬、氣單胞菌屬、埃希氏桿菌屬的菌種、菌株和血清型的裝置和方法。
上述這些活動細菌，由于其對人和動物的病原特性，在食品衛生，環境衛生和污染的監視，以及用作臨床試樣等方面，是特別重要的主體。
現有的方法，特別是對在食品試樣中沙門氏菌污染所用的檢測方法，既耗時又費力。
一種用于沙門氏細菌污染(如在食品試樣中)的標準的檢測方法，包括如下步驟(a)在225毫升含有如細菌學胨的“預濃縮”或“復蘇”(resuscitation)介質中分散25克食品或其它物料的試樣，培育多達一天的時間(如在37℃下，培育18-24小時);
(b)把原始培養液再培養在每一種由一種或多種不同形式(例如二種)構成的“選擇性濃縮介質”中，以抑制與存在的沙門氏菌有關的其它微生物的生長，通過培育使這些濃縮培養液生長，以得到可以顯示的沙門氏菌(如果存在);(最少的可顯示的菌的含量可以在很大范圍內變化，若不存在其它污染，則為大約每毫升1000個微生物，在有其它微生物嚴重污染的情況下，每毫升大約有一百萬以上的微生物或者更多);
(c)用所得的濃縮培養液，在一組選擇性不同的固體生長介質上接種，通常在瓊脂上接種，在皿上識別出沙門氏菌落(如果在初始的試樣中存在);
(d)對任意臨時識別為沙門氏菌的菌落至少進行生物化學和/或免疫學(凝集)檢測，以進一步證實或推翻這種識別。
整個過程大約一周。
近來，發展了一種改進的免疫學的檢測方法，它可取代標準方法中的步驟(c)和(d)，稍微縮短了整個時間。
現有技術中還有一種辦法，即通過一個選擇性的移動系統用以隔絕沙門氏菌(PFStuart和HPivnick(1965)，應用微生物學13(3)PP365-372)，這種技術是利用u形管中“半固體”膠體介質，在u形管的一側，接種后將得到細菌，在其另一側，在半固體膠體的表面用一取自預濃縮培養液的樣品作為接種體。
另一種依據待測微生物活動性的技術如美國專利USP 4563418(生物控制有限公司)所述，該專利描述了一種“活動免疫固定方法”(motilityimmunoimmobilisation)，用來檢測活動的微生物，如沙門氏菌。它還公開了一移動容器，其每端開孔，一個蓋子蓋在每端的開孔上，它包含一種膠凝的移動介質。采用這種系統時，在(容器)一端通過置入抗血清來固定與膠凝介質相接觸的沙門氏菌，在其另一端，置入含有趨藥性誘引劑(如L-絲氨酸)的選擇性濃縮介質和微生物接種體，所說的接種體來自先有的與膠體介質相接觸的選擇性濃縮培養液。培育之后陽性結果由靠近抗血清加入處的管子那端的一部分固定細菌來指示。
另外有關(包括移動濃縮的內容)沙門氏菌的檢測的回顧與說明最近已經出版，可見JM De Smedt，RF Bolderdijk，HFRappld和DLautenschlaeger(1986)《食品保護》，卷49(7)PP510-514，其中提到，轉移由預濃縮培養液得到的接種體，以便在含有Rappaport-Vassiliadis肉湯的半固體瓊脂表面上形成斑點經過24小時培育之后，在遷移后的細菌顯現生長的區域邊緣采集試樣，進行再培養，以檢測沙門氏菌的存在。
美國專利USP3704204(Armour和CO)描述了一用于沙門氏菌的快速檢測法，舉例為用一個位于介質表面上方大約1吋或半吋的用乙酸鉛飽和的棉墩，在營養基中培育肉骨樣品，營養基中含有選擇性抑制劑，如膽汁鹽，脫氧膽酸鹽，氧化鋰和吖啶衍生物(吖啶黃素)在經過24小時培育之后，棉墩發黑，這視為陽性(可疑)結果。據報導，采用這種方法，盡管沒有錯誤的陰性反應，但有許多錯的陽性反應。
雖經這些努力，但如何以簡便的方式，縮短活動細菌檢測所需的時間，特別是在較早的培養階段上，仍存在著問題。
本發明的目的之一，就是為活動細菌提供檢測裝置和方法，它能使由單個容器內的樣品培養液所獲得的檢測結果，具有較高的可靠性。
本發明的另一個目的，是提供簡便的活動細菌選擇性濃縮培養和檢測的裝置和方法，以簡化和/或減少操作者對樣品和培養液的處理。
一方面，本發明提供了一種選擇性培養活動細菌的方法，包括的步驟是(a)制備一種懷疑含有活動細菌的物料的細菌學培育樣品;
(b)將上述物料放入含有適宜于活動細菌復蘇和生長的液體營養基的培養容器中;
(c)提供一種載體，它部份地浸入上述的液體營養基中，并且凸出在上述液體營養基表面以上，上述載體含有支持營養介質，它們選自適合于活動細菌細菌學的選擇性生長和指示的介質，上述載體在上述的液體營養基表面以下有一個開孔，以使在上述容器中的液體介質和上述載體中的支持介質之間保持接觸，從而使得活動細菌在培養期間可以從上述的液體中遷移到上述的支持介質中。
(d)培育上述的試樣和上述的營養基，以使在上述液體介質中的試樣里存在的任何活動細菌生長，并且使活動細菌在培養期間遷移入上述的支持介質中，并在其中使活動細菌生長。
在幾個方法的實施例中，上述載體在上述液體營養基表面以上同樣有一個開孔，上述支持營養介質可有一轉移表面，以使在活動細菌遷移入支持介質、生長并通過以后，便于轉移含上述細菌的試樣。上述方法還可包括另一步驟，即在上述細菌生長之后，把它們從支持介質的轉移表面轉移入和轉移過上述支持介質。
另一方面，本發明提供了一種選擇性培養活動細菌的設備，它包括(a)一含有適合于活動細菌復蘇和生長的液體營養基的培養容器;
(b)一種載體，它部份地浸入上述液體營養基中，又凸出在上述液體營養基的表面上，上述載體含有支持性營養介質，它們選自適合于活動細菌細菌學的選擇性生長和指示的介質，上述載體在上述液體營養基表面以下有一個開孔，以便于在容器中的液體介質和在載體中的支持介質保持接觸，從而使得活動細菌在培養期間可從上述液體遷移入上述支持介質中。
這樣，本發明可以實現微生物，如活動細菌的培養、選擇、濃縮，在許多實施例中，還包括了檢測。發明可以利用已知類型的適合于待測的微生物復蘇和生長的液體介質，它包括用干組分經水或用適宜的基本介質再水化以形成這種介質。類似地，也可以利用已知類型的適合于待測的微生物選擇的支持性選擇濃縮介質和/或適合于待測的微生物指示其存在和生長的指示劑，以及其它改進形式，還包括干制劑，它經水或用適宜的基本介質再水化后，即形成這種支持介質。
本發明還提供了一些支持介質載體，它們具有如下所述的特征，用在下面所述的培養步驟中。
在采用本發明時，培養容器和支持介質應這樣設置，使得選擇性濃縮和/或指示介質在與復蘇和生長介質相接觸的一個區域或容器中，從而在使用時，待測微生物在培養過程中，可以生長或選先移入濃縮介質，不要求通過人工接種轉移。
在本說明書中，“支持介質”的含意是指一種與膠體或固體原料相伴(如分散)的液體生長介質，這種介質達到了這種程度，即它基本上不存在對流，但不能阻止活動微生物在其內的遷移，也不能阻止(在合適的情況下)非活動微生物生長通過。這種條件是能夠提供的，例如通過含有凝固劑的介質，或依靠一種由固體網狀物或骨架支撐的液體介質，達到基本沒有對流的程度。非限制性的支持介質的實例如稀薄的明膠材料如“Sloppy”膠體，它是一種公知的用于濃縮活動細菌的材料，又如纖維狀的傳導材料，例如過濾紙、尼龍或聚酰胺或聚酯過濾器，特別如褶形過濾器，它具有很狹窄的含有液體或半固體膠體的軸向通道，在該通道內，微生物可以生長，或者微生物因它們自身的活動特性能夠遷移，或一種多孔聚合物過濾器。
人們知道，選擇性介質和濃縮介質可用作為培養基，它含有選擇性的抑制劑，用以阻止或減少除待測微生物外的大部分其他微生物的生長，最差的情況是只有輕微的抑制，而較優選的是對所需微生物的生長呈中性或起刺激作用。這種試劑的實例和其劑量在現有技術中已屬公知，不屬于本發明的內容。在存在沙門氏菌的情況下，已知的選擇性試劑包括膽汁鹽，吖啶衍生物和如下文說明的其他特定介質組分，如，染料如鉆石綠。
本發明所用的液體復蘇/生長介質可以不含選擇性抑制劑。對于沙門氏菌檢測，用選擇性抑制劑如孔雀綠是有益的。在大多數情況下，復蘇/生長介質應不含趨藥性誘引劑，從而如果需要，可有效地在支持介質中包含公知的趨藥性誘引劑，例如L-絲氨酸，以增強活動微生物從液體復蘇介質(自動)轉移入支持性選擇介質和/或指示介質的能力。
本發明能夠使加到培養裝置的食品或其它試樣，在一個培育階段后，得到一種待測微生物(如果存在)的濃縮培養液。
本發明的優點之一是它提供了一種培養裝置，它能在與食品樣品接種的單個培養裝置內，獲得適當稠密的和濃縮的活動細菌(如沙門氏菌)菌種的培養液。
按照本發明，還提供了一種用于微生物例如細菌，特別是活動細菌的選擇性濃縮培養方法，包括把懷疑含有上述微生物的浸軟食品或其它試樣接種到適合待測微生物復蘇和生長的液體介質中，然后使上述微生物(如果存在)在上述的液體介質中復蘇和生長，其中上述的液體介質培育時又與上述微生物的支持選擇性濃縮介質相接觸，從而使得任何上述微生物(如果存在)在培育期間能生長和遷移入選擇性介質中，在上述培育結束后，得到上述微生物(如果上述樣品中存在)的濃縮培養液。
按照本發明，還提供了用于如上所述的選擇性濃縮培養的物料，物料包括一系列成品試劑和包含干試劑的載體，載體用水或基本介質再水化，得到如上所述載有支持介質的裝置和插入件。這些物料最好被分布在密封的干燥無菌袋中，使用時啟封并再水化。
根據本發明裝置的一個實施例，半固體或者其他支持選擇性濃縮和/或指示介質，被支持在第二個容器，或培養容器的第二區域中，使得在選擇性濃縮介質和/或指示介質中的濃縮培養試樣，在培養周期結束時，可以方便地取出。
在第二容器中的選擇濃縮介質和/或指示介質，如果需要，可以通過一支持隔板與第一容器的液體介質分開，所說的隔板例如篩網、過濾器或多孔膜，或者其它能使活動細菌通過的隔板。適宜的孔徑至少大約5-10微米-大孔是容許的和有利的。適宜的多孔聚合物材料例如由Porex工業技術公司出售的“Porex”牌(商標)，目前這種材料優選的是“Porex”Cat·X4898高級親水DBS多孔聚合物，孔的尺寸15-45微米，板厚1/8吋，并切割成適當大小的園盤。
在一種簡便的實施例中，液體介質有一個區域同半固體選擇濃縮介質或指示介質相接觸，通過在半固體濃縮介質中所含膠體輕微的脫水收縮作用獲得一方便的取樣點，從而能夠經由第二容器或第二容器區域取樣孔取樣。它能以液體形式引出濃縮培養試樣，可優選用在半固體培養液的取樣上。
如果需要，按照本發明的設備能提供二個以上的培養介質區域，串聯設置，從而使得活動細菌在從液體介質的接種區域遷移到取樣點時，必須跨過二個以上的培養介質區域。這種設置能集合在一起，例如采用一個含有支持選擇性濃縮和/或指示介質的第二管。這種管可在它的頂部和底部開孔，浸入液體復蘇培養介質中，在管的下端，使液體介質同在管內的支持介質之間經由大孔膜或者過濾器或其它可被微生物穿過的隔板實現液相接觸，并含有一系列濃縮介質的膠體或其它支持層，其中設有一取樣點，它同管子上部開孔或其他簡便的取樣點相鄰近。
按照本發明，裝置可這樣使用(a)把一懷疑含有活動細菌的樣品接種到液體培養介質區域中，但不能到濃縮介質區域，(這可以這樣做到例如通過把樣品粉碎或分散到液體培養介質中)(b)培育培養介質以使活動細菌(如果存在)繁殖并遷移入濃縮介質區域，(c)從一個或其中之一個濃縮介質區域取樣，取出含有活動細菌(如果在接種體內存在)的濃縮培養液樣品。
按照本發明設備的另一個實施例，它包括二個或二個以上并聯設置的半固體或支持選擇和/或指示介質的區域，從而使得微生物，如待測的活動細菌，可從液體介質的接種區域生長或遷移入每一個平行的區域，每個區域含一種或多種半固體或支持選擇和/或指示介質。這可如下實現，例如將第二管浸入液體培養介質，在液體介質和支持介質之間經由大孔膜、過濾器和其它隔板在每個管下端保持接觸，另設置一個取樣點，它和每個管上部開孔相鄰。
這些實施例帶來的優點是，在單個培養容器中，可以同時載有適合于活動細菌的二種或二種以上的選擇濃縮介質和/或指示介質，在許多情況下，經過初始接種后，就不再需要人工處理。
然后，濃縮培養的樣品，可用適當的方法，來檢測微生物如活動細菌的存在。這些方法例如微生物培養、生物化學、免疫學或者顯微檢測方法。
本發明優選的材料及其相應的設備包括一個管狀載體，管狀載體二端的每一端均開孔，裝載支持選擇性濃縮介質，或者經再水化后可形成上述介質的干物質。不論支持介質是呈膠體或液體形式，都可依靠適宜的多孔擋板把它們截留在管狀載體內，以使微生物可以通過。當為液體介質時，擋板可以是紙或塑料材料的緊密褶形過濾器，這種過濾器有非常狹窄的軸向通道，可基本上阻止對流，但可使待測的微生物生長或移動通過。現已發現，可以使用如過濾嘴香煙的濾嘴那樣的普通褶形過濾器。
管狀載體較方便地是采用圓柱體，但這不是主要的，也能采用其它斷面形狀。管狀載體包括任意的頂部或底部開孔，或頂部與其它設備材料相通的形式，活動細菌可在載體內遷移，以用于進一步檢測。在一個合適的實施例中，管狀材料是不透水的塑料制品，包含有一個或一組相類似的或不同的選擇性濃縮區域，或選用對待測微生物有鑒別性的介質區域，串聯設置，從而使微生物培養液必須從管狀載體的一端，依次穿過每一個區域而到達另一端。
優選地，管狀載體在其遠離用作與復蘇介質相接觸的開孔端的另一開孔端處，載有游離液體或多孔材料，通過該端，游離液體樣品可以很容易提取出來，作為濃縮培養液試樣，用于附加的鑒別或培養步驟(如果需要)中(例如可通過擠壓試管)。如果在管狀載體中有一種以上支持介質，則為一個或多個其頂部不通孔的隔室提供一個通道是有用的，該通道可釋放如代謝氣體或再水化時的空氣。
以下將非限制性地舉例說明目前較優選的，用于本文所述設備的介質(a)介質1(用作在培育管中沙門氏菌的復蘇和生長的適宜的介質)，由足夠量的等分的干粉構成，它們在吸收無菌水后，可得225毫升如下的組合物酪蛋白胰酶解胨(Oxoid L42)10克/升;氯化鈉5克/升;磷酸氫二鈉3.5克/升;孔雀綠(Merck細菌學級)40毫克/升，形成這種介質后，pH值約7.2。
介質1優選用作檢測這樣的樣品，即它們被懷疑除了與沙門氏菌有關外，很少或沒有被其它微生物污染。如它可用于牛奶和雞蛋產品如奶粉和蛋粉的檢測。
一種選用的介質1a另含40毫克/升新生霉素和4克/升(無抗菌素)脫脂奶粉。在另一該選用介質的改進型中，主要從清晰度考慮，用3.0克/升酪蛋白代替奶粉。這種選用的介質優選用于懷疑有大量的非沙門氏菌污染的產品，如肉類產品中。
(b)介質2(LID)(適合于活動沙門氏菌的生長和傳遞的選擇性支持介質和指示劑)為一種干粉組合物，經再水化后可得到一種高粘性的含下列組分的介質，稱為“Wet”濕含量(克/升)細菌學胨(Oxoid L37) 10酵母提取液(Oxoid L21) 6葡萄糖 2L-賴氨酸 20檸檬酸鐵銨 1硫代硫酸鈉 0.08藻酸鈉(工業藻酸鹽/Kelco藻酸鈉二甲基甲酰胺)(或者-優選地-用3.75克/升黃原酸樹膠代替藻酸鹽)10
濕含量(克/升)L-絲氨酸 1脫氧膽鈉 5-(最終pH值為6.7)介質2可以干粉形式等分配入載體管下部腔室。
現有的一種優選的介質2(LID)的改進型，是用3.75克/升黃原酸樹膠(Xanthan gum)和1.25克/升乳糖代替藻酸鈉。
(c)介質3(改進的RV基于Rappaport-Vassiliadis介質)是選用的適合于活動的沙門氏菌的，帶指示劑的選擇性支持介質。它含有適當的干粉，再水化后得到高粘度的下列組分的介質、稱為“Wet”濕含量(克/升)大豆胨，中性的(Oxoid L44) 5氯化鈉 8磷酸二氫鉀 1.6氯化鎂(無水) 18.7藻酸鈉(工業藻酸鈉/Kelco藻酸鈉二甲基甲酰胺) 12.5絲氨酸 1孔雀綠(細菌學級) 0.04-(最終pH值約為5.2)介質3同樣可望用于管狀載體的下部腔室。
(d)介質4(BGD)(鉆石綠脫氧膽指示介質)
濕含量(克/升)凝乳酶粉(Oxoid) 5細菌學胨(Oxoid) 10酵母提取液(Oxoid L21) 3乳糖 10蔗糖 10磷酸氫二鈉 1磷酸二氫鈉 0.6酚紅 0.09鉆石綠 0.0047L-絲氨酸 1脫氧膽酸鈉 5藻酸鈉(藻酸鈉二甲基甲酰胺)(或者-優選地-用3.75克/升黃原酸樹膠代替藻酸鹽)10-(最終pH值約6.9)介質4可望用于管狀載體的上部。
(e)介質5(LICNR)(賴氨酸鐵胱氨酸中性紅指示介質)濕含量(克/升)L-單氫氯化賴氨酸 8L-二氫氯化賴氨酸 2胰酶解胨(Oxoid L42) 5酵母提取液(Oxoid L21) 3乳糖 5葡萄糖 1水楊苷 1
濕含量(克/升)檸檬酸鐵胺 0.5硫代硫酸鈉 0.1L-胱氨酸 0.1L-絲氨酸 1藻酸鈉(藻酸鈉二甲基甲酰胺) 7.5-10中性紅 0.025-(最終pH值約6.2)這種介質也可望用于在管狀載體的上部。
在使用這些介質的一種有效的方式中，第一選擇指示管含有二個隔室，在下隔室中有介質LID，在上隔室中有介質BGD。第二個選擇指示管和第一個平行設置，具有類似的結構，在其下隔室中，有改性的RV介質，在上隔室中有LICNR介質。
通常，這些介質的實施例的共性特征是一種或多種選擇/指示介質被(較弱地)凝固，并含有一種趨藥性的有效量的絲氨酸或者其它細菌學趨藥性的誘引劑，而復蘇/生長介質是液體，不含任何附加的絲氨酸或其它誘引劑。
本發明的實施例將參照附圖作進一步的描述，而本發明并不僅僅限于這些實例。
提供的附圖如下(不按比例)圖1，2，3，4，5是按照本發明的優選的實施例。
圖1是按照本發明的實施例之細菌學檢測裝置單元系統的透視圖。
圖2是圖1系統檢測裝置的局部透視圖。
圖3是圖2裝置水平剖視的平面圖。
圖4是圖2裝置側視圖，圖5是如圖1所示的管狀載體的結構示意圖。
圖6是按照本發明一個選擇性實施例的培養設備剖視圖。圖7是另一個選擇性培養設備的正視圖。
圖8是內含有待再水化的干燥的圓柱形支承體的無菌密封袋的剖面圖，它可成為圖6或圖7所示設備的一部分。
圖9和10是大致如前各圖所示的安裝在一浮動架中的管狀載體的透視圖和垂直剖視圖。
圖11是用于所述的培養方法的改進的管狀載體的實施例之透視圖。
除有特別指出者外，本說明書所涉及的培養介質及其組分均記載在Oxoid指南(Oxoid有限公司出版，Wade Road，Basingstoke，Hampshire，RG24OPW，UK(1982年第5版)和它修訂的附錄中。
參照圖1，一呈金屬線框狀的托架1，支持檢測裝置2，檢測裝置2有一個頂蓋，外表面由熱成型塑料構成，托架1可以支持像檢測裝置2那樣的一組裝置，在本例中為一排。
圖2表示如圖1的檢測裝置2的局部透視圖。檢測裝置2包括一個熱成型塑料盆體3，它包括整體折緣4和一個內部可移動的塑料蓋5，塑料蓋5位于在盆體3中的凸緣6上，凸緣6用來支持蓋5。在本實施例中，塑料體3具有基本上透明的側壁，事實上，塑料體3全部是由基本上透明的塑料材料構成。裝置體3的下部7(在蓋5和凸緣6以下)作為以下所描述的微生物生長介質和檢測樣品的培育室，在一種有效的構形中，裝置2的尺寸能在蓋5以下容納大約250毫升的液體和樣品(同封頭容積一起)。
在裝置體3的側壁內設置定位槽8，接受和容納支持微生物介質的載體。圖2表示有4個定位槽8，這些槽8采用半圓形凹槽形狀，用來支持和接受像圖2所示載體9那樣的管狀載體。管狀載體9配置在圖2裝置內，通過盆體3撓性的側壁內的定位槽8和像內蓋5中凹槽10那樣的半圓形凹槽的聯合作用而固定。盆體3和蓋5由于輕微可撓，故可比較容易地插入和移動像9那樣的管狀載體，在每個盆體3里最多能容納4個載體。
盆體3，折緣4，內蓋5詳細的結構如圖3，4所示。
管狀載體9的結構如圖5所示。
每個管狀載體9(例如聚苯乙烯制成，有些可撓性)有一個敞開的頂部和敞開底部11，至少有2個多孔隔板12，13(如在本文描述的由Porex DBS親水多孔聚合物板)將其內部分隔成一組隔室14，15。最上部的隔室15可以敞開或用另一個多孔隔板蓋上。當然這些隔板被設置成能使載體按本文所述方式使用，即當它們被浸入液體介質時，液體介質能同在載體內含有的介質相接觸。為了這個目的，低部隔板通常設置在管子底部或者靠近管子底部。
聚苯乙烯管9和它的配件的合適尺寸如下內徑約9mm下室容量(例如用于選擇性介質)約1毫升，高度和上部介質容量約8mm和0.6毫升，管子全高約65mm。
每個上述的隔室內容納的是對活動細菌有選擇性的和/或能指示其中活動細菌的生長的培養介質。
合適的介質如上文所述。絲氨酸是一種特別有效的介質組分，因為它使介質對某些活動細菌，如沙門氏菌和埃希氏桿菌屬表現為趨藥性誘引。
作隔板的材料可用Porex技術有限公司的Porex(商標)多孔聚合物，特別是用大約1/8吋厚的親水性的DBS聚合物板，切割成約1-3毫米，優選大于2毫米厚的圓盤。在使用干介質并由與水相接觸再水化時，最好在聚合物圓盤的下側提供一層薄薄的憎水材料涂層(例如“Repelcote”商標)。介質以干粉形態裝入隔室里，經再水化后形成凝膠。現已發現，在某些特定情況下，上述介質中的乳糖和藻酸組分(或如目前優選的黃原酸和乳糖組分)，與多孔圓盤憎水的下表面一起，促進了水平滑地向上移動，從而得到連續的膠體介質，介質經管子內的充滿含水液體的多孔隔板相互聯結。
管子通常由干粉介質組分構成并且是無菌密封的，例如采用X射線照射鋪箔密封。
設備可按下述使用。
培育用的樣品的制備可方便地這樣實現借助于-Stomacher(商標)均化裝置(Seward，Surgical，VAC House，Blackfriars Road，倫敦SEI)(或其它如USP，3819158/GB1402538描述)，把樣品分散到介質中。
使用的試樣和介質的合適比例大約為25克比225毫升。(然而，在各種情況下，若使用大量的物料，把幾種(如多到10種)樣品組合和混合在一起，又如每種試樣各25克，作為單個的有效試樣，按本文所述方法檢測，也在本發明的范圍之內。當然，如果這一組合試樣結果為陽性，則對每一種樣品來源便均有懷疑，故需作進一步的檢測)。
試樣和液體營養基，可與一種或多種含有如上描述的合適介質的管狀載體一起，放進培養容器中，支持介質同在培養容器中的介質相接觸。管狀載體最好這樣放置;使它們的下端浸沒在液體營養基液面以下，而它們的上端凸出在液面以上。
在培育之后，例如在37℃，或高達41.5℃，經過18-24小時，或按需要可延長至長達48小時，沙門氏菌的存在可通過如下途徑指示如含有賴氨酸鐵肉湯的任意區域黑化，和/或鉆石綠指示劑肉湯顏色變紅，或如在所選用的指示劑介質(如本文所選用的)的情況下，已知的相對應的顏色變化。
如果因證實培養和/或檢測需要，濃縮的沙門氏菌培養試樣可從開口的頂9移出，如果必要，可輕微地擠壓含有支持介質的撓性管以從凝膠或其它形式的支持介質擠出培養液。如果需要，培養裝置可以延長培育。
在一合適的培養周期之后，如果需要，可以移出在管狀載體中支持介質上表面處的適宜的液體試樣液滴，以作為活動細菌的濃縮試樣。通常，當設立了一組培養容器來檢測多個樣品時，只是在那些指示劑陽性反應的試樣才有必要移出樣品進行進一步的測定。為進一步檢測，采用某些裝置，使它與含有選擇性/指示介質管狀載體頂部相通，這些也是在本發明所包括的范圍之內。
參照圖6，它表示一種選用的裝置，包括一個培養瓶1，在培養瓶1內含有細菌學胨-水介質2作為復蘇和生長介質，在復蘇和生長介質內含分散的一定量的要檢測微生物的食品和其它物料。該例是用于檢測沙門氏菌污染的試樣，在這種情況下，試樣的制備和培養如圖1-5所述。
培養瓶1還包括一個載體插入件3，插入件3提供一個由瓶1形成的培養容器的第二區域，第二區域被固定到培養容器有關的瓶口上，在這個實施例中，插入件3載有一種或多種選擇濃縮和/或指示介質，它對呈被支持形態的沙門氏菌有選擇性，即微生物可以遷移入載體插入件3和其中的介質，并能通過其中的營養基被選擇性濃縮和/或指示。與此同時，其它微生物的通過或生長則受到限制。
載體插入件3包括一個撓性的不透水的塑料管4，懸掛和安裝于培養瓶1的瓶頸5上，用一個多孔的細菌柱塞6封住，管4有敞開的頂部和底端，同時在該實施例中，在液面以上有一組側向孔以允許空氣排出。
在管4內有三個介質區，每個區通過一種緊密的褶形過濾器支持，這種濾器類似于過濾咀香煙的濾咀形式。褶形過濾器有軸向的狹窄通道，它基本上與管4軸線相平行。三個褶形過濾器7，8，9的每一個在管4內形成一個支持柱塞。過濾器互相靠在一起或幾乎靠在一起。過濾器7，9如下所述是用介質浸漬的紙過濾器。過濾器8是紙的或者塑料材料的，它所含有的液體，是在管4部件裝備有用水或用營養基從干燥的浸漬狀態經再水化的過濾器7，8，9時，在其內部所流動的介質組分。
在該例中，柱塞7可用組分從其干料浸漬態再水化形成賴氨酸鐵肉湯(通常包括在這種肉湯中的瓊脂，黃原酸或者其他凝固組分可以存在，也可以不要)。柱塞9可用組分從其干料再水化，得到鉆石綠指示劑肉湯。凝固組分可以存在，也可以不要。
管4和在其中的過濾器柱塞7，8，9在使用之前可通過在無菌蒸餾水中浸濕5分鐘而再水化。然后無菌轉移并插入到圖1所示的瓶1的位置。
采用本裝置后，與采用了本發明的其他裝置和方法的例子一樣，意味著當有一系列可疑的樣品時，一組顯示陽性反應的瓶(可能較少所需要的再培養或附加檢測操作可以減少。該裝置像許多本發明的選用形式那樣，同樣可快速地獲得培養檢測結果。
參照圖7(不按比例)，除了如下所述者外，與圖1所示設置類似。
在瓶1的適當位置有一個撓性塑料袋21，主要由二層在它們的邊緣22處熱封而成，袋中含有適合于微生物的復蘇和生長的培養介質。折邊23蓋在由袋的后片和前片23a的上邊緣形成的孔上。在使用中，通過二個掛鉤24，25以及一在二個掛鉤之間延伸的剛性支座把袋掛住。一個熱封接縫26把袋分成主隔室和安放及支持不能透液的撓性塑料管4的側袋27，4的頂部和底部是敞開的，用以支持基本如圖6所述的選擇性濃縮和/或指示介質。對于培養介質，側袋27在下部與主隔室相通，由于接縫26沒有完全延伸到袋底，培養介質表面如圖示28。
管4及其所含物料，除了它包括5個柱塞之外，類似于圖6所述。柱塞是由壓緊的褶形過濾材料構成的。
最下部的柱塞用組分從其干浸漬制劑再水化，以得到加倍的賴氨酸鐵肉湯(不包括必要的凝固組分)，這樣，即使一部分肉湯被濾到大量的生長和復蘇介質中，仍可獲得足夠的顏色反應。中部柱塞含有的組分可得到原量的賴氨酸鐵肉湯，最上部柱塞含有(在再水化之前)的組分能得到鉆石綠指示劑肉湯。在一種適合的實施例中，五個柱塞的總長度大約是2吋，而它們的直徑大約是1/4吋。
該裝置的使用如圖7所示，在細節上可以作必要修改。
參照圖8，它表示本發明實施例的一種無菌密封的干燥容器。該容器是由一種塑料外殼31構成，包含有脫水材料構成的管4，管內含如上所述的支持介質。干燥的柱塞(例如紙)在其成褶和壓緊之前的制備為根據柱塞材料的要求，干燥一定量的可形成如上介質的物料。例如在60℃的真空中。這種材料在干燥、成褶、裝填于管4中，密封在外殼31內之后，可用伽瑪射線以0.5Mrade(KGrays)照射進行滅菌處理。如果要求的話，在每個外殼31中能夠裝填多個插入件，如果適宜，同時可放入一定量的干燥劑。
圖6-8所述管狀插入件的一種較重要的變化形式是可采用以明膠支持的由多孔，如圖1-5所述的大孔隔板限制的半固體介質。它們可按照圖8描述的那樣干燥裝填。
一種適宜的插入件(在附圖中沒有表示)，含有凝膠物質，其組分為Oxoid(商標)的含有膽脂酸鈉(0.2克%)，脫氫膽脂酸鈉(0.6克%)，新生霉素(0.04克%)和黃原酸(0.4克%)的硫化鉍肉湯。這種混合物可選擇性培養沙門氏菌，在陽性結果下變黑。明膠依靠固定在管子下端斷面上的多孔膜過濾器截留在管內。當然這種膜也可以用在褶形過濾器支持的實施例中。
在這種情況中的用于沙門氏菌又一選用的實施例為，一種裝置，它含有呈凝膠狀態的選擇性濃縮介質，能同復蘇和生長介質液相接觸，包括一個敞開的熱成型塑料管，在它下部開口處直徑大約1吋，在它頂端開口處，直徑逐漸變狹窄，大約1/4吋，整個高度大約1吋。
底部開孔邊緣用粘合劑通過細密的尼龍篩網膜密封。用于該例和另外的實例的適宜篩網孔徑是10微米，每厘米190目，由42微米直徑的尼龍線編織而成的篩網，篩網透水率是80升/平方米/秒。(這種篩網可以商購，為Simonyl HD10商標)。該裝置可被支撐或浮動在復蘇/生長介質表面上，它包含有如前所述的選擇性濃縮介質。上部孔可被用作取樣點。
在圖9和圖10中表示的是另外一些把管狀載體放入如前所述的復蘇培養介質中適當位置的布置。在圖9和圖10布置中，二個管狀載體91，(基本上如前述各圖所示)，作為一可移動推力件，裝配入浮動架92上的孔中。架92包括一個平臺93，平臺上有孔用來插入管91，優選平臺93的材料是白色的塑料板(剛性)，以便很容易地觀察在管91內的介質狀況。固定在平臺93周圍和下方的是充滿空氣或泡沫或其它浮動材料的浮動裙座94。如果裙座依靠空氣浮動則為氣密式。每個載體管包含一個由多孔親水聚合物制成的下隔板(95)和上隔板(96)，下部為選擇性支持介質97，上部為指示劑支持介質98。在培養周期結束時，試樣能從上部介質的上表面99移出。
在使用當中，在管子中介質能夠通過與水接觸再水化，管子用推力將其裝配進浮動平臺93的孔中。然后，該裝置在檢測和培育時，浮動在與樣品接種的復蘇介質中。這種布置使得可以很大地改變培養容器的外形和尺寸，以適應各種規模的復蘇培養。
一種改進的用于本發明所述的培養方法的管狀載體的實施例如圖11所示。一種注射模成型塑料管111設有如上所述的多孔親水聚合物制成的下隔板112和上隔板113，形成下隔室114和上隔室115。在使用中，上述隔室114和115分別含有選擇性和指示介質。通常如前所述，管狀載體在114和115中含有干組分，無菌密封包裝分布。下隔室114與上方的隔板113相連，另與管111的壁內所形成的側孔116-117相通。側孔116-117向上延伸越過隔室115，并且再開孔進入管111的主孔道，形成隔室114的通道。管的通道在使用之前是閉塞的，這是由在隔室115以上活塞118同管111密合實現的。按照這個實施例，通過手柄119向上移動活塞118，使再水化的水能夠通過下隔板112快速抽上，以水化在114和115中的凝膠介質。活塞18在使用之后，完全抽出并棄之。所形成的經再水化的管狀載體能與如上所述的簡單的管狀載體相類似的方法采用，而通常，是簡單地將載體浸入水中實現再水化。按照本發明的這種布置，能夠快速地建立濃縮培養。在使用中，通道116-117因能排泄代謝氣體，改善了微生物從下部到上部隔室轉移的穩定性。
其它的微生物，只要用適當的替代介質，按照本發明所指出的使用支持濃縮和/或指示介質與復蘇/生長介質保持接觸的辦法，也可以在培養中復蘇和濃縮。例如彎曲桿菌屬，可利用在圖6和圖8中表示的較新型的插入件柱塞7，其中含有“普雷斯頓”選擇性介質組分(如果需要可以省去瓊脂，或者由另一選用的凝固劑例如含有乳糖的黃原酸取代)以及柱塞9，其中含有一種適宜的已知指示介質，進行濃縮和檢測。
對復蘇/生長介質可作的一種有效的改進是加入少量的消泡劑，如在225毫升介質中加入0.2毫升的戊醇。
雖然不是必需，但在本發明的范圍內，也可以分出一部分接種有樣品如經過一段時間培育的復蘇/生長介質，并僅用整個培養液的一部分與支持生長介質接觸。這樣，權利要求
1中的步驟(C)或可在分離出一部分培養液之后進行，然后使剩余物與支持介質接觸，以便進行與之接觸的進一步的培育和培養。步驟(D)可以修正以僅培育一部分的培養液，該培養液由樣品和復蘇/生長介質培育而得，從而使得活動細菌可以遷移入支持介質中。在該方法的改進型中，盡管不是必需，但可以用進一部的介質來稀釋所分離出的那部分復蘇/生長介質培養液。
目前，本發明人優選的用于沙門氏菌檢測的支持介質，是如上所述的在一個管中的改進的RV介質(下部-直接與復蘇/生長培養液接觸)和LICNR介質(上部-與RV介質接觸)的混合。如果需要，管子的下部可以被掩蓋住以使管子上部的指示反應更加醒目。
在采用圖11的改進柱塞的方法以再水化支持介質管的場合，就不需要再用上述在其他情況下有幫助的“防護涂覆”而成的防水涂層。再者，若在管狀載體中的支持介質已被再水化，如用無菌水再水化，則有時劇烈攪拌它們將有幫助，如用“Whirlimxer”(商標)攪拌。
若把一組或多個類似管4的插入件及其所含的物料或其它選擇性濃縮介質，插入一單個的接種有待測樣品的復蘇和生長介質的試樣中，也屬于本發明的范圍。
按這種辦法，幾種可能的微生物能夠同時例如在一個瓶中進行檢測。
本發明容許專業人員在顯而易見的地方作許多的改進和變化，現在所公開的內容，還包括本發明說明書、附圖和權利要求
中描述的各個特征的組合及其二次組合。
權利要求
1.一種用于選擇性地培養活動細菌的方法，包括如下步驟(a).制備一種懷疑含有活動細菌的物料之細菌學培育樣品；(b).把上述物料放入含有適合于活動細菌復蘇和生長的液體營養基的培養容器中；(c).提供至少一種載體，它部分浸入上述的液體營養基中，但凸出于上述液體營養基表面以上，上述載體內含有由適宜介質得來的支持營養基，所說的適宜介質適合于活動細菌的細菌學選擇生長和指示，上述載體在上述液體營養基表面以下有一個開孔，以使在上述容器中的液體介質與由上述載體載有的支持介質保持接觸，從而使得在培養期間上述的活動細菌可從上述的液體遷移入上述的支持介質中；(d).培育上述樣品和上述的營養基，使得在上述液體介質中的上述試樣里存在的任何活動細菌生長，在培養期間上述活動細菌遷移入上述的支持介質中，并在其中使上述活動細菌生長。
2.按照權利要求
1的方法，其特征是上述載體在上述營養基的表面以上還有一個開孔，上述支持營養基有一個轉移表面以用于上述細菌在它們遷移入上述的支持介質、生長和移出之后試樣的轉移，上述的方法還包括把上述活動細菌在生長之后，從上述支持介質的轉移表面，轉移入和轉移通過上述的支持介質。
3.按照權利要求
1的方法，其特征是采用一至少有二種支持介質串聯的載體，第一種支持介質同上述的液體介質相接觸，使第二種支持介質同第一種支持介質相接觸，從而使得活動細菌在培養期間，可從液體介質連續地遷移通過上述的第一和第二支持介質。
4.按照權利要求
3的方法，其特征是采用一種載體，它含有與上述液體相接觸的，適合于待培養細菌的選擇性支持介質，并含有與上述選擇性介質相串聯接觸的，適合于待培養細菌的指示介質。
5.按照權利要求
4的方法，其特征是采用選擇從凝膠賴氨酸-鐵介質和改進的凝膠Rappaport-Vassiliadis介質得來的選擇性介質，選擇從鉆石綠脫氧膽介質和賴氨酸-鐵-胱氨酸中性紅介質得來的指示介質，以適用于選擇性濃縮培養和指示沙門氏菌。
6.按照權利要求
1的方法，其特征是采用一種以上載體，每種載體都載有支持選擇性和/或指示介質，它與上述的液體營養基相接觸。
7.用于選擇性地培養活動細菌的設備，包括(a).一含有液體營養基的培養容器，以用于活動細菌的復蘇和生長;(b).一載體，它部分浸入上述的液體營養基中并凸出于上述液體營養基的表面以上，上述載體含有從適宜的介質得來的支持營養基，適宜的介質是指適合于細菌學地選擇性生長和指示活動細菌的介質，上述載體在液體營養基的表面以下有一個開孔，以用于在上述容器中液體介質和在上述載體中的支持介質之間保持接觸，從而使上述活動細菌在培養期間從上述液體遷移進入上述的支持介質。
8.按照權利要求
7的設備，其特征是上述載體包括由多孔支持物或打孔隔板隔開的二個隔室，上述的二個隔室含有第一種和第二種選擇性和/或指示介質。
9.按照權利要求
8的設備，其特征是上述的隔板包括孔的尺寸大于10微米的多孔聚合物，以使活動細菌可從其中通過。
10.按照權利要求
7的設備，其特征是介質是一種凝膠介質。
11.按照權利要求
10的設備，其特征是上述介質呈無菌密封包裝的干組分形式，它可經再水化形成適合于培養的介質狀態。
12.按照權利要求
7的設備，其特征是上述的培養容器包括選自支座、固定件和浮臺的裝置，以便固定上述的載體，從而在使用中使載體部分地浸入上述的液體培養介質中。
13.按照權利要求
9和11的設備，其特征是上述的載體是管狀，有一個活動的注射活塞，可在管內抽上含水液體用以上述干組分的再水化，在管上有一個通道，用以在培養期間釋放出上述第一隔室(底部)的氣體。
14.一種細菌學的載體，包含有至少一種適合于活動細菌選擇性濃縮培養的營養物料，上述的載體包括一個管，有一個第一開孔和與第一開孔隔開的第二開孔，所含的物料在與上述的第一開孔相鄰處形成一支持介質，上述的介質選自適合于活動細菌細菌學的選擇性生長和指示的介質，上述的管和支持介質以這樣設置，使得上述的載體能夠部分地浸入液體營養基中，并且凸出在上述液體營養基的表面以上，液體營養基同載體內的支持介質保持接觸，從而使得活動細菌在上述細菌的培養期間，可從上述的液體遷移進入上述的支持介質中。
15.按照權利要求
14的一種細菌學載體，其特征是上述的支持介質是與多孔的或打孔隔板保持接觸的支持介質，所述的隔板鄰近上述的第一開孔。
16.按照權利要求
15的一種細菌學載體，它包含至少二種支持介質物料，每一種選自適合于活動細菌細菌學地選擇性生長和指示的介質，第一種上述介質是與上述的第一開孔相鄰的多孔的或者打孔隔板保持接觸的支持介質，第二種上述介質是一種與位于第一種介質和第二開孔之間的第二多孔或打孔隔板保持接觸的支持介質。
17.用于活動微生物選擇性濃縮培養和檢測的方法和設備，其特征是由說明書，附圖和權利要求
的幾個特征中的一個或多個特征。
專利摘要
用于選擇性地培養活動細菌，例如沙門氏菌、凱普勒菌屬的方法，步驟如下
文檔編號C12M1/28GK87106707SQ87106707
公開日1988年5月11日 申請日期1987年8月28日
發明者羅伊·霍爾布魯克 申請人:尤尼利弗公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan