專利名稱:利用淀粉葡萄糖苷酶和游動酵單細菌將經預處理并液化的淀粉轉化成乙醇的制作方法
本發明涉及一種利用高效的游動酵單胞菌種，在微需氧的條件下將預處理液化的淀粉轉化成乙醇的方法。
生產乙醇的傳統方法是采用兩級間歇發酵工藝，其中，前酵包括稱之為生長階段的酵母需氧繁殖，后酵包括在存有或不存有少量氧時乙醇生產的厭氧處理。在乙醇生產的后酵期間，為進一步繁殖酵母需要略為補充空氣或氧。如果希望利用諸如沉降或離心裝置進行酵母細胞再循環，以提高總的工藝效率，則后者是必需的。由于酵母發酵內在地取決于乙醇生產速率與生長的匹配，為選擇乙醇生產的最佳條件，培養基必須補充以助生長物質或精細地控制通氣。
傳統的酵母發酵工藝(后酵)取決于具有約5～10百萬細胞/毫升規格的大的接種菌種的尺寸。優選的發酵溫度在30℃～40℃之間，並使用冷卻設備控制所產生的熱。為得到9%～11%(體積/體積)的乙醇，半連續發酵培養工藝的后酵階段時間為40～60小時。這一發酵時間可通過細胞再循環，使接種的菌種密度增加80～100倍而降低至10小時。淀粉水解物轉化成乙醇的成本率表現為最好是在使用有3～5個供后酵處理之用的發酵罐的發酵培養工藝中，連續地添加新鮮酵母以得到最大利用效率和11%(體積/體積)乙醇。
生產乙醇的第二種方法亦為已知，該方法使用游動酵單胞菌種(見歐洲專利No.0047641-George Weston Ltd.)。這一方法也是兩級處理，正如上邊所述的。但單細菌種在其生長階段(前酵)不需要添加空氣，而需要供應足夠的氮氣以保持厭氧條件。在乙醇生產的后酵處理期間，糖的濃度決不能超過6%(重量/體積)，因此需要間歇地或連續地添加濃縮的糖溶液。較佳的溫度為28℃～33℃，較佳的PH值為5.5。這一方法不僅需補充氮，亦需補充營養物。
已經公開的還有第三種乙醇生產方法，該方法是在兩級發酵工藝中使用有固定化酵母或游動酵單胞菌種，各自均帶有一定量的糖(10%重量/體積)(見英國專利No.2055121-Tanabe Sugaku Co.Ltd.)。
第四種生產乙醇的方法是通過細胞再循環，連續地使用游動酵單胞菌(澳大利亞專利AU-B-67696/81)或在半間歇培養條件下使用絮凝的游動酵單胞菌種(澳大利亞專利AU-B-78199/81)。在這兩種情況下，發酵溫度控制在30℃，PH值在5.0，培養基含有添加5～10克/升酵母浸膏的純葡萄糖。
在酵母發酵的情況下，已知的碳源轉化的例子為蔗糖，葡萄糖，糖蜜，甘蔗汁和淀粉水解物;在游動酵單胞菌發酵的情況下，例子限于葡萄糖;在固定化細胞的情況下，限定在葡萄糖和糖蜜，而在本發明者以前的專利申請，限定在蔗糖，糖蜜，甘蔗漿，甜菜漿和葡萄糖/果糖混合物。
本發明的一個目的就是提供一種從淀粉物料，如由谷物、玉米和木薯中得到的經預處理液化的淀粉生產乙醇的方法。該方法利用以游離或固定化狀態存在的、或兩種形式均有的淀粉葡萄糖苷酶(EC3、2、1、3)和游動酵單胞菌的組合作用。
更為突出的目的是該方法提供了單級發酵處理工藝。
另一目的是該方法可在有培養基存在時進行，其中淀粉組份的濃度大于10%(重量/體積)。
本發明的再一個目的是提供這樣一種方法。該方法使用單級發酵，或者如果需要可對這一培養方法調節，例如分批加料、半連續發酵罐培養、連續或多級系統，其中的能量供給較低。
本發明的其它目的可由下面的描述中體現出來。
概括地講，本發明屬于在一個發酵罐中從預處理過的液化淀粉物料中生產乙醇的方法，其特征在于以下幾個步驟(a)通過淀粉葡萄糖苷酶使預處理過的液化淀粉糖化成葡萄糖;以及(b)在有發酵培養基存在的條件下，利用微生物游動酵單胞菌將葡萄糖發酵成乙醇。
“預處理過的液化淀粉”是一種由干法或濕法研磨含植物料的淀粉而得到的麥芽素(maltrin)、糊精、淀粉、脂類以及蛋白質的復雜混合物。該產物經物理、化學或酶劑處理以降低淀粉的粘度，以便于在隨后的發酵工藝或食品工業中可使用較高的濃度。
糖化和發酵工序最好是在同一發酵容器中以單級發酵處理的形式同時進行。通過調節控制加入的淀粉葡萄糖苷酶的量來保證發酵前或發酵的同時由糖化所產生足夠的葡萄糖，以滿足游動酵單胞菌發酵生產乙醇的需要。
“單級發酵工藝”的含義為，在同一發酵容器中同時進行生長和生產兩個階段。該方法的起始既可通過向含有發酵培養基的發酵容器中添加含有游動酵單胞菌的種菌而完成，也可通過將發酵培養基加入含有一部分早先發酵操作的余物的發酵罐中而完成，該余物含有游動酵單胞菌。
發酵最好是在微需氧條件下進行。
“微需氧條件”是指不加任何氣體(氧、空氣、氮等)到發酵罐中，發酵培養基表面暴露于大氣中。微生物游動酵單胞菌在其生長和發酵生產乙醇過程中不需要空氣或氧(好氣)或氮(厭氣)，但容許在發酵培養基表面存有空氣。
微生物游動酵單胞菌的優選菌株已分別于1984年4月24日和1986年1月17日寄存在昆士蘭大學微生物系培養物保藏中心(St.Lucia，Queensland，4067，Australia)，寄存號為UQM2716，UQM2841和UQM2864及美國典型培養物保藏中心(ATCC)(12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland，20952，U.S.A.)，寄存號為39676，53432和53431。
菌株UQM2716是通過連續培養技術由保藏在國家工業細菌保藏中心(Torry Research Station，Abbey Road，Aberdeen，AB9 8DG，United Kingdom)的菌株(寄存號NCIB11199)和寄存在ATCC的菌株(寄存號29191)以及寄存在昆士蘭大學的菌株(寄存號UQM2007)進行選擇得到的。選擇是根據相對于母株UQM2007的蔗糖轉化的改進性能及代謝率而確定。
菌株UQM2864是一種由菌株UQM2716得到的果糖用負突變體，而第三種菌株UQM2841是一種由菌株UQM2007得到的果糖用負突變體。這些菌株可以是游離或固定化狀態，當然也可使用其突變化或變種。
預處理過的液化淀粉最好是由谷類中得到(如小麥、大麥、燕麥、黑麥、黑小麥、玉米、木薯、竹芋等)，可以是以濾清或未濾清的溶液狀態，亦可結合任意其它指定的基質加入到發酵罐中。對淀粉物料所采用的預處理方式將視物料而定。
在本發明的一次典型商業實踐中，第三方供應商向發酵罐操作人員提供了以化學不定的(復雜的)產品混合物形式存在的預處理過的液化淀粉，該混合物是通過一種通常被作為供應商貿易秘密的酶或非酶方法制得的。
在單級發酵中，為獲得最大乙醇產率或在連續加料系統中獲得更高產率，淀粉組份的較佳濃度范圍為10%～30%(重量/體積)，最好是15%～20%(重量/體積)。
發酵培養基最好包括任一種或多種下述組份淀粉葡萄糖苷酶(EC3、2、1、3)、胨(干酪素水解物)、酵母浸膏、磷酸二氫鉀(或銨或鈉)、硫酸銨、或氫氧化銨或脲素、及硫酸鎂。
這些組份(淀粉葡萄糖苷酶除外)的較好的濃度范圍均為0.01%～0.5%，最好是大約0.2%。淀粉葡萄糖苷酶的濃度范圍最好規定為10～100毫克/升或0.32～1.0GPU/克淀粉。“GPU”是用葡萄糖產生單位來表示酶活性(在PH為4.5，55℃條件下，三分鐘內1個單位將由可溶性淀粉中釋出1.0毫克葡萄糖)。酵母浸膏，胨(干酪素水解物)可用泛酸鈣或β-丙氨酸代替。
上面所述的培養基組份(淀粉葡萄糖苷酶除外)可優先考慮用適當濃度的玉米浸液的濃縮液、甘薯汁或漿或糖蜜、甜菜汁或漿或糖蜜代替。
發酵工藝的PH值為3.5～7.0，最好控制在3.9～5.0之間，起始PH值為4.5～7.0。另一方面，通常對PH值為4.1左右的預處理過的液化淀粉/玉米浸液之濃縮液混合物的起始PH值可不加任何控制，也可調節這一自然PH值至4.3～5.0，在4.3～4.5范圍內較好。然后進行發酵並通過混合物的自然緩沖作用保持PH值。這一點給于了該方法重要的經濟上的優點。
發酵罐中的溫度最好保持在25℃～40℃，將溫度穩定地控制在30℃～35℃之間更可取。
為使充分理解本發明，現詳細說明本方法的優選實施例。
實施例1將600克麥芽素(maltrin)(DE10)溶解于2升蒸餾水中。在添加75克玉米浸泡液濃縮液(50%固體含量)后，將該混合物加熱至92℃經5～10分鐘，然后轉移到4升發酵罐中。冷卻后用蒸餾水將體積稀釋至2700毫升。向這一發酵培養基中添加相當于0.64GPU/克淀粉的淀粉葡萄糖苷酶。將在培養基中于37℃下生長12～24小時的種菌300毫升加入發酵罐中，該培養基含10%(重量/體積)葡萄糖、0.2%(重量/體積)酵母浸膏、0.2%(重量/體積)干酪素水解物(胨)、0.2%(重量/體積)磷酸二氫鉀、0.2%(重量/體積)水合硫酸鎂、0.2%(重量/體積)硫酸銨。
起始PH值為4.8，通過添加2N堿(如80克/升NaOH)控制PH值在4.5。在溫度為35℃、攪拌速度為150轉/分條件下進行培養。
15小時后出現最高的乙醇產量，得到的乙醇濃度為78克/升或9.87%(體積/體積)。
實施例2將500克麥芽素(maltrin)M-100溶于2升蒸餾水中，于92℃加熱5～10分鐘並轉移入4升發酵容器中。添加200毫升培養基，該培養基含有任何一種或多種下述組份胨(干酪素水解物)、酵母浸膏、磷酸二氫鉀、硫酸銨或脲素或氨或磷酸二氫銨、及水合硫酸鎂，每種組份的濃度為0.2%(重量/體積)，其中胨和酵母浸膏可用泛酸鈣代替;或者通過添加適量的玉米浸液濃縮液、甘蔗漿、糖蜜或甜菜漿來全部代替培養基。
將300毫升如實施例2所述的、經12～24小時生長的游動酵單胞菌和相當于0.64GPU/克淀粉的淀粉葡萄糖苷酶一起加入發酵罐中。起始PH值為5.0，通過添加2N堿(如80克/升NaoH)控制PH值在4.5。並且于35℃、150轉/分鐘的攪拌速度下進行培養。
15小時后出現最乙醇產量，得到的乙醇濃度為74克/升或9.36%(體積/體積)。
實施例3將540克麥芽素(maltrin)M-100溶于2升蒸餾水中並加熱至92℃經10分鐘。將9克酵母浸膏，9克胨，及磷酸二氫鉀、水合硫酸鎂、硫酸銨各6克溶解成700毫升。全部培養基可通過添加適當的玉米浸液之濃縮液(1%～5%(體積))加上淀粉水解物、甘蔗漿、汁或糖蜜、或甜菜漿或糖蜜來取代。
將2升麥芽素(maltrin)加700毫升營養液裝入3升發酵罐中並將溫度調至25～38℃，最好是30℃～35℃。加菌種之前，PH值應在4.5～6.5范圍內，最好是5.0～5.5。
將300毫升、于含有5%～10%葡萄糖(重量/體積)、3克/升酵母浸膏、3克/升胨及各為2克/升的磷酸二氫鉀、水合硫酸鎂和硫酸銨的培養基中于30℃～37℃生長12～24小時的游動酵單胞菌菌種，和400毫克/升淀粉葡萄糖苷酶(12000U/克酶)一起加入到發酵罐(3升)中。
起始PH值調至4.5～6.5，最好為6.0。在發酵期間，通過添加2N堿(如80克/升NaoH)將PH值控制在4.5。于35℃，以60轉/分鐘的最小攪拌速率進行培養。22小時后出現最高乙醇產量，乙醇濃度為89.7克/升或11.4%(體積/體積)。發酵罐溫度保持在28～40℃范圍較好，最好為35℃。
實施例4實施例是重復的，其中將300毫克/升淀粉葡萄糖苷酶加入發酵罐並進行發酵18小時。
生成的乙醇濃度為88.6克/升或11.2%(體積/體積)。
實施例5使用20毫克/升淀粉葡萄糖苷酶以及43小時的發酵時間重復實施例4。生成的乙醇濃度為86.4克/升或11.0%(體積/體積)。
產得的乙醇作為汽油的一種組份或作為化學工業、例如生產乙烯的基礎產物具有商業價值。其它副產品、二氧化碳可用于干冰或作為藻類生物生長的一種碳源。
因為在發酵過程中微生物能產生相當的熱量，故此發酵處理就僅需少量能量供給。此外，發酵是在微需氧條件下進行的，這就避免了使用通氣泵或加氮泵，發酵組份和產物僅需要小的機械攪拌和PH值調節。
當發酵完成時，可以將游動酵單胞菌細胞從發酵培養基中分離掉，乙醇可以被蒸餾出來。另一種方法是將一部分來自前批發酵處理的發酵培養基加入發酵罐中作為以后發酵的游動酵單胞菌細胞的種菌。
實驗表明發酵工藝的成功不完全取決于基材的質量。
本發明不限于上述的特殊實施例，可對這些實施例進行各種改變和改善而並不超出所附權利要求
中所規定的范圍。
權利要求
1.一種在發酵罐中由淀粉物料生產乙醇的方法，其特征在于以下步驟(a)通過淀粉葡萄糖苷酶將淀粉物料糖化成葡萄糖，以及(b)在有發酵培養基存在的條件下利用微生物游動酵單胞菌將葡萄糖發酵成乙醇。
2.如權利要求
1的方法，其特征在于游動酵單胞菌是一種寄存在ATCC、寄存號為39676的菌株或ATCC39676的突變體或變種。
3.如權利要求
1的方法，其特征在于游動酵單胞菌是一種寄存在ATCC、寄存號為29191的菌株或ATCC29191的突變體或變種。
4.如權利要求
1的方法，其特征在于游動酵單胞菌是一種寄存在ATCC、寄存號為53431的菌株或ATCC53431的突變體或變種。
5.如權利要求
1的方法，其特征在于游動酵單胞菌是一種寄存在ATCC、寄存號為53432的菌株或ATCC53432的突變體或變種。
6.如權利要求
1～5中任一項的方法，其特征在于糖化和發酵工序是在同一發酵容器中，以單級發酵工藝的形式同時進行，調節或控制游動酵單胞菌細胞的量以使得糖化工序產得的葡萄糖即時發酵成乙醇。
7.如權利要求
1～6中任一項的方法，其特征在于發酵是在微需氧條件下進行。
8.如權利要求
1～7中任一項的方法，其特征在于淀粉水解物是由谷類、玉米、木薯或竹芋得到的。
9.如權利要求
8的方法，其特征在于谷類包括小麥、大麥、燕麥、黑麥或黑小麥。
10.如權利要求
8或9的方法，其特征在于淀粉以濾清或未濾清的溶液狀態加入發酵罐。
11.如權利要求
1～10中任一項的方法，其特征在于淀粉的濃度范圍為10%～30%(重量/體積)。
12.如權利要求
11的方法，其特征在于淀粉的濃度范圍為15%～20%(重量/體積)。
13.如權利要求
1～12中任一項的方法，其特征在于發酵培養基包括任一種或多種下述組份淀粉葡萄糖苷酶(EC3、2、1、3)、胨(干酪素水解物)、酵母浸膏、磷酸二氫鉀(或銨或鈉)、硫酸銨、或氫氧化銨、或脲素和硫酸鎂。
14.如權利要求
13的方法，其特征在于各種組份(淀粉葡萄糖苷酶除外)的濃度范圍為0.01%～8.5%(重量/體積)。
15.如權利要求
14的方法，其特征在于各種組份(淀粉葡萄糖苷酶除外)的濃度范圍為0.2%(重量/體積)。
16.如權利要求
13的方法，其特征在于淀粉葡萄糖苷酶的濃度范圍為10～100毫克/升或0.32～1.0GPU/克淀粉。
17.如權利要求
13～16中任一項的方法，其特征在于用泛酸鈣或β-丙氨酸代替酵母浸膏和胨。
18.如權利要求
1～17中任一項的方法，其特征在于發酵培養基的PH值保持在3.5～7.0。
19.如權利要求
18的方法，其特征在于PH值為4.5～5.0。
20.如權利要求
1～19中任一項的方法，其特征在于溫度保持在34℃～40℃。
21.如權利要求
20的方法，其特征在于溫度保持在35℃。
22.如權利要求
1～21中任一項的方法，其特征在于當發酵完成時，從發酵培養基中分離游動酵單胞菌細胞並蒸餾出乙醇。
23.如權利要求
1～21中任一項的方法，其特征在于將一部分來自前面發酵生產的發酵培養基加入發酵罐中，作為隨后發酵用的游動酵單胞菌細胞菌種。
24.用權利要求
1～23中任一項方法從淀粉物料制取的乙醇。
專利摘要
一種預處理過的液化淀粉發酵成乙醇的方法，其中淀粉物料通過淀粉葡萄糖苷酶糖化成葡萄糖，而葡萄糖在單一發酵容器中通過微生物游動酵單胞菌發酵成乙醇。可改變淀粉葡萄糖苷酶與游動酵單胞菌細胞的比率使得糖化和發酵工序以相同速率進行。淀粉濃度范圍為10％～30％(重量/體積)。
文檔編號C12P7/06GK87103681SQ87103681
公開日1987年12月9日 申請日期1987年5月1日
發明者霍斯特·沃納·多爾 申請人:昆士蘭大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan