專利名稱：淀粉衍生物、淀粉活性物質結合物、其制備方法及其作為藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及淀粉衍生物、這種淀粉衍生物與活性物質的結合物及其制備方法。本發明進一步涉及淀粉/活性物質結合物作為藥物的應用。
藥物活性物質如治療性蛋白、抗生素、核酸、細胞因子和激素與聚乙二醇衍生物共軛(“聚乙二醇化”)是廣泛應用的方法(Francis G.E.等人，Polyethylene glycol modification in tumour targeting and cytokinetherapy，J.Drug Targeting(1995)，3321-340)。從而使例如本身為水不溶性的活性物質轉變為水溶性衍生物，其可施用到血流中。
另外，有可能通過與聚乙二醇衍生物偶聯增加所述活性物質的分子量，以使其不再可能經由腎臟濾過，即，克服了所謂的腎臟屏障，從而使得這種衍生物與未共軛的活性物質相比，他們的血漿半衰期顯著地延長。此外，與聚乙二醇衍生物偶聯還有可能降低例如非人源的蛋白質的抗原性，否則當給予所述物質時會產生免疫副作用。
然而，聚乙二醇(PEG)具有缺點，其為不可代謝分子，用其衍生的蛋白質可導致腎臟的空泡化。因此使用可代謝的聚合物將活性物質衍生化特別有意義，所述可代謝的聚合物在體內的分解可以優先控制。用于此目的的適合的分子是羥乙基淀粉(HES)，其長時間以來已經廣泛地以多種分子規格用作血漿擴容劑(DE 19628705A1)。
即使當以高劑量給藥時，與其它血漿擴容劑如明膠衍生物或右旋糖苷、以及人白蛋白相比，HES只表現出罕見的和很小程度的副作用。
然而，活性物質衍生化的其它未解決的問題是活性物質與載體的選擇性結合。在蛋白質的情況中，例如希望在距離反應中心或受體充分遠處與載體偶聯。否則，活性被降低或破壞。
DE19628705A1描述了使血紅蛋白結合于羥乙基淀粉的方法。然而，該結合通過血紅蛋白的多個游離氨基相對非選擇性地發生。
考慮到現有技術，本發明要解決的問題是得到與活性物質盡可能選擇性結合的淀粉衍生物。
另外，這種淀粉衍生物的組成應盡可能使活性物質通過共價結合定量地結合到這種淀粉衍生物上。
本發明要解決的問題是還要得到淀粉衍生物，其在有機體內的分解行為是可以控制的。具體地說，淀粉衍生物的組成應使其不能通過腎臟屏障并防止其被迅速排泄。因此，淀粉衍生物在血清中應表現出延長的半衰期。然而，淀粉衍生物在生理學合理的時間段內應是可分解的并且沒有殘留。
活性物質在水相和有機溶劑中的溶解行為也應通過其與已知的淀粉衍生物的結合能夠在寬的范圍內控制。
最后，本發明要解決的問題是得到一種方法，其應該盡可能簡單和經濟地制備這種淀粉衍生物及其與活性物質的偶聯產品。
這些問題，以及雖然沒有確切地提及，但可不言而喻地從本文中討論的或從中必然顯現的關系推斷出的其它問題可用權利要求1中描述的淀粉衍生物解決。對本發明的這些淀粉衍生物的經驗性修飾在從屬于權利要求1的從屬權利要求2-9中保護。這些淀粉衍生物與活性物質的結合物在權利要求10-25中保護。對于用得到的所述淀粉衍生物作為中間產物來制備淀粉/活性物質結合物的方法，權利要求26-28提供了對要解決的問題的解決方案。
權利要求29-31描述了包含本發明的淀粉/活性物質結合物的藥物以及這些藥物的優選醫藥應用。
通過制備式(I)的化合物，有可能得到極具選擇性地與活性物質的SH官能團結合的淀粉衍生物， 其中X表示溴或碘原子，R”表示直鏈或支鏈烷基、芳基或芳烷基，R-CO-表示取代或未取代的氧化淀粉殘基，其在還原性端基處被氧化形成羧酸。
本發明的化合物具有以下優點。
淀粉衍生物的特有結構式防止淀粉衍生物能夠通過腎臟屏障，其結果是血漿中活性物質的半衰期得到延長。半衰期表示在所用活性物質的一半被分解或排泄時的時間。
式(I)的化合物在生理學合理的時間段內是可分解的并且沒有殘留，但另一方面還表現出可控制的消除行為。
權利要求1的衍生物通常可從任何具有可氧化為羧酸的基團的淀粉制備。優選地，所述基團為淀粉的還原性端基。已經發現，當氧化的淀粉R-CO-殘基為羥乙基淀粉殘基時，式(I)的前述性質可特別容易地達到。
得到羥乙基淀粉的起始產品為具有高含量支鏈淀粉的淀粉，其是淀粉的高度支化組分，具體為馬鈴薯淀粉、蠟狀玉米淀粉、高梁淀粉或蠟狀米淀粉。
對這些淀粉進行水解分解反應以大致預調到預期的分子量。分子量從大約20,000,000道爾頓降低到幾百萬道爾頓。
在隨后的用已知的羥乙基化試劑進行堿羥乙基化中，有可能在失水葡萄糖單元的2，3和6位引入羥乙基。在合成中不易形成雙取代單元，如2，3-二羥亞乙基水解葡萄糖、2，6-二羥亞乙基水解葡萄糖。
羥乙基取代存在兩種不同定義的取代度。
取代度MS(摩爾取代)定義為是每失水葡萄糖單元的平均羥乙基數。其根據樣品中羥乙基的總數來確定，例如根據Morgan，通過醚分離和隨后定量測定由此形成的碘乙烷和亞乙基。
另一方面，取代度DS(取代的程度)定義為是所有失水葡萄糖單元中取代的失水葡萄糖單元的比例。其可在樣品水解后定量測量未取代的葡萄糖測定。從這些定義可知MS＞DS。在單取代的情況中，即，每個取代的失水葡萄糖單元只帶有一個羥乙基時，MS＝DS。
本發明的式(I)的羥乙基淀粉中的羥乙基淀粉殘基優選具有0.1到0.8的取代度MS。特別優選地，羥乙基淀粉殘基具有0.4到0.7的取代度MS。
未取代的失水葡萄糖單元中的每個羥乙基在羥乙基化方面的反應性不同，取決于反應條件。在一定范圍內，取代的樣品，即，為統計學上分布在單個聚合物分子中的單個的不同取代的失水葡萄糖，可受此影響。有利的是，C2-和C5-位主要發生羥乙基化，由此C6-位由于其容易接近更常被取代。
在本發明范圍內，優選使用主要在C2-位取代的羥乙基淀粉(HES)，其被盡可能均勻地取代。這種HES的制備在EP 0402724 B2中有所描述。他們在生理學合理的時間段內分解且沒有殘留，但另一方面還表現出可控制的消除行為。主要在C2-位取代使羥乙基淀粉相對難以被α-淀粉酶分解。如果可能，聚合物分子內不發生失水葡萄糖單元被連續取代是有利的，以保證分解性而沒有殘留。另外，盡管是低取代的，這種羥乙基淀粉在含水介質中具有充分高的溶解性，使得溶液即使較長時間后仍保持穩定，且沒有聚集體或凝膠形成。
對于失水葡萄糖單元的羥乙基，優選本發明的式(I)中的羥乙基淀粉殘基的C2∶C6的取代比為2到12。特別優選地，C2∶C6的取代比為3到11。
對于活性物質的偶聯，優選將羥乙基淀粉(HES)的還原性端基氧化為羧酸或內酯。DE 19628705 A1描述了一種方法，其中用碘/氫氧化鉀使還原性端基氧化。隨后可通過得到的酸官能團與活性物質發生偶聯。
本發明式(I)的化合物中的R-CO-殘基在優選分子式中表示氧化的羥乙基淀粉殘基，其以所描述的用于形成羧酸的方式在還原性端基被氧化。
由于使用天然原材料支鏈淀粉和由于其中在某種程度上需要分離聚合物鏈的制備方法，羥乙基淀粉不是以具有規定分子量的均勻分子的物質存在，而是不同大小的分子的混合物，其也被羥乙基不同地取代。這種混合物的描述需要使用統計學平均量級(參見K.Sommermeyer等人，“Klinisch Verwendete HydoxyethylstrkePhysikalisch-chemische Charakterisierung”，Krankenhauspharmazie，271(1987))。因此，為表示平均分子量，使用平均分子量(Mw)。這種平均值的通用定義為Mw=ΣiNi·MiwΣiNi·Miw-1]]>優選本發明式(I)中的羥乙基淀粉R-CO-殘基具有2000到1,000,000 D的平均分子量(使用凝膠滲透色譜法測定)。更優選地，平均分子量Mw為5,000到500,000 D和最更優選為8,000到250,000D。
化合物(I)中的基團R”可包含飽和或不飽和鍵。如作為R”的烷基、芳基和芳烷基還可包含取代基，諸如例如，烷基、芳基、芳烷基、鹵素、羰基、酰基、羧基、羧酸酯基、羥基、硫羥基、烷氧基和/或烷基硫代取代基。在優選的實施方案中，R”為式(CH2)n的基團，其中n表示1到10的整數。特別優選地，R”為亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基或亞辛基。
本發明還涉及通式(II)的淀粉/活性物質結合物 其中R”表示直鏈或支鏈的烷基、芳基或芳烷基，R-CO-表示取代或未取代的氧化淀粉殘基，其在還原性端基處被氧化形成羧酸，和R’為活性物質殘基。
式(II)的淀粉/活性物質結合物為前述式(I)的化合物與其中含有至少一個SH基團的活性物質形成的偶聯產物。R-CO-殘基和R”具有與前面說明式(I)中相同的含義。
優選的活性物質R’-SH，其作為殘基R’-S-包含在式(II)的化合物中，選自肽、蛋白質、抗生素、核酸、或激素。必要的條件是這些化合物包含至少一個SH基團。
其也可為通過定向誘變引入半胱氨酸殘基的蛋白質或肽。因為在蛋白質或肽中沒有SH基團，有可能在本發明的范圍內使用治療性蛋白的所謂半胱氨酸-muteine，其通過使用基因工程的定向誘變選擇性地進行交換或引入半胱氨酸殘基。這種交換是本領域技術人員已知的，在A.Bendele等人的Short CommunicationRenal TubularVacuolation in Animals Treated with Polyethylene-Glycol conjugatedProteins，Toxicological Science 42，152-157(1998)中有所描述，在其它文獻中也有描述。
SH官能團也可在活性物質與式(I)的化合物反應之前通過用2-亞胺基四氫噻吩(Trauts試劑)轉化引入到帶有伯胺基團的活性物質中。通過這種方法把SH基團引入到活性物質諸如例如蛋白質中通常是本領域技術人員已知的。
治療性抗體、抗體fab片段和抗體F(ab’)2片段為優選的活性物質蛋白質。由于他們相對低的分子量，這種抗體片段容易通過腎臟，其可通過用淀粉衍生化延長其血漿半衰期。在本發明的范圍內也已經確定抗體或抗體片段被蛋白酶的水解分解可借助于用羥乙基淀粉衍生化而減少。
在另外的優選實施方案中，活性物質為細胞因子，具體為干擾素α2a或干擾素α2b，或促紅細胞生成素。
在本發明的范圍內，已經確定，當活性物質與式(I)的化合物偶聯并轉化為式(II)的淀粉/活性物質結合物時，活性物質在含水介質中的溶解性受到影響。
在本發明的范圍內，已經確定，當蛋白質或酶與式(I)的化合物偶聯并轉化為式(II)的淀粉/活性物質結合物時，蛋白質或酶在有機溶劑中的溶解性受到影響。優選的非質子性溶劑為二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或二甲基乙酰胺。
本發明還在另外的方面涉及前述的式(II)的淀粉/活性物質結合物的制備方法。得到最初描述的式(I)的淀粉衍生物作為該方法的中間產物。該方法的特征在于以下步驟a)取代或未取代淀粉的還原性端基首先被選擇性地氧化，形成羧基或內酯基團。優選使用羥乙基淀粉。氧化可例如根據DE 19628705A1使用碘/氫氧化鉀進行。
b)步驟a)中得到的氧化的淀粉或羥乙基淀粉的羧基或內酯基團與二胺反應，H2N-R”-NH2其中R”表示烷基、芳基或芳烷基，其可為支鏈或非支鏈的。所述殘基也可包含飽和及不飽和鍵。烷基、芳基或芳烷基也可包含其它取代基，諸如例如烷基、芳基、芳烷基、鹵素、羰基、酰基、羧酸酯基、羥基、硫羥基、烷氧基和/或烷基硫代取代基。
優選地，R”為非支鏈的飽和烷基(CH2)n，其中n表示2到10的整數。特別優選的化合物為乙二胺、1，3-丙二胺、1，4-丁二胺、1，5-戊二胺、1，6-己二胺和1，8-辛二胺。
通過使取代或未取代的氧化淀粉與上述二胺反應，得到式(III)的化合物 其中R-CO-表示取代或未取代的氧化淀粉殘基，如同已經在開始的式(I)中的描述，所述淀粉殘基在還原性端基處被氧化形成羧酸。
c)式(III)的化合物與鹵代乙酸和作為活化劑的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺反應，以形成式(I)的化合物 其中X表示溴或碘原子。
d)最后，式(I)的化合物與具有至少一個硫羥基的活性物質R’-SH反應，形成式(II)的淀粉/活性物質結合物 其中R’表示活性物質殘基。
已經發現，在中性到微堿性條件下，活性物質的硫羥基比其它活性基團更容易與式(I)的化合物反應。優選地，pH為6.5-8.5。在這些條件下，硫羥基脫質子化發生硫羥化，其具有特別的反應性，并選擇性地與式(I)的化合物反應。
已經確定，使用上述方法可極具選擇性地使活性物質通過與淀粉偶聯進行衍生化。在這種情況中，有選擇性的是指活性物質基本上只通過它的硫羥基與式(I)的化合物反應，和其基本上只通過硫醚鍵偶聯為淀粉/活性物質結合物。
特別優選地，該偶聯方法用于含有SH基團的肽或蛋白質。式(I)的化合物有可能與蛋白質或肽的SS基團反應，在SS基團轉化為SH基團后進行。
式(I)的化合物與含SH基團的肽或蛋白質的反應的收率為20％到90％，取決于蛋白質或肽的分子量和SH或SS基團的數量。因此，在優選的情況中，可實現活性物質與淀粉載體的大量偶聯。
有可能使上述方法步驟c)中的式(III)的中間產品與其它通常使用的交聯劑反應，代替與鹵代乙酸的反應。在這種情況中，交聯劑的官能團與化合物(III)的伯胺反應。在隨后的步驟中，交聯劑的殘余官能團之一與活性物質的官能團反應，優選與SH基團反應，其結果形成了淀粉/活性物質結合物。通常使用的交聯劑為如具有α-ω-末端相同或不同官能團的雙官能交聯劑。這種交聯劑的綜述可在firmPerbio的目錄(2001/2002)中發現。
另外，對于本領域技術人員不言而喻的是，有可能使開始描述的在還原性端基基團被氧化形成羧酸的淀粉殘基或羥乙基淀粉殘基直接與上述通常使用的交聯劑之一反應。在這種情況中，交聯劑的官能團與氧化的淀粉或羥乙基淀粉的羧基反應，在隨后的步驟中，交聯劑的殘余官能團之一與活性物質的官能團反應，優選與SH基團反應，其結果是形成淀粉/活性物質結合物。
根據本發明的一個方面，上述的活性物質的淀粉衍生物可用于制備藥物。優選地，所述藥物用于治療傳染性疾病或激素紊亂。在這個方面，這種藥物可包含標準的藥學助劑。
以下用一個實施例描述本發明，但本發明不受其限制。
實施例110g氧化羥乙基淀粉的結合物與乙二胺一起溶解于50ml蒸餾水中，所述氧化羥乙基淀粉結合物的平均分子量Mw為40,000和取代度MS為0.2，其制備類似于DE 19628705 A1。把0.2g的溴乙酸溶解于5ml蒸餾水中，并用0.01標準氫氧化鈉濃溶液調節pH值為4.5，把該溶液加入到上述氨基官能團化的羥乙基淀粉中。攪拌下，向反應混合物中加入0.1g的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺，通過加入0.01標準鹽酸和然后加入0.01標準氫氧化鈉濃溶液保持pH為4.5長達一小時。另外反應2小時后，反應產物經過超濾，然后用乙醇沉淀和用乙醇洗，真空避光干燥。
權利要求
1.一種下式(I)的淀粉衍生物 其中X表示溴或碘原子，R”表示直鏈或支鏈烷基、芳基或芳烷基，R-CO-表示取代或未取代的氧化淀粉殘基，其在還原性端基處被氧化形成羧酸。
2.權利要求1的淀粉衍生物，其中R”為式(CH2)n的基團，和n表示1到10的整數。
3.權利要求1或2的淀粉衍生物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，所述羥乙基淀粉殘基的分子量Mw為2,000到1,000,000D。
4.權利要求1或2的淀粉衍生物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，所述羥乙基淀粉殘基的分子量Mw為5,000到500,000D。
5.權利要求1或2的淀粉衍生物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，所述羥乙基淀粉殘基的分子量Mw為8,000到250,000D。
6.權利要求1到5的淀粉衍生物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，所述羥乙基淀粉殘基的取代度MS為0.1到0.8。
7.權利要求1到5的淀粉衍生物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，所述羥乙基淀粉殘基的取代度MS為0.4到0.7。
8.權利要求1到7的淀粉衍生物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，關于失水葡萄糖單元的羥乙基，所述羥乙基淀粉殘基的C2∶C6的取代比為2到12。
9.權利要求1到7的淀粉衍生物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，關于失水葡萄糖單元的羥乙基，所述羥乙基淀粉殘基的C2∶C6的取代比為3到11。
10.下式(II)的淀粉/活性物質結合物 其中R”表示直鏈或支鏈烷基、芳基或芳烷基，R-CO-表示取代或未取代的氧化淀粉殘基，其在還原性端基處被氧化形成羧酸，和R’為活性物質的殘基。
11.權利要求10的淀粉/活性物質結合物，其中R”為式(CH2)n的基團，和n表示1到10的整數。
12.權利要求10或11的淀粉/活性物質結合物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，所述羥乙基淀粉殘基的分子量Mw為2,000到1,000,000D。
13.權利要求10或11的淀粉/活性物質結合物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，所述羥乙基淀粉殘基的分子量Mw為5,000到500,000D。
14.權利要求10或11的淀粉/活性物質結合物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，所述羥乙基淀粉殘基的分子量Mw為8,000到250,000D。
15.權利要求10到14的淀粉/活性物質結合物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，所述羥乙基淀粉殘基的取代度MS為0.1到0.8。
16.權利要求10到14的淀粉/活性物質結合物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，所述羥乙基淀粉殘基的取代度MS為0.4到0.7。
17.權利要求10到16的淀粉/活性物質結合物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，關于失水葡萄糖單元的羥乙基，所述羥乙基淀粉殘基的C2∶C6的取代比為2到12。
18.權利要求10到16的淀粉/活性物質結合物，其中R-CO-殘基為被氧化形成羧酸的羥乙基淀粉殘基，關于失水葡萄糖單元的羥乙基，所述羥乙基淀粉殘基的C2∶C6的取代比為3到11。
19.權利要求10到18的淀粉/活性物質結合物，其中活性物質選自肽、蛋白質、抗生素、核酸或激素。
20.權利要求19的淀粉/活性物質結合物，其中蛋白質為抗體、抗體fab片段或抗體F(ab’)2片段。
21.權利要求19的淀粉/活性物質結合物，其中蛋白質為促紅細胞生成素。
22.權利要求19的淀粉/活性物質結合物，其中蛋白質為肽或蛋白質，在所述肽或蛋白質中通過靶誘變插入了半胱氨酸殘基。
23.權利要求19的淀粉/活性物質結合物，其涉及一種活性物質，在所述活性物質中通過與2-亞胺基四氫噻吩反應插入了SH官能團。
24.權利要求19的淀粉/活性物質結合物，其中活性物質為細胞因子。
25.權利要求24的淀粉/活性物質結合物，其中細胞因子選自干擾素α2a和干擾素α2b。
26.一種制備淀粉/活性物質結合物的方法，其特征在于a)將取代或未取代淀粉的還原性端基氧化形成羧基或內酯基團；b)使步驟a)中制備的羧基或內酯與下式的二胺反應，得到式(III)的化合物，H2N-R”-NH2其中R”表示直鏈或支鏈烷基、芳基或芳烷基， 其中R-CO-表示取代或未取代的氧化淀粉殘基，其在還原性端基處被氧化形成羧酸；c)使式(III)的化合物與鹵代乙酸和作為活化劑的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺反應，形成式(I)的化合物， 其中X表示溴或碘原子；和d)使式(I)的化合物與具有至少一個SH基的活性物質R’SH反應，形成式(II)的淀粉/活性物質結合物， 其中R’表示活性物質殘基。
27.權利要求26的方法，其特征在于R”為式(CH2)n的基團，和n表示1到10的整數。
28.權利要求26或27的方法，其特征在于步驟d)的反應在pH值為6.5到8.5的條件下進行。
29.一種藥物，其包括權利要求10到25的淀粉/活性物質結合物。
30.權利要求10到25的淀粉/活性物質結合物在制備用于治療傳染性疾病的藥物中的應用。
31.權利要求10到25的淀粉/活性物質結合物在制備用于治療激素紊亂的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種下式(I)的淀粉衍生物，其中X表示溴原子或碘原子；R”表示直鏈或支鏈烷基、芳基或芳烷基；和R－CO－表示取代或未取代的氧化淀粉殘基，其在還原性端基處被氧化形成羧酸。式(I)的淀粉衍生物可選擇性地與含有SH基團的活性物質反應且在人體內具有延長的半衰期。本發明也涉及式(I)與活性物質的偶聯產品，及其生產方法，及其作為藥物的應用。
文檔編號C08B31/00GK1625569SQ03803152
公開日2005年6月8日 申請日期2003年2月20日 優先權日2002年2月20日
發明者克勞斯·薩默邁爾, 諾貝特·贊德, 羅納德·弗蘭克, 哈拉爾德·康拉蒂 申請人:德國費森尤斯卡比有限公司