專利名稱：化學修飾法制備具有谷胱苷肽過氧化物酶活性的含硒透明質酸化合物的制作方法
技術領域：
本發明是利用化學修飾的方法制備具有高谷胱苷肽過氧化物酶(GPX)活性的含硒透明質酸的技術。該發明利用天然透明質酸的性質，使硒化后的透明質酸不但其抗氧化活性較純透明質酸有所提高，而且還增添了新的GPX活性。硒和透明質酸的結合同時提高了硒和透明質酸各自的效用，這為硒化多糖在提高機體免疫力，預防和治療包括腫瘤在內的多種疾病的應用上提供了應用前景。
背景技術：
1.透明質酸 由于透明質酸具有抗氧化性，故有“皮膚清道夫”的美譽，對分解皮膚表面由于太陽紫外線照射產生的超氧自由基起到關鍵作用。透明質酸及其衍生物又作為基礎藥物與各類治療藥物組成的復方制劑中的載體，把不同的治療藥物導向并保留在人體各個不同的病理部位，這樣不僅可以使藥物作用到更精確的靶位上，在提高治療藥物在病理部位的濃度，大大增強療效的同時，又可避免很多藥物的全身性副作用。透明質酸同載體激素、抗生素等制成的長效或定向釋放制劑也有很好的發展前景。透明質酸經交聯后形成的不同分子量和溶解度的大分子聚合物，可作為緩釋劑。新近研究表明透明質酸與癌癥的發生有密切關系。在諸多影響癌浸潤及轉移的因素中，普遍存在于細胞外基質中的透明質酸與癌細胞表面、內部相應受體的相互作用，已引起廣泛重視。細胞周期蛋白CD44是癌癥發生的關鍵因子，現有研究表明，透明質酸能夠特異性的與之親和。這種特性引起了人們的廣泛關注。以透明質酸為載體的抗癌靶向藥物如透明質酸-氟脲嘧啶，透明質酸-二氯滅痛等，已經進入三期臨床階段。
2.硒 硒是人體必須的微量元素，具有抗氧化，抗衰老，增強機體的抗腫瘤免疫能力，尤其較高濃度的硒能夠對腫瘤細胞增殖起到強烈的抑制作用，其在體內循環途徑的起始價態是-2價。硒能顯著的影響機體內的免疫系統，所以提高機體內血硒水平能夠對許多由缺硒引起的地方性疾病如克山病、大骨節病、肝癌等起到預防和治療作用。體內的硒蛋白酶谷胱苷肽超氧化物酶(GSH-Px)可降低或清除脂質過氧化物產生的自由基對膜的傷害，防止膜質過氧化，保護生物膜不受損傷的功能。在我國，最早的含硒化合物處于提取階段，中國專利92107669.X公開了題為“硒多糖及其制備方法”，介紹了從富硒酵母中提取硒多糖的制備方法，該方法的生物利用度有了很大的提高，但仍不十分理想，且產物僅為葡聚糖和硒的結合物，其生物活性也未見報道。還有相關專利報道了其他種生物多糖，如卡拉膠，它是一種來源于中國海南島的植物多糖，經過動物實驗證明，硒化卡拉膠較亞硒酸鈉具有更好的生物利用度和生物增益效應，而且毒性小。但報道的方法是將硒轉化為硝酸鹽再進行硒化，引入了雜質，分離提純步驟復雜。該法最終得到的硒化多糖中，硒以硒酸酯(+7價)和硒氫(-2價)兩種形式存在，+7價硒不能像-2價的硒那樣被人體直接吸收并行使生物功能，并且毒性藥顯著大于-2價硒。并且由于其所用原料為植物多糖類物質，它的組織相容性問題將限制其作為注射類藥物在臨床中應用。我們所采用的方法原料為透明質酸，現有研究已表明其具有非常良好的組織相容性，目前已經被廣泛應用為藥物載體。
2.鑒于含硒酶在預防和治療白內障、克山病、心血管病、炎癥及癌癥等方面的巨大應用潛力，而天然含硒酶自身具有諸如來源有限，體外環境中易失活，分子量大，容易引起人體內免疫反應等缺點。近年來，科學工作者一直致力與對新型含硒酶的開發和活性的模擬。最早的含硒酶模擬物有Ebselen(PZ51)，Glutaselenone等，雖然已有詳細的實驗證明這些模擬物具有較好的GPX活性和在醫用制藥方面的開發潛力，但同時模擬物自身也存在水溶性差、催化效率低等缺點，如PZ51，Glutaselenone的催化效率僅為天然GPX的千分之一左右。八十年代后期，抗體酶的制備進入了新階段，但普遍的催化效率要比天然酶低2-3個數量級。到了九十年代初，人們開始應用化學合成法人工模擬含硒酶，如中國專利94102481.4公開了題為“化學突變具有底物結合部位的單克隆抗體制備含硒抗體酶”，介紹了用標準單抗制備技術和簡單的化學突變相結合的方法制備活力為天然兔肝GPX0.21倍的含硒抗體酶的方法；在此基礎上，中國專利96112628.0公開了題為“活力高于天然酶的含硒抗體酶的制備方法”，介紹了制備具有底物結合部位和催化部位共同組成活性中心輸水腔的單抗，近而得到活力可達天然兔肝GPX10倍的抗體酶的方法，但上述的方法都是以蛋白質為基本出發點合成的模擬物，無法避免由外源蛋白質引入體內導致的免疫系統發生的排斥反應，所以很難應用于醫藥制劑及臨床治療。中國專利00133040.3公開了題為“含硒環糊精及其在制備治療白內障藥物中的應用”，介紹了運用簡單的化學合成方法，以環糊精為酶的底物結合部位，制備活力為PZ51 GPX7倍的硒化環糊精，其穩定性和抗氧化活性較好。但相對于透明質酸來講，環糊精不具備靶向性藥物載體的作用，因此以環糊精為底物合成的含硒化合物應用于臨床治療，具有副作用大，藥物療效低的缺點。
透明質酸作為主要的生產原料，可通過生物體內提取和微生物發酵法大量制備，這就很好的解決了成本高的問題。經過對透明質酸性質的研究，新開發的模擬物在制備階段不經歷如上述專利所述的PMSF的活化過程，這與已有的方法相比較，不但降低了生產的成本，而且整個制備過程都不引入新的雜質，簡化了產品的制備、分離提純等步驟，也使模擬物生產成本大大降低，工藝簡化，而生物活性較環糊精硒化產物提高近10倍。
發明內容
本發明的目的在于提供一種簡單工藝制備具有GPX活性及抗氧化活性的含硒多糖。其原理為以透明質酸多糖分子中的-OH作為修飾部位，以NaHSe作為修飾劑，硒化透明質酸。產物經硒化后具有GPX活性和高抗氧化活性。
本發明的制備工藝為NaHSe與透明質酸水溶液在特定條件下反應生成含-SeH的透明質酸；硒化的透明質酸經空氣中氧化，生成雙硒橋聯化合物。經已醇沉淀，離心，棄上清，沉淀用乙醇、丙酮反復洗滌，揮去有機溶劑，樣品冷凍干燥，得含硒透明質酸純品。
具體實施例方式
1.雙硒橋聯透明質酸的合成路線(1)將透明質酸用水充分溶解至濃度為5mg/mL，取100ml該水溶液在容器中通高純氮氣除氧10min，保證反應體系的惰性環境，然后密封備用。
(2)NaHSe的制備將2.028gNaBH4溶解于25mL水中，再將1.974g硒粉加入到NaBH4中，此時觀察到水中有大量的氣體生成，并伴隨有熱量放出，待泡沫逐漸消退時，蓋上一插有針頭的膠塞，反應結束后，反應體系冷卻，有大量的鹽析出，液體呈無色。由于NaBH4與H+反應，伴隨有少量H2Se產生，為防止中毒，反應在通風櫥中進行。反應的方程式如下
(3)取制備好的NaHSe水溶液25mL，迅速加至如(1)所示的透明質酸水溶液中，迅速密封反應體系，防止NaHSe被氧化，開始硒化反應。反應的方程式為
(4)將硒化反應體系置于60℃的水浴中，反應48h。
(5)透明質酸硒化反應后產物充分暴露于空氣中，使過量的NaHSe充分氧化。
(6)氧化后的含硒透明質酸用1mol/L的HCl調pH值至7.0。
(7)用乙醇將含硒透明質酸沉淀，收集沉淀，經乙醇、丙酮反復洗滌后，冷凍干燥，得含硒透明質酸純品。
2.硒含量測定將硒化后的透明質酸配成1.5mg/mL的水溶液，取500μL加入新配制的1mol/L的NaBH4溶液50μL，反應20min后，用1mol/L的咪唑淬滅，用1mol/L的HCl調pH值至中性，精確測量終體積。取多糖溶液158μL，加入2.79ml的Ph＝8.0的Tris-HCl Buffer，再加入30μL 0.01mol/L的DTNB分析液。反應10min后測定其在412nm處吸光度值，以蒸餾水代替糖溶液做參比。測定含硒量。測定在上述制備條件下生成的每克含硒透明質酸含硒量約為280μg。
3.硒化透明質酸活性研究(1)硒化透明質酸的GPX活性測活體系500μL，含50mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.0、1mmol/L疊氮鈉。1mmol/L谷胱苷肽，0.25mmol/LNADPH，1U谷胱苷肽還原酶，加入0.5mmol/LH2O2啟動反應，在340nm處監測NADPH被、氧化的吸光度變化。測定酶活時，以蒸餾水代替含硒多糖作為空白對照。酶活力單位定義為每分鐘每微摩爾含硒多糖消耗1微摩爾NADPH為一個活力單位。最終測定在上述條件下得到的含硒多糖的比活力為75.2U/μmol。
(2)硒化透明質酸的抗氧化活性研究測活體系為3ml，取用上述制備的硒化透明質酸溶液100μL，加入2ml蒸餾水，依次加入20mmol/L的水楊酸鈉300μL，0.5mmol/L的FeSO4300μL，最后加入60mmol/L的H2O2300μL，將反應體系在32℃的水浴中反應1h后，在752分光光度計上測定其在510nm處的吸光度值。測定活力時以蒸餾水代替糖溶液作參比，以相同濃度的純透明質酸水溶液代替糖溶液作對照，最終測定其抗OH·-的活性在20μg/ml時的抑制率達到75％，是未經修飾的透明質酸的400多倍。
4.硒化條件對產物含硒量的影響(1)將透明質酸用水充分溶解至不同濃度，濃度分別為，1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，5mg/mL，8mg/mL，10mg/mL，取100ml該水溶液進行如1中所示的硒化反應，得到其硒含量分別為每克透明質酸中含硒78，156，197，280，221，186μg。最終得到在透明質酸水溶液最佳濃度為5mg/mL時，其產物含硒透明質酸兼具硒含量高和溶解性好特點。
(2)將5mg/mL的透明質酸與NaHSe的用量摩爾比分別配制成1∶1000，1∶2500，1∶5000，1∶12500，1∶17500，1∶25000，用不同的透明質酸與NaHSe用量摩爾比進行如1中所示的硒化反應，得到其硒含量分別為每克透明質酸中含硒227，268，292，315，323，344μg。最終得到在透明質酸與NaHSe的用量最佳摩爾比為1∶2500時，其產物含硒透明質酸兼具硒含量高和硒利用率高的特點。
(3)將5mg/mL的透明質酸進行硒化，反應時間分別為6，12，24，36，48h，用不同的透明質酸硒化時間進行如1中所示的硒化反應，得到其硒含量分別為每克透明質酸中含硒123，157，185，257，282μg。最終得到在透明質酸硒化反應最佳時間為48h時，其產物含硒透明質酸具有硒含量高的特點。
(4)將5mg/mL的透明質酸進行硒化，反應溫度分別為20，40，50，60，70，80℃，用不同的透明質酸硒化溫度進行如1中所示的硒化反應，得到其硒含量分別為每克透明質酸中含硒36，128，207，292，331，364μg。最終得到在透明質酸硒化反應最佳溫度為60℃時，其產物含硒透明質酸兼具硒含量高和透明質酸降解程度小的特點。
本發明有如下特點1含硒透明質酸的制備方法獨特新穎，為酶的模擬物開發提供了一條新的路線。
2含硒透明質酸制備方法簡單。
3含硒透明質酸的活性廣泛，且活力高。
4含硒透明質酸具有硒和多糖雙方面的應用前景，多方面的應用潛力，可作多種藥物的開發。
權利要求
1.一種含硒透明質酸的制備方法，其特征在于含硒透明質酸為硒和透明質酸的化合物。其制備工藝為NaHSe與透明質酸水溶液反應生成含-SeH的透明質酸，反應結束后將反應體系暴露于空氣中氧化，除去過量的硒，產物經乙醇沉淀，離心，收集沉淀，用乙醇、丙酮反復洗滌，揮去有機溶劑，樣品冷凍干燥，得含硒透明質酸純品。
2.一種如權利要求1所示的含硒透明質酸的制備方法，得到的含硒透明質酸為淡黃色粉末狀物質，每克含硒透明質酸的含硒量約為280μg。所含硒價態為-2價。
3.一種如權利要求1所示的含硒透明質酸的制備方法，其特征為透明質酸水溶液的濃度為1～10mg/mL，其最佳用量為5mg/mL。
4.一種如權利要求1所示的含硒透明質酸的制備方法，其特征為透明質酸水溶液在硒化前通氮氣除氧，然后密封備用。
5.一種如權利要求1所示的含硒透明質酸的制備方法，其特征為透明質酸與NaHSe的用量摩爾比為1∶1000～1∶25000，其最佳摩爾比為1∶2500。
6.一種如權利要求1所示的含硒透明質酸的制備方法，其特征為透明質酸硒化反應時間為6～48h，其最佳反應時間為48h。
7.一種如權利要求1所示的含硒透明質酸的制備方法，其特征為透明質酸硒化反應溫度為20～80℃，其最佳反應溫度為60℃。
8.一種如權利要求1所示的含硒透明質酸的制備方法，其特征為透明質酸硒化反應后產物在空氣中氧化，除去過量的NaHSe。
9.一種如權利要求1所示的含硒透明質酸的制備方法，其特征為氧化后的含硒透明質酸用HCl調pH值至7.0。
10.一種如權利要求1所示的含硒透明質酸的制備方法，其特征為含硒透明質酸溶液用乙醇沉淀，用乙醇、丙酮反復洗滌后，冷凍干燥，得含硒透明質酸純品。
全文摘要
本發明屬于含硒透明質酸的制備技術。采用簡單的化學合成法，以透明質酸多糖分子中的－OH作為活化修飾部位，以NaHSe作為修飾劑，硒化透明質酸。產物硒化后經氧化，得到產品硒化透明質酸，每克透明質酸含硒量約為280μg。硒和多糖的結合，提高了硒和多糖各自的效用，本發明正是巧妙的利用天然透明質酸及硒的性質，使硒化后的透明質酸具有較原透明質酸更高的抗氧化活性，更重要的是增添了新的GPX活性，深入挖掘了硒化多糖在提高機體免疫力，預防和治療包括腫瘤在內的多種疾病的巨大潛力。
文檔編號C08B37/08GK1523042SQ0312713
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月4日 優先權日2003年9月4日
發明者劉蘭英, 洪水聲, 陳佳, 滕利榮, 孟慶繁, 逯家輝 申請人:吉林大學