專利名稱：一種從制備當歸注射液的廢棄物中提取當歸多糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種從制備當歸注射液的廢棄物中提取當歸多糖的方法。
多聚糖簡稱多糖(Polysaccharides)，是由十個以上的單糖基通過甙鏈連接而成。可以以均多糖或雜多糖形式存在。近年來多糖的生物活性(主要是調節免疫功能)逐漸為人們所認識，多糖類藥物被認為是一類新型、高效、低毒類藥物，引起國內外醫藥學界重視。
當歸的化學成分復雜，主要分為揮發油及水溶性組分兩大部分。日本學者Yamade等從東當歸根中分離出分子量13500、結構為6位分枝α(1→4)的水溶性葡聚糖，其多糖組分還含有鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、木糖等。然而因產地來源及制備方法的不同，導致多糖組分中總糖醛酸、蛋白質、己糖種類和比例不同，生物學活性差異很大。為此，找到一種簡便、經濟、對環境污染小的方法分離制備當歸多糖，且保證其具有穩定的質量標準，對于充分開發傳統植物藥物當歸具有重要指導意義，也將取得良好的經濟效益。
本發明提供的技術方案是一種從當歸注射液提取廢棄物制備當歸多糖的方法，將制備當歸注射液所得醇沉物，加水溶解，0～10℃靜置后過濾，去沉淀，濃縮至0.1～2.0g/ml；加入2.0～10.0倍體積的無水乙醇，0～10℃靜置后過濾，沉淀、加水溶解、離心、除去沉淀，上清液進一步濃縮后，加入2.0～10.0倍體積的無水乙醇，靜置，棄上清，沉淀以無水乙醇洗滌、過濾，至乙醇洗滌沉淀時黃色褪盡；沉淀物干燥，得到當歸多糖(ASP)。
在上述方法中，將制備當歸注射液所得醇沉物，加水溶解，靜置后過濾，去沉淀，濃縮至0.5～1.0g/ml；加入4.0～8.0倍體積的無水乙醇，0～10℃靜置后過濾，沉淀、加水溶解、離心、除去沉淀，上清液進一步濃縮后，加入4.0～8.0倍體積的無水乙醇，靜置，棄上清，沉淀以無水乙醇洗滌、過濾，至乙醇洗滌沉淀時黃色褪盡；沉淀物經真空干燥或40～70℃烘干，得到當歸多糖。
本發明利用制備當歸注射液所得廢棄物來提取多糖，變“廢”為寶，充分利用中藥資源，簡便、快捷且對環境污染小。
實施例2從當歸注射液提取廢棄物制備當歸多糖的方法，取制備當歸注射液所得醇沉物，稱重，加適量水溶解，3℃靜置10小時，過濾，除去沉淀，將上清液濃縮至約0.3g/ml后，加入8倍體積的無水乙醇，6℃靜置11h，過濾，沉淀加入適量的水溶解，3500rpm離心10min，除去沉淀，上清液進一步濃縮后，加入2倍體積的無水乙醇，4℃靜置24h，棄上清，沉淀部分用無水乙醇洗滌、過濾，反復數次，至乙醇洗滌沉淀時黃色褪盡。沉淀物經真空干燥，即得到當歸多糖ASP。1.ASP的定性實驗及糖含量測定1.1試驗方法1.1.1標準曲線的制作精密稱取105℃恒重的葡萄糖0.10g于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，取此溶液10ml置于100ml容量瓶中，定容至刻度，制成標準溶液。精密吸取標準溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml分別試管中，加蒸餾水稀釋至2ml，兩管平行；另精密吸取蒸餾水2ml作空白對照，置刻度試管中，分別加入水飽和酚溶液0.5ml，濃硫酸5.0ml，劇烈振蕩10min，于30℃水浴中保溫20min，在島津UV1601分光光度計490nm處比色。1.1.2 ASP糖含量測定精密稱取制得的ASP0.051g，置100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，吸取該溶液2、4ml分別置于100ml容量瓶中加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上述兩種濃度溶液各2ml，兩管平行，分別加入水飽和酚溶液0.5ml，濃硫酸5.0ml，劇烈振蕩10min，于30℃水浴中保溫20min，在島津UV1601分光光度計490nm處比色。1.2試驗結果及分析以不同濃度的葡萄糖溶液與其OD490作回歸分析得直線方程Y＝0.1426+5.08x(回歸系數r＝0.998)，式中Y表示光密度，x表示葡萄糖的量。將當歸多糖溶液加入苯酚和硫酸后由無色變為橙色，表明由當歸醇沉物精制而得的物質確屬糖類。將測定結果代入回歸方程Y＝0.1426+5.08x計算，得出ASP的平均糖含量為65.5％。
進一步檢驗硫酸-苯酚顯色反應的穩定性，對標準品(葡萄糖)和ASP在顯色后不同時間的OD490值進行測定，結果表明標準品和待測品(ASP)在顯色后的0min～90min內OD490無明顯變化，至反應后120min時，各管OD490值開始有所下降。說明硫酸--苯酚顯色反應在90min以內顯色穩定。結果見表1。
表1.硫酸—苯酚顯色反應OD490值隨時間變化表管號 糖含量OD490(顯色后)/mg0min 15min 30min 60min 90min 120min空白管 0 00 0 0 0 0標準管1 0.01 0.1960.195 0.198 0.199 0.197 0.1711’ 0.01 0.1970.200 0.199 0.196 0.209 0.176標準管2 0.02 0.2460.248 0.249 0.249 0.247 0.2242’ 0.02 0.2400.236 0.236 0.239 0.238 0.219標準管3 0.03 0.3090.310 0.309 0.309 0.307 0.2933’ 0.03 0.3070.309 0.308 0.309 0.305 0.290標準管4 0.04 0.3710.370 0.368 0.372 0.365 0.3504’ 0.04 0.3720.369 0.371 0.369 0.368 0.349標準管5 0.05 0.3990.401 0.403 0.400 0.398 0.3895’ 0.05 0.3970.400 0.398 0.396 0.394 0.386測定管1 0.02 0.2240.222 0.221 0.223 0.217 0.2061’ 0.02 0.2230.222 0.222 0.221 0.218 0.207測定管2 0.04 0.2920.294 0.292 0.292 0.293 0.2732’ 0.04 0.2940.293 0.292 0.292 0.288 0.275上表中n’為n的平行管，n＝1、2、3、4或5。2.DEAE-纖維素層析柱分離ASP灌制DEAE-纖維素層析柱稱取DEAE-纖維素40克，用適量去離子水潤濕，緩慢將潤濕的DEAE-纖維素灌入直徑4.5cm的層析柱中，同時緩慢攪拌以完全除去氣泡，保持DEAE-纖維素層析柱頂端呈水平。用200ml 10％的氫氧化鈉過柱，再用大量蒸餾水過柱，至從層析柱中流出的蒸餾水的pH值為7.0。至此DEAE-纖維素層析柱灌制完畢。
將ASP溶液上樣于DEAE-纖維素層析柱，依次以去離子水、酸性洗脫液(冰乙酸∶正丁醇∶蒸餾水＝2∶9∶17，體積比)及堿性洗脫液(10％NaOH，w/v)將ASP洗脫得三種組分ASP-1、ASP-2、ASP-3。ASP的3種分離組分經濃縮后，ASP-3溶液在滴入少量乙醇(約溶液體積的10％)即有大量沉淀，ASP-1溶液和ASP-2溶液中仍需加入終濃度為80％的無水乙醇才能完全沉淀。
3種組分60℃烘干后，ASP-1呈棕灰色粉末狀，ASP-2呈深棕色塊狀，ASP-3呈白色塊狀。3種組分久置空氣中不吸潮。3.ASP分離組分糖含量測定精密稱取制得的ASP的3種分離組分ASP-1、ASP-2、ASP-3各0.05g，其余步驟同ASP糖含量的測定。將測得的待測品的OD490值代入方程Y＝0.1426+5.08x計算，得ASP-1的糖含量均值為72.14％，ASP-2的糖含量均值為66.11％，ASP-3的糖含量均值為63.53％。4.ASP與其分離組分糖成分分析稱取ASP、ASP-1、ASP-2、ASP-3各10mg，各加入4ml 2N H2SO4，封管，100℃水解5小時，水解液以BaCO3中和，60℃濃縮。在距濾紙底邊2.5cm處用鉛筆劃一直線為起點線，在距濾紙側邊1.5cm處為第一點樣點，再每隔2.5cm為一點樣點，用玻璃毛細管將1％標準品溶液和待測品溶液點樣于各點樣點，標準品和待測品在濾紙上的擴散直徑需控制在0.5cm內。將濾紙底邊浸入以正丁醇∶乙醇∶水＝40∶11∶19(體積比)混合而成的展開劑中，上行法層析12小時后，將濾紙用吹風吹干，均勻噴涂顯色劑(鄰苯二甲酸1.66g和苯胺0.93g共溶于100ml水中，再以正丁醇飽和)，用吹風加熱濾紙至各糖點顯色。
ASP、ASP-1、ASP-2、ASP-3被水解為單糖后，經過紙色譜展開，可見各標準品在濾紙上的移動距離不同，各顯色點的直徑均在1cm內。實驗結果表明ASP主要含有D-半乳糖和D-阿拉伯糖，ASP-1主要含有D-阿拉伯糖和α-葡萄糖醛酸，ASP-2主要含D-阿拉伯糖，ASP-3主要含D-半乳糖和D-阿拉伯糖。各樣品的RF值見表2。表2.樣品RF值標準品 RF值 標準品 RF值 待測品 RF值D-核糖 0.16 α-葡萄糖酚醛 0.17 ASP0.10/0.31D-半乳糖 0.10 D-木糖 0.28 ASP-1 0.17/0.31L-鼠李糖 0.37 D-阿拉伯糖 0.31 ASP-2 0.31D-果糖 0.23 D-葡萄糖0.14 ASP-3 0.10/0.315.試劑和材料無水葡萄糖，北京車華化學試劑廠；D-核糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-果糖、α-葡萄糖醛酸、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖，上海化學試劑三廠；所用試劑均為分析純。孔徑25μm半透膜，Sigma公司，內徑1.0mm的玻璃毛細管，華西醫科大學儀器廠；中速定性分析濾紙，杭州富陽特種紙廠。
權利要求
1.一種從制備當歸注射液的廢棄物中提取當歸多糖的方法，其特征在于將制備當歸注射液所得醇沉物，加水溶解，0～10℃靜置后過濾，去沉淀，濃縮至0.1～2.0g/ml；加入2.0～10.0倍體積的無水乙醇，0～10℃靜置后過濾，沉淀、加水溶解、離心、除去沉淀，上清液進一步濃縮后，加入2.0～10.0倍體積的無水乙醇，靜置，棄上清，沉淀以無水乙醇洗滌、過濾，至乙醇洗滌沉淀時黃色褪盡；沉淀物干燥，得到當歸多糖。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于將制備當歸注射液所得醇沉物，加水溶解，靜置后過濾，去沉淀，濃縮至0.5～1.0g/ml；加入4.0～8.0倍體積的無水乙醇，0～10℃靜置后過濾，沉淀、加水溶解、離心、除去沉淀，上清液進一步濃縮后，加入4.0～8.0倍體積的無水乙醇，靜置，棄上清，沉淀以無水乙醇洗滌、過濾，至乙醇洗滌沉淀時黃色褪盡；沉淀物經真空干燥或40～70℃烘干，得到當歸多糖。
全文摘要
本發明涉及一種從制備當歸注射液的廢棄物中提取當歸多糖的方法，其特征在于將制備當歸注射液所得醇沉物，加水溶解，0～10℃靜置后過濾，去沉淀，濃縮至0.1～2.0g/ml；加入2.0～10.0倍體積的無水乙醇，0～10℃靜置后過濾，沉淀、加水溶解、離心、除去沉淀，上清液進一步濃縮后，加入2.0～10.0倍體積的無水乙醇，靜置，棄上清，沉淀以無水乙醇洗滌、過濾，至乙醇洗滌沉淀時黃色褪盡；沉淀物干燥，得到當歸多糖。本發明利用制備當歸注射液所得廢棄物來提取多糖，變“廢”為寶，充分利用中藥資源，簡便、快捷且對環境污染小。
文檔編號C08B37/00GK1434059SQ0311853
公開日2003年8月6日 申請日期2003年1月27日 優先權日2003年1月27日
發明者彭仁琇, 夏雪雁, 李穎, 王智勇, 楊靜 申請人:武漢大學