專利名稱：高純度真菌多糖的制備方法
技術領域：
本發明涉及從真菌的子實體或深層發酵的菌絲體中提取真菌多糖的一種制備工藝方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
真菌多糖是具有高度免疫活性的一類多糖，廣泛存在于真菌的子實體和深層發酵的菌絲體中，高純度的真菌多糖既可以直接用于口服，也可以加工成注射制劑。通常制備高純度的真菌多糖是水提取或堿提取后，用蛋白酶處理或用有機溶劑處理去除粗提液中的主要雜質——蛋白質，再經過葡聚糖凝膠過濾純化。現有的從真菌的子實體或深層發酵的菌絲體中提取真菌多糖的工藝方法，不能實現大規模的工業化生產，工藝路線長，生產效率低，產品成本高，不能滿足市場的需要。
發明內容
本發明的目的是要提供一種制備效率高，過程簡單，生產成本低的高純度真菌多糖的制備方法。
本發明的目的是這樣實現的，高純度真菌多糖的制備方法，是以真菌為原料，采用真菌重量2-5倍的水，在溫度為70℃-90℃進行2小時-4小時的提取，經篩網過濾去掉殘渣，獲得的水提取液中加入提取水重量60％-85％的硫酸銨，攪拌后靜置1小時以上沉淀蛋白質，再離心去除沉淀，將上清液用膜分離裝置超過濾脫鹽，再經多次加稀釋水和超過濾循環操作，獲得真菌多糖濃縮液(收集的最后1次透過液)，濃縮液經干燥制得多糖純度達到97％-99.5％的真菌多糖粉末。所說的篩網為100目-400目的篩網。超過濾的操作壓力為0.01-0.04MPa。干燥為冷凍干燥或噴霧干燥。所說的殘渣再用0.5N NaOH提取，提取液加入1∶4的鹽酸溶液，調節至pH6.5-7.0后加入硫酸銨，攪拌后靜置2小時以上沉淀蛋白質，再離心去除沉淀，將上清液用膜分離裝置超過濾脫鹽，再經多次加稀釋水和超過濾循環操作，獲得真菌多糖濃縮液，濃縮液經干燥制得多糖純度達到97％-99.5％的真菌多糖粉末。真菌包括香菇、靈芝、姬松茸的粉末狀子實體和深層發酵菌絲體。稀釋水的重量是提取水重量的1/10-1/3。所說的離心去除沉淀是3000rpm離心20min去除沉淀。膜分離裝置為截留分子量為10000的膜分離裝置。多次加稀釋水和超過濾循環操作為至少10次加稀釋水和超過濾循環操作。獲得真菌多糖濃縮液，如不進行濃縮可直接用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。制得的真菌多糖粉末可進一步制成膠囊或片劑。所述的硫酸銨為純度不小于99％的硫酸銨。
本發明以粉末狀真菌子實體或深層發酵的菌絲體為原料，經水提后殘渣再用NaOH提取，水提取液和經鹽酸中和后的堿提取液分別用硫酸銨沉淀蛋白質雜質，離心去除沉淀后，上清液用超過濾膜分離技術脫鹽并濃縮，濃縮液經冷凍干燥或噴霧干燥制得高純度真菌多糖粉末。工藝先進、合理、簡單，產品制備效率高，質量好，成本低。避免使用任何有機溶劑，無污染物質排放，適合大規模工業化生產。有很好的推廣應用價值。
具體實施例方式
實施例1將100kg香菇子實體粉碎，加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例2收集實施例1中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 400kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約24kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入240kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為80kg，向透過液中加入80kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例3將100kg香菇子實體粉碎，加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得香菇多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例4收集實施例3中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 300kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約18kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為90kg，向透過液中加入90kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得香菇多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例5向100kg深層發酵的香菇菌絲體中加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例6收集實施例5中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 300kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約18kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為70kg，向透過液中加入70kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例7向100kg深層發酵的香菇菌絲體中加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得香菇多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例8收集實施例7中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 400kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約24kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入240kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為80kg，向透過液中加入80kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得香菇多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例9將100kg靈芝子實體粉碎，加入400kg水，90℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入240kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為80kg，向透過液中加入80kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例10收集實施例9中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 400kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約24kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入240kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為80kg，向透過液中加入80kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例11將100kg靈芝子實體粉碎，加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得靈芝多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例12收集實施例11中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 300kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約18kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為80kg，向透過液中加入80kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得靈芝多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例13向100kg深層發酵的靈芝菌絲體中加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例14收集實施例13中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 300kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約18kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例15向100kg深層發酵的靈芝菌絲體中加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得靈芝多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例16收集實施例15中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 400kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約24kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入240kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000 rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為80kg，向透過液中加入80kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得靈芝多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例17將100kg姬松茸子實體粉碎，加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例18收集實施例17中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 400kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約24kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入240kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為80kg，向透過液中加入80kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例19將100kg姬松茸子實體粉碎，加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得姬松茸多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例20
收集實施例19中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 400kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約24kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入240kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為80kg，向透過液中加入80kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得姬松茸多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例21向100kg深層發酵的姬松茸菌絲體中加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例22收集實施例21中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 400kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約24kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入240kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為80kg，向透過液中加入80kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，用作水劑或注射針劑的原料。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例23向100kg深層發酵的姬松茸菌絲體中加入300kg水，80℃提取2h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入180kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為60kg，向透過液中加入60kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得姬松茸多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
實施例24收集實施例23中水提取后的殘渣，向殘渣中緩慢加入0.5N NaOH 400kg，邊加邊攪拌，防止局部堿濃度過高，靜置4h，用200目篩網過濾，向濾液中緩慢加入1∶4的鹽酸溶液約24kg，調節至pH6.5-7.0，再緩慢加入240kg硫酸銨，攪拌均勻后靜置4h，3000rpm離心20min去除沉淀后，上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置超過濾脫鹽，操作壓力0.02MPa，每次操作控制保留液體積為80kg，向透過液中加入80kg水，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后1次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得姬松茸多糖粉末。保留液中脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。
權利要求
1.一種高純度真菌多糖的制備方法，其特征是以真菌為原料，采用真菌重量2-5倍的水，在溫度為70℃-90℃進行2小時-4小時的提取，經篩網過濾去掉殘渣獲得的水提取液中加入提取水重量60％-85％的硫酸銨，攪拌后靜置1小時以上沉淀蛋白質，再離心去除沉淀，將上清液用膜分離裝置超過濾脫鹽，再經多次加稀釋水和超過濾循環操作，獲得真菌多糖濃縮液，濃縮液經干燥制得多糖純度達到97％-99.5％的真菌多糖粉末。
2.根據權利要求1所述的高純度真菌多糖的制備方法，其特征是所說的篩網為100目-400目的篩網。
3.根據權利要求1所述的高純度真菌多糖的制備方法，其特征是所說的超過濾的操作壓力為0.01-0.04MPa。
4.根據權利要求1所述的高純度真菌多糖的制備方法，其特征是所說的干燥為冷凍干燥或噴霧干燥。
5.根據權利要求1所述的高純度真菌多糖的制備方法，其特征是所說的殘渣再用0.5N NaOH提取，提取液加入1∶4的鹽酸溶液，調節至pH6.5-7.0后用硫酸銨攪拌后靜置1小時以上沉淀蛋白質，再離心去除沉淀，將上清液用膜分離裝置超過濾脫鹽，再經多次加稀釋水和超過濾循環操作，獲得真菌多糖濃縮液，濃縮液經干燥制得多糖純度達到97％-99.5％的真菌多糖粉末。
6.根據權利要求1所述的高純度真菌多糖的制備方法，其特征是所說的真菌包括香菇、靈芝、姬松茸的粉末狀子實體和深層發酵菌絲體。
7.根據權利要求1所述的高純度真菌多糖的制備方法，其特征是所說的稀釋水的重量是提取水重量的1/10-1/3。
8.根據權利要求1、5所述的高純度真菌多糖的制備方法，其特征是所說的離心去除沉淀是3000rpm離心20min去除沉淀。
9.根據權利要求1、5所述的高純度真菌多糖的制備方法，其特征是所說的膜分離裝置為截留分子量為10000的膜分離裝置。
10.根據權利要求1、5所述的高純度真菌多糖的制備方法，其特征是所說的多次加稀釋水和超過濾循環操作為至少20次加稀釋水和超過濾循環操作。
全文摘要
高純度真菌多糖的制備方法，以粉末狀真菌子實體或深層發酵的菌絲體為原料，經水提后，殘渣再用NaOH溶液提取，水提取液和經鹽酸中和后的堿提取液分別用硫酸銨沉淀，離心去除沉淀后，上清液用超過濾膜分離技術脫鹽并濃縮，濃縮液經冷凍干燥或噴霧干燥制得多糖純度達到97％以上的真菌多糖粉末。進一步可制成膠囊或片劑。濃縮液如不進行濃縮可直接用作水劑或注射針劑的原料。脫除的硫酸銨溶液經濃縮結晶后可循環使用或直接用作化學肥料。本發明工藝先進、合理、簡單，產品制備效率高，質量好，成本低。避免使用任何有機溶劑，無污染物質排放，適合大規模工業化生產。
文檔編號C08B37/00GK1454904SQ0311342
公開日2003年11月12日 申請日期2003年5月8日 優先權日2003年5月8日
發明者錢建亞 申請人:揚州大學