糖原的物理化學生產方法及該方法獲得的糖原的制作方法

專利名稱：糖原的物理化學生產方法及該方法獲得的糖原的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種由諸如淀粉、纖維素、葡聚糖(dextran)、支鏈淀粉(pullulan)等的多糖類物質、諸如麥芽糖等的低聚糖和含有這些糖類的諸如小麥粉、田七人參(Panax notoginseng)等含糖物料，物理化學生產糖原的方法。本發明還涉及通過此方法生產的糖原及其用途。
背景技術：
糖原是由類似淀粉的葡萄糖組成的同多糖(homopolysaccharide)，其是植物中的儲藏多糖(storage polysaccharide)。糖原具有聚合物結構，其中D-葡萄糖通過α1，4-糖苷鍵連接在一起并且由于α1，6-糖苷鍵而具有高度支化的結構，每8-10個葡萄糖殘基具有一個分支。
糖原已知是作為儲藏多糖。在動物中，糖原是以顆粒形式(糖原顆粒)存在于幾乎所有細胞中，特別是在肝臟和肌肉中大量存在。肌肉糖原是肌肉收縮的能量來源。肝臟糖原被用于在禁食期間保持血糖。糖原特征方面的差異對應于其功能方面的差別。肌肉糖原的分子量為1-2百萬。肝臟糖原的分子量為5-6百萬，并且有時高至2千萬(Iwanami Seibutsugaku Jiten(生物學字典)，第4版，p.354，Iwanami-Shoten(Tokyo)，1996年3月21日出版)。
盡管糖原是動物的儲藏多糖，糖原已知具有增強肝功能的作用。據報道，從墨魚和扇貝中提取的糖原具有潛在的抗腫瘤活性(Yosiaki Takata等，J.Mar.Biotech.，6.pp.208-213(1998))。這種糖原可用作用于功能食品的新物料并且其應用已得到開發。
糖原是由動物體內的單糖例如由葡萄糖等等生物合成的。
通常來說，多糖的糖鏈是通過化學方法或酶促方法(enzymatic method)合成的。兩種方法都基于異頭位置(anomer position)處的OH基團(其形成糖的半縮醛環)被預先作為離去基團活化并且隨后被另一種糖或生物組分所取代這一機理。迄今，使用化學方法已開發出唾液酸(sialyl)LeX神經節苷酯(對細胞粘著分子或癌癥相關抗原的研究的劃時代結果)、刺孢霉素(calicheamicins)(具有制癌作用)等等，使用酶促方法已開發出環糊精(具有包合作用)、偶聯糖(取代蔗糖的甜味劑，其不太會造成牙的腐蝕)等等。
在合成多糖糖鏈的化學方法中，例如，已知用酸來分解長鏈低聚糖；并且用稀酸處理各種所得的單糖，導致其中產生低聚糖化合物的逆反應。在酶促方法中，已知當用轉化酶(其是糖的水解酶)以高濃度和在高溫下處理蔗糖時，果糖轉化成葡萄糖，其中每1個蔗糖分子中有1-3個果糖分子，形成果糖低聚糖(fructooligosaccharide)。
通常，多糖糖鏈的化學合成需要糖供體(sugar donors)、糖受體(sugaracceptors)和啟動子。而且，必須制備糖供體和糖受體或任選的它們的衍生物；并且必須嚴格確定諸如溶劑、脫水劑、溫度等等因素。除此之外，需要復雜的步驟，例如保護基團的轉化或消除，特異性羥基基團的釋放等等。因此，化學合成多糖糖鏈并不容易。針對各種不同的底物，需要獨立確定糖供體和糖受體以及因素。還沒有任何已知的合成糖鏈的技術可以普遍性適用于各種底物原料，而與它們的類型無關。

發明內容
本發明人認真研究了多糖類物質(polysaccharides)的合成。結果發現，通過將含有儲藏多糖的植物或者將多糖類物質本身在酸的存在下加熱并且加壓，能夠生產出糖原。由此，本發明得以完成。根據本發明，通過簡單的操作，使用含有大量多糖類物質(例如，淀粉等等)的植物以及諸如淀粉、支鏈淀粉、纖維素、葡甘露聚糖(glucomannan)、木聚糖(xylan)、葡聚糖等的物料，可以獲得大量的糖原。本發明人進一步分析了所獲得的糖原的物理性質，從而完成了本發明。根據本發明，提供一種糖原類物質，特別是具有10,000或更低的低分子量的糖原。
本發明人曾經公開過兩步提取法(日本專利申請2001-280812，標題為“Hyomenkoshitsu-no-Kokeibutsu-karano-Yukoseibun-no-Tyusyutsuho-oyobi-Denshitinganyusyokuyososeibutsu[從具有硬表面的固體物質中提取有效成分和用于食品的含田七氨酸的組合物]”，2001年9月14日申請)，其中將田七人參在有機酸溶液中加壓處理，以便其外皮表面部分中的細胞破壞并且從田七人參中提取出礦物質，隨后，用稀乙醇溶液從提取殘余物中萃取有機組分，并且進一步揭示了可以獲得同時含有高濃度無機組分和有機組分的水溶性田七人參萃取物粉末。該田七人參萃取物粉末中含有約86％的糖質物質(glycosubstances)。注意這里所用的“％”是指重量百分比，除非有另外的說明。
本發明的發明人不認為田七人參中的這種高含糖量和抗肝炎作用僅僅歸因于人參皂苷化合物，雖然他們不希望被任何特定理論的束縛。本發明人認真研究了田七人參萃取物粉末中存在的糖，并且證實了糖中的一種物質是糖原，其與增強肝功能的作用有關。本發明人定量分析了這種糖原，結果完成了本發明。
結果，田七人參萃取物粉末中含有約37.45％(相對于物料的重量，約29.15％)糖原，其在田七人參本身中只含有約4.42％。將糖原從田七人參萃取物中純化并且通過NMR測定證實是真正的糖原。在糖原的純化過程中，經證實生產出的糖原具有各種分子量。基于這些發現，本發明人認為是酸和加壓操作引起糖組分發生轉糖基作用(transglycosylation)，從而產生糖原。
本發明涉及一種糖原的生產方法。該方法包括在酸性條件下加熱和加壓處理含糖物料的步驟。
含糖物料可以是多糖或低聚糖。
含糖物料可以是葡萄糖的同多糖。
含糖物料可以是淀粉、纖維素、支鏈淀粉或葡聚糖。
含糖物料可以是植物物料，選自田七人參(Panax notoginseng)、玄南文三七粉(Yun nan San-chi powder)(商標)、高麗人參(Panax ginseng)、小麥粉、大豆、大豆粉、香菇(shiitake)和咖啡萃取殘余物。
植物物料可以呈以植物的未加工組織、顆粒或粉末的形式。
優選，加熱步驟在有機酸的存在下進行。
優選，有機酸是檸檬酸。
優選，加熱步驟是在重量相對于含糖物料重量為約10％的檸檬酸的存在下進行。
優選，加熱步驟是在壓力條件下進行。
本發明還涉及含有得自植物的糖原的植物萃取物。該植物萃取物可以通過包括在酸性條件下加熱和加壓處理植物物料的步驟的方法來制備。
該方法還包括如下步驟將通過在酸性條件下加熱和加壓處理植物物料的步驟獲得的萃取物溶液與萃取物殘余物(extract residue)分離，并且使用有機溶劑萃取該萃取物溶液或萃取物殘余物。
代表性地，上述植物萃取物中含有高濃度的得自植物的糖原。植物萃取物如下制備。將呈原始形式(以下稱作“未加工形式”或者將呈原始形式的植物的整體或一部分稱作“未加工組織”)或呈顆粒或粉末形式的植物，在酸性條件下加熱預定的時間，接著進行加壓和加熱處理。將所得的萃取物溶液與通過將作為殘余物獲得的固體物質用約40-約60％乙醇進行加熱-萃取處理而獲得的萃取物溶液合并，隨后濃縮(condensation)。所得的植物萃取物可以粉化成萃取物粉末的形式。
代表性地，上述的酸性條件通過添加有機酸來實現，優選pH 6或更低。優選地，有機酸可以是檸檬酸。注意，本文所用的術語“得自植物的糖原”是指包含在植物(根、莖、葉)中的糖原或者從植物中所含的糖生產的糖原。這里所用的術語“植物物料”是指植物(根、莖、葉)；通過加工獲得的其任何形式的部分，例如通過切割、粉碎等(顆粒、切片等等)；植物的整體或一部分中的萃取物等等。
本發明還涉及分子量為10,000或更低的糖原。
代表性地，糖原的分子量為約3,000，約9,000或約9,500。
本發明還涉及含有分子量為10,000或更低的糖原作為主組分的組合物。
組合物可以含有分子量為約320,000的糖原和分子量為約3,000的糖原。
組合物可以含有具有[α]D+197°比旋光度且在1HNMR圖譜中于5.37ppm和4.95-5.33ppm下具有異頭質子峰的糖原。
組合物可以含有分子量為約280,000的糖原和分子量為約9,000的糖原。
組合物可以含有具有[α]D+178°比旋光度且在1HNMR圖譜中于4.97ppm和5.22-5.33ppm下具有異頭質子峰的糖原。
組合物可以含有分子量為約3,000,000的糖原、分子量為1,200,000的糖原和分子量為約9,500的糖原。
組合物可以含有具有[α]D+174°比旋光度且在1HNMR圖譜中于5.38ppm和4.96ppm下具有異頭質子峰的糖原。
本發明還涉及食用組合物，該組合物含有上述的植物萃取物。該食用組合物可以通過加入上述的植物萃取物或萃取物粉末作為糖原組分來制備。


圖1顯示了本發明的糖原的產率隨時間的示意圖。
圖2顯示了本發明組合物的HPLC分析的色譜圖。
圖3A顯示了本發明組合物中所含的糖原的NMR圖譜。圖3A(a)顯示了本發明組合物中所含的得自田七人參的純化糖原的NMR圖譜。圖3A(b)顯示了標準糖原的NMR圖譜。
圖3B顯示了本發明組合物中所含的糖原的NMR圖譜。圖3B(c)顯示了本發明組合物中所含的得自葡聚糖的純化糖原的NMR圖譜。圖3B(d)顯示了得自淀粉的糖原的NMR圖譜。
具體實施例方式
下面將詳細描述本發明的實施方案。
作為本發明糖原的起始原料的含糖物料，一般包含多糖類物質，例如淀粉、纖維素、葡聚糖、支鏈淀粉等等，還包含低聚糖，例如麥芽糖等。天然存在的含糖植物物料，例如田七人參等等，可以用作含糖物料。田七人參中含有高濃度的人參皂苷、礦物質和維生素，并且可以是以任何未加工組織的形式和經粉碎的細粒、微粒和細粉末形式，作為本發明糖原的起始原料使用，無需考慮產地和收割的時間。
本發明的糖原通過包括在酸性條件下加熱和加壓處理上述含糖物料的方法來生產。
上述的酸性條件可以通過添加無機酸例如磷酸、鹽酸等等來實現。或者，酸性條件可以通過添加檸檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸和葡糖醛酸及這些有機酸的鈉鹽或鉀鹽、及其混合物來實現。乙酸可以是食用醋酸(合成醋和發酵醋，如蘋果發酵醋(apple cider vinegar)，果醋，海藻醋(kelp vinegar)、酒醋(wine vinegar)等等，及其任何比例的混合物)。更優選，酸性條件可以通過使用檸檬酸和乙酸來實現。首選，酸性條件可以通過使用檸檬酸來實現。
將足夠量的上述無機酸或有機酸添加至致使含有含糖物料的水溶液的pH達6或更低并且優選pH達5-1的程度，或者相對于含糖物料，一般來說是0.1-20wt％，更優選1-15wt％并且首選5-10wt％。一般來說，在向含糖物料添加酸之前，將亟待添加至含糖物料中的酸在比含糖物料大2-15倍、優選8-10倍體積的水中稀釋。
在酸性條件下加熱處理含糖物料的步驟是在約100℃的大氣壓條件下進行，一般來說進行10分鐘至數小時，優選30分鐘至2小時。或者，此加熱步驟可以是在75℃至125℃的1-1.3kf/cm2壓力條件下(取決于容器)進行。在此情形中，人選的是，在加壓條件下加熱之前，可以預先將含有含糖物料的含酸溶液在約100℃的大氣壓條件下加熱，一般來說加熱10分鐘至數小時，優選30分鐘至2小時，由此增加糖原的生產效率。
本發明的糖原的生產方法還可以包括將含有糖原的溶液與加熱的含糖物料分離。該分離含糖原溶液的步驟可以通過本領域已知的方法來完成，例如過濾、離心等等。可以將所獲得的含糖原溶液濃縮并且通過本領域已知的方法干燥，例如冷凍干燥、噴霧干燥等等，以便獲得含糖原的粉末。
任選的是，本發明的糖原可以從含糖原的粉末中經過進一步純化后使用。糖原的純化可以通過本領域公知的方法來完成。例如，參見KazuoMatsuda編“Tato-no-Bunri·Seiseiho[多糖的分離和純化方法]”pp.130-131，1989。這種方法包括使用醇的分級沉淀。代表性地，醇包括甲醇和乙醇。任選的是，在進行上述加工之前，可以對含糖原的粉末進行脫蛋白質或類似處理。這種脫蛋白質處理包括三氯乙酸處理，使用諸如醇、氯仿等溶劑的處理，這些是本領域已知的。針對純化的糖原，可以使用已知的方法，例如凝膠過濾、比旋光、NMR測定試驗等等，來鑒定物理性質，例如分子量、分子量分布、葡萄糖鍵類型等等，并且分析結構。
下面將描述一種有效生產本發明含糖原粉末的具代表性的示例性方法。
將適當粒化的田七人參在10wt％檸檬酸水溶液中，于90-100℃下加熱1小時，同時任選進行攪拌。之后，在開始增壓同時保持1.1-1.3kgf/cm2后，將溶液加壓和加熱處理兩小時，隨后將萃取物溶液與固體部分的萃取物殘余物按照常用方法如過濾等方法分離。將所獲得的萃取物溶液進行干燥處理(冷凍干燥、噴霧干燥等等)，以獲得本發明的含糖原的粉末。注意田七人參可以是以未加工組織、細粒和粉末的任何形式使用。
在上述的實例中，使用田七人參作為含糖物料。本發明不限于此，并且可以使用諸如小麥粉、大豆、高麗人參(Panax ginseng)、Zinsic、姜黃等等的植物物料作為含糖物料來代替田七人參來實施本發明的方法。同樣在此情形下，可以將這些植物物料中所含的糖質物質轉化成糖原，而不會損害物料中所含的有效組分，并且可以獲得含各自糖原的粉末。在本發明的生產糖原的方法中，可以使用糖本身，例如多糖類物質、低聚糖類物質等等，作為起始原料來代替上述的植物物料。能夠理解的是，本發明不限于上述的含糖物料。
本發明的含糖原的粉末具體表征為其是高度水溶性的。因此，該粉末可以施用于液體、凝膠或固體形式的食品組合物，而不限制其類型。例如，可以將粉末添加至軟飲料、果汁、茶、果凍、布丁、面包、餅干、焦糖(caramels)、Okaki(米餅)等等中。可以將粉末加工成粉劑、粒劑或片劑，任選與賦形劑如淀粉、糊精、乳糖等等一起使用，及其它可食用組合物，如萃取物、顏料、調味品等等一起，或者，可以用包衣劑(coating agent)包膠(encapsulated)，例如用明膠等等。所得的產品可以用作保健食品、膳食補劑等等。能夠理解的是，本發明的含糖原粉末的食用組合物應用不限于上述的實例。
食用組合物中含糖原粉末的含量可以是約0.1-100wt％，取決于食用組合物的類型、條件等等。
本發明的含糖原的粉末可以容易地與其它物質以可調的方式混合，致使粉末高度有效地起功能因子的作用。這是因為植物物料的有效組分是以水溶性的形式被萃取出的。
下面，將通過實施例的方式來描述本發明。以下的實施例是舉例說明性的，本發明不限于此。
實施例(實施例1)制備田七人參萃取物將91kg的田七人參顆粒(2-3mm)、9kg檸檬酸和550L水放入具有加壓設備的容器中，接著在90-96℃下加熱1小時。之后，將混合物在1.1kgf/cm2壓力下保持1小時。使用具有NA500濾紙的壓濾裝置，將所得的反應溶液過濾。將所得的萃取物溶液等分。之后，向田七人參萃取物殘余物中添加700L的45％乙醇溶液，接著在65℃下回流加熱2小時。使用具有NA500濾紙的壓濾裝置，將所得的反應溶液過濾，并且將此乙醇萃取物溶液等分。將如此獲得的檸檬酸萃取物溶液和乙醇萃取物溶液混合在一起并且濃縮。將所得的濃縮溶液噴霧干燥，得到65.76kg萃取物粉末(冷凍干燥粉末)。分析萃取物粉末中所含的組分。測定結果示于下表1中。
正如表1中的a)所示，所獲得的田七人參萃取物粉末中含有37.45％糖原。注意，糖原是參照牡蠣萃取物食品標準(日本Health Food & Nutrition FoodAssociation)來測定的；在表1中，糖原濃度(％)是由通過冷凍干燥獲得的萃取物粉末中的糖原含量以單位wt％來表示的，并且糖原生產率是由萃取物粉末中所含的糖原的重量除以起始原料重量來表示的(相對于原料重量的計算值)。
表1-a)顯示了玄南文三七粉(商標)萃取物粉末、高麗人參未加工組織萃取物粉末、小麥粉萃取物粉末、大豆未加工組織萃取物粉末、大豆粉萃取物粉末和香菇(Lentinula)萃取物粉末中所含的糖原的測量結果，它們按類似以下實施例4中所示的方法獲得，不同之處是使用10-30g的萃取物粉末。正如表1-a)所示，玄南文三七粉(商標)萃取物粉末、高麗人參未加工組織萃取物粉末、小麥粉萃取物粉末、大豆未加工組織萃取物粉末、大豆粉萃取物粉末和香菇萃取物粉末中分別含有32.70wt％、18.29wt％、47.06wt％、5.82wt％、44.03wt％和1.74wt％的糖原。表1-b)中所示的結果在以下實施例4中描述。
表1a)通過本發明方法從植物中生產糖原

*FD表示冷凍干燥。括號內的數值表示植物的原始糖原含量。
*1萃取在125℃下使用熱水在加壓條件下進行*2沒有獲得結果，因為咖啡萃取物殘余物的含水量不清楚。
b)

(實施例2)對糖原的生產條件的研究接下來，通過改變加壓時間來比較糖原的生產率。
將175mL水、30-35g田七人參未加工組織和相當于9wt％田七人參未加工組織的檸檬酸添加至四只錐形瓶的每只中，進而將它們用食品包裝膜覆蓋，接著在高壓釜中，于1.1-1.2kgf/cm2壓力條件下分別沸騰10min、20min、35min和60min。使每份反應產物冷卻。將反應產物的溶液部分離心(3,000rpm，5min)，獲得萃取物溶液。將沉淀的殘余物返回仍含有原始田七人參未加工組織的錐形瓶中。向燒瓶中添加200mL的50％乙醇溶液，進而給燒瓶裝配回流冷凝器，并且將溶液在85℃下加熱1-1.5小時。使所得的加熱溶液冷卻，隨后離心(5,000rpm，10min)。將乙醇萃取物溶液等分，然后與先前等分的萃取物溶液混合，接著減壓濃縮，然后冷凍干燥，得到粉末。
測定所得萃取物粉末的產量和糖原含量，并且結果示于圖1。如圖1所示，在35min的加壓時間處，萃取物粉末的產率最高，74％，并且在10min時糖原產率達到約40％，并且隨后幾乎恒定，直至60min。因此，可以判斷對于在1.1-1.2kgf/cm2壓力條件下的加壓時間，35min是足夠的。
(實施例3)在實施例2所獲得的壓力條件下(即，1.1-1.2kgf/cm2，35min)，通過改變檸檬酸濃度來比較糖原的產率。進行與實施例2相同的過程，不同之處是將檸檬酸的濃度改變成相對于原料的5、6、7、8和9％。結果示于下表2。正如表2中所示，在添加9％檸檬酸的情形中，糖原的生產率最高41.4％。
表2糖原生產對檸檬酸濃度的依賴性

(實施例4)將除Panax notogingseng以外的樣品，在類似于實施例2的壓力條件下進行萃取處理，以便研究通過本發明萃取方法的糖原生產。
將10-30g的玄南文三七粉(商標)、玄南文三七粉(商標)萃取物粉末、高麗人參未加工組織萃取物粉末、小麥粉萃取物粉末、大豆未加工組織萃取物粉末、大豆粉、大豆粉萃取物粉末、香菇、香菇萃取物粉末、靈芝(Ganodermalucidum)、靈芝萃取物粉末和咖啡萃取物殘余物，按與實施例2類似的方式，在加壓條件下(1.1-1.2kgf/cm2，35min)處理。最后，獲得冷凍干燥的粉末并且測定其的糖原含量。結果示于上表1中。
正如表1-a)中所示，田七人參萃取物粉末中含有約29.15％(相對于原料的重量)的糖原，其在田七人參本身中只含約4.42％。由此，通過本發明的加壓處理，糖原含量增加6.5倍或更大。類似地，對于“Yun Nan San-chi powder玄南文三七粉(商標)”來說，其由田七人參制造并且含有1.51％糖原，通過本發明萃取方法獲得的萃取物粉末中含有20.05％糖原，即糖原含量增加13.3倍。
由干燥高麗人參(其與田七人參同屬)未加工組織和干燥大豆未加工組織制作的萃取物粉末中，其糖原含量相對于原料重量分別為5.49％和1.60％。這些數值比田七人參小一個或更多個數量級。小麥粉萃取物粉末的糖原含量相對于原料重量為32.78％。
由大豆制作的大豆粉和大豆粉萃取物粉末中的糖原含量，相對于原料的重量，分別為0.47％和2.02％。由此，通過本發明的萃取方法，糖原含量增加約4.3倍。
香菇(其中包括蘑菇)及其萃取物粉末的糖原含量，相對于原料的重量，分別為0.15％和0.75％。由此，通過本發明的萃取方法，糖原含量增加約5倍。
咖啡萃取物殘余物萃取物粉末的糖原含量相對于萃取物粉末的重量為8.64％。
相反，通過本發明的萃取方法，靈芝和傘菌(Agaricus)的糖原含量從原始的含量降低。
上述結果說明，通過包括在酸存在下加熱和加壓的物理化學方法，可以從植物中生產大量的得自植物的糖原。在蘑菇類植物中，香菇含有蘑菇多糖，其是具有抗腫瘤活性的β-葡聚糖，且傘菌也含有具有抗腫瘤活性的β-葡聚糖。通過本發明的方法，可以識別出在香菇和傘菌之間的顯著區別，即香菇中的糖原增加而傘菌中的糖原降低。這是值得注意的結果。
注意表1-b)中顯示的Pien Tze Huang是一種含有85％田七人參的中藥。Pien Tze Huang含有約3％的糖原，其與田七人參本身的糖原含量是不同的。
(實施例5)為證實當對得自植物的物料進行本發明萃取方法的處理來生產糖原時會導致糖原含量的增加，使用各種糖作為原料并且按與實施例2相同的方式進行處理，并且測定糖原含量。結果示于下表3。
表3通過本發明的方法由各種單糖、低聚糖和多糖生產糖原


作為原料，使用淀粉，淀粉大量包含在高級植物的種籽、根、根莖等中。淀粉是由D-葡萄糖組成的多糖。
i)馬鈴薯淀粉制備含有檸檬酸的馬鈴薯淀粉樣品及不含檸檬酸的馬鈴薯淀粉樣品。所得的樣品呈具有白色不溶物的混濁水溶液形式。將樣品在1.1kfg/cm2下加壓處理35min，使得含有檸檬酸的樣品呈軟粘(runny)溶液形式而不含不溶物，而不含檸檬酸的樣品是透明的，但仍存在不溶物。因此，將不含檸檬酸的樣品離心，除去剩余的不溶物，得到透明樣品溶液。
對于其中仍存在不溶物的含檸檬酸的樣品而言，向反應溶液中添加乙醇至45％濃度。對于不含檸檬酸的樣品，向分離出的不溶物添加45％乙醇。將各樣品加熱一小時。對于含有檸檬酸的樣品，在所獲得的反應溶液中，看出有輕微的沉淀，而不含檸檬酸的樣品，生產絲狀沉淀。將除去這些沉淀的溶液與前面的加壓處理后獲得的各自的反應溶液混合，接著濃縮并且冷凍干燥。測定所得粉末的糖原含量。
結果，在根據本發明方法處理的馬鈴薯淀粉中發現大量的糖原，達到23.04％。在不含檸檬酸的對照樣品中，在冷凍干燥粉末中沒有發現糖原，如表3中所示。
ii)玉米淀粉對于玉米樣品，與馬鈴薯淀粉類似，制備含檸檬酸的樣品和不含檸檬酸的樣品。在加壓反應之后，兩種樣品都轉變成凝膠狀，從而不能將溶液部分與沉淀分離。將乙醇直接加入各自的樣品中至45％，接著加熱1小時。結果，對于含檸檬酸的樣品，獲得粉狀不溶物，通過過濾分離和去除，獲得溶液部分。對于不含檸檬酸的樣品，產生連續的布狀不溶物。將不溶物纏繞在玻璃棒周圍并且去除，得到透明溶液部分。將各溶液部分濃縮至預定的量，接著冷凍干燥，獲得萃取物粉末。定量分析所得萃取物粉末中的糖原。結果，在不含檸檬酸的樣品的萃取物粉末中沒有發現糖原，而在具有檸檬酸的樣品中發現12.02％的糖原。
iii)可溶性淀粉正如表3中所示，通過本發明的萃取方法，從可溶性淀粉中產生0.82％的糖原。
iv)纖維素、支鏈淀粉和葡聚糖通過本發明的萃取方法，從纖維素、支鏈淀粉和葡聚糖中產生0.65％、36.78％和71.26％的糖原。對于葡聚糖，在加壓處理之后及在添加45％乙醇接著加熱之后，反應溶液都分離成兩層。因此，將溶液的頂層部分和底層部分彼此分離。將各部分濃縮，接著冷凍干燥。由此，獲得冷凍干燥粉末。來自頂層部分和底層部分的冷凍干燥粉末中分別含有32.60％和38.66％糖原，即，獲得總共71.26％糖原。
v)棉子糖、麥芽糖、海藻糖、蔗糖和葡萄糖另一方面，當使用棉子糖(三糖)、麥芽糖、海藻糖和蔗糖(雙糖)及葡萄糖(單糖)時，根據本發明的萃取方法從棉子糖和麥芽糖中發現0.39％和0.28％的糖原。當使用海藻糖、蔗糖和葡萄糖作為原料時，沒有檢測到糖原。
當使用雙糖作為原料時，糖原產生與否歸因于麥芽糖是還原糖，而海藻糖和蔗糖是非還原糖。當使用海藻糖和蔗糖作為原料時，可推斷出產生了多糖而非糖原。由此，認為使用葡萄糖是難以形成多糖的。
如上所述，當將本發明的萃取方法應用于多糖類物質時，可以看到糖原的產生。由此，證實了可以通過在酸存在下的物理化學方法，從植物中產生得自植物的糖原。
例如，據推斷當使用田七人參和葡聚糖的混合物作為原料時，可以產生糖原，其結構不同于當將各自原料分開使用時產生的糖原。可以預期，例如，從咖啡萃取物殘余物中所含的甘露聚糖中，可以產生新的物質如糖原。
(實施例6)將50％牡蠣萃取物、28.9％在與實施例2類似條件下獲得的田七人參萃取物粉末，和3％潤滑蠟混合，并且進行篩析。向所得的混合物添加20％乳糖、1％三磷酸酸鈣和2.0％蔗糖脂肪酯，接著徹底混合。將所得的混合物壓片，接著用蟲膠包衣并且拋光，生產原型食用組合物片劑。
(實施例7)將62.5％在與實施例2類似條件下獲得的田七人參萃取物粉末和12.2％麥芽糖醇(multitol)預先混合，接著添加0.5％支鏈淀粉，生產初級顆粒(含有1-2％水分)。向此初級顆粒中添加16.8％發酵姜黃和8％潤滑蠟，同時預混合，隨后徹底混合。將混合物壓片。將片劑用酵母包裝材料和甘油包衣，生產原型食用組合物。
(實施例8)使用混合器，將10.0wt％維生素E、6.6wt％麥芽糖和1.6wt％磷酸鈣混合，產生預混合物粉末。將此粉末與20.9wt％在與實施例2類似條件下獲得的田七人參萃取物粉末、10wt％淀粉和45wt％乳糖-粉末纖維素徹底混合，接著篩析。將混合物放入混合器中，并且向混合物添加5wt％蔗糖脂肪酯、0.9wt％磷酸鈣和5wt％乳糖-粉末纖維素，隨后混合。將所得的粉末壓片，接著用蟲膠包衣并且拋光，生產原型食用組合物片劑。
(實施例9)將48.99wt％在與實施例2類似條件下獲得的田七人參萃取物粉末、8.6wt％維生素C、0.12wt％鹽酸維生素B6、5wt％蔗糖酯和6.04wt％晶體纖維素混合。將此混合物與31.25wt％還原麥芽糖水溶液混合，接著壓片。以相對于片劑7-8％的量制備蟲膠10wt％乙醇溶液。將此溶液噴灑在片劑上，作為蟲膠包衣用，生產原型食用組合物。
(實施例10)制備純化糖原1、由馬鈴薯淀粉和葡聚糖制備純化糖原當嘗試將20g從馬鈴薯淀粉中按與實施例5i)類似的方式獲得的含糖原粉末溶解于200mL純化的水中時，粉末完全溶解。將此無色溶液在95℃下加熱20min，然后在室溫下冷卻。之后，將溶液在5℃冷卻1.5小時。確認溶液轉變成微混濁。因此，將溶液在8,500rpm下離心6min，以除去混濁物。將所得的上清液在5℃下冷卻。之后，向上清液中添加三氯鹽酸至5％濃度并且在5℃下放置過夜。之后，通過離心(8,500rpm，6min)除去沉淀。將所得的上清液添加至3倍體積的甲醇中。通過離心(8,500rpm，10min)收集所得的沉淀。將所得的沉淀順序用甲醇和乙醚洗滌。將此沉淀在真空干燥器中室溫下干燥2小時，得到粗糖原。
將20g所獲得的粗糖原放入玻璃紙管中，隨后針對1.4-1.5L純化水在5℃下滲析3天。在此期間，每天更換新鮮的純化水。之后，將滲析液冷凍干燥。所得的干燥粉末即是純化糖原。
接下來，由從葡聚糖中按與實施例5iv)類似的方式獲得的含糖原粉末，類似地獲得純化糖原。馬鈴薯和葡聚糖中的純化糖原的產率分別為16.2％和18.2％。
上述純化糖原試樣的物理性質示于下表4中。
表4

注意，在表4中，含糖量(sugar content)是通過制備各試樣的5％溶液并且使用白利糖度折射計(brix refractomer)(Atago制造)測量來測定的。碘反應是使用0.01mol/L碘溶液來進行的。此外，純化糖原中的糖原含量是按照牡蠣萃取物食品標準(Japan Health Food & Nutrition Food Association)測定的。
2、從田七人參制備糖原當將30g按實施例1所述從田七人參中獲得的含糖原粉末溶解于300mL純化水中時，產生不溶物。通過離心(8,500rpm，6min，10℃)除去不溶物，獲得褐色上清液。將此上清液在95℃下加熱20min并且使之在室溫下冷卻。之后，將上清液在5℃下冷卻1.5小時。溶液的混濁度增加。在8,500rpm下離心6min，除去混濁組分，獲得上清液。將此上清液冷卻至5℃過夜。向上清液中添加三氯鹽酸至5％濃度并且在5℃下放置。之后，通過離心(8,500rpm，6min)除去沉淀。將所得的上清液添加至三倍體積的甲醇中。離心收集所得的淡褐色沉淀。將所得的沉淀用甲醇洗滌并且溶解于約200mL二甲基亞砜(DMSO)中。離心(6,500rpm，10min，10℃)除去不溶物。向所得上清液中加入三倍體積的乙醇，進行再沉淀。此乙醇再沉淀進行另外兩次，以便純化。之后，通過用純化水替換DMSO進行兩次再沉淀，進行純化。將所得的乳白色沉淀在室溫下真空干燥，獲得24.7g干燥粉末。將20g此干燥粉末溶解于140mL純化水中，向其中添加36mL異戊醇和108mL氯仿的混合物，接著溫和搖動10小時。將此溶液靜置。之后，將所得的水層等分，接著離心(7,500rpm，30min，10℃)。通過添加36mL異戊醇和108mL氯仿的混合物來進行該除去蛋白質的操作兩次。之后，將所得的白色變成黃白色的溶液放入玻璃紙管中，接著針對1.4-1.5L純化水在5℃下滲析3天。在此期間，每天更換新鮮的純化水。之后，將滲析液冷凍干燥，獲得13.4g純化糖原(糖原是69.0％并且糖原產率是11.9％)。此純化產物在碘反應中顯現品紅顏色。
(實施例11)分析純化糖原1、分子量通過凝膠過濾測定實施例10中獲得的純化糖原的分子量。
1、1制備樣品將從淀粉、葡聚糖和田七人參中獲得的純化糖原分別稱重至3.16mg、3.32mg和3.33mg。將各純化糖原溶解于1mL純化水中，對其的50μL進行HPLC分析。
1、2HPLC裝置和測定條件HPLC分析的條件如下。
HPLC裝置LC-7A，帶有UV分光光度計檢測器SPD-6A(ShimazuCorporation)柱Shodex Asahipak CS-620(50cm×7.6mm I.D.)(Showa Denko制造)流動相純化水流動相流速0.8mL/min檢測波長UV280nm1、3結果使用校準曲線，其使用支鏈淀粉和葡萄糖低聚物作為標準物質制備，基于HPLC分析中的停留時間測定各樣品中所含的糖原的分子量。圖2顯示了HPLC分析的示例性色譜圖。在圖2中，(a)表示得自葡聚糖的純化糖原的色譜(chromatogram)，(b)表示得自田七人參的純化糖原的色譜，并且(c)表示得自糖原的純化糖原的色譜。注意，圖2的(a)、(b)和(c)各自顯示了相同樣品的結果，其中左手的色譜顯示的是使用UV分光光度計檢測器的測量結果，右手的色譜顯示的是使用差式折光計檢測器的測量結果。正如圖2所示，它揭示了各個樣品是由多種基于不同分子量的分子物質組成的。各個分子物質的分子量和各個分子物質相對于樣品重量的比例示于下表5。
表5

正如表5所示，它揭示了從淀粉中獲得的糖原含有分子量為3,000的分子作為主組分；從葡聚糖中獲得的糖原含有分子量為9,000的分子作為主組分；并且從田七人參中獲得的糖原含有分子量為9,500(60.6％)的分子作為主組分。
與從田七人參中生產的糖原相比，從淀粉和葡聚糖中生產的糖原具有的特征性特點是它們具有小分子量。根據文獻(Seibutugaku-Jiten[生物學字典]，Iwanami Syoten，見上)，肝糖原的分子量為5-10×106，而肌肉糖原的分子量為1-2×106。它揭示了與這些數值相比，這三種純化糖原都具有相對低的分子量。
2、比旋光度將實施例10獲得的各純化糖原精確稱重至0.1g樣品，向其中添加純化水至20mL。將各樣品溶液放入長度為200mm的測量管中。使用旋光計(Elmer制造)測定各樣品的比旋光度。
結果，從淀粉、葡聚糖和田七人參中獲得的純化糖原的測量值分別為[α]D+197.2°、[α]D+178.4°和[α]D+174.1°。
根據文獻(Seikagaku-Jiten[生物化學字典](第3版)，Tokyo Kagaku Dojin，p.402，1998年10月8日)，糖原溶液的比旋光是[α]D+197至200°(淀粉的比旋光度是[α]D+202°)。得自淀粉的純化糖原溶液是表明比旋光度在此范圍內的溶液。得自田七人參和葡聚糖的純化糖原溶液的比旋光度比文獻中所描述的數值低。
3、1H NMR測定通過1H NMR測量值來表征按與實施例10類似方式獲得的純化糖原。糖原是由葡萄糖組成的同多糖，并且可以使用來自異頭質子的信號作為指示劑來鑒定，其中所說的異頭質子得自葡萄糖。1H NMR測定如下進行。
3、1制備樣品得自淀粉和葡聚糖的純化糖原溶液對于每一種，制備11mg/0.65mL D2O溶液。糖原試劑(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造標準物質)和得自田七人參的純化糖原對于每一種，制備10mg/0.65mL D2O溶液。
3、2測定條件在以下條件下使用UNITY INOVA 600型裝置(Varian Corporation制造)。
觀察頻率599.6MHz；溫度45℃；觀察寬度6KHz；脈沖寬度30°并且脈沖重復時間7秒。
3、3結果(1)標準物質對于糖原試劑(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)，在5.39ppm周圍和4.98ppm周圍觀察有異頭質子峰。異頭質子峰的一個示例性峰見圖3A(b)。
5.39ppm處的峰歸于α1，4-鍵。4.98ppm處的峰歸于α1，6-鍵。α1，6-鍵占約5％。在1-3.3ppm處觀察到的峰據推測對應于雜質。
(2)得自田七人參的純化糖原正如圖3A(a)所示，實施例10第2部分中的得自田七人參萃取物粉末的純化糖原，具有對應于α1，4-鍵的5.38ppm異頭質子峰和對應于α1，6-鍵的4.96ppm異頭質子峰，如同圖3A(b)所示的標準糖原(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造)，由此證實是糖原。比較得自田七人參萃取物粉末的純化糖原與標準物質之間在5.38ppm和4.96ppm處的異頭質子的信號水平比，得自田七人參萃取物粉末的純化糖原的比是約10∶1(70.9/7.1)，標準物質的比是約20∶1(80.2/4.4)。這說明差別歸因于得自田七人參萃取物粉末的純化糖原與標準物質的微結構的不同，例如糖鏈結構中的支化程度等等。考慮表明微結構和抗腫瘤活性之間關系的報導(Yosiaki Takata等，J.Mar.Biotech.，6.pp.208-213(1998))，認為微結構的差別與田七人參的抗腫瘤活性有關。得自田七人參的純化糖原，據推測對應于雜質的峰僅僅存在于1.2ppm和2.7ppm處，由此說明其的純化程度相比于標準物質是高的，其中所說的標準物質中據推測對應于雜質的峰存在于1-3.3ppm處。α1，6-鍵占約10％。
(3)得自淀粉的純化糖原對于得自淀粉的純化糖原，在5.37ppm、5.33ppm和4.95ppm處觀察有異頭質子峰(圖3B(d))。這些峰與糖原試劑的上述異頭質子峰很好地相一致。
5.37ppm峰可能歸于α1，4-鍵。得自淀粉的純化糖原通常顯示具有頂點(sharp peaks)的高分辨率圖譜。這是因為如上所述，得自淀粉的純化糖原含有分子量小于糖原試劑的分子。α1，6-鍵占約8％。
(4)得自淀粉葡聚糖的純化糖原對于得自葡聚糖的純化糖原，在4.97ppm處主要觀察有異頭質子風格(圖3B(c))。該峰歸于α1，6-鍵。葡聚糖是主要含有α1，6-鍵的葡萄糖同多糖。歸于α1，4-鍵的5.3ppm處的峰是小的。對于得自葡聚糖的糖原來說，這個峰較小。
4、單糖組成將淀粉酶添加至按與實施例13類似方式從各種含糖物料中獲得的純化糖原的水溶液中，以便酶促降解純化糖原。將各自所得的降解溶液點在硅膠平板上，接著使用異丙醇和純化水(16∶4)的混合物溶液作為展開劑進行TLC分析。展開之后，回收平板，接著在室溫下干燥。將平板上噴灑稀硫酸溶液，接著在115℃下加熱約3min。
結果，任何溶液(其中純化糖原被酶促降解)顯示Rf值為0.59，其等于作為標準樣品的葡萄糖(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)的Rf值(結果未顯示)。由此證實任何純化糖原都具有葡萄糖的單糖組成。另一方面，在酶促降解前用相同溶劑將得自各種含糖物料的純化糖原展開。在這種情況中，斑點保留在開始點(即，未展開)，如同標準糖原(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)那樣。
(實施例12)測試純化糖原對肝功能的改進作用給小鼠腹膜內注射按與實施例10第2部分類似方式獲得的得自田七人參的純化糖原，以便體內測試肝功能的改進。
1、對象使用ICR誘導型雄性小鼠(MDS Pharm Services制造，體重22±2g)進行體內試驗。
2、測試用樣品使用純化糖原和水飛薊素(Silymarin)(注冊商標)(Sigma制造)作為測試用樣品。水飛薊素是陽性對照，其具有改進肝功能的作用。將糖原和水飛薊素溶解于含2％Tween 80(注冊商標)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)的0.9％鹽水中至預定的濃度。
3、劑量每只小鼠腹膜內注射300mg/kg或400mg/kg純化糖原(糖原組)。作為對照，每只小鼠腹膜內注射10mL/kg含2％Tween 80的0.9％鹽水(對照組)。每只小鼠腹膜內注射100mg/kg陽性對照水飛薊素(水飛薊素組)。
4、試驗方法對每個組，使用5只ICR誘導型小鼠(22±2g)。給每只小鼠立即注射溶解于50％橄欖油中的四氯化碳溶液(0.1mL/Kg)，以便誘發肝失調(liverdisorder)。在注射四氯化碳之前30分鐘、之后4小時和之后8小時，腹膜內注射300mg/kg或400mg/kg各待測樣品。最后注射之后24小時，殺死小鼠并且收集血液。使用常用的分光光度測定法，使用自動分析儀(紫外線檢測)測定血清GPT(SGPT)和GOT(SGOT)水平(分別使用GPT測量試劑盒和GOT測量試劑盒(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造))。
5、實驗結果測量結果示于下表6。
表6得自田七人參的純化糖原的肝功能改進作用

表6中，數字(IU/L)是每組5只小鼠的SGPT和SGOT的平均值。括號內的平均后的數值表示各組測量結果相對于對照組測量結果的降低率。
當SGPT和SGOT數值低于對照數值時，肝功能改進作用通常得到確認。正如表6中所示，對于糖原組，300mg/Kg和400mg/Kg注射顯示SGPT降低10-11％并且SGOT降低15-16％，由此說明純化糖原具有中等程度的肝功能改進作用。陽性對照水飛薊素顯示SGPT降低71％并且SGOT降低80％，即，顯著的肝功能改進作用。注意當SGPT和SGOT降低30％或更多時，肝功能改進作用被判斷是顯著的。
(實施例13)測試田七人參萃取物的肝功能作用按照與實施例12所述的相同方法進行肝功能改進試驗，不同之處是使用按實施例1所述的獲得的田七人參萃取物粉末，試驗結果示于下表7。
表7田七人參萃取物粉末的肝功能改進作用

與表6類似，表7中的數字(IU/L)是每組5只小鼠的SGPT和SGOT的平均值。括號內的平均后的數值表示各組測量結果相對于對照組測量結果的降低率。
正如表7所示，田七人參萃取物組顯示SGPT降低71％并且SGOT降低69％。由此說明田七人參萃取物顯示顯著的肝功能改進作用。
工業實用性本發明提供一種糖原的生產方法，該方法包括在酸性條件下加熱和加壓處理多糖、含大量淀粉的植物等等，其中只需要非底物特異性和簡單的操作。根據本發明的方法，可以從各種物料中獲得各種糖原。通過分析這些糖原的性質，提供了可用于食品物料、輸注溶液物料等等的原料。
糖原已知是作為動物的儲藏多糖以及具有增強肝功能的作用。此外，據報道，從墨魚、扇貝等中提取的糖原類物質具有潛在的抗腫瘤活性。由此，可以預料糖原作為新功能食品的應用。
本發明提供糖原，特別是分子量為10,000或更低的低糖原。本發明提供通過簡單操作，使用含有大量多糖(如淀粉等)、淀粉、支鏈淀粉、葡聚糖等等作為原料獲得的糖原。
權利要求
1.一種糖原的生產方法，包括在酸性條件下加熱和加壓處理含糖物料的步驟。
2.權利要求1的方法，其中含糖物料是多糖或低聚糖。
3.權利要求1的方法，其中含糖物料是葡萄糖的同多糖。
4.權利要求1的方法，其中含糖物料是淀粉、纖維素、支鏈淀粉或葡聚糖。
5.權利要求1的方法，其中含糖物料是植物物料，選自田七人參、玄南文三七粉(商標)、高麗人參、小麥粉、大豆、大豆粉、香菇和咖啡萃取殘余物。
6.權利要求5的方法，其中植物物料是以植物的未加工組織、顆粒或粉末的形式存在。
7.權利要求1的方法，其中加熱步驟在有機酸的存在下進行。
8.權利要求7的方法，其中有機酸是檸檬酸。
9.權利要求1的方法，其中加熱步驟是在重量相對于含糖物料重量為約10％的檸檬酸的存在下進行。
10.權利要求1的方法，其中加熱步驟是在加壓下進行。
11.一種含有得自植物的糖原的植物萃取物，通過包括在酸性條件下加熱和加壓處理植物物料的步驟的方法來制備。
12.權利要求11的植物萃取物，其中植物物料是以植物的未加工組織、顆粒或粉末的形式存在。
13.權利要求11的植物萃取物，其中方法還包括如下步驟將通過在酸性條件下加熱和加壓處理植物物料的步驟獲得的萃取物溶液與萃取物殘余物分離，并且使用有機溶劑萃取該萃取物溶液或萃取物殘余物。
14.一種分子量為10,000或更低的糖原。
15.權利要求14的糖原，其分子量為約3,000、約9,000或約9,500。
16.一種組合物，含有分子量為10,000或更低的糖原作為主組分。
17.權利要求16的組合物，含有分子量為約320,000的糖原和分子量為約3,000的糖原。
18.權利要求17的組合物，含有比旋光度為[α]D+197°且在1H NMR圖譜中于5.37ppm和4.95-5.33ppm下具有異頭質子峰的糖原。
19.權利要求16的組合物，含有分子量為約280,000的糖原和分子量為約9,000的糖原。
20.權利要求19的組合物，含有比旋光度為[α]D+178°且在1H NMR圖譜中于4.97ppm和5.22-5.33ppm下具有異頭質子峰的糖原。
21.權利要求16的組合物，含有分子量為約3,000,000的糖原、分子量為1,200,000的糖原和分子量為約9,500的糖原。
22.權利要求21的組合物，含有比旋光度為[α]D+174°且在1H NMR圖譜中于5.38ppm和4.96ppm下具有異頭質子峰的糖原。
23.一種食用組合物，含有權利要求11的植物萃取物。
全文摘要
本發明提供一種糖原的生產方法。該方法包括在酸性條件下加熱和加壓處理含糖物料的步驟。含糖物料是多糖或低聚糖。或者，含糖物料是植物物料，選自田七人參、玄南文三七粉(商標)、高麗人參、小麥粉、大豆、大豆粉、香菇和咖啡萃取殘余物。代表性地，糖原包括分子量為10,000或更低的分子。該糖原的比旋光度為[α]
文檔編號C08B37/18GK1617891SQ0282774
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月6日 優先權日2001年12月7日
發明者松永和義, 石原隆文 申請人:備前化成株士會社