專利名稱：抗腫瘤羧烷基牛膝多糖的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多糖類免疫調節劑及其制備方法，特別是涉及免疫調節劑牛膝多糖類衍生物及其制備方法。
近年來，多糖衍生物的抗病毒作用已引起國內外藥物學家和病毒學家的極大興趣。但在多糖的結構改造中，羧烷基化合物的制備較為困難，不是取代度低就是造成原有多糖結構遭到破壞，而且，并非所有多糖羧烷基化之后其活性都能提高，如地衣多糖經O-羧甲基化后抗腫瘤活性卻大大降低。羧烷基在糖殘基上所處位置，引入的數量，以及羧烷基在鏈上均勻分布的程度都對多糖的構象產生影響，只有調節最佳構像，多糖才能發揮最大的生物活性[化學通報，9，54，(1999)]。
本發明對牛膝多糖進行了羧烷基化，制得了羧烷基牛膝多糖。所述的羧烷基牛膝多糖的13C-NMR圖譜數據是果糖呋喃環上的碳的化學位移數據δ62.5～63.1、105.5～107.0、79.0～79.5、77.1～77.2和/或86.0～87.0、82.6～83.0、65.2，葡萄糖吡喃環上的碳的化學位移數據δ95.2、73.8、75.3、82.2、74.9，羧基碳的化學位移數據δ179.5～181.0，羧烷基的亞烷基碳的化學位移數據δ72.0～73.0。其IR圖譜的數據如下3700～3000cm-1的強寬峰為分子間及分子內羥基吸收，2950～2850cm-1為C-H鍵伸縮振動，1610～1595cm-1的強峰為羧酸鹽C＝O伸縮振動，1450～1400cm-1為羰基旁亞烷基的剪式振動，1350～1300cm-1為C-H非平面搖擺振動，1150～1000cm-1強寬峰為糖環上C-O-C醚鍵不對稱伸縮振動和C-OH鍵伸縮振動的疊加，940～920cm-1為呋喃環伸縮振動。
寡糖和多糖結構的復雜性給寡糖和多糖的結構分析帶來了極大的困難。本發明的羧烷基牛膝多糖據分析其取代度、糖數具有如右所示結構右式中R＝H或(CH2)kCOOM，其中k＝1～3，M＝K、Na、Ca1/2，a，b，c，d，o，p，q＝2～19，a+b+c+d+o+p+q＝2～19。尤以下述結構為主下式中m、n＝2～19，
因為多糖羧烷基取代度的大小不僅影響其溶解度等理化性質，而且直接影響其生理活性，所以采用鈉元素百分含量分析法和紅外光譜定量分析法相對照，得到羧甲基牛膝多糖(CMAbPS)的產物的取代度例如表1所示，其羧甲基取代度在0.2～2.5之間，主要是在0.2～1.5之間表1
所述鈉元素百分含量分析法是測得樣品中鈉元素百分含量Na％，取代度DS’＝(1.62×Na％)/(23-0.8×Na％)。所述紅外光譜定量分析法是采用Bio-Rad FTS-185紅外光譜儀的Win-IR曲線擬合圖，通過擬合單獨計算出-OCH2COONa的峰面積S1600cm-1，用S1600cm-1與表征葡萄糖環骨架振動的吸收峰面積S930cm-1之比表征產物中羧甲基的取代度DS”。
本發明的羧烷基牛膝多糖可通過如下方法合成在室溫～100℃下，用C2～C4的氯烷酸、溴烷酸或碘烷酸為羧烷基化試劑，加入堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣等，在水溶液中與牛膝多糖反應0.1～10小時，生成不同取代度的羧烷基牛膝多糖，所述的牛膝多糖與羧烷基化試劑的摩爾比為1∶1～10，所述的羧烷基化試劑是C2～C4的氯烷酸、溴烷酸或碘烷酸。推薦的反應溫度是80～100℃，推薦反應2～5小時，推薦反應摩爾比1∶3～6。通過改變溶劑的量及反應試劑的比例關系，可生成不同取代度的羧烷基牛膝多糖。反應后將反應溶液中和，再經分離純化可得純品。
經生物活性試驗，研究結果顯示羧烷基牛膝多糖具有較好的抑制小鼠Lewis肺癌和S-180腫瘤的效果，并能提高小鼠NK細胞活性，具有增強免疫活性的作用。
本發明的羧烷基牛膝多糖由于引入了羧基離子，克服了多糖羧烷基化的困難，實現了多糖的結構改造，使得其溶解性水溶性更好，用有機溶劑沉淀法也比單純牛膝多糖的純化更為有效，制得的羧烷基化合物取代度一般在0.2～2.5間，取代度高，調節了最佳構像，而且其合成方法簡便，制備的羧烷基牛膝多糖具有抗腫瘤及增強免疫功能的作用，適于工業化。
圖2是CMAbPS經Sephadex G-25柱層析分離圖(1.2cm×60cm)，淋洗液0.1M NaCl，流速0.33ml/min，6min/tube。其是將DEAE-Cellulose純化的CMAbPS再經Sephadex G-25柱層析，苯酚—硫酸法隔管檢測A490得到。
圖3是CMAbPS的HPLC圖，分析柱TSK-2000SW，洗脫液雙蒸水，流速1ml/min，檢測器RI，其是將上述二次柱層析純化的純品經HPLC分析得到。
圖4是CMAbPS的紅外光譜圖。圖5是CMAbPS的13C-NMR圖譜。
圖6是AbPS的質譜總圖，顯示為六～十六糖。
圖7、8、9、10是將AbPS按四個分子量段分別獲得的質譜圖，顯示為四～二十一糖。
具體實施例方式
實施例1取牛膝多糖250mg，用10ml雙蒸水溶解，加入247mg氫氧化鉀溶解，然后加入286mg溴丁酸，95℃下攪拌反應1小時。然后用1mol/L鹽酸中和至pH＝7，用5倍體積丙酮沉淀、離心、透析、冷凍干燥，再經DEAE-Cellulose及SephadexG-25柱層析純化，即得羧丙基牛膝多糖(241mg)，用這種方法得到的羧丙基牛膝多糖中羧丙基取代度為0.2，具有抗腫瘤和增強免疫活性。
實施例2取牛膝多糖250mg用5ml雙蒸水溶解，加入494mg氫氧化鈉溶解，然后加入571mg氯乙酸，95℃下攪拌反應3小時。然后用1mol/L鹽酸中和至pH＝7，用5倍體積丙酮沉淀、離心、透析、冷凍干燥，再經DEAE-Cellulose及SephadexG-25柱層析純化，即得羧甲基牛膝多糖(286mg)，用這種方法得到的羧甲基牛膝多糖中羧甲基取代度為0.7，13C-NMRδ63.03，62.97，62.93，62.88，62.86，62.79，62.75，62.71，107.00，106.87，106.78，106.71，106.67，106.51，106.17，106.13，105.95，105.88，79.43，79.40，79.31，79.24，79.16，79.13，79.04，77.19，77.13，83.83，82.98，82.86，82.79，82.70，65.2，95.20，73.80，75.30，74.90，180.63，180.58，180.43，180.36，180.32，180.23，180.12，180.00，179.89，179.71，179.62，72.25，72.22，82.22，86.90，86.77，86.50，86.44.
實施例3取牛膝多糖250mg，用2.5ml雙蒸水溶解，加入617mg氫氧化鉀溶解，然后加入714mg氯乙酸，室溫下攪拌反應10小時。然后用lmol/L鹽酸中和至pH＝7，用5倍體積丙酮沉淀、離心、透析、冷凍干燥，再經DEAE-Cellulose及SephadexG-25柱層析純化，即得羧甲基牛膝多糖(340mg)，用這種方法得到的羧甲基牛膝多糖中羧甲基取代度為1.5，具有抗腫瘤和增強免疫活性。
實施例4 羧甲基牛膝多糖的生物活性研究我們對羧甲基牛膝多糖CMAbPS(DS＝0.849)進行分離、純化之后，送檢生物活性測定，其結果如下
1.羧甲基牛膝多糖對小鼠Lewis肺癌足趾接種的療效試驗
***表示顯著性差異，p小于0.012.羧甲基牛膝多糖對小鼠S-180肉瘤(腋皮下接種)的試驗結果
***p小于0.013.羧甲基牛膝多糖對荷Lewis肺癌小鼠NK活性的影響
***為實驗組OD均值/效應對照組OD均值，p小于0.01。#為靶細胞OD均值。
權利要求
1.一種羧烷基牛膝多糖，其特征是其13C-NMR圖譜的數據如下果糖呋喃環上的碳δ62.5～63.1、105.5～107.0、79.0～79.5、77.1～77.2和/或86.0～87.0、82.6～83.0、65.2，葡萄糖吡喃環上的碳δ95.2、73.8、75.3、82.2、74.9，羧基碳δ179.5～181.0，羧烷基的亞烷基碳δ72.0～73.0；其IR圖譜的數據如下3700～3000cm-1強寬峰，2950～2850cm-1強峰，1610～1595cm-1，1450～1400cm-1，1350～1300cm-1，1150～1000cm-1強寬峰，940～920cm-1。
2.如權利要求1所述的羧烷基牛膝多糖，其特征是具有如下結構
3.如權利要求2所述的羧烷基牛膝多糖，其特征是具有如下結構 式中m、n＝2～19，m+n＝2～19，R如權利要求1所述。
4.如權利要求1所述的羧烷基牛膝多糖，其特征是所述的羧烷基取代度為0.2～2.5。
5.如權利要求4所述的羧烷基牛膝多糖，其特征是所述的羧烷基取代度為0.2～1.5。
6.如權利要求1所述的羧烷基牛膝多糖的制備方法，其特征是在水溶液中，用羧烷基化試劑和堿，與牛膝多糖在室溫～100℃下反應0.1～10小時，生成羧烷基牛膝多糖，所述的牛膝多糖與羧烷基化試劑的摩爾比為1∶1～10，所述的羧烷基化試劑是C2～C4的氯烷酸、溴烷酸或碘烷酸。
7.如權利要求6所述的羧烷基牛膝多糖的制備方法，其特征是再經DEAE-Cellulose及Sephadex G-25柱層析純化，制得羧烷基牛膝多糖純品。
8.如權利要求1所述的羧烷基牛膝多糖，其特征在于所述的羧烷基牛膝多糖具有抗腫瘤和增強免疫功能作用。
全文摘要
本發明涉及抗腫瘤羧烷基牛膝多糖,其是用氯烷酸、溴烷酸或碘烷酸為羧烷基化試劑,加入堿,在相應條件下與牛膝多糖生成不同取代度的羧烷基牛膝多糖,這一系列不同取代度的羧烷基牛膝多糖經生物活性試驗表明,具有抗腫瘤及增強免疫功能的作用。
文檔編號C08B37/00GK1344747SQ01132018
公開日2002年4月17日 申請日期2001年10月26日 優先權日2001年10月26日
發明者田庚元, 鄧樂華 申請人:中國科學院上海有機化學研究所, 浙江新昌京新制藥有限公司