Gcsf綴合物的制作方法

專利名稱：Gcsf綴合物的制作方法
背景技術：
粒細胞集落刺激因子(GCSF)是一種藥學上的活性蛋白，所述蛋白調節嗜中性粒細胞的增殖、分化和機能的激活(Metcalf，Blood 67257(1986)；Yan等，Blood 84(3)795-799(1994)；Bensinger等，Blood 81(11)3158-3163(1993)；Roberts等，Expt’l Hematology 221156-1163(1994)；Neben等，Blood 81(7)1960-1967(1993))。GCSF可以使干細胞和前體細胞從骨髓轉移(mobilization)，并且用于治療由于化學療法引起的粒細胞減少的患者，或用作骨髓移植的前序。
美國專利第5,214,132號公開了一種人GCSF的突變蛋白，所述突變蛋白在位置1、3、4、5和17不同于天然hGCSF，所述突變蛋白的所述位置不是天然GCSF的氨基酸，而分別是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser。(也參見，Kuga等，Biochem.Biophys.Res.Commun.159103-111(1989))。M.Okabe等(Blood 75(9)1788-1793(1990年5月1日))報道了一種rhGCSF的衍生物，其中在rhGCSF N端區的5個位置上的氨基酸被取代，在兩種測定中，所述rhGCSF衍生物顯示比小鼠和/或人骨髓祖細胞中的完整rhGCSF的比活高。美國專利第5,218,092號公開了一種人GCSF的突變蛋白，所述突變蛋白在位置1、3、4、5、17、145和147不同于天然hGCSF，所述突變蛋白的所述位置不是天然GCSF的氨基酸，而分別是Ala、Thr、Tyr、Arg、Ser、Asn和Ser。美國專利第5,214,132和5,218,092號的公開內容通過引用結合到本文中。
蛋白治療藥物例如GCSF的生物利用度通常受血漿半壽期短的限制，并且對蛋白酶降解敏感，阻礙了最大的臨床潛能。其它治療蛋白的研究已經表明，通過使蛋白與聚合物例如聚乙二醇(PEG)綴合，通常一個與通過蛋白和PEG兩者共價結合的連接部分綴合，可以克服這樣的困難。
這種PEG綴合的生物分子已經顯示具有臨床上的可應用特性(Inada等，J.Bioact.and Compatible Polymers，5343(1990)；Delgado等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，9249(1992)；和Katre，Advanced Drug Delivery Systems，1091(1993))。在這些特性中有更好的物理和熱穩定性、針對酶降解敏感性的保護作用、溶解度增加、使體內循環半壽期更長和清除率減少、降低免疫原性和抗原性以及降低毒性。
具有與本發明綴合物的結構不同的PEG-GCSF綴合物公開于歐洲專利公布號EP 0 335 423；歐洲專利公布號EP 0 401 384；R.W.Niven等，J.Controlled Release 32177-189(1994)；和Satake-Ishikawa等，Cell Structure and Function，17157-160(1992))。
發明概述因此，本發明是一類新型的GCSF的PEG衍生物。本發明的綴合物具有一個可以參見下文的酰胺連接物。
與未修飾的GCSF(即沒有連接PEG的GCSF)比較，本綴合物的循環半壽期和血漿滯留期增加、清除率減少以及體內粒細胞生成活性增加。另外，與PEG-GCSF綴合物比較，本發明的綴合物具有優良的粒細胞生成特性。其它PEG-GCSF綴合物公開于歐洲專利公布號EP 0335 423；歐洲專利公布號EP 0 401 384；以及載于Niven等(出處同上)中。然而，本發明綴合物的結構不同于這些綴合物，并且具有優良的特性，尤其在體內低劑量時表現出長期、高粒細胞生成活性。
本發明的一個優選的GCSF是一種GCSF突變蛋白，所述突變蛋白的特性等同于或優于天然GCSF，并且與GCSF的用途相同。所述突變蛋白與GCSF的氨基酸序列相同，只是所述突變蛋白在位置1、3、4、5和17的氨基酸不是天然GCSF氨基酸，而分別是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser(GCSF突變蛋白)(參見

圖1)。該突變蛋白公開于美國專利第5,214,132號，該專利通過引用結合到本文中。
本發明生理學活性PEG-GCSF綴合物的結構式如下 本發明的另一部分是要求保護的綴合物的組合物，其中對于所述組合物中的綴合物而言，m和n可以為不同的整數。
本發明綴合物的用途與GCSF相同。具體來說，本發明的綴合物可用于治療由于化學療法引起的粒細胞已減少的患者或用作骨髓移植的前序，其方式與用GCSF治療這些病癥的方式相同。然而，本發明的綴合物具有包括優良的穩定性、更高的溶解度、循環半壽期和血漿滯留期增加在內的改良的特性。
附圖的描述圖1GCSF突變蛋白的一級結構所示的GCSF突變蛋白在位置1、3、4、5和17上不同于野生型人GCSF，所述突變蛋白在所述位置上不是天然GCSF氨基酸，而分別是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser。圖2PEG化(Pegylation)試劑圖320kDa PEG修飾的和未修飾的GCSF突變蛋白的分離。PEG反應混合物的一種典型洗脫圖。
柱子1-2ml FractogelEMD SO3650S。
平衡緩沖液10mM乙酸銨，pH 4.5洗脫緩沖液1. 0.15M NaCl的平衡緩沖液2. 0.5M NaCl的平衡緩沖液圖4單次注射后第5天的PEG-GCSF突變蛋白活性給雌性C57BL/6J小鼠皮下注射25.2μg PEG化GCSF突變蛋白綴合物；在給藥后的第5天，從眶后竇中收集靜脈血樣品。進行計數器血液學分析和白細胞分類分析(leukocyte differentialanalysis)；將所得到的嗜中性粒細胞計數相對于每個實驗的載體對照標準化。所示數據代表每組4只小鼠的平均值±S.E.。圖5 在酰胺和脲連接的GCSF突變蛋白-PEG綴合物中隨PEG質量(kDa)而變化的PMN的增加。對于用SPA試劑制備的綴合物，PMN＝0.277MW+3.95。對于用脲試劑制備的綴合物，PMN＝0.152MW+2.74。圖6 單次注射后第7天的PEG-GCSF突變蛋白活性給雌性C57BL/6J小鼠皮下注射25.2μg PEG化的GCSF突變蛋白綴合物；在給藥后的第7天，收集眶后靜脈血樣品。進行計數器血液學分析和白細胞分類分析；將所得到的嗜中性粒細胞計數相對于每個實驗的載體對照標準化。所示數據代表每組4只小鼠的平均值±S.E.。圖7 鼠PBSC轉移集落測定圖8 鼠PBSC轉移集落測定圖9 鼠PBSC轉移集落測定圖10鼠PBSC轉移集落測定圖11鼠PBSC轉移集落測定發明詳述要求保護的發明是一種具有下式結構的生理學活性PEG-GCSF綴合物 其中G是一種粒細胞集落刺激因子，其參與如式I中所示的聚乙二醇部分的酰胺鍵的氨基較少，R為低碳烷基，n為420-550的整數，而m為1-5的整數。
選擇n和m的數目，使得所產生的式I綴合物的生理學活性和未修飾的GCSF相當，所述活性可以表示與未修飾GCSF的相應活性相同、超過其活性或為未修飾GCSF相應活性的一部分。n代表PEG單位中環氧乙烷殘基的數目。OCH2CH2的一個PEG亞單位的分子量約為44道爾頓。m代表與所述GCSF分子連接的PEG單位的數目。本發明的綴合物可以有1、2、3、4、5或6個PEG單位/個GCSF分子。因此，所述綴合物的分子量(不包括所述GCSF的分子量)取決于n和m的數目。
n值可以為420-550，產生其中每個PEG單位的平均分子量為約18千道爾頓至約25千道爾頓/PEG單位的綴合物。n值最好為450-490，產生其中每個PEG單位的平均分子量約為20千道爾頓的綴合物。m可以為1、2、3、4或5。優選的m為1-4，特別優選的m為2。本發明綴合物PEG部分的分子量范圍為約18千道爾頓(n＝420，m＝1)至約125千道爾頓(n＝550，m＝5)。如果n為420-550而m為1-4的整數，則本發明綴合物PEG部分的分子量范圍為約18千道爾頓(n＝420，m＝1)至約97千道爾頓(n＝550；m＝4)。“約”為某一數值的分子量是指所述數值在通過常規分析技術測定的合理范圍內。
在一個優選的綴合物中，n為450-490，而m為1-4，在所述情況下，所述綴合物PEG部分的分子量范圍為約20千道爾頓(n＝450；m＝1)至約86千道爾頓(n＝490；m＝4)。在另一優選的綴合物中，n為420-550，而m為2，在所述情況下，所述綴合物PEG部分的分子量范圍為約37千道爾頓(n＝420)至約48千道爾頓(n＝550)。在一個特別優選的綴合物中，n為450-490，而m為2，在所述情況下，所述綴合物PEG部分的分子量范圍為約40千道爾頓(n＝450)至約43千道爾頓(n＝490)。
R可以是任一低碳烷基，所謂低碳烷基是指具有1-6個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、異丙基等。包括支鏈烷基。一個優選的烷基是甲基。
所謂GCSF是指從任何常規來源例如組織、蛋白質合成、含有天然或重組細胞的細胞培養物中獲得的、最好是人類的天然或重組的蛋白。包括具有GCSF活性的任一蛋白，例如突變蛋白或非突變的修飾蛋白。從天然或重組來源獲得并且分離GCSF是眾所周知(參見，例如美國專利第4,810,643和5,532,341號，所述專利的公開內容通過引用結合到本文中)。一種優選的GCSF綴合物是如美國專利第5,214,132號中所描述的帶有GCSF突變蛋白的綴合物。
式I的生理學活性綴合物具有GCSF活性，意思是指如通過本領域已知的各種分析所測定的任何已知GCSF活性的任一部分活性或多種活性。具體來說，本發明的綴合物具有表現為增加PMN計數能力的GCSF活性。這是一種已知的GCSF活性。在綴合物中的這種活性可以通過本領域眾所周知的分析法而確定，例如下文描述的分析法(也參見Asano等，Jpn.Pharmacol.Ther.(1991)192767-2773；Yamasaki等，J.Biochem.(1994)115814-819；和Neben等，Blood(1993)811960)。
通過GCSF與下式的琥珀酰亞胺丙酸(SPA)試劑共價連接，產生式I的綴合物 通過常規方法，按照已知步驟，可以獲得式II的試劑(參見美國專利第5,672,662號，該專利的公開內容通過引用結合到本文中)。n與上述式I中的一樣，并選擇n以產生所需分子量的綴合物。優選其中n為450-490(MW＝20kDa)的這類試劑。通過常規方法，根據用于式II試劑中的PEG-醇原材料而變化n，可以獲得其它的分子量。分子量為5kDa、10kDa、15kDa和20kDa的式II的SPA試劑可以得自ShearwaterPolymers，Inc.(Huntsville，Alabama)。
通過常規方法可以將式II的試劑與GCSF綴合。連接是通過酰胺鍵進行的。具體來說，式II的試劑主要與GCSF的一個或更多個伯氨基(例如，N末端和賴氨酸側鏈)反應，在GCSF和PEG聚合物骨架之間形成一個酰胺鍵。式I中所示的NH衍生自與式II的試劑反應形成一個酰胺鍵的GCSF的這些伯氨基。式II的試劑還可以在較低程度上與位于GCSF位置66上的絲氨酸的羥基反應，以在GCSF和PEG聚合物骨架之間形成一個酯鍵。對技術人員而言，所述反應條件是常規的，并在下文的詳述中提供。
通過常規方法可以完成所述試劑與GCSF的連接。可以使用本發明任何選定MW的PEG(n)。例如，可以在pH為5-10的溶液中、在溫度為4℃-室溫、持續30分鐘-20小時、利用試劑與蛋白的摩爾比為4∶1-30∶1的條件下進行所述反應。可以選擇反應條件以指導所述反應向主要產生所需取代程度的方向進行。一般而言，低溫、低pH(例如pH5)和短反應時間趨于減少所連接的PEG的數目(較低的m)。高溫、中性至高pH(例如pH≥7)和較長的反應時間，增加所連接的PEG的數目(較高的m)。例如，在式II試劑為5kDa、pH7.3和試劑與蛋白的摩爾比為30∶1、溫度為4℃以及反應時間為30分鐘的情況下主要產生單-PEG綴合物；溫度為4℃并且反應時間為4小時的情況下主要產生二-PEG綴合物；溫度為室溫并且反應時間為4小時的情況下主要產生三-PEG綴合物。所述反應通過使所述反應混合物酸化并且冷凍于-20℃而終止。一般而言，優選pH為7-7.5以及試劑與蛋白的摩爾比為4∶1-6∶1。
根據電荷差異，可以采用例如陽離子交換層析的純化方法分離綴合物，這有效地將綴合物分離成它們的各種分子量。例如，可以在陽離子交換柱上加樣，然后用約20mM乙酸鈉(pH約4)洗滌，然后用緩沖的線性(0M-0.5M)NaCl梯度(pH為3-5.5，最好是pH約為4.5)洗脫。可以采用常規方法，例如質譜法、SDS-PAGE或其它已知的根據分子量分離分子實體的方法，根據分子量，鑒定通過陽離子交換層析獲得的流分的內容物。因此鑒定出含有連接有所需數目(m)PEG的式I綴合物的流分，將所述流分純化成無未修飾的GCSF和不具有所連接PEG的其它數目的綴合物。
本發明的另一部分是一種綴合物的組合物，其中包括特定比率的m值不同的綴合物。本發明的一個優選組合物是其中m＝1、2、3和4的綴合物的混合物。其中m＝1的綴合物的百分比為18-25％，其中m＝2的綴合物的百分比為50-66％，其中m＝3的綴合物的百分比為12-16％，而其中m＝4的綴合物的百分比至多為5％。這樣的一種組合物可以通過摩爾比為4-6∶1(過量的試劑)的PEG化試劑與GCSF反應而產生。讓所述反應于4℃-8℃、pH接近7.5下進行20小時，在所述反應結束時，加入乙酸.然后將綴合物從在反應期間存在的殘余的未修飾的蛋白、過量的PEG化試劑和其它雜質以及緩沖液組分中純化出來。除PEG化蛋白外，還產生作為反應副產物的N-羥基琥珀酰亞胺和聚乙二醇-羧酸。
提供以下實施例以說明本文所描述的發明，而不是以任何方式限制本發明。在這些實施例中使用GCSF突變蛋白。通過例舉的方法，也可將其它種類的GCSF與PEG綴合。
實施例1PEG化試劑1.GABA酰胺連接物(P-6GA-1，P-12Ga-1)所述GABA酰胺連接物試劑含有或者為6kDa或者為12kDa的2條PEG鏈。對于所述結構參見圖2-A。2.酰胺連接物(P-5am-1，P-10am-1)產生5kDa和10kDa酰胺連接物。對于所述結構參見圖2-B。3.酰胺連接物該試劑是用5kDa、10kDa、15kDa和20kDa PEG分子制備的商品琥珀酰亞胺丙酸(SPA)，其通用結構示于圖2-C中。4.脲連接物該試劑用5kDa、10kDa和25kDa PEG分子制備，所述典型結構示于圖2-D中。5.氨基甲酸乙酯連接物產生10kDa和20kDa氨基甲酸乙酯連接物，所述結構示于圖2-E中。6.氨基甲酸乙酯連接物示于圖2-G中的作為商品制備的36kDa PEG試劑的該結構表明，所述PEG試劑的一端用一個叔丁基加帽。該試劑是在本實例中所用的最高分子量的PEG。7.硫代氨基甲酸乙酯連接物該PEG化試劑的結構可以參見圖2-F。在該試劑中所用的PEG的分子量為20kDa。
以下試劑由Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.Tokyo，Japan)提供1)G-CSF突變蛋白是指GCSF突變蛋白、與包含或者為6kDa或者為12kDa的2條m-PEG鏈的支鏈甲氧基聚乙二醇(m-PEG)試劑(PEG-GABA-NHS，參見圖2A)綴合的GCSF突變蛋白、與5kDa和10kDa線性、酯/酰胺的m-PEG試劑(參見圖2B)綴合的GCSF突變蛋白。分子量為5kDa、10kDa、15kDa和20kDa的m-PEG-琥珀酰亞胺丙酸-NHS(PEG-SPA)試劑購自Shearwater Polymers(Huntsville，Alabama，參見圖2C)。以下蛋白PEG化試劑在Hoffmann-La Roche，Inc制備1)m-PEG-脲連接物(5kDa、10kDa和25kDa，參見圖2D)，2)m-PEG-氨基甲酸乙酯連接物(10kDa和20kDa，參見圖2E)，m-PEG-硫代氨基甲酸乙酯連接物(10kDa和20kDa，參見圖2F)，而平均分子量為36kDa的叔丁基-m-PEG-氨基甲酸乙酯連接物試劑得自DDI Pharmaceuticals，Inc.(Mountainview，CA，參見圖2G)。PEG化試劑影響PEG化反應的因素有1)pH，2)溫度，3)反應時間，4)蛋白與PEG試劑的摩爾比，和5)蛋白質濃度。通過控制這些因素中的一個或更多個，人們可以指導所述反應向主要產生單、二、三等PEG綴合物的方向進行。例如，用于Shearwater Polymer的SPA-PEG 5000(N-羥基琥珀酰亞胺)試劑的反應條件是1)pH 7.3，2)對于單-PEG和二-PEG，溫度為4℃，而對于三-PEG，溫度為室溫，3)對于單-PEG，反應時間為30分鐘，而對于二-PEG和三-PEG，反應時間為4小時，和4)蛋白與試劑的摩爾比為1∶30。對于所有試劑，單獨確定產生所需PEG種類的最適反應條件。它們示于表1中。所述反應通過使所述反應混合物酸化并且冷凍于-20℃而終止。從反應混合物中分離修飾的和游離的GCSF突變蛋白(磺丙基(SP)陽離子交換)含有大約5mg蛋白質的反應混合物用水稀釋10-20倍，并且用冰醋酸將pH調至4.5。然后將所稀釋的樣品上樣到先前已裝填1-2mlFractogel EMD SO3--650S(EM Separations，Gibbstown，New Jersey)柱中，所述柱已用10mM乙酸銨(pH 4.5)平衡。在流通液中去除未吸附的試劑和反應副產物。采用0.15M NaCl的平衡緩沖液，用分級梯度洗脫修飾的GCSF突變蛋白。保留在所述柱上的未修飾的GCSF突變蛋白用0.5M NaCl的平衡緩沖液分級洗脫。將所分離的GCSF突變蛋白-PEG綴合物的混合物用0.2μm濾膜除菌過濾，然后冷凍貯藏于-20℃。GCSF突變蛋白PEG綴合物的表征蛋白含量測定法采用1mg/ml溶液的A280值為0.86，測定所述純化的GCSF突變蛋白PEG綴合物的蛋白濃度。SDS-PAGE分析按照Laemmli，Nature 227680-685，1970，采用12％和15％聚丙烯酰胺凝膠或8-16％聚丙烯酰胺梯度凝膠，在還原條件下，進行該分析。百分組成測定法根據考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠的光密度測量，確定各種GCSF突變蛋白-PEG綴合物的反應混合物中的每種(單、二、三等)的百分組成(參見表2)。GCSF突變蛋白PEG綴合物中PEG質量的測定根據PEG的平均分子量，各個PEG綴合物(單、二等)的鑒定，基于電泳遷移率、所連接的PEG分子的數目、以及基于考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠的光密度測量的百分組成，確定各種制備物中取代的PEG總質量。一種特定的制備物的PEG總質量是其各個PEG質量的總和。根據以下公式計算單個PEG質量PEG質量＝PEG分子量×PEG分子數×百分組成其中PEG分子量是5kDa、10kDa、20kDa等。
對于單、二、三，PEG分子數分別為＝1、2、3。
在PEG總質量測定中，也可采用質譜法(MALDI-TOF)。在該情況下，質譜可以鑒定并且確定單個PEG綴合物的分子量。與每個PEG綴合物連接的PEG分子量是單個PEG綴合物的總分子量減去GCSF突變蛋白的分子量(18.9kDa)。這些值乘以百分組成，得到單個PEG質量；它們的和是PEG總質量。
已經采用兩種方法測定了各種制備物的PEG質量。結果概述于表2中。內毒素水平的測定采用LAL方法，按照生產商的說明(Associates of Cape Cod，Inc.，Woods Hople，Massachusetts)，測定內毒素水平。生物學活性如先前所描述的方法，對M-NFS-60細胞進行體外生物測定并且在雌性C57BL/6J小鼠中進行體內測定。(參見Asano等，Jpn.Pharmacol.Ther.(1991)192767-2773)。結果和討論PEG化反應總的來講，結果說明，活性較低的試劑例如脲連接物需要較高的pH、溫度和蛋白試劑的摩爾比以及較長的反應時間，以獲得所需量的綴合物(參見表1和表2)。從反應混合物中分離修飾的和游離的GCSF突變蛋白一個典型的洗脫圖示于圖4中。除陽離交換層析外，可能還需要其它步驟例如凝膠滲透層析以去除微量污染物和內毒素，并且對用于貯藏的終產物進行緩沖液交換。對于20kDa SPA(酰胺)和20kDa氨基甲酸乙酯綴合物，強陽離子交換分離法已經使其放大至30mg規模。用該方法獲得大致定量的回收率。百分組成和PEG質量百分組成和PEG質量的結果概述于表2中。在我們的實驗中，在高分子量PEG綴合物(例如20kDa SPA二PEG和12kDa GABA)的情況下，基于電泳遷移率以測定反應混合物的百分組成來鑒定PEG種類不是十分可靠。為了測定PEG質量，并且鑒定高分子量和高度取代的PEG綴合物，需要聯合SDS-PAGE、SP-HPLC和MALDI-TOF MS分析法。然而，衍生自低分子量PEG試劑(例如，5kDa)的單PEG化和PEG綴合物可以十分準確地從其相應的SDS-PAGE分布圖中鑒定出。內毒素水平采用LAL法，除衍生自氨基甲酸乙酯試劑的一種綴合物外，在所有PEG綴合物中都可檢測＜1EU/mg的內毒素。在該PEG綴合物中，只在稀釋后檢測到內毒素。已經證實，這不是由于在稀釋期間的污染引起，因此，在該樣品中某些未知的物質可能在較高蛋白濃度下在所述LAL測定中引起了抑制。當稀釋所述樣品，并且在隨后稀釋抑制性物質時，觀察陽性內毒素結果。生物學活性所有GCSF突變蛋白PEG綴合物的體外和體內生物學活性列于表2中。總的來講，觀察到在體外活性和取代的程度以及PEG的分子量之間成反比。相比之下，觀察到隨著取代的PEG分子量的增加，體內活性的增強。其它人也觀察到該結果(Satako-Ishikawa等，Cell StructFunct.17(3)157-60，1992)。推測PEG分子與GCSF突變蛋白的多肽骨架的化學連接產生某些形式的負面影響受體/配體相互作用的構象變化，由此降低結合親和性。另外，體外測定相對短的溫育時間可能不足以達到最高活性。另一方面，注射所述藥物后，小鼠的體內測定需更長的時間(天)，并且需數天才結束。這種較長溫育時間結合所述PEG-GCSF突變蛋白循環半壽期的增加，代償了由于PEG化引起的結合親和性方面的損失。最終結果是達到體內最大生物活性。另一種假說是，當將PEG-GCSF突變蛋白注射到小鼠體內時，它作為前體藥物起作用。在這種情況下，PEG-GCSF突變蛋白的PEG部分以某種方式不斷地被切下，導致持續釋放微量的游離GCSF突變蛋白，這解釋了體內活性的維持和增強。然而，所述前體藥物假說不能解釋首次給藥后7天所觀察的體內基線活性。由于所述蛋白和PEG之間的酰胺鍵是穩定的并不容易被裂開，因此所述前體藥物機制是不大可能的。
在所研究的15種GCSF突變蛋白PEG綴合物中，P-12GA-1、20kDaSPA、20kDa氨基甲酸乙酯和36kDa氨基甲酸乙酯的體內活性比其余的制備物的活性高得多。
總的來說，觀察到PEG分子的分子量和體內活性增加之間成正比。該結果示于圖5中，其中表示隨酰胺(SPA)和脲連接的PEG綴合物中PEG總質量而變化的PMN計數的增加。GCSF突變蛋白PEG綴合物的選擇和特征認真評價所述15種PEG綴合物中的綴合化學、生物學特性和藥物開發之后，所選擇進行進一步評價的3種綴合物是1)P-12GA-1，2)20kDa SPA和3)20kDa氨基甲酸乙酯。在頭-頭比較(head-to-headcomparsion)中，評價在SP-純化的反應混合物中存在的20kDa SPA衍生的單、二和三PEG綴合物，表明所有三種綴合物在用25.2μg單劑的雌性C57BL/6J小鼠中保持高粒細胞生成活性達5天(表3和圖4)。相比之下，保持相似活性需要每日多劑的未修飾的GCSF突變蛋白(數據未顯示)。在除兩種(20kDa SPA和P-12GA-1)外的所有情況下，在小鼠的初次給藥后的第7天，體內活性均恢復到正常水平(圖6)。20kDaSPA和P-12GA-1綴合物均在8.4μg較低劑量下表現出活性增加，并且在第7天恢復到正常水平(參見表3)。百分組成數據(表3)指出，20kDaSPA和P-12GA-1制備物均含有大約50％二聚體，而剩余的50％在單體和三聚體之間分布。20kDa氨基甲酸乙酯試劑在所用的實驗條件下主要產生單-PEG(參見表3)。所評價的所有PEG綴合物(包括主要的單體氨基甲酸乙酯衍生物)的體外活性符合取代程度以及PEG分子量之間成反比的通用模式。顯示所評價的PEG綴合物的體內生物學活性與所評價的分子量范圍內的PEG分子量成正比(圖5)。結論在所檢查的15種GCSF突變蛋白PEG綴合物中，P-12GA-1、20kDaSPA和20kDa氨基甲酸乙酯連接物的制備物表現出良好的體內活性圖。20kDa PEG-GCSF突變蛋白表現出包括工業生產價值在內的最佳總體特性。表1.用來制備各種PEG綴合物的反應條件
表2.各種PEG-GCSF突變蛋白綴合物的組成、PEG質量和生物學活性數據
基于考馬斯藍染色的SDS-PAGE的光密度測定法(*)，或根據MALDI TOF MAS分析(**)，計算百分組成和加入的PEG的質量。(a)、(b)、(c)每個代表一種獨立的生物測定；報告第5天的PMN數據表3.三種主要分子的組成、PEG質量、PEG化位點和生物學活性數據
將8.4μg或25.2μg的或者ND-28日劑量或者單次劑量的PEG綴合物給予雌性C57BL/6J小鼠。在初次給藥后的第5天和第7天，取靜脈血樣品，并且進行白細胞分類分析。*基于考馬斯染色的SDS-PAGE的光密度測定。**根據MALDI TOF MS測定。
實施例2與rhG-CSF突變蛋白綴合的20kDa PEG的制備如下進行用20kDa甲氧基-PEG琥珀酰亞胺丙酸(SPA)對G-CSF突變蛋白的修飾。將PEG試劑溶于蒸餾水中，濃度約為200mg/ml，然后以摩爾比為4∶1-6∶1(過量的試劑)加到G-CSF突變蛋白溶液(約5mg/ml)中。讓反應于4℃-8℃、pH約7.5下進行20小時。在反應結束時，加入冰醋酸終止反應。然后將PEG化的GCSF突變蛋白(也稱為PEGG)從在修飾期間存在的殘余的未修飾突變蛋白、過量的PEG試劑和其它雜質和緩沖液組分中純化出來。除PEG化蛋白外，還產生作為反應副產物的N-羥基琥珀酰亞胺和聚乙二醇-羧酸。
采用陽離子交換層析，然后通過超濾法，對PEGG進行純化。上樣于陽離子交換柱，然后用20mM乙酸鈉(pH 4.0)洗滌。用線性氯化鈉梯度洗脫，將PEGG從反應混合物中的所有其它組分中分離出來。隨后，用超濾法/滲濾法使PEGG濃縮至約4.0mg/ml，并且將緩沖液變為20mM乙酸鈉、50mM氯化鈉、pH 6.0。
采用陽離子交換層析，分析在以上所列的條件下進行的5輪PEG化和純化，這證明了所述G-CSF突變蛋白PEG化反應的再現性。證明所述PEG化反應在以下最佳條件下在多輪反應中可再現，至多為2.5g(PEGG最終產量)20kDa-SPA-PEG突變蛋白的比率為4-6∶1；pH約7.5，4℃，20小時。所測定的PEGG混合物的平均百分組成為21.7％單-PEGG(％RSD＝16.6)，60.3％二-PEGG(％RSD＝6.6)，15.1％三-PEGG(％RSD＝4.0)和2.9％四-PEGG(％RSD＝26.1)，如表4中所示。表4陽離子交換分析5輪PEGG合成和純化中的單、二、三和四-PEGG的相對百分組成
實施例3外周血干細胞的轉移已經開發出從骨髓轉移原始干細胞和定向前體細胞并且在外周血中增多循環祖細胞的技術。這些受激細胞可能能夠介導致死照射以及骨髓或干細胞移植后的早期和持續移入。Neben，S.Marcus，K和Mauch，P給予環磷酰胺和/或粒細胞集落刺激因子后小鼠的造血干細胞和祖細胞亞群從骨髓轉移至血液。Blood 811960(1993)。外周血干細胞(PBSC)的募集可能有助于縮短化學療法誘發的骨髓減少癥患者或經歷其它重度骨髓抑制治療的那些患者造血功能恢復的時間。Roberts，AW和Metcalf，D粒細胞集落刺激因子誘導小鼠外周血中祖細胞的選擇性升高。Experimental Hematology 221156(1994)。已經用生長因子和化療藥物刺激轉移。Bodine，D外周血“干”細胞的轉移有煙的地方就有火？Experimental Hematology 23293(1995)。刺激PBSC后，通過白細胞提取法收獲轉移的細胞，然后低溫保存直到需要它們為止。目前臨床方案要求在標準高劑量化療(CHT)和每日重復給予或連續輸注生長因子(有時持續2周或更長)后，通過白細胞提取法重復收集PBSC濃縮物。Brugger，W，Bross，K，Frisch，J，Dern，P，Weber，B，Mertelsmann，R和Kanz，L用依托泊苷、異環磷酰胺和順鉑的綜合化學療法后，通過依次給予白細胞介素-3和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子轉移外周血祖細胞。Blood 791193(1992)。用兩種PBSC轉移的小鼠模型，第一種在正常小鼠中，第二種在化療模型中，進行下文所描述的研究。所述實驗證明，與NEUPOGEN(G-CSF)比較，按照本發明的PEG化的G-CSF突變蛋白(PEGG)，實現干細胞轉移的效能增加。也明確地確立了PEG化突變蛋白在顯著減少且更有效的給藥方案方面的優越性。
這些研究評價在7天瓊脂集落測定中用多種生長因子體外刺激的轉移的未成熟鼠PBSC的擴增能力。除集落形成能力外，還對所有小鼠的血液進行完全的血液學分布型加上絕對嗜中性粒細胞計數(ANC)的評價。還測定血清G-CSF水平。對測定最優化后，進行數個時程實驗，并且檢查高劑量和低劑量的G-CSF。實驗模型包括G-CSF誘導的和環磷酰胺(Cytoxan)誘導的轉移，以及采用CHT和所述細胞因子的聯合治療。
材料和方法在所有實驗中使用購自Jackson Laboratory的6-10周齡的雌性C57BL/6J小鼠。在第-1天用或者200mg/kg Cytoxan或者磷酸緩沖鹽水(PBS)載體，對所述小鼠進行腹膜內注射。在第0天，給所述動物皮下注射0.1ml的或者NEUPOGEN(GCSF)、PEGG(20kDSPA連接的PEG化突變蛋白，Lot #P20W3)或者含1％正常小鼠血清的PBS載體。接受Neupogen的小鼠每天給予相同劑量的注射，而所有其它小鼠接受載體。在處死的當天，從麻醉小鼠的眶后竇收集外周血，放入含有EDTA的試管中。對于每組動物，將少量合并的全血加入到三個復份的35mm2組織培養皿中，所述培養皿裝有補充15％胎牛血清和0.35％和0.35％Difco瓊脂、含有1000U/ml重組小鼠(rm)白細胞介素3、100ng/ml rm干細胞因子和1000U/ml rm白細胞介素6的總量為1ml RPMI 1640培養基。將固化的瓊脂培養物于37℃、在濕潤的5％CO2的空氣氛圍下溫育1周。在暗視野照明下，使用立體解剖顯微鏡對集落進行計數。
結果在第一項的所示研究中，正常小鼠在第0-5天每天接受注射25μg/只小鼠NEUPOGEN，或者在第0天接受單次注射25μg/只小鼠PEGG。在第3-7天處死小鼠。如圖7中所示，通過集落形成證明的轉移在第3天和第4天在注射NEUPOGEN的小鼠中顯著增加，但在第5天開始逐漸回到基線水平(盡管NEUPOGEN注射持續到第5天)。另一方面，用PEGG注射的小鼠顯示出更加高度評價的集落數目，所述集落數目的穩定水平保持到第7天。
化療模型的變化形式(paradigm)是相似的。CHT組的小鼠在第1天接受一劑Cytoxan的注射。然后某些小鼠在以后日子里只接受載體注射，同時其它小鼠或者在第0-5天接受每天注射NEUPOGEN的聯合治療，或者在第0天接受單次注射PEGG。圖8顯示在第4天Cytoxan治療的小鼠的一個峰值，在以后的日子逐漸回到基線水平。NEUPOGEN和PEGG組均在第5天達到峰值，證明集落數目顯著升高。然而，直至第6天和第7天Cytoxan+PEGG值保持非常顯著地高于Cytoxan+NEUPOGEN組的那些值。圖9證明聯合治療的協同效應優于Cytoxan或G-CSF單獨治療的效應。
第二項研究示于圖10和圖11中。連續10天每天接受注射較低的3μg/只小鼠NEUPOGEN劑量的正常小鼠在所檢查的全部時程中，表現出相對低水平的“多階段(phase)”轉移。用單次3μg/只小鼠PEGG劑量注射的動物表現出到第4天為止外周循環中大約5倍的轉移的祖細胞數目，雖然所述作用是必需在6天內的一次爆發。
在注射Cytoxan的小鼠中，3μg/只小鼠PEGG的單劑量誘發的PBSC轉移量與注射30μg NEUPOGEN/只小鼠(日劑量為3μg/天，連續10天)誘發的量大致相同(圖11)。在第5天兩組的祖細胞轉移達到峰值，并且所述峰的大小相同。看來唯一的區別是NEUPOGEN的延續效應略微長久。在CHT模型中集落的數目比正常小鼠模型中集落的數目高4-10倍。
這些實驗證明了PEG化突變蛋白優于NEUPOGEN的兩種獨特的潛在優勢。首先，在正常小鼠和化學療法治療的小鼠中，在誘發PBSC轉移的能力方面，顯然PEGG比NEUPOGEN的效力高。其次，已經顯示采用比所述臨床制品目前使用的給藥方案劑量減少且更為有效的給藥方案，在小鼠中所述PEG化突變蛋白比NEUPOGEN更為有效。
權利要求
1.一種具有下式的生理學活性綴合物 其中G是一種粒細胞集落刺激因子，并且其與所述綴合物中的一個聚乙二醇部分形成一個酰胺鍵的氨基較少；R為低碳烷基；n為420-550的整數；而m為1-5的整數。
2.權利要求1的綴合物，其中R為甲基。
3.權利要求2的綴合物，其中n為450-490。
4.權利要求2的綴合物，其中m為1-4的整數。
5.權利要求4的綴合物，其中m為2。
6.權利要求1的綴合物，其中所述粒細胞集落刺激因子是具有圖1中所示序列的GCSF突變蛋白。
7.權利要求1的綴合物，其中n為450-490。
8.權利要求1的綴合物，其中m為1-4的整數。
9.權利要求8的綴合物，其中m為2。
10.權利要求1的綴合物，其中所述粒細胞集落刺激因子是具有圖1中所示序列的GCSF突變蛋白。
11.權利要求1的綴合物，它比相應的未綴合的粒細胞集落刺激因子的循環半壽期更長和體內粒細胞生成活性更高。
12.權利要求11的綴合物，其中所述粒細胞集落刺激因子是具有圖1中所示序列的GCSF突變蛋白。
13.一種具有下式的生理學活性綴合物 其中R為甲基；n為450-490的整數；m為2；而G為具有圖1中所示序列的GCSF突變蛋白，并且其與所述綴合物中的一個聚乙二醇部分形成一個酰胺鍵的氨基較少。
14.一種包含多種具有下式的生理學活性綴合物的組合物 其中在每種所述綴合物中G為粒細胞集落刺激因子，并且其與所述綴合物中的一個聚乙二醇部分形成一個酰胺鍵的氨基較少；在每種所述綴合物中的R獨立地為低級烷基；在每種所述綴合物中的n獨立地為420-550的整數；在每種所述綴合物中m獨立地為1-4的整數；其中m為1的綴合物的百分比為18％-25％；其中m為2的綴合物的百分比為50％-66％；其中m為3的綴合物的百分比為12％-16％；而其中m為4的綴合物的百分比至多為5％。
15.權利要求14的組合物，其中在每種所述綴合物中R為甲基。
16.權利要求14的組合物，其中在每種所述綴合物中n和R相同。
17.權利要求14的組合物，其中n為450-490。
18.權利要求14的組合物，其中在每種所述綴合物中所述粒細胞集落刺激因子是具有圖1中所示序列的GCSF突變蛋白。
19.一種包含多種具有下式的生理學活性綴合物的組合物 其中R為甲基；在每種所述綴合物中的n相同并且為450-490的整數；G為具有圖1中所示序列的GCSF突變蛋白，并且其與所述綴合物中的一個聚乙二醇部分形成一個酰胺鍵的氨基較少；在每種所述綴合物中m獨立地為1-4的整數；其中m為1的綴合物的百分比為18％-25％；其中m為2的綴合物的百分比為50％-66％；其中m為3的綴合物的百分比為12％-16％；而其中m為4的綴合物的百分比至多為5％。
20.一種產生PEG-GCSF綴合物的方法，所述PEG-GCSF綴合物比相應的未綴合的GCSF的循環半壽期更長并且體內粒細胞生成活性更高，所述方法包括將一種具有下式的試劑與所述GCSF共價連接，以產生所述綴合物
21.權利要求21的方法，其中所述GCSF是具有圖1中所示序列的GCSF突變蛋白。
全文摘要
本發明描述了具有式(I)的生理學活性PEG－GCSF綴合物,以及含有各種綴合物的混合物的組合物,其中在所述組合物中對于所述綴合物m和n可以為不同的整數。
文檔編號C08G65/333GK1376164SQ00809241
公開日2002年10月23日 申請日期2000年1月19日 優先權日1999年1月29日
發明者P·S·拜倫 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司