一種構建基因工程集胞藻生產可生物降解塑料的方法

專利名稱：一種構建基因工程集胞藻生產可生物降解塑料的方法
技術領域：
本發明涉及一種用構建的基因工程集胞藻生產可生物降解塑料的方法，屬于生物技術(特別是生物化工)領域。
隨著人類社會的不斷發展，塑料制品已成為我們必不可少的工業和生活用品，而由石油產品制成的傳統塑料的廢棄物很難降解。近年來由于大量廢舊塑料地膜、包裝塑料袋和一次性不可降解塑料餐具的使用量激增，并且任意拋棄，各大、中城市普遍形成了嚴重的白色污染。它已同汽車尾氣、含磷洗滌劑一起被列為我國環保治理的重點。因此，人們把目光投向環境友好型的塑料制品—生物可降解塑料的研制、開發與生產。
聚-β-羥基丁酸酯(Poly-β-Hydroxybutyrate，以下簡稱PHB)是最早發現的一種生物可降解高分子材料。當環境營養條件不平衡時(如限氮或限磷)，很多微生物體內將積累PHB，其物理化學性質與聚丙烯塑料相似，且在自然條件下可被微生物分泌的酶降解，對環境不造成污染。PHB不僅具有通常高分子材料的力學性能和加工性能，還具有化學合成塑料所沒有的一些特殊性能，如可生物降解性、生物相容性、光學活性、壓電性和抗凝血性等，此外，它的比重大、透氧性低、抗紫外輻射，從而在醫藥、農業、電子、包裝材料等領域具有獨特而廣泛的應用前景，深受國際生物工程界的重視。
1990年，英國帝國化學公司采用異養型細菌真養產堿桿菌，以葡萄糖和丙酸為原料，在限磷條件下發酵，推出了商品名為Biopol的β-羥基丁酸及β-羥基戊酸共聚物塑料。之后，人們又對重組大腸桿菌的PHB生產進行了研究，到目前為止，其表達量一般可達菌體干重的70％左右。但由于發酵所用原料(葡萄糖、蔗糖、丙醇等)價格高、發酵過程中要持續通氧、發酵液的分離純化困難等原因，使生產的成本過高，產品的市場競爭能力較傳統塑料低。為此，大幅度降低PHB的生產成本，成為PHB生產并推向市場所必需解決的一個關鍵問題。
從原料成本考慮，CO2是最廉價的碳源。異養微生物發酵生產PHB所用的有機碳源基本上都是通過光合作用將大氣中的CO2固定于綠色植物中，經過一系列的生物化學反應合成而來的。如果將綠色植物光合作用固定下來的CO2直接用于PHB的合成，將是一種從根本上解決原料成本過高問題的理想途徑。利用轉基因技術將細菌PHB合成酶基因轉移至擬南芥(生物技術(Biotechnology)13:142-150；美國國家科學研究進展(Proceedingsof the National Academic Science of USA)91:12760-12764；國際生物大分子雜志(International Journal of Biological Macromolecules)17:7-12)、油菜、馬鈴薯(植物學報37:581-588；植物學報40:615-621)和棉花(美國國家科學研究進展(Proceedingsof the National Academic Science of USA)93:12768-12773；熱化學學報(ThermochimActa)313:43-53)等植物體內，便可在植物中建立PHB合成途徑。雖然從降低原料成本看，轉基因植物生產PHB具有很大的優勢，但由于植物生長周期長、需占用可耕地、PHB表達量低(目前報道的最高水平僅達細胞干重的14％)，產品分離提取困難，大大阻礙了這一技術向實際生產的轉化。
藍細菌又稱藍藻，是一種光合放氧自養微生物。藍細菌與細菌一樣，都是原核細胞，其染色體裸露存在于細胞質中。與真核藻類、高等植物相同，藍細菌可通過光合作用，利用日光能從CO2、水、無機鹽合成其全部細胞物質。細胞生長和分裂所需的其它所有分子，都是由這些光合作用的初產物合成的(藍細菌分子生物學(The Biology ofCyanobacteria),1994,pp217-257)。集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)是一種單細胞球狀藍細菌，它具有以下優點結構簡單，可在多種條件下生長，既可進行光合自養也可異養生長(應用藻類學雜志(Journal of Applied Physiology)8:263-273)；染色體DNA的全部測序工作已完成，并預測了可能的蛋白質編碼區域。可將S.6803的特定基因刪除、修飾以研究其功能、作用，也可在某一特定位點引入外源基因改變其代謝途徑(DNA研究(DNA Research)3:109-136；DNA研究(DNA Research)3:185-209)；易轉化，適于基因操作(酶學方法(Methods in Enzymology)297:18-26)。在正常培養條件下，不需對細胞作任何處理，外源線狀或近環狀質粒DNA，都容易通過同源重組整合到集胞藻6803的染色體DNA上。而且，用各種抗生素的抗性基因作標記，對集胞藻6803進行轉化和篩選都很方便。
伴隨著對藍細菌生理學的研究，人們在一些藍細菌，如佛氏綠膠藍細菌(生物化學生物物理學報(Biochima Biophysics Acta)120:308-310)、螺旋藻(細菌學雜志(Journalof Bacteriology)149:361-363；細菌學雜志(Journal of Bacteriology)172:2791-2792)、聚球藻(發酵與生物工程雜志(Journal of Fermentation and Bioengineering)82:512-514；細菌學雜志(Journal of Bacteriology)179:5009-5013)、集胞藻(微生物學叢刊(Archives of Microbiology)170:162-170)等中，發現了與細菌體內類似的PHB顆粒，使藍細菌作為PHB的表達體成為可能。盡管這些藍細菌具有合成PHB的能力，但PHB在其體內的積累水平并不高。迄今為止，文獻報道的最高表達量是在耐熱聚球藻中，PHB可積累至細胞干重的20％，比細菌的積累量低得多，但高于轉基因植物中的表達量。1996年，日本學者第一次采用基因工程方法，用含真養產堿桿菌PHB合成酶基因的質粒轉化聚球藻7942，實現了PHB在無PHB合成能力的藍細菌中的表達，但轉化體中PHB的含量很低，僅達干重的1％(生物技術通訊(Biotechnology Letters)18:1047-1050)。我國關于這方面的研究還未見報道。
對藍細菌積累PHB的研究表明，PHB在藍細菌體內作為貯存物質的功能已大大退化。藍細菌體內，碳源及能量貯存物質主要是糖原(微生物學年報(Annual Reviews ofMicrobiology)38:1-25)。在光能自養條件下，指數生長期的細胞可積累糖原達干重的10-20％，而在氮饑餓條件下，糖原可積累至細胞干重的40-60％，也即過剩的碳源絕大部分首先轉變為糖原儲存起來，僅有很少一部分轉變為PHB。當平衡生長條件恢復后，糖原立即分解，釋放碳源及能量。由此可見，在藍細菌體內，糖原取代了PHB的生理功能，糖原的合成在底物上與PHB的合成形成競爭。要想提高藍細菌體內PHB的表達量，必需控制競爭物質糖原的合成。
在藍細菌中，糖原的合成涉及三個酶二磷酸腺苷(簡稱ADP)-葡萄糖焦磷酸羧化酶、糖原合成酶以及分支酶，其中ADP-葡萄糖焦磷酸羧化酶用agp基因編碼，催化ADP與自由葡萄糖分子結合成ADP-葡萄糖的反應，而ADP-葡萄糖是藍細菌糖原合成酶的專一性底物(生物化學生物物理叢刊(Archives of Biochemistry and Biophysics)372:179-188；藍細菌生物學(The Biology of Cyanobacteria),1982,pp47-85)。因此，切斷ADP-葡萄糖的供應，即可抑制糖原合成，從而將碳源底物流引向PHB合成途徑，提高藍細菌PHB的表達量。
本發明的目的是提出一種構建基因工程集胞藻生產聚-β-羥基丁酸酯的方法，利用基因工程的方法改造藍細菌集胞藻，將與PHB合成途徑形成競爭反應的糖原合成途徑去除，并以該突變株為表達載體，利用廉價碳源CO2在其體內直接合成PHB，實現藍細菌PHB的高水平積累，從而大大降低PHB的生產成本。
本發明提出的構建基因工程集胞藻生產可生物降解塑料的方法，由以下步驟組成1、首先從野生型集胞藻中提取染色體DNA所用野生型集胞藻6803由美國亞利桑那州立大學購得。其過程為從固體平板上挑取5-10個單藻落，接種于裝有200-400毫升液體培養基的培養瓶中，該培養基記為BG-11培養基，每升培養基的組成為碳酸鈉20g、磷酸氫二鉀30.5g、檸檬酸鐵銨6g、硝酸鈉1.5g、硫酸鎂75mg、含0.25mol/L乙二胺二乙酸二鈉、pH值為8.0的水溶液11.2μL、氯化鈣36mg、檸檬酸6mg、含2.86g/L硼酸、0.222g/L七水硫酸鋅、0.079g/L五水硫酸銅、1.81g/L四水氯化鎂、0.39g/L二水鉬酸鈉、0.049g/L六水硝酸鈷的微量元素液1mL，在溫度為24-32℃、光照密度為1000-3000lx的光照培養箱中通氣培養至培養液在730納米下的吸光值為0.3-1.0；將培養液轉移至200-300毫升離心杯中，于15-25℃、3000-5000轉/分的條件下離心5-15分鐘，按照常規藍細菌DNA提取方法對所得藻細胞進行處理，得到野生型集胞藻的染色體DNA沉淀，加入0.2-0.6mL的含1.21g/L三羥甲基氨基甲烷及0.372g/L二水合乙二胺二乙酸二鈉、pH8.0的緩沖液中，溶解沉淀，備用。
2、以野生型集胞藻染色體DNA為模板，按集胞藻agp基因的上游與下游核苷酸順序合成寡核苷酸為引物。引物中含有脫氧腺嘌呤核苷三磷酸(記為A)、脫氧鳥嘌呤核苷三磷酸(記為G)、脫氧胞嘧啶核苷三磷酸(記為C)、脫氧胸腺嘧啶核苷三磷酸(記為T)，所合成的引物一為5’-磷酸-C-A-G-C-T-C-C-G-G-A-T-C-C-C-A-A-C-G-G-C-G-磷酸-3’；引物二為5’-磷酸-G-G-C-C-G-A-G-C-T-C-A-G-G-G-A-T-T-T-T-A-C-T-G-C-T-T-T-磷酸-3’，兩種引物均由北京鼎國生物技術發展中心(以下簡稱鼎國公司)合成。引物合成后，用無菌水溶解沉淀至濃度為50-100μmol/L，備用。
3、運用聚合酶鏈式反應技術從染色體DNA上擴增目的基因agp片段，所用聚合酶及相應擴增緩沖液、四種脫氧核苷酸溶液(以下簡稱dNTPs)均由鼎國公司購得。取3-10μL步驟1制備的染色體DNA溶液于一已滅菌的離心管中，依次加入20-40μL無菌水、5-15μL的擴增緩沖液、5-15μL的四種脫氧核苷酸、0.5-1.5μL的由步驟2合成的引物一、0.5-1.5μL的由步驟2合成的引物二、0.5-1μL的Taq DNA聚合酶，用無菌水補足至總體積為100-150μL，再加入60-120μL的石蠟油；將離心管置于變溫系統中，升溫至92-96℃，保持10-15分鐘，然后降溫至50-60℃，保持1-5分鐘，再升溫至70-76℃，保持1-5分鐘，接著按升溫至92-96℃并保持1-2分鐘、降溫至50-60℃并保持1-5分鐘、升溫至70-76℃并保持1-5分鐘的變化順序循環20-30次，最后升溫至92-96℃并保持1-2分鐘，降溫至50-60℃并保持1-5分鐘，升溫至70-76℃并保持10-20分鐘，結束擴增反應。
4、采用限制性核酸內切酶對第3步擴增得到的agp DNA片段及質粒pUC118進行切割，所用限制性核酸內切酶及相應緩沖液由鼎國公司購得。取5-10μl由第3步擴增得到的agp DNA片段，依次加入0.5-1.5μlBamHⅠ內切酶、0.5-1.5μlSacⅠ內切酶、1-2μl的相應酶切緩沖液、3-5μl無菌水，在25-38℃下反應1-4小時；同時取2-4μl質粒pUC118，依次加入0.5-1.5μl BamHⅠ內切酶、0.5-1.5μl SacⅠ內切酶、1-2μl的相應酶切緩沖液、6-11μl無菌水，在25-38℃下反應1-4小時。
5、在連接酶作用下將agpDNA片段連入質粒pUC118載體的多克隆位點，所用T4 DNA連接酶及相應緩沖液由鼎國公司購得。取2-8μl由步驟4所得的agp DNA片段、5-9μl由步驟4所得的質粒pUC118片段，混合，加入1-2μl連接反應緩沖液，1μl T4 DNA連接酶，在2-6℃下反應8-12小時，備用。
6、采用分子克隆操作制備大腸桿菌的感受態細胞(氯化鈣法)，所用大腸桿菌DH10B由清華大學生物系微藻生物技術實驗室保種。從菌體的固體平板上挑取單菌落，接種于3-10mL液體培養基中，該培養基記為LB培養基，每升培養基中含有5g酵母浸膏粉、10g蛋白胨、10g氯化鈉，pH值為7.0，在25-38℃下于150-300轉/分的搖床上培養細菌6-15小時，接著取0.1-1.0mL培養液接種于50-100mL液體培養基中，在25-38℃下于150-300轉/分的搖床上培養至培養液在600納米處的吸光值為0.3-1.0，然后按照常規的氯化鈣法制備感受態細胞7、agp DNA片段的基因克隆，所用試劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(簡稱IPTG)及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(簡稱X-gal)由鼎國公司購得。取150-250μL感受態大腸桿菌DH10B細胞，加入5-10μL由步驟5所得的連接反應物，按照常規方法進行轉化實驗，在含40μg/mL IPTG、40μg/mL X-gal和15g/L瓊脂粉的LB固體培養基上于37℃下培養細胞，16-24小時后挑取白色菌落，按照常規方法制備質粒DNA；8、采用限制性核酸內切酶分別對步驟7得到的質粒DNA及質粒pRL425進行切割，質粒pRL425由美國Rick Debus教授提供，限制性核酸內切酶及相應緩沖液由鼎國公司購得。取2-4μl由第7步所得質粒DNA，依次加入0.5-1.5μlKpnⅠ內切酶、0.5-1.5μlSmaⅠ內切酶、1-2μl相應酶切緩沖液、3-5μl無菌水，在25-38℃下反應1-4小時，采用常規低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收長為4341bp的DNA片段；同時取2-4μl質粒pRL425，依次加入0.5-1.5μlKpnⅠ內切酶、0.5-1.5μlEcoRV內切酶、1-2μl相應酶切緩沖液、6-11μl無菌水，在25-38℃下反應1-4小時，采用常規低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收長為1539bp的DNA片段；9、分別取4-9μl上述第8步的兩種DNA片段，加入1-2μl連接反應緩沖液，1μl T4 DNA連接酶，在2-6℃下反應8-12小時，取5-10μL，加入150-250μL由步驟6所得感受態大腸桿菌DH10B細胞，按照常規方法進行轉化實驗，涂布于含750μg/mL紅霉素和15g/L瓊脂粉的LB固體培養基上，在37℃下培養16-24小時，挑取單菌落，按照常規方法制備質粒DNA，備用；10、藍細菌細胞的轉化及突變工程株的篩選在200-400mL含0.5-1.5g/L葡萄糖的BG-11液體培養基中，接種5-10個集胞藻單藻落，在溫度為24-32℃、光照密度為1000-3000lx的光照培養箱中通氣培養至培養液在730納米處的吸光值為0.3-1.0；取10-20mL培養液于50mL已滅菌離心管中，15-25℃、3000-5000轉/分離心10-20分鐘，棄上清；向沉淀中加入2-8mL BG-11液體培養基中，使溶液在730納米處的吸光值等于2.5；取0.2-0.6mL上述溶液于已滅菌玻璃培養管中，加入2-8μL由步驟9所得質粒DNA，振蕩；將試管置于溫度為24-32℃、光照密度為1000-3000lx的光照培養箱中培養5-10小時，每半小時振蕩一次；取100-300μL液體涂布于含葡萄糖的BG-11固體平板上；20-30小時后將濾紙轉移至含10-100μg/mL紅霉素的BG-11固體平板上，繼續培養10-15天至單藻落出現；11、挑取5-10個步驟10獲得的單藻落分別接種于200-400mL BG-11液體培養基、含0.5-1.0g/L葡萄糖的BG-11液體培養基、含5-20mM乙酸鈉的BG-11液體培養基或同時含0.5-1.0g/L葡萄糖和5-20mM乙酸鈉的BG-11液體培養基中，在溫度為25-32℃、光照密度為1500-2500lx的光照培養箱中培養，每24小時取樣，測定細胞密度，培養6-8天后，用離心機以4000-8000轉/分的轉速，離心10-20分鐘，棄上清液，收獲所得細胞，于60℃烘箱干燥沉淀，即可獲得本發明的產品可生物降解塑料聚-β-羥基丁酸酯。
利用本發明所構建的集胞藻突變株無合成糖原的能力，在不同外加碳源存在的條件下，體內積累的PHB水平可達野生型細胞在相同培養條件下所積累PHB水平的1.3-10倍，突變株還能高效利用外加葡萄糖，相同條件下，所收獲的生物量可達野生型細胞生物量的1.4-1.6倍。本發明利用基因工程的方法，通過部分取代與目的產物PHB合成形成競爭反應的糖原合成酶基因，從而刪除糖原合成途徑，確實產生了抑制糖原合成、將碳源底物流引向PHB合成途徑、提高PHB表達量以及促進集胞藻生長的顯著效果。本發明所構建的集胞藻突變株在一定培養條件下積累的PHB水平，為同類研究中的最高值，必將為降低PHB生產成本提供現實的參考，也為利用清潔原料和清潔能源生產環境友好型物質提供可能。
下面介紹
具體實施例方式實施例1(1)首先從野生型集胞藻中提取染色體DNA。從固體平板上挑取5個單藻落，接種于裝有400毫升液體培養基的培養瓶中。該培養基記為BG-11培養基，每升培養基的組成為碳酸鈉20g；磷酸氫二鉀30.5g；檸檬酸鐵銨6g；硝酸鈉1.5g；硫酸鎂75mg；含0.25mol/L乙二胺二乙酸二鈉、pH為8.0的水溶液11.2μL；氯化鈣36mg；檸檬酸6mg；含2.86g/L硼酸、0.222g/L七水硫酸鋅、0.079g/L五水硫酸銅、1.81g/L四水氯化鎂、0.39g/L二水鉬酸鈉、0.049g/L六水硝酸鈷的微量元素液1mL。在溫度為30℃、光照密度為2000lx的光照培養箱中通氣培養至培養液在730納米下的吸光值為1.0。將培養液轉移至250毫升離心杯中，子25℃、4000轉/分的條件下離心10分鐘，獲得1克濕藻沉淀。向所得沉淀中加入40mL含10％蔗糖、6.05g/L三羥甲基氨基甲烷、3.72g/L二水合乙二胺二乙酸、pH值為8.0的緩沖液，25℃下放置1小時；于25℃、6000轉/分的條件下離心10分鐘，棄上清；向沉淀中加入8mL含6.05g/L三羥甲基氨基甲烷、2.93g/L氯化鈉、18.6g/L二水合乙二胺二乙酸、pH值為8.0的緩沖液，轉移至50毫升離心管中，加入1.5mL濃度為50mg/mL的溶菌酶水溶液，混勻，37℃放置20分鐘，再加入1mL濃度為10％的N-十二烷基肌氨酸鈉水溶液，混勻，37℃放置20分鐘；加入10.5mL用含1.21g/L三羥甲基氨基甲烷及0.372g/L二水合乙二胺二乙酸二鈉、pH8.0的緩沖液平衡過的苯酚溶液，混勻1小時；4℃、6000轉/分離心10分鐘，吸取10mL上清液至另一離心管中；在該上清中加入10mL氯仿(含二十五分之一體積的異戊醇)，混勻0.5小時；4℃、6000轉/分離心10分鐘，吸取10mL上清液至另一離心管中，再加入1mL體積的濃度為3.0mol/L、pH值為5.0的乙酸鈉溶液和20mL無水乙醇，在-20℃下放置8-12小時；4℃、12000轉/分離心10分鐘，棄上清，向沉淀中加入1mL 70％乙醇，4℃、12000轉/分離心10分鐘，去上清；將DNA沉淀置超凈工作臺干燥。向干燥沉淀中加入0.4mL含1.21g/L三羥甲基氨基甲烷及0.372g/L二水合乙二胺二乙酸二鈉、pH8.0的緩沖液，溶解沉淀。備用。
(2)以野生型集胞藻染色體DNA為模板，按集胞藻agp基因的上游與下游核苷酸順序合成寡核苷酸為引物。所涉及到的四種脫氧核苷三磷酸分別為脫氧腺嘌呤核苷三磷酸(記為A)、脫氧鳥嘌呤核苷三磷酸(記為G)、脫氧胞嘧啶核苷三磷酸(記為C)、脫氧胸腺嘧啶核苷三磷酸(記為T)，所合成的引物一為5’-磷酸-C-A-G-C-T-C-C-G-G-A-T-C-C-C-A-A-C-G-G-C-G-磷酸-3’；引物二為5’-磷酸-G-G-C-C-G-A-G-C-T-C-A-G-G-G-A-T-T-T-T-A-C-T-G-C-T-T-T-磷酸-3’。兩種引物均由北京鼎國生物技術發展中心(以下簡稱鼎國公司)合成。引物合成后，用無菌水溶解沉淀至濃度為100μmol/L，備用。
(3)運用聚合酶鏈式反應技術從染色體DNA上擴增目的基因agp片段，所用聚合酶及相應擴增緩沖液、四種脫氧核苷酸溶液(以下簡稱dNTPs)均由鼎國公司購得。取5μL由步驟1制備的染色體DNA溶液于一已滅菌的離心管中，依次加入30μL無菌水、10μL擴增緩沖液、10μLdNTPs、1μL由步驟2合成的引物一、1μL由步驟2合成的引物二、0.5μL的Taq DNA聚合酶，再加入42.5μL無菌水，最后加入60μL的石蠟油；將離心管置于變溫系統中，升溫至92℃，保持10分鐘，然后降溫至52℃，保持2分鐘，再升溫至71℃，保持3分鐘，接著按升溫至92℃并保持1分鐘、降溫至52℃并保持2分鐘、升溫至71℃并保持3分鐘的變化順序循環25次，最后升溫至92℃并保持1分鐘，降溫至52℃并保持2分鐘，升溫至71℃并保持10分鐘，結束擴增反應。
(4)采用限制性核酸內切酶對第3步擴增得到的agp DNA片段及質粒pUC118進行切割，所用限制性核酸內切酶及相應緩沖液由鼎國公司購得，質粒pUC118由清華大學生物系微藻生物技術實驗室提供。酶切agp DNA片段時反應液的組成為agp DNA片段 10μlBamHⅠ(10U/μl)1μlSacⅠ(10U/μl) 1μlBeffer E(10×) 2μl無菌水 6μl總體積20μl在37℃下反應3小時；同時取2μl質粒pUC118，進行酶切，反應液組成為質粒puc1182μlBamHⅠ(10U/μl) 1μl
SacⅠ(10U/μl) 1μlBuffer E(10×) 2μl無菌水 14μl總體積 20μl在37℃下反應3小時。
(5)在連接酶作用下將agp DNA片段連入質粒pUC118載體的多克隆位點，所用T4噬菌體DNA連接酶及相應緩沖液由鼎國公司購得。連接反應加樣比例為質粒pUC118酶切液9μlagp DNA片段酶切液 8.5μl10×連接緩沖液 2μlT4噬菌體DNA連接酶 0.5μl總體積 20μl在2℃下反應12小時。備用。
(6)采用分子克隆操作制備大腸桿菌的感受態細胞(氯化鈣法)，所用大腸桿菌DH10B由清華大學生物系微藻生物技術實驗室保種。從菌體的固體平板上挑取單菌落，接種于裝有5mL液體培養基中。該培養基記為LB培養基，由5g/L酵母浸膏粉、10g/L蛋白胨、10g/L氯化鈉組成，pH值為7.0。在37℃下于200轉/分的搖床上培養細菌10小時，接著取0.5mL培養液接種于50mL液體培養基中，在37℃下于200轉/分的搖床上培養至培養液在600納米處的吸光值為0.375；將培養液轉入預冷的已滅菌離心管中，冰浴冷卻10分鐘后于4℃的離心機上以5000轉/分離心15分鐘；倒出上清液，在無菌條件下將管倒置1分鐘以使殘留的上清液流盡；向沉淀中加10毫升用冰預冷的0.1mmol/L CaCl2溶液，冰浴放置15分鐘；于4℃的離心機上以5000轉/分離心15分鐘，棄上清；加入2毫升用冰預冷過的0.1mol/LCaCl2溶液再次重懸沉淀，在冰上放置片刻即可得到感受態細胞。
(7)agp DNA片段的基因克隆，所用試劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(簡稱IPTG)及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(簡稱X-gal)由鼎國公司購得。取200μL步驟(6)制備的感受態大腸桿菌DH10B細胞，加入5μL步驟(5)所得連接反應物，在冰上放置30分鐘，立即將管轉移至42℃的循環水浴中，放置90秒，立即將管轉移至冰浴中，放置2分鐘，每管加入0.8mL的LB液體培養基，在37℃下放置45分鐘，室溫下以5000轉/分的速度離心2分鐘，棄上清，留約50μL，搖勻后涂布于含40μg/mL IPTG、40μg/mL X-gal和15g/L瓊脂粉的LB固體培養基上，于37℃培養16小時，挑取白色菌落，按照常規方法制備質粒DNA，該質粒長為4647bp，命名為pUCA。
(8)采用限制性核酸內切酶分別對質粒pRL425及步驟7得到的質粒pUCA進行切割，質粒pRL425由美國Rick Debus教授提供，限制性核酸內切酶及相應緩沖液由鼎國公司購得。酶切pUCA時反應液的組成為質粒pUCA4μlSmaⅠ(10U/μl) 1μlKpnⅠ(10U/μl) 1μl多用酶切緩沖液(10×)2μl
無菌水 14μl總體積 20μl在37℃下反應3小時，采用常規低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收長為4341bp的DNA片段，備用。同時取2μl質粒pRL425進行酶切，反應液加樣比例為質粒pRL425 2μlEcoRV(10U/μl) 1μlKpnⅠ(10U/μl) 1μl多用酶切緩沖液(10×) 2μl無菌水 14μl總體積 20μl在37℃下反應3小時，采用常規低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收長為1539bp的DNA片段，備用。
(9)各取8.5μl以上所得的兩種DNA片段，加入2μl連接反應緩沖液，1μl T4噬菌體DNA連接酶，在2℃下反應12小時。取5μL連接反應液，加入200μL步驟(6)所得感受態大腸桿菌DH10B細胞，按照常規方法進行轉化實驗，涂布于含750μg/mL紅霉素和15g/L瓊脂粉的LB固體培養基上，在37℃下培養16小時，挑取單菌落，按照常規方法制備質粒DNA。該質粒長為5881bp，命名為pUCAE。
(10)藍細菌細胞的轉化及突變工程株的篩選在200mL含1.5g/L葡萄糖的BG-11液體培養基中，接種5個集胞藻單藻落，在溫度為30℃、光照密度為2000lx的光照培養箱中通氣培養至培養液在730納米處的吸光值為0.5；取20mL培養液于50mL已滅菌離心管中，25℃、4000轉/分離心10分鐘，棄上清；向沉淀中加入4.0mL BG-11液體培養基中，使溶液在730納米處的吸光值等于2.5；取0.4mL上述溶液于已滅菌玻璃培養管中，加入6μL步驟6所得質粒DNA，振蕩；將試管置于溫度為30℃、光照密度為2000lx的光照培養箱中培養6小時，每半小時振蕩一次；取100μL液體涂布于含葡萄糖的BG-11固體平板上；22小時后將濾紙轉移至含20μg/mL紅霉素的BG-11固體平板上，繼續培養11天至單藻落出現。
(11)挑取步驟(10)獲得的單藻落接種于300mLBG-11液體培養基中，在溫度為30℃、光照密度為2000lx的光照培養箱中通氣培養(光合自養)，細胞生長速度與野生型細胞相同，培養7天后，胞內葉綠素含量為野生型細胞的1.25倍；PHB含量約為細胞干重的15％，是野生型細胞PHB含量的4.4倍；胞內未檢測到糖原的存在。
實施例2(1)同實施例1中的(1)，首先從野生型集胞藻中提取染色體DNA。
(2)同實施例1中的(2)，以野生型集胞藻染色體DNA為模板，按集胞藻agp基因的上游與下游核苷酸順序合成寡核苷酸引物。用無菌水溶解沉淀至濃度為100μmol/L，備用。
(3)取10μL步驟(1)制備的染色體DNA溶液于一已滅菌的離心管中，依次加入45μL無菌水、15μL擴增緩沖液、15μLdNTPs、1.5μL由步驟(2)合成的引物一、1.5μL由步驟(2)合成的引物二、1μLTaq DNA聚合酶，再加入61μL無菌水，最后加入80μL的石蠟油；將離心管置于變溫系統中，升溫至94℃，保持10分鐘，然后降溫至54℃，保持2分鐘，再升溫至72℃，保持3分鐘，接著按升溫至94℃并保持1分鐘、降溫至54℃并保持2分鐘、升溫至72℃并保持3分鐘的變化順序循環25次，最后升溫至94℃并保持1分鐘，降溫至54℃并保持2分鐘，升溫至72℃并保持10分鐘，結束擴增反應。
(4)采用限制性核酸內切酶對第(3)步擴增得到的agp DNA片段及質粒pUC118進行切割，所用限制性核酸內切酶及相應緩沖液由鼎國公司購得，質粒pUC118由清華大學生物系微藻生物技術實驗室提供。加樣體積、反應溫度及時間同實施例1步驟(4)，只是將酶切緩沖液改成了多用酶切緩沖液(10×)。
(5)在連接酶作用下將agp DNA片段連入質粒pUC118載體的多克隆位點，所用T4噬菌體DNA連接酶及相應緩沖液由鼎國公司購得。連接反應加樣比例為質粒pUC118酶切液4μlagp DNA片段酶切液 3.5μl10×連接緩沖液 2μlT4噬菌體DNA連接酶 0.5μl總體積 10μl在4℃下反應8小時。備用。
(6)同實施例1中步驟(6)，采用分子克隆操作制備大腸桿菌的感受態細胞(氯化鈣法)，所用大腸桿菌DH10B由清華大學生物系微藻生物技術實驗室保種。
(7)同實施例1中步驟(7)，獲得質粒pUCA。
(8)同實施例1中步驟(8)，只是將酶切緩沖液改成Buffer J。
(9)各取3.5μl步驟(8)所得的兩種DNA片段，加入2μl連接反應緩沖液，1μl T4DNA連接酶，在4℃下反應8小時。取5μL連接反應液，加入200μL步驟(6)所得感受態大腸桿菌DH10B細胞，按照常規方法進行轉化實驗，涂布于含750μg/mL紅霉素和15g/L瓊脂粉的LB固體培養基上，在37℃下培養20小時，挑取單菌落，按照常規方法制備質粒DNA，命名為pUCAE。
(10)藍細菌細胞的轉化及突變工程株的篩選在400mL含1.0g/L葡萄糖的BG-11液體培養基中，接種10個集胞藻單藻落，在溫度為28℃、光照密度為3000lx的光照培養箱中通氣培養至培養液在730納米處的吸光值為0.45；取10mL培養液于50mL已滅菌離心管中，25℃、4000轉/分離心10分鐘，棄上清；向沉淀中加入1.8mL BG-11液體培養基中，使溶液在730納米處的吸光值等于2.5；取0.4mL上述溶液于已滅菌玻璃培養管中，加入8μL步驟6所得質粒DNA，振蕩；將試管置于溫度為28℃、光照密度為3000lx的光照培養箱中培養8小時，每半小時振蕩一次；取150μL液體涂布于含葡萄糖的BG-11固體平板上；24小時后將濾紙轉移至含30μg/mL紅霉素的BG-11固體平板上，繼續培養12天至單藻落出現。
(11)挑取步驟(10)獲得的單藻落接種子400mL含1.0g/L葡萄糖的BG-11液體培養基中，在溫度為28℃、光照密度為3000lx的光照培養箱中通氣培養(光合混養)，細胞最大生長速度是野生型細胞的1.7倍；最終收獲的細胞量為野生型細胞1.5倍；培養7天后，胞內葉綠素含量與野生型細胞相近；PHB含量約為細胞干重的1.6％，是野生型細胞PHB含量的1.3倍；胞內未檢測到糖原的存在。
實施例3(1)同實施例1中的(1)，首先從野生型集胞藻中提取染色體DNA。
(2)同實施例1中的(2)，以野生型集胞藻染色體DNA為模板，按集胞藻agp基因的上游與下游核苷酸順序合成寡核苷酸引物。用無菌水溶解沉淀至50μmol/L，備用。
(3)取5μL步驟(1)制備的染色體DNA溶液于一已滅菌的離心管中，依次加入60μL無菌水、10μL擴增緩沖液、10μLdNTPs、2μL由步驟(2)合成的引物一、2μL由步驟(2)合成的引物二、0.5μL的Taq DNA聚合酶，再加9.5μL無菌水，最后加入80μL的石蠟油；將離心管置于變溫系統中，升溫至96℃，保持10分鐘，然后降溫至56℃，保持2分鐘，再升溫至74℃，保持3分鐘，接著按升溫至96℃并保持1分鐘、降溫至56℃并保持2分鐘、升溫至74℃并保持3分鐘的變化順序循環25次，最后升溫至96℃并保持1分鐘，降溫至56℃并保持2分鐘，升溫至74℃并保持10分鐘，結束擴增反應。
(4)采用限制性核酸內切酶對第(3)步擴增得到的agp DNA片段及質粒pUC118進行切割，所用限制性核酸內切酶及相應緩沖液由鼎國公司購得，質粒pUC118由清華大學生物系微藻生物技術實驗室提供。加樣體積、反應溫度及時間同實施例1步驟(4)。
(5)在連接酶作用下將agp DNA片段連入質粒pUC118載體的多克隆位點，所用T4 DNA連接酶及相應緩沖液由鼎國公司購得。連接反應加樣比例為質粒pUC118酶切液9μlagp DNA片段酶切液 8μl10×連接緩沖液 2μlT4噬菌體DNA連接酶 1μl總體積 20μl在6℃下反應10小時。備用。
(6)同實施例1中步驟(6)，采用分子克隆操作制備大腸桿菌的感受態細胞(氯化鈣法)，所用大腸桿菌DH10B由清華大學生物系微藻生物技術實驗室保種。
(7)同實施例1中步驟(7)，獲得質粒pUCA。
(8)同實施例1中步驟(8)，只是將酶切緩沖液改成Buffer J。
(9)各取3.5μl步驟(8)所得的兩種DNA片段，加入2μl連接反應緩沖液，1μl T4DNA連接酶，在6℃下反應10小時。取8μL連接反應液，加入200μL步驟(6)所得感受態大腸桿菌DH10B細胞，按照常規方法進行轉化實驗，涂布于含750μg/mL紅霉素和15g/L瓊脂粉的LB固體培養基上，于37℃下培養20小時，挑取單菌落，按照常規方法制備質粒DNA，命名為pUCAE。
(10)藍細菌細胞的轉化及突變工程株的篩選在400mL含1g/L葡萄糖的BG-11液體培養基中，接種5個集胞藻單藻落，在溫度為26℃、光照密度為35001x的光照培養箱中通氣培養至培養液在730納米處的吸光值為0.475；取10mL培養液于50mL已滅菌離心管中，25℃、4000轉/分離心10分鐘，棄上清；向沉淀中加入1.9mL BG-11液體培養基中，使溶液在730納米處的吸光值等于2.5；取0.4mL上述溶液于已滅菌玻璃培養管中，加入8μL步驟6所得質粒DNA，振蕩；將試管置于溫度為26℃、光照密度為3500lx的光照培養箱中培養8小時，每半小時振蕩一次；取200μL液體涂布于含葡萄糖的BG-11固體平板上；26小時后將濾紙轉移至含40μg/mL紅霉素的BG-11固體平板上，繼續培養13天至單藻落出現。
(11)挑取步驟(10)獲得的單藻落接種于400mL含10mM乙酸鈉的BG-11液體培養基中，在溫度為26℃、光照密度為3500lx的光照培養箱中通氣培養(光合混養)，細胞最大生長速度為野生型細胞的60％；最終收獲的細胞量為野生型細胞的74％；培養7天后，胞內葉綠素含量是野生型細胞的1.13倍；PHB含量約為細胞干重的30％，是野生型細胞PHB含量的10倍；胞內未檢測到糖原的存在。
實施例4(1)同實施例1中的(1)，首先從野生型集胞藻中提取染色體DNA。
(2)同實施例1中的(2)，以野生型集胞藻染色體DNA為模板，按集胞藻agp基因的上游與下游核苷酸順序合成寡核苷酸引物。用無菌水溶解沉淀至75μmol/L，備用。
(3)取10μL步驟(1)制備的染色體DNA溶液于一已滅菌的離心管中，依次加入30μL無菌水、15μL擴增緩沖液、15μLdNTPs、2μL由步驟(2)合成的引物一、2μL由步驟(2)合成的引物二、1μL的Taq DNA聚合酶，再加入75μL無菌水，最后加入100μL石蠟油；將離心管置于變溫系統中，升溫至94℃，保持10分鐘，然后降溫至56℃，保持2分鐘，再升溫至72℃，保持3分鐘，接著按升溫至94℃并保持1分鐘、降溫至56℃并保持2分鐘、升溫至72℃并保持3分鐘的變化順序循環25次，最后升溫至94℃并保持1分鐘，降溫至56℃并保持2分鐘，升溫至72℃并保持10分鐘，結束擴增反應。
(4)采用限制性核酸內切酶對第(3)步擴增得到的agp DNA片段及質粒pUC118進行切割，所用限制性核酸內切酶及相應緩沖液由鼎國公司購得，質粒pUC118由清華大學生物系微藻生物技術實驗室提供。加樣體積、反應溫度及時間同實施例1步驟(4)。
(5)同實施例1中步驟(5)。
(6)同實施例1中步驟(6)，采用分子克隆操作制備大腸桿菌的感受態細胞。
(7)同實施例1中步驟(7)，獲得質粒pUCA。
(8)同實施例1中步驟(8)。
(9)同實施例1中步驟(9)，獲得質粒pUCAE。
(10)同實施例1中步驟(10)，獲得具有紅霉素抗性的單藻落。
(11)挑取步驟(10)獲得的單藻落接種于400mL含1.0g/L葡萄糖及10mM乙酸鈉的BG-11液體培養基中，在溫度為30℃、光照密度為3000lx的光照培養箱中通氣培養(光合混養)，細胞最大生長速度為野生型細胞的1.1倍；最終收獲的細胞量為野生型細胞的1.2倍；培養7天后，胞內葉綠素含量是野生型細胞的1.16倍；PHB含量約為細胞干重的5.0％，是野生型細胞PHB含量的2.7倍；胞內未檢測到糖原的存在。
權利要求
1.一種構建基因工程集胞藻生產可生物降解塑料的方法，其特征在于，該方法由以下步驟組成(1)首先從野生型集胞藻中提取染色體DNA其過程為從固體平板上挑取5-10個單藻落，接種于裝有200-400毫升液體培養基的培養瓶中，該培養基記為BG-11培養基，每升培養基的組成為碳酸鈉20g、磷酸氫二鉀30.5g、檸檬酸鐵銨6g、硝酸鈉1.5g、硫酸鎂75mg、含0.25mol/L 乙二胺二乙酸二鈉、pH值為8.0的水溶液11.2μL、氯化鈣36mg、檸檬酸6mg、含2.86g/L硼酸、0.222g/L七水硫酸鋅、0.079g/L五水硫酸銅、1.81g/L四水氯化鎂、0.39g/L二水鉬酸鈉、0.049g/L六水硝酸鈷的微量元素液1mL，在溫度為24-32℃、光照密度為1000-3000lx的光照培養箱中通氣培養至培養液在730納米下的吸光值為0.3-1.0；將培養液轉移至200-300毫升離心杯中，于15-25℃、3000-5000轉/分的條件下離心5-15分鐘，按照常規藍細菌DNA提取方法對所得藻細胞進行處理，得到野生型集胞藻的染色體DNA沉淀，加入0.2-0.6mL的含1.21g/L三羥甲基氨基甲烷及0.372g/L二水合乙二胺二乙酸二鈉、pH8.0的緩沖液中，溶解沉淀，備用；(2)以野生型集胞藻染色體DNA為模板，按集胞藻agp基因的上游與下游核苷酸順序合成寡核苷酸為引物。引物中含有脫氧腺嘌呤核苷三磷酸(記為A)、脫氧鳥嘌呤核苷三磷酸(記為G)、脫氧胞嘧啶核苷三磷酸(記為C)、脫氧胸腺嘧啶核苷三磷酸(記為T)，所合成的引物一為5-磷酸-C-A-G-C-T-C-C-G-G-A-T-C-C-C-A-A-C-G-G-C-G-磷酸-3’；引物二為5’-磷酸-G-G-C-C-G-A-G-C-T-C-A-G-G-G-A-T-T-T-T-A-C-T-G-C-T-T-T-磷酸-3’，引物合成后，用無菌水溶解沉淀至濃度為50-100μmol/L，備用；(3)取3-10μL步驟1制備的染色體DNA溶液于一已滅菌的離心管中，依次加入20-40μL無菌水、5-15μL的擴增緩沖液、5-15μL的四種脫氧核苷酸、0.5-1.5μL的由步驟2合成的引物一、0.5-1.5μL的由步驟2合成的引物二、0.5-1μL的Taq DNA聚合酶，用無菌水補足至總體積為100-150μL，再加入60-120μL的石蠟油；將離心管置于變溫系統中，升溫至92-96℃，保持10-15分鐘，然后降溫至50-60℃，保持1-5分鐘，再升溫至70-76℃，保持1-5分鐘，接著按升溫至92-96℃并保持1-2分鐘、降溫至50-60℃并保持1-5分鐘、升溫至70-76℃并保持1-5分鐘的變化順序循環20-30次，最后升溫至92-96℃并保持1-2分鐘，降溫至50-60℃并保持1-5分鐘，升溫至70-76℃并保持10-20分鐘，結束擴增反應；(4)取5-10μl由第3步擴增得到的agp DNA片段，依次加入0.5-1.5μLBamHⅠ內切酶、0.5-1.5μlSacⅠ內切酶、1-2μl的相應酶切緩沖液、3-5μl無菌水，在25-38℃下反應1-4小時；同時取2-4μl質粒pUC118，依次加入0.5-1.5μlBamHⅠ內切酶、0.5-1.5μlSacⅠ內切酶、1-2μl的相應酶切緩沖液、6-11μl無菌水，在25-38℃下反應1-4小時；(5)取2-8μl由步驟4所得的agp DNA片段、5-9μl由步驟4所得的質粒pUC118片段，混合，加入1-2μl連接反應緩沖液，1μl T4 DNA連接酶，在2-6℃下反應8-12小時，備用(6)從菌體的固體平板上挑取單菌落，接種于3-10mL液體培養基中，該培養基記為LB培養基，每升培養基中含有5g酵母浸膏粉、10g蛋白胨、10g氯化鈉，pH值為7.0，在25-38℃下于150-300轉/分的搖床上培養細菌6-15小時，接著取0.1-1.0mL培養液接種于50-100mL液體培養基中，在25-38℃下于150-300轉/分的搖床上培養至培養液在600納米處的吸光值為0.3-1.0，然后按照常規的氯化鈣法制備感受態細胞；(7)取150-250μL感受態大腸桿菌DH10B細胞，加入5-10μL由步驟5所得的連接反應物，按照常規方法進行轉化實驗，在含40μg/mL IPTG、40μg/mL X-gal和15g/L瓊脂粉的LB固體培養基上于37℃下培養細胞，16-24小時后挑取白色菌落，按照常規方法制備質粒DNA；(8)取2-4μl由第7步所得質粒DNA，依次加入0.5-1.5μlKpnⅠ內切酶、0.5-1.5μlSmaⅠ內切酶、1-2μl相應酶切緩沖液、3-5μl無菌水，在25-38℃下反應1-4小時，采用常規低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收長為4341bp的DNA片段；同時取2-4μl質粒pRL425，依次加入0.5-1.5μlKpnⅠ內切酶、0.5-1.5μlEcoRV內切酶、1-2μl相應酶切緩沖液、6-11μl無菌水，在25-38℃下反應1-4小時，采用常規低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收長為1539bp的DNA片段；(9)分別取4-9μl上述第8步的兩種DNA片段，加入1-2μl連接反應緩沖液，1μl T4DNA連接酶，在2-6℃下反應8-12小時，取5-10μL，加入150-250μL由步驟6所得感受態大腸桿菌DH10B細胞，按照常規方法進行轉化實驗，涂布于含750μg/mL紅霉素和15g/L瓊脂粉的LB固體培養基上，在37℃下培養16-24小時，挑取單菌落，按照常規方法制備質粒DNA，備用；(10)在200-400mL含0.5-1.5g/L葡萄糖的BG-11液體培養基中，接種5-10個集胞藻單藻落，在溫度為24-32℃、光照密度為1000-3000lx的光照培養箱中通氣培養至培養液在730納米處的吸光值為0.3-1.0；取10-20mL培養液于50mL已滅菌離心管中，15-25℃、3000-5000轉/分離心10-20分鐘，棄上清；向沉淀中加入2-8mL BG-11液體培養基中，使溶液在730納米處的吸光值等于2.5；取0.2-0.6mL上述溶液于已滅菌玻璃培養管中，加入2-8μL由步驟9所得質粒DNA，振蕩；將試管置于溫度為24-32℃、光照密度為1000-3000lx的光照培養箱中培養5-10小時，每半小時振蕩一次；取100-300μL液體涂布于含葡萄糖的BG-11固體平板上；20-30小時后將濾紙轉移至含10-100μg/mL紅霉素的BG-11固體平板上，繼續培養10-15天至單藻落出現；(11)挑取5-10個步驟10獲得的單藻落分別接種子200-400mL BG-11液體培養基、含0.5-1.0g/L葡萄糖的BG-11液體培養基、含5-20mM乙酸鈉的BG-11液體培養基或同時含0.5-1.0g/L葡萄糖和5-20mM乙酸鈉的BG-11液體培養基中，在溫度為25-32℃、光照密度為1500-2500lx的光照培養箱中培養，每24小時取樣，測定細胞密度，培養6-8天后，用離心機以4000-8000轉/分的轉速，離心10-20分鐘，棄上清液，收獲所得細胞，于60℃烘箱干燥沉淀，即可獲得本發明的產品可生物降解塑料聚-β-羥基丁酸酯。
全文摘要
本發明涉及一種構建基因工程集胞藻生產可生物降解塑料的方法,首先利用聚合酶鏈式反應技術得到野生型集胞藻的agp基因,然后利用分子克隆技術對其進行部分刪除,用獲得的重組質粒轉化野生型集胞藻,最后獲得無糖原合成能力、能生產可生物降解塑料PHB的基因工程集胞藻,使用本發明的方法,為利用清潔和清潔原生產環境友好型物質提供了可能。
文檔編號C08H99/00GK1309183SQ0013367
公開日2001年8月22日 申請日期2000年12月1日 優先權日2000年12月1日
發明者沈忠耀, 吳桂芳, 吳慶余 申請人:清華大學