專利名稱：殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用殼聚糖與金屬形成配合物后氧化降解制備窄分子量分布寡聚糖的新方法。更具體地說是將殼聚糖與金屬進行配位-氧化裂解，經必要后處理，得到數均分子量及分子量分布范圍符合特有生物生理活性、醫療保健功能要求，有著廣泛用途的低聚寡糖。
目前，殼聚糖降解制備低聚水溶性殼聚糖的方法主要有酶降解法、氧化降解法、酸降解法，其次還有微波法、超聲波法、輻射法等。現有的酶降解法主要依賴于殼聚糖酶、脂肪酶、溶菌酶以及其他非專一性水解酶，能得到較高收率的六至八糖，這種糖在食品及醫藥方面(抗癌藥物)用途廣泛，但在選擇合適的酶種以適合工業化大規模生產上尚存在困難，即缺乏以經濟成本進行大規模工業化生產的可能；而現已用于殼聚糖產品的工業化生產(如“鱘之寶”膠囊一上海偉康生物制品公司生產)的氧化降解法，包括了H2O2氧化法、H2O2-NaClO2法、H2O2-HCl法、和其他一些氧化降解法。但是這種方法對殼聚糖降解存在的最大問題是在降解過程中引入了各種反應試劑，使得對其降解副反應的控制以及在降解產物的分離純化方面增加了難度；酸降解法，它包括HCl降解法、酸-亞硝酸鹽法、過醋酸法、其他酸解法。其中用HCl降解法得到的低聚水溶性殼聚糖-鹽酸鹽的分子量分布比較寬。用酸-亞硝酸鹽法可制備相對較高含量的12至19(分子量在2000-3000，分布相對狹窄)低聚水溶性殼聚糖。酸解法和單純的氧化降解法都是非特異性的降解過程，其降解過程較難控制，雖然已先后用于工業化生產，并且各種分子量范圍的殼聚糖產品都能得到，但要想得到特定分子量范圍且具有較高收率，和能廣泛應用的殼聚糖產品仍是比較困難的；而其他降解法如微波法、超聲波法、輻射法等，也可以得到低聚水溶性殼聚糖，但仍然屬于非特異性降解過程，目前尚屬基礎研究探索階段。可以說除酶降解法外，凡屬非特異性降解過程降解得到的產物都有其無法解決的平均分子量分布寬這一難題。
本發明的目的是避開目前工業生產中采用的以非特異性降解過程為機制的，制備低聚水溶性殼聚糖過程所表現出的種種弊端和不足，提供一種殼聚糖與金屬形成配合物后氧化控制降解的新方法，人為制造特異性降解的氛圍，使制備獲取寡糖之目的終得以實現。
本發明的原理是以殼聚糖(Chitosan,(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-匍萄糖為主的聚合體)為原料，將這種含有氨基的殼聚糖在與金屬離子形成配合物的同時，破壞分子間及分子內氫鍵，降低溶液粘度，以使其能夠達到經氧化降解后，制備出較為專一分子量的寡糖配合物，然后用螯合劑將“廢”金屬除去，便可獲得專一分子量(低于1萬)，具有獨特的生理、生物活性和醫療特性的低聚水溶性殼聚糖(寡糖)。要想達到這一目的，必須在制備過程中準確把握每個制備環節中的每一細節。首先通過測量脫乙酰度計算出自由氨基的個數(摩爾數)。其次是根據不同金屬的配位性質，將定量的金屬離子加入殼聚糖溶液中，這樣可使大分子殼聚糖中的部分氨基以配合物形式存在，在進行這一過程的同時也實現了降低溶液粘度，即鹽效應結果。這一過程便可使金屬離子靠自由擴散作用在高分子間及分子內隨機均勻地形成定量的配位結點，使得大分子隨機結合后，自然分成了如附圖2中所示的有配位金屬存在的配位結點和未參與配位的自由殼聚糖糖苷鏈。可形象的將金屬存在的配位結點看作是附圖表2中網上的網結，將未參與配位的自由殼聚糖糖苷看作是附圖2中網上的網線。對于有些金屬來說，氧化后殼聚糖鏈是從金屬鄰近部位斷鍵的，而對于另一些金屬來說，也可以是從配位構型造成的優勢構象部位斷鍵。同時證明金屬加入量越多，配位結點越多，網越密，網節越短。即殼聚糖糖苷鏈越短，降解后的糖數越少，反之，糖數則多。本發明采用的溶液介質體系包括HAc-H2O、NaAc-HAc-H2O，以及其他一些除H2O2氧化法以外的溶解體質體系；以及本發明提到的醋酸銅、醋酸鎳、醋酸鑭、醋酸鐵、氯化鋇金屬鹽，及正在大范圍涉及到的主族金屬、稀土金屬、過度金屬鹽的特性。本發明在實驗中采取多重對照方式1)測定脫乙酰度，計算出原料氨基的個數，根據所需降解窄分子量要求，選擇不同性質、原子半徑的金屬并計算出所需加入金屬離子的摩爾數2)用適宜濃度、適量體積的酸性水溶液在適宜溫度、pH值及攪拌條件下溶解殼聚糖固體，并使其溶解完全3)將配制為一定濃度的金屬鹽水溶液加入溶解完全的殼聚糖溶液中，調節pH值、攪拌、控溫使金屬離子與殼聚糖配位反應完全；4)在適宜pH值、適宜溫度、攪拌條件下滴入適量摩爾濃度的氧化劑，并維持一定時間使氧化降解反應完全；5)在一定溫度下用堿調節pH值，對可在pH5～8時形成氫氧化物沉淀的金屬先考慮用此法過濾去除金屬，無沉淀生成的考慮加入適宜金屬的螯合劑用絡合沉淀法過濾去除，對不易生成沉淀的金屬可考慮螯合萃取去除；6)除去金屬的母液經適當濃縮后即可得所需產品的一定濃度的水溶液，產品的數均分子量及分子量分布范圍參數可通過粘度計和糖分析專用高效液相色譜測得；7)對于要求相差2～4糖范圍的低聚殼聚糖可通過GPC(gelpermeation chromatography膠凝滲透色層[分離]法)專用設備作層析柱分離來獲取。
以上過程明確了通過控制對金屬的加入量，使糖個數與金屬離子形成定比例關系，限定降解后糖數的多少，這便約束了降解后的分子量的專一性，使降解通過氧化劑氧化來最終實現。經本發明所采取的多重實驗的初步實驗結果可總結如下ⅰ)同濃度、同pH值、同溫度下，加金屬離子的殼聚糖溶液較不加金屬離子的殼聚糖溶液的粘度低，并與加入量有關；ⅱ)含金屬離子的溶液在加入等量H2O2后，其降解速率比不加金屬離子的要快得多；ⅲ)不同金屬離子引起的降解速率也不同。如銅離子大于鎳離子；ⅳ)改變金屬及H2O2加入量可有效地控制降解后溶液的粘度，既控制平均分子量范圍；ⅴ)完全氧化可使殼聚糖完全降解。實驗中已表現出銅離子存在催化性；ⅵ)實驗經氣質聯用分析發現了含氨基小分子和多羥基小分子的分子離子峰，這說明降解應從配位區開始。這恰恰說明斷鍵后片斷分子量分布受配位鍵限制變得較為專一的結果。
以下將結合附圖對本發明作一說明。
附
圖1是本發明殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解方法工藝流程圖。
附圖2是本發明理想的殼聚糖糖苷鏈金屬配位后形成的網狀結構示意圖。圖中M為配位結點，彈簧式線段為未配位糖苷段。
由附圖1和附圖2可知本發明殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解是先測定所采用原料殼聚糖的脫乙酰度，并計算出其中氨基的摩爾數，以0.1～10％的醋酸水溶液攪拌溶解，再兌稀使其形成0.001～0.5溶液。然后根據不同金屬的配位能力強弱、金屬離子半徑大小，確定金屬離子的加入量，稱量后用蒸餾水配成0.001-0.5的溶液在攪拌下滴入殼聚糖稀溶液中，使金屬離子自由擴散到大分子殼聚糖的氨基部位并形成配位鍵。由于高聚殼聚糖中部分氨基與金屬離子形成配合物，由此將大分子變為網狀結構。從附圖2得知，通過控制金屬加入量，可使糖個數與金屬離子形成定比例關系，限定未配位殼聚糖苷鏈大小，來約束降解后分子量的專一性，這一表現已被確認為“金屬配位-氧化裂解”原理對殼聚糖控制降解過程中的核心所在。在這種情況下應加入過氧化氫在一定時間內控溫氧化降解，降解后的混合物通過三種附加方法除去金屬離子1)、可采用螫合沉淀法去除金屬離子；2)、離子交換樹脂去除金屬離子；3)、使用特性柱去除金屬離子。去除金屬離子后，將寡聚殼糖母液進行中和、純化，即得到最終產物的寡聚殼聚糖水溶液。按附圖1中的步驟制備或購買合乎降解指標要求的殼聚糖作為基本原料。在其與金屬離子配位前，取少量測定其脫乙酰度，根據脫乙酰度計算金屬離子加入量(摩爾數)。加進0.1％-10％的醋酸水溶液，在溫度10～60℃之間，攪拌4～36小時使其溶解完全。再將如主族金屬離子、過渡金屬離子或稀土金屬離子配成稀的水溶液，在攪拌條件下緩慢加入體系中。然后在溫度0～80℃范圍內，反應2～12小時后，調節pH值在2～6之間，使之配位反應完全。再加入摩爾數與金屬離子摩爾數相同或略大于金屬離子摩爾數，濃度為0.01～25％的過氧化氫(H2O2)，在溫度0～60℃之間，0.3～24小時之間氧化降解。再用0.1～10％稀堿(NaOH、Na2CO3等)調節pH值，使其中可生成氫氧化物沉淀的金屬先完全沉淀，過濾除去對于不生成氫氧化物沉淀的金屬用絡合劑沉淀后過濾除去；對于金屬鈉離子等用交換樹脂去除金屬。將去除金屬的母液經真空濃縮后既得到產品。最后將所得產品送去作層析分離，收集不同分子量段的組份，給出產物參數和指標。
為了更進一步的說明本發明殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解原理，現以實施例加以詳述。
實施例1取殼聚糖0.5克，以1∶2～5的比例溶于HAC和水的混合溶液中，使其完全溶解后，采用酸堿滴定法測定其游離氨基保持在原加入量的78～86％。然后稱取0.005～0.05醋酸銅Cu(OAc)2·2H2O，加入殼聚糖溶液中，送進攪拌器在10～60℃的溫度下，攪拌20～140分鐘，再加入0.6～25％的氧化劑(H2O2)水溶液，在0～60℃的溫度下繼續攪拌約1～360小時后得到降解絡合物。然后將降解絡合物pH值調至5-6之間(弱酸性)，再加進DMBTA(自合成銅Cu絡合劑)生成Cu-DMBTA沉淀，過濾去除廢金屬。將得到的寡聚殼聚糖母液加入4～8％碳酸鈉再次調節母液pH值至6～8，真空濃縮，得寡聚殼聚糖母液主要為2～6的寡糖。
實施例2將準備好的殼聚糖原料取出0.5克，加入1∶2～10的HAC和水混合溶液中，殼聚糖原料溶解后，采用酸堿滴定法測定以上殼聚糖混合溶液中的游離氨其數保持在78～86％，再取0.001～0.01M的銅Cu(Ac)2·2H2O加入到以上溶液中，送進攪拌器后，在溫度5～55℃下攪拌，反應20分鐘～20小時后，再加氧化劑，再次在0～55℃的溫度下進行攪拌和降解絡合物約20分鐘～24小時，然后對得到的降解絡合物進行調節其pH值至5～6(酸性)時，再采用一種自合成的銅(Cu)絡合劑DMBTA去除廢金屬離子后得到寡聚殼聚糖母液，將母液送去過濾，并再次調節濾液pH值至7～8(中性)時，濃縮，最終得到主要成份為6～12的寡糖。
本發明殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解有以下優特點1、在原理上避開了目前工業生產中采用的以非特異性降解過程為機制的種種弊端和不足，人為的制造了特異性降解的氛圍。
2、可通過選擇不同半徑、不同用量的金屬離子與高聚殼聚糖形成配合物。再通過氧化斷鍵降解方便的得到所需降解范圍窄分子量分布的低聚殼聚糖。方法簡便，易操作，所選用試劑廉價易得，所得產品在實際應用中穩定、可靠。
3、可滿足工業化批量生產。
權利要求
一種殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解，其特征是以殼聚糖為基本母體，降低其基本母體的粘度，使其可與金屬鹽配合形成配合物，在一定溫度、一定PH值下保持穩定均一的存在狀態，而達到氧化降解的目的。
2.根據權利要求1所述的殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解，其特征在于其中殼聚糖是從水產養殖、海洋生物中的蝦、蟹殼及昆蟲、藻類和細菌生成的主要提取物之一。
3.根據權利要求1所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于其中金屬鹽包括主族金屬元素、過渡金屬元素以及稀土金屬元素。
4.根據權利要求1、2、3所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于其中殼聚糖中須加進0.1～10％的有機酸或無機酸水溶液，在0～100℃的溫度下，經過20分鐘～48小時進行溶解，降低其粘度。
5.根據權利要求1、4所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于其中主族金屬元素在加入殼聚糖有機酸或無機酸水溶液中時，其濃度一般保持在0.01～10％，其pH值在1～6稀土金屬元素在加入殼聚糖有機酸或無機酸水溶液中時，其濃度一般保持在0.01～10％，其pH值為1～6過渡金屬元素在加入殼聚糖有機酸或無機酸水溶液中時，其濃度一般保持在0).01～10％，其pH值為1-6。
6.根據權利要求1、2、3、4、5所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于其中殼聚糖與金屬配合形成的殼聚糖金屬配合物，采用0.01～25％的氧化劑，在0～55℃溫度下，經20分鐘～76小時降解。
7.根據權利要求1、6所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于除過氧化氫H2O2、H2O2-NACIO2、H2O2-HCI以外的其他氧化劑，以及對殼聚糖金屬配合物形成與控制降解有同等作用的物質體系。
8.根據權利要求1、3、5、6所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于其中主族、過渡、稀土金屬離子在其與殼聚糖配位降解后，脫去其中配位離子時，需加入比以上各類金屬多1.0～14％摩爾量的無毒性強金屬螯合劑、金屬沉淀劑(以水處理金屬沉淀劑為主)。
9.根據權利要求1、2、3、4、5、6、7、8所述的殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解，其特征在于其中寡聚殼聚糖母液在去除以上各類金屬離子時ⅰ)可采納自合成的金屬離子絡合劑DMBTA等系列產品，以螫合沉淀法去除金屬離子ⅱ)離子交換樹脂去除，ⅲ)以特性柱去除均可達到使寡聚殼聚糖母液分離、純化的目的。
10.對于要求相差2-4糖范圍的低聚殼聚糖可在粗產品的基礎上，通過GPC專用層析柱生產。
10.對于要求相差2-4糖范圍的低聚殼聚糖可在粗產品的基礎上，通過GPC專用層析柱生產。
全文摘要
一種采用“金屬配位－氧化裂解”原理對殼聚糖控制降解，制備窄分子量分布寡聚殼聚糖的新方法。其原理是利用生物甲殼素脫乙酰化后殼聚糖中部分氨基及相鄰羥基與加入的適宜金屬在稀溶液中配位。通過控制糖與金屬離子摩爾數的比例控制配位點的個數。稀溶液中配位使配位結點在殼聚糖高分子鏈中均勻分布，即保證了配位結點之間未配位糖苷鏈中糖數的均一性。氧化從配位結點或優勢構象處裂解高分子鏈，后處理得到窄分子量分布的低聚寡聚糖。
文檔編號C08B37/08GK1317496SQ00105049
公開日2001年10月17日 申請日期2000年4月11日 優先權日2000年4月11日
發明者張岐, 林強, 尹學瓊, 于文霞, 馮玉紅 申請人:海南大學