專利名稱：Wk－5344a物質和wk－5344b物質及其生產的制作方法
背景技術：
1.發明領域本發明涉及WK-5344A物質和WK-5344B物質及其生產。更具體而言，本發明涉及對膽固醇酯轉移蛋白有抑制作用的新型物質WK-5344A物質和WK-5344B物質及其生產。
2.相關領域描述由于血管壁中膽固醇積累如成人高血壓所致動脈硬化引起的心肌梗死和腦意外，其多種預防性藥物已知。包括如，普伐他汀、莫維諾林和氟伐他汀(Endo，A.，醫藥化學雜志(Journal of MedicinalChemistry)28，401-405，1985和Endo，A.，脂類研究雜志(Journal ofLipid Research)33，1569-1582，1992)。
心肌梗死和腦意外的發作和這些疾病的過程極其復雜。因此，十分需要治療這些疾病的具有不同作用機制的物質。
最近，由于日常生活中食品的西方化，因血管壁中膽固醇積累引起的心肌梗死和腦意外的死因增加，并成為生活方式相關疾病的問題。大多數膽固醇主要在肝臟和腸中酯化，通過長鏈脂肪酸形成膽固醇酯，其被分泌到血液中成為乳糜微粒和極低密度脂蛋白的成分，并主要作為低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的成分在血液中循環。
將肝臟膽固醇轉運到外周組織中的低密度脂蛋白是刺激動脈硬化的一個危險因素。相反，高密度脂蛋白從外周組織中收集膽固醇，被認為是抑制動脈硬化進展的一個因素。膽固醇酯轉移蛋白參與兩種脂蛋白間膽固醇酯的交換反應，并參與低密度脂蛋白的成熟。
因此，抑制膽固醇酯轉移蛋白功能的物質可減少血液中動脈硬化的危險因素——低密度脂蛋白，而相反，由于可抑制動脈硬化的高密度脂蛋白的增多而產生抗動脈硬化作用，并對這些疾病有效。
發明概述與目的為了發現新型生物活性物質，我們研究了從土壤中分離的微生物的代謝產物，并發現從土壤中新分離的微生物菌株WK5344的培養物產生對膽固醇酯轉移蛋白有抑制作用的物質。從該培養物中分離并純化該膽固醇酯轉移蛋白抑制劑后，由于具有這種化學結構的物質尚不清楚，我們將這些物質命名為WK-5344A物質和WK-5344B物質。
本發明即是根據這種了解實現的。
本發明的一個目的在于提供具有下列通式的WK-5344A物質 本發明的另一個目的在于提供具有下列通式的WK-5344B物質 本發明的另一目的在于提供一種生產WK-5344A物質和WK-5344B物質或其鹽的方法，該方法包括培養一種屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)并具有產生WK-5344A物質和WK-5344B物質的能力的微生物，在培養物中積累WK-5344A物質和WK-5344B物質，并從該培養物中分離WK-5344A物質和WK-5344B物質。
優選實施方案描述根據本發明的優選實施方案，本發明涉及生產新型物質WK-5344A物質和WK-5344B物質或其鹽的方法，其中具有產生WK-5344A物質和WK-5344B物質的能力、屬于鏈霉菌屬的微生物是鏈霉菌屬的WK-5344種。本發明進一步涉及一種具有產生WK-5344A物質和WK-5344B物質的能力、屬于鏈霉菌屬的微生物，該微生物是鏈霉菌屬的WK-5344(FERM BP-6668)。
具有產生本發明的WK-5344A物質和WK-5344B物質的能力的微生物(下文稱為產WK-5344物質微生物)屬于鏈霉菌屬，并具有無限制地產生WK-5344A物質和WK-5344B物質的能力。用來產生本發明的WK-5344A物質和WK-5344B物質的優選微生物菌株的例子是鏈霉菌WK-5344種，它是由本發明者從新收集的土壤中分離的。
該菌株的分類學特征如下。(I)形態學特征營養菌絲體在多種瓊脂培養基上生長良好，未見斷裂。氣生菌絲體在無機鹽-淀粉瓊脂和甘油-天冬酰胺瓊脂上大量生長，呈白色到灰色。在顯微鏡下觀察，觀察到顯示20個以上孢子的螺旋和鏈的氣生菌絲體。孢子的形態是大小為1.0×0.5μm的橢圓形。孢子表面多刺。未見菌核、孢子囊和游動孢子。(II)在不同瓊脂培養基上的培養特性根據E.B.Shirling和D.Gottlieb(國際系統細菌學雜志(International Journal of Systematic Bacteriology)16，313，1966)的方法觀察到的生產菌株的培養特性如表1所示。
色調的確定參照《色彩調和手冊》(Color Harmony Manual)第4版(Container Corporation of America，Chicago，1958)作為標準色，并在括號中表示色調的名稱。如未特別說明，下表顯示該菌株在不同培養基中27℃培養兩周后培養狀態的目測結果。表1蔗糖-硝酸鹽瓊脂生長 良好，淡芥褐色(2ie)背面 淡芥褐色-苔綠色(2ie-241g)氣生菌絲體豐富，灰色(5fe)可溶性色素不產生葡萄糖-天冬酰胺瓊脂(ISP)生長 良好，竹色(2gc)背面 竹色(3ie)氣生菌絲體豐富，雪花石膏色-灰色可溶性色素(13ba-5fe)
淡黃色(1db)甘油-天冬酰胺瓊脂(ISP)生長 良好，餅干色(2ec)背面 竹色(3ie)氣生菌絲體豐富，雪花石膏色-灰色可溶性色素(13ba-5fe)淡黃色(1db)無機鹽-淀粉瓊脂(ISP)生長 良好，竹色(2gc)背面 駝色(3ie)氣生菌絲體 豐富，灰色(5fe)可溶性色素 不產生酪氨酸瓊脂(ISP)生長 良好，竹色(2gc)背面 淡芥褐色-苔綠色(2ie-241g)氣生菌絲體 豐富，雪花石膏色(5fe)可溶性色素 不產生麥片瓊脂(ISP)生長 適中，竹色-金黃色(2fb-2kb)背面 竹色-暗褐色(2fb-2li)氣生菌絲體 適中，灰色(5fe)可溶性色素 香櫞色(1gc)酵母膏-麥芽提取物瓊脂(ISP)生長 良好，竹色(2gc)背面 芥子色(2le)氣生菌絲體 豐富，珍珠灰(13cb)可溶性色素 橄欖黃(11e)營養瓊脂生長 適中，竹色(2gc)
背面 塊金色(2nc)氣生菌絲體 適中，灰色(5fe)可溶性色素 不產生蛋白胨-酵母膏-鐵瓊脂(ISP)生長 適中，暗金色(2ng)背面 淡芥子褐色(2ie)氣生菌絲體 少，白色(a)可溶性色素 不產生葡萄糖-硝酸鹽瓊脂(ISP)生長 適中，淡芥子褐色(2ie)背面 芥子色(2le)氣生菌絲體 適中，白色(a)可溶性色素 金色(11/21c)甘油蘋果酸鈣瓊脂生長 適中，竹色(2gc)背面 淡麥色-竹色(2ea-2gc)氣生菌絲體 豐富，珍珠色(3ba)可溶性色素 香櫞色(1gc)葡萄糖-蛋白胨瓊脂生長 適中，竹色(2gc)背面 淡麥色-金黃色(2ea-2kb)氣生菌絲體 少，白色(a)可溶性色素 不產生(III)生理特性(1)黑色素(a)酪氨酸瓊脂 陰性(b)蛋白胨-酵母膏-鐵瓊脂陰性(c)葡萄糖-蛋白胨-明膠培養基陰性
(d)胰蛋白胨-酵母提取液陰性(2)酪氨酸酶反應 陰性(3)硫化氫產生 陰性(4)硝酸鹽還原 陽性(5)明膠液化(21-23℃) 陰性(葡萄糖-蛋白胨-明膠培養基)(6)淀粉水解 陽性(7)脫脂乳凝結(37℃) 陰性(8)脫脂乳胨化(37℃) 陽性(9)生長溫度 9-37℃(10)碳源的利用(Pridham和Gottlieb培養基)利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、蜜二糖、甘露醇、鼠李糖、果糖和肌醇。
略有利用棉子糖和蔗糖(11)纖維素分解陰性(IV)細胞壁組成細胞壁的二氨基庚二酸是LL型。
該菌株的分類學特征總結如下。
細胞壁中的二氨基庚二酸是LL型。營養菌絲體在多種瓊脂培養基上顯示良好生長，未見斷裂。氣生菌絲體的形態為長孢子鏈螺旋。孢子表面多刺。不同培養特性顯示褐色調的營養菌絲體和白色到灰色調的氣生菌絲體。在酵母膏-麥芽提取物瓊脂培養基、麥片瓊脂培養基、葡萄糖-天冬酰胺瓊脂培養基、甘油-天冬酰胺瓊脂培養基、葡萄糖-硝酸鹽瓊脂培養基和甘油-蘋果酸鈣瓊脂培養基上可溶性色素形成是黃綠色素。
根據這些觀察結果，該菌株確定為是一種屬于鏈霉菌屬的菌株，稱為鏈霉菌WK-5344種。
該菌株在1999年3月1日保藏于國際專利保藏單位，國立生命科學和人體技術研究所，位于AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566日本，保藏號為FERMBP-6668。
盡管產WK-5344物質的微生物菌株被作為本發明的優選菌株，但其分類學特征極易突變為微生物的普通特征，并且不穩定。眾所周知，也可通過自然突變技術突變，或一般進行的人工突變技術如紫外線照射、X線照射或使用誘變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍和甲磺酸乙酯進行突變。因此，本發明中能使用能產生WK-5344物質、屬于鏈霉菌屬的菌株，包括人工突變體和自然突變體。產WK-5344物質的菌株中包括通過細胞工程技術(如細胞融合和基因操作)突變的菌株。
在本發明的WK-5344A物質和WK-5344B物質的生產中，屬于鏈霉菌屬的產WK-5344A物質的微生物在優選的培養基中培養。在該微生物的培養過程中，通常使用用于普通微生物的培養方法。培養基的實例是含有微生物用可同化碳源、微生物用可消化氮源的營養培養基，必要時可添加無機鹽。
上述可同化碳源的實例有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、糊精、纖維素、甘油和有機酸，它們單獨或結合使用。可消化氮源的實例有有機氮源如蛋白胨、肉膏、酵母提取物、干酵母、大豆粉、玉米漿、棉籽油、酪蛋白、大豆蛋白水解物、氨基酸和尿素，和無機氮源如硝酸鹽和氨鹽，它們單獨或結合使用。
另外，必要時可添加無機鹽如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽和磷酸鹽和重金屬鹽。在培養基中，可添加刺激該菌株生長及WK-5344A物質和WK-5344B物質產生的痕量氮元素、生長刺激物質或前體。
培養能在有氧條件下進行，如搖瓶培養或通氣攪拌培養。培養基的pH優選地為中性條件。對于工業生產，浸沒通氣是優選的。培養條件可以是20-37℃，通常24-30℃，優選地27℃。液體培養中培養時間一般為2-6天，以積累WK-5344A物質和WK-5344B物質，當達到WK-5344A物質和WK-5344B物質的最大產量時，可終止培養。
為了根據所用菌株類型和外部條件獲得優選條件，可調節并選擇培養條件如培養基組成、培養溫度、攪拌速度和通氣量。在液體培養中，如果產生泡沫，可使用消泡劑如硅油、植物油和表面活性劑。
由于培養液或培養菌絲體中含有在培養物中積累的WK-5344A物質和WK-5344B物質，加入助濾劑如硅藻土(Celite)和Hyflosupercell過濾培養物，或離心分離培養液與菌絲體，用有機溶劑抽提，然后濃縮提取液，并分離WK-5344A物質和WK-5344B物質。
從培養濾液中分離WK-5344A物質和WK-5344B物質如下進行用不與水混溶的有機溶劑如乙酸乙酯、乙酸丁酯和苯抽提培養濾液，真空濃縮提取液獲得WK-5344A物質和WK-5344B物質。這種粗物質能用純化親脂性物質的已知方法純化，例如使用載體如硅膠或礬土的柱層析，獲得純化的WK-5344A物質和WK-5344B物質。
為了從菌絲體中分離WK-5344A物質和WK-5344B物質，用可與水混溶的有機溶劑如甲醇抽提菌絲體，真空濃縮提取液，用不與水混溶的有機溶劑如乙酸乙酯、乙酸丁酯或苯抽提濃縮液，并在與以上從培養液中獲得的提取液合并或不合并的情況下純化該提取液，獲得WK-5344A物質和WK-5344B物質。
本發明的WK-5344A物質和WK-5344B物質的理化性質描述如下。[I]WK-5344A物質(1)分子式C45H30N3O13Fe[用高分辨率FAB質譜(陽性)，測得m/z877.1203(M＋H)](計算值877.1206)(2)分子量876[經FAB質譜(陽性)測定為m/z877(M＋H)+和899(N＋Na)+](3)旋光率[α]D25-3000°(c＝0.01，甲醇)(4)紫外譜在甲醇中測定的紫外譜如
圖1所示。在280、305(肩)、440和690nm周圍觀察到特異的最高峰。
(5)紅外譜紅外譜(KBr壓片)如圖2所示。λmaxKBrcm-13400、1728、1701、1597、1493、1385、1284、1207和1105。
(6)溶劑中的可溶性在甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿和二甲亞砜中可溶，不溶于水。
(7)物質性質中性(8)物質的顏色與形態綠色粉末(9)質子核磁共振圖3(Varian NMR，在氘甲醇中，400MHz)(10)碳核磁共振圖4(Varian NMR，在氘甲醇中，100MHz)考慮上述理化性質和光譜數據確定WK-5344A物質的結構如下。 [II]WK-5344B物質(1)分子式C46H30N3O14Fe[用高分辨率FAB質譜(陽性)，測得m/z905.1151(M＋H)](計算值905.1155)(2)分子量904[經FAB質譜(陽性)測定為m/z905(M＋H)+](3)旋光率[α]D25-3000°(c＝0.01，甲醇)(4)紫外譜在甲醇中測定的紫外譜如圖5所示。在285、303(肩)、445和698nm周圍觀察到特異的最高峰。
(5)紅外譜紅外譜(KBr壓片)如圖6所示。λmaxKBrcm-13400、1718、1701、1597、1508、1385、1281、1196和1105。
(6)溶劑中的可溶性在甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿和二甲亞砜中可溶，不溶于水。
(7)物質性質中性(8)物質的顏色與形態綠色粉末(9)質子核磁共振圖7(Varian NMR，在氘甲醇中，400MHz)(10)碳核磁共振圖8(Varian NMR，在氘甲醇中，100MHz)考慮上述理化性質和光譜數據確定WK-5344B物質的結構如下。 如上所述，詳細敘述了WK-5344A物質和WK-5344B物質的理化性質，與這些性質相同的化合物未有報道，因此確定WK-5344A物質和WK-5344B物質為新物質。
本發明的WK-5344A物質和WK-5344B物質的生物學性質和抑制活性在下文中說明。(1)對人膽固醇酯轉移蛋白的抑制作用按照Kato等人，生物化學雜志(Journal of Biological Chemistry)264，4082-4087，1989所述的方法，用由人血漿制備的粗蛋白測定對膽固醇酯轉移蛋白的作用。
合并重建的含有25μl[1-14C]膽固醇酯的高密度脂蛋白(下文稱為HDL)、10μl人源低密度脂蛋白(下文稱為LDL)、30μl 7mM 5，5-二硫二硝基苯甲酸，和5μl部分純化的人膽固醇酯轉移蛋白。總共150μl反應混合液在37℃下反應30分鐘。
反應后，加入5μl 0.1％硫酸葡聚糖、5μl 6mM MgCl2和20μl離子強度調節為0.16的磷酸緩沖液，使混合液在冰上20分鐘。在4℃下以13000轉/分離心該混合液15分鐘。收集沉淀的LDL級分。LDL溶解于180μl 0.1N NaOH中，并用液體閃爍計數器測定LDL中轉移的膽固醇酯。對于膽固醇酯轉移蛋白活性，50％抑制的結果是0.54μg/mlWK-5344A物質，2.0μg/ml WK-5344B物質。
如上文所述，本發明的WK-5344A物質和WK-5344B物質顯示對膽固醇酯轉移蛋白有明顯的抑制作用，并認為可用于預防和治療由人體中膽固醇積累引起的疾病。
附圖簡述圖1顯示本發明的WK-5344A物質的紫外譜(在CH3OH中)。
圖2顯示本發明的WK-5344A物質的紅外譜(KBr壓片)。
圖3顯示本發明的WK-5344A物質的質子核磁共振譜(CD3OD)。
圖4顯示本發明的WK-5344A物質的碳核磁共振譜(CD3OD)。
圖5顯示本發明的WK-5344B物質的紫外譜(在CH3OH中)。
圖6顯示本發明的WK-5344B物質的紅外譜(KBr壓片)。
圖7顯示本發明的WK-5344B物質的質子核磁共振譜(CD3OD)。
圖8顯示本發明的WK-5344B物質的碳核磁共振譜(CD3OD)。
發明實施方案詳述下列實施例說明了本發明，但不應看作是限制本發明。
含有4.0％可溶性淀粉、2.0％溶劑抽提的烤大豆粉、32μl/l 0.1N硫代硫酸鈉、0.05％FeSO4·7H2O、0.05％KH2PO4和0.03％KCl的培養基(調節為pH6.5)在30升小型發酵罐中蒸汽滅菌。冷卻后無菌接種200ml種子培養液，并在250轉/分攪拌、10升/分通氣下27℃培養96小時。
培養后，離心培養液獲得的菌絲體用6升丙酮抽提。真空濃縮提取液除去丙酮，調節為pH5.0，用10升乙酸乙脂抽提，并真空濃縮提取液，獲得粗物質9.20克。粗物質在己烷、甲醇和水(40∶19∶1)中分配，收集分配于下層的WK-5344物質，真空濃縮獲得粗物質1.29克。將粗物質懸浮于10ml乙腈中，裝填于ODS柱(20ml，Senshu Co.，SSC-ODS-7515-12)上，用含0.05％磷酸的乙腈洗脫層析。
合并洗脫的12ml級分，并合并含有活性成分的級分。除去乙腈后，用乙酸乙酯抽提水層級分，并真空干燥，獲得粗活性物質157mg。
將157mg粗活性物質溶解于1.57ml甲醇中，裝填于ODS柱(147ml，Senshu Co.，SSC-ODS-7515-12)上，用含0.05％磷酸的乙腈逐步洗脫層析。合并洗脫的12ml級分，并合并含有活性成分的級分。除去乙腈后，用乙酸乙酯抽提水層級分，并真空干燥，獲得粗活性物質19.5mg。
將19.5mg粗活性物質溶解于0.5ml氯仿中，裝填于硅膠柱(126ml，Kiesel gel60)上，用氯仿和甲醇洗脫層析。每一級分分離為12ml。結果，分離到1.69mg WK-5344A物質和1.12mg WK-5344B物質。
發明作用如上所述，在培養基中培養一種屬于鏈霉菌屬并具有產生WK-5344A物質和WK-5344B物質的能力的微生物，以在培養物中積累WK-5344A物質和WK-5344B物質。從該培養物中收集WK-5344A物質和WK-5344B物質，獲得對膽固醇酯轉移蛋白有抑制作用的物質。預計該物質對成人疾病如動脈硬化引起的心肌梗死和腦意外有預防和治療作用。
權利要求
1.以下列通式表示的WK-5344A物質或其鹽
2.以下列通式表示的WK-5344R物質或其鹽
3.一種生產WK-5344A物質和WK-5344B物質或其藥學可接受的鹽的方法，包括培養屬于鏈霉菌屬并具有在培養基中產生WK-5344A物質和WK-5344B物質的能力的微生物，在培養基中積累WK-5344A物質和WK-5344B物質，從培養基中分離WK-5344A物質和WK-5344B物質，若需要時將該物質轉化為其藥學可接受的鹽。
4.根據權利要求3的方法，其中屬于鏈霉菌屬并具有產生WK-5344A物質和WK-5344B物質的能力的微生物是鏈霉菌屬的WK-5344。
5.一種屬于鏈霉菌屬并具有產生WK-5344A物質和WK-5344B物質的能力的微生物。
6.根據權利要求5的微生物，其中該微生物是鏈霉菌WK-5344FERM BP-6668。
全文摘要
本發明涉及對膽固醇酯轉移蛋白有抑制作用的新型物質WK－5344A物質和WK－5344B物質,及其生產方法。在培養基中培養一種屬于鏈霉菌屬并具有產生WK－5344A物質和WK－5344B物質的能力的微生物,在培養基中積累WK－5344A物質和WK－5344B物質,然后從該培養基中分離WK－5344A物質和WK－5344B物質。由于該物質顯示對膽固醇酯轉移蛋白有明顯的抑制作用,所以該物質可有效地用于預防和治療由人體中膽固醇積累引起的疾病。
文檔編號C07F15/00GK1333836SQ99815565
公開日2002年1月30日 申請日期1999年3月8日 優先權日1999年3月8日
發明者大村智, 供田洋, 高橋洋子 申請人:社團法人北里研究所