專利名稱：生產用于靜脈給藥的免疫球蛋白和其他免疫球蛋白產品的方法
技術領域：
本發明的領域本發明涉及一種從粗制血漿或粗制血漿蛋白組分中純化免疫球蛋白，即免疫球蛋白G(IgG)方法。本發明也涉及一種免疫球蛋白產品和這種免疫球蛋白產品的醫療用途。
本發明的背景在19世紀40年代末就引進了用于預防和治療一些傳染性疾病的人正常免疫球蛋白(HNI)。通過Cohn & Oncley的冷凍乙醇分級分離法(Cohn E等，(1946)，美國化學學會雜志，68,459-475),(Oncley等，(1949)，美國化學學會雜志，71,541-550)，并且后來Kistler和Nitschmann也曾進行過改良的方法而制備的HNI，在皮下或肌肉給藥時證實是安全、有效的，避免病毒感染的傳播。
先天性或獲得性免疫球蛋白的完全或部分缺失(分別是原發性和繼發性免疫缺陷綜合征)在頻繁的普通或嚴重感染中會表現出來，尤其是細菌性感染。以前通過每周達幾次的反復肌肉注射或皮下大量注射HNI進行終生治療，尤其是肌肉內給藥，是非常痛苦的。
在六十年代早期，曾經進行靜脈途徑HNI用藥的嘗試。試驗顯示約5％的健康志愿者和約95％的免疫球蛋白缺陷病人產生了程度不同的急性副反應，從呼吸困難到循環性休克，由于靜脈應用HNI可以導致上述嚴重的副反應，因此禁止使用該給藥方式。
這些副反應是由上述免疫球蛋白的聚集體引起的，這些聚集體可以強烈地激活補體系統參與其它副作用的發生。這在免疫球蛋白缺失的病人身上表現的尤其明顯。尤其嚴重的一種過敏性副反應可見于產生IgA抗體的患者。因此，在制備過程中避免形成聚集體和/或減少這些聚集體的方法得到發展，大約二十年前測試了第一代用于靜脈內給藥的免疫球蛋白(IVIG)并發現它是適用的。
應用IVIG的初衷是為了減緩先天性或獲得性免疫球蛋白完全或部分缺失的患者體內的感染性發作并減輕HNI給藥時伴隨的痛苦。IVIG的另一個優勢是可以在短時間內大劑量免疫球蛋白給藥，并且通過這個方法有可能很快獲得血液中足夠高的濃度。尤其治療嚴重的細菌感染時迅速在感染病灶形成高濃度是有重要意義的。
近年來，進一步證實IVIG在治療其它方法難以治療的嚴重疾病是有效的，例如，以免疫學為基礎的由血小板缺失造成的出血，原發性血小板減少性紫癜，一些罕見疾病例如川崎綜合征和一些自身免疫性疾病例如多神經根炎(Guillain Barre綜合征，又稱急性熱病性多神經炎)。其它一些現代難以治療的疾病現在也在進行IVIG臨床試驗。IVIG在這些疾病中的作用機理只是部分闡明。IVIG的效應與IgG的免疫調節特性有關，例如封閉巨噬細胞的Fcγ-受體，增強IgG的代謝，下調細胞因子產量，并干預獨特型/抗獨特型網絡，尤其與中和自身免疫的反應性活性有關。
第一代IVIG是通過胃蛋白酶切割初始原料制備的(Cohn組分Ⅱ)，切割的目的是去除免疫球蛋白聚集體。該方法不包括層析步驟。為了保持產品穩定，必須冷凍干燥一段合適時間并在即將使用前溶解。
IVIG的初始原料是已經證實在肌肉注射時對可能的病毒傳播是安全的HNI。由此，認為IVIG也是安全的。然而臨床應用幾年后，一些制造商的IVIG令人吃驚的顯示可導致丙型肝炎病毒感染的轉移。為了闡明在HNI的生產過程中已消除了病毒而進行的研究顯示用分級分離法從血漿中制備HNI時對病毒的消除是適度的。用于肌肉內的HNI的安全性似乎是因為它含有具保護性的免疫球蛋白。結合適度的注射體積和肌肉內給藥方案，這些保護性免疫球蛋白能夠中和并呈遞未感染血漿中的普通病毒。尤其是免疫球蛋白大劑量靜脈內給藥時，如20世紀90年代早期所證實的可能會發生病毒感染。因此，在生產方法中應該包括一步或多步明確病毒失活/或已消除的步驟，這一點得到了認可。
以未切割和未修飾的有抗補體活性和高穩定性的免疫球蛋白分子為基礎的第二代IVIG于80年代中期問世，但始終是冷凍干燥的產品形式。這代IVIG通過多步層析純化。這種產品目前占IVIG市場的主流。這樣第一代和第二代IVIG都是粉劑，在即將使用前溶解。
冷凍干燥的IVIG溶解很慢(一小瓶累計30分鐘)。一個病人往往需要溶解幾份。因此使用者有馬上可使用的IVIG液體是十分首要的，液體產品已引入市場。更重要的是，為了獲得一種純度高、穩定性高，而臨床效應又高，而副反應低的全天然IVIG，仍然需要改善生產方法。這樣就需要對從粗制血漿或血漿蛋白組分中純化IgG的方法進一步充實、改進，以獲得不含病毒的液體產品。最后，該方法應該能夠用于大規模生產。
本申請所述的純化方法可以制備一種靜脈內給藥的液體免疫球蛋白產品，其特征為高純度、純天然、具有生物活性、兩次病毒滅活、穩定的新一代IVIG，不含任何去污劑、聚乙二醇(PEG)或白蛋白等穩定劑。
發明概述本發明涉及一種改良的純化方法和一種與其它藥物一樣能夠靜脈內給藥的液體免疫球蛋白產品。
用本發明所述方法制備的免疫球蛋白可稱為第三代IVIG。本方法按下述條件進行分離不用胃蛋白酶進行切割，通過沉淀去除聚集體和顆粒(已確認這一步驟可以有效清除病毒)，通過離子交換層析法達到進一步純化，引進S/D處理作為病毒滅活步驟，并且制備的產品為液體。
與以前本領域的產品相比由于通過本發明的方法獲得的免疫球蛋白產品純度得到改善，不必添加諸如非離子去污劑，PEG或白蛋白的穩定劑來防止液體IVIG產品在儲存過程中形成IgG的聚集體。本發明方法獲得的產品比以前本領域的產品質量更高而且提供了改善的臨床效用，而且實際上不存在不希望的副作用。
本發明的詳細描述本發明涉及一種從粗制血漿或含免疫球蛋白的血漿組分中純化免疫球蛋白，即IgG的方法，所述方法包括以下步驟(a)制備含免疫球蛋白的粗制血漿蛋白組分的水相懸浮液；(b)在上述步驟(a)的懸浮液中加入足夠量的一種可溶于水的，而不使蛋白變性的沉淀劑，沉淀大部分非免疫球蛋白G的蛋白，免疫球蛋白聚集體和諸如病毒的具潛在感染性粒子的顆粒，而基本上不造成免疫球蛋白G單體的沉淀，這樣形成了一種固體沉淀和液體上清的混合物；(c)從步驟(b)的混合物中回收澄清的含免疫球蛋白G的上清；(d)將步驟(c)澄清的含免疫球蛋白G的上清加至陰離子交換樹脂，再加至陽離子交換樹脂；(e)用pH和離子強度足以去除樹脂中的蛋白雜質，而基本上不造成免疫球蛋白G洗脫的緩沖液洗去蛋白雜質和蛋白沉淀劑；(f)用pH和離子強度足以有效洗脫免疫球蛋白G的基本上非變性緩沖液洗脫免疫球蛋白G，從而回收含免疫球蛋白G的洗脫液；(g)將步驟(f)含免疫球蛋白G的洗脫液進行透濾/超濾以濃縮和/或透析洗脫液并任選地加入穩定劑；(h)在步驟(g)已透濾/超濾并任選地加入穩定劑的含免疫球蛋白G的組分中加入病毒致死劑量的病毒滅活劑形成基本上無病毒的含免疫球蛋白G的溶液；(i)將步驟(h)含免疫球蛋白G的溶液加至陰離子交換樹脂純化再接著加至陽離子交換樹脂；
(j)用pH和離子強度足以從樹脂中有效洗去蛋白雜質和病毒滅活劑而基本上不造成免疫球蛋白G的洗脫的緩沖液洗步驟(i)的陽離子交換樹脂；(k)用pH和離子強度足以有效洗脫免疫球蛋白G的基本上非變性緩沖液從步驟(ｊ)的陽離子交換樹脂洗脫免疫球蛋白G，由此回收含免疫球蛋白G的洗脫液；以及(l)透濾/超濾步驟(k)的含免疫球蛋白G的洗脫液以降低離子強度并濃縮免疫球蛋白G溶液，加入糖類物質調節重量摩爾滲透濃度。
本純化方法的起始原料可以是粗制血漿，但是含免疫球蛋白的粗制血漿蛋白組分是更方便的。純化方法的起始原料可以是正常人血漿或者可以來源于含有高滴度特定抗體的供體，例如超免疫血漿。在本說明書中，術語“含免疫球蛋白的血漿組分”包括所有本方法可用的起始原料，例如無冷沉淀物的血漿或各種血漿蛋白諸如因子Ⅸ和抗凝血酶已去除的無冷沉淀物血漿，不同的Cohn組分，和PEG沉淀法獲得的組分(Polson等，(1964)，生物化學生物物理學報，82,463-475；Polson和Ruiz-Bravo,(1972)Vox Sang,23,107-118)或硫酸銨沉淀的組分。在一個優選的實施方案中，血漿蛋白組分是Cohn組分Ⅱ和Ⅲ，但是Cohn組分Ⅱ，或Conh組分Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ也可使用。優選用Kistler-Nitschmann改良的標準Cohn-分級分離法從血漿中制備不同的Cohn組分。除免疫球蛋白外，Cohn組分包括例如纖維蛋白原，α-珠蛋白和β-珠蛋白，包括各種脂蛋白，它們應該在后續純化步驟中優選去除。根據用于獲得Cohn組分的分離方法(例如離心或過濾)，可以使用助濾劑，也可以不使用。
本發明方法的第一步包括制備含免疫球蛋白的血漿蛋白組分的水相懸浮液，其中IgG在懸浮液中的濃度足夠高，這樣，在后續沉淀步驟中，大部分非IgG-蛋白，尤其是高分子量的成分，聚合免疫球蛋白和其它蛋白及具潛在感染性的顆粒沉淀，而單體免疫球蛋白基本上不沉淀。如果在加入沉淀劑前在這種有緩沖作用并經過濾的懸浮液中IgG濃度至少4g/l那么通常可以達到這一點。應該認識到沉淀懸浮液的蛋白濃度影響及pH和溫度根據所選的沉淀劑而定。
血漿蛋白組分優選在基本上非變性溫度和pH下重懸于水中和/或緩沖液中。術語“基本上非變性”是指術語所涉及的條件基本上不會造成IgG分子功能活性的不可逆喪失，例如喪失抗原結合活性和/或Fc的生物學功能(參見實施例2)。
用體積是血漿蛋白組分體積的6-9倍，優選7-8倍的由至少一種非變性緩沖系統酸化處理的水懸浮血漿蛋白組分是有利的。為了保證免疫球蛋白的最佳溶解性和后續PEG沉淀步驟的最佳效果，含免疫球蛋白的懸浮液的pH優選保持在pH6以下，比如在4,0-6.0的范圍內，優選是5.1-5.7，最優選的pH是5.4。任何合適的酸性緩沖液都可使用，但緩沖系統優選包括至少一種下述緩沖液和酸磷酸鈉，醋酸鈉，醋酸，HCL。本領域熟練技術人員將會理解大量的其它緩沖液也可以使用。
尤其為了防止蛋白質變性和將蛋白酶的活性降至最低，免疫球蛋白緩沖液優選保持低溫。免疫球蛋白懸浮液和水及所加的緩沖系統優選在0-12℃的范圍內保持相同的溫度，優選的溫度是0-8℃，最優選的是1-4℃。
乙醇沉淀的糊狀物的懸浮液含相對大量的聚集蛋白物質。任選地，過濾含免疫球蛋白的懸浮液以去除例如大的聚集體，如果存在的助濾劑，和殘留的不溶糊狀物。過濾優選使用厚濾紙，例如C150AF,AF2000或AF 1000(Schenk),30LA(Cuno)或相似的濾器。也可離心去除聚集體，如果存在的助濾劑，和殘留的不溶性蛋白物質。
在含免疫球蛋白的經過濾的懸浮液中加入至少一種量足以造成免疫球蛋白聚集體中大部分高分子量蛋白，脂蛋白，聚集的蛋白沉淀的基本上不會引起變性的水溶性蛋白質沉淀劑。其它顆粒性物質，諸如感染性顆粒，如病毒顆粒，也會沉淀而不引起免疫球蛋白單體的沉淀。本文中的術語“感染性顆粒”包括如病毒顆粒(例如肝炎病毒，HIV1和HIV2)和細菌。
基本上不會引起變性的水溶性蛋白沉淀劑在蛋白純化領域中是為人熟知的。這種沉淀劑用于蛋白分級分離，可從懸浮液中得到部分純化的蛋白。本發明方法中使用的適合的蛋白沉淀劑包括PEG的各種分子量形式，辛酸，和硫酸銨。本領域的熟練技術人員會理解也可任選地使用其它幾種不會導致變性的水溶性沉淀劑進行沉淀。術語“加入蛋白沉淀劑”和該術語的其它形式是指加入一種或多種類型的蛋白沉淀劑。
一種優選的沉淀劑是有機試劑PEG，尤其是分子量在3000-8000Da范圍內的，如PEG3350,PEG4000,PEF5000，特別是PEG6000(這些數字代表PEG的平均分子量)。應用PEG的優點在于PEG不含離子且有穩定蛋白的特性，例如已知低濃度的PEG是IVIG的穩定劑。沉淀過程也有清除病毒的作用。PEG濃縮和沉淀各種種類、大小和表面包被的病毒。
向過濾的懸浮液中定量加入蛋白沉淀劑，可以使大量高分子量聚集的蛋白和顆粒沉淀，而不使IgG單體沉淀，形成澄清的上清溶液。加入的蛋白沉淀劑可以是固體粉末或濃縮溶液。
PEG作為沉淀劑時，蛋白質分子量越高，所使用PEG的濃度越低。PEG3350、PEG4000或是優選使用PEG6000為沉淀劑時，過濾的懸浮液中沉淀劑濃度優選在3-15％(重量)范圍內，例如4-10％(例如約5％,6％,7％,8％,9％,10％)，其中6％是最優選的。在進行沉淀時，至少需在固相和液相間出現平衡后再進行沉淀，通常大約兩個小時，例如2小時到12小時，優選時間大約4小時。在整個沉淀過程中懸浮液優選保持在低溫(例如低于12℃，低于10℃，優選在2℃和8℃之間)。最適溫度根據蛋白沉淀特性而定。
蛋白完全沉淀后，從固體沉淀和沉淀后的上清混合物中回收澄清的幾乎全是單體形式的IgG的上清。可使用常規方法從固相中分離液相進行回收，如離心和/或過濾。優選使用1000-5000g離心力的極限沉降離心(例如Westfalia)。
任選地，回收的含IgG的澄清的上清經厚濾紙過濾去除較大的顆粒和聚集體。任選地隨后使用常規滅菌濾器(如Millipore或Sartorius的0.22μm的濾器)進行無菌過濾，這樣可從溶液中消除細菌。
澄清的和任選地過濾的含IgG的上清進行至少一步，如兩步，也可選擇進行多步陰離子和陽離子交換層析以去除殘留的非IgG雜質，例如IgA，白蛋白和聚集體。在一個優選的實施方案中，將任選經過過濾的含IgG的澄清上清在兩個適當直徑的交換柱中經陰離子交換樹脂層析后，再進行陽離子交換樹脂層析。
在用離子交換層析純化IgG時，優選的是，如pH和離子強度等條件的選自是使溶液中大部分雜質(諸如非IgG蛋白，例如IgA，鐵轉運蛋白，白蛋白和聚集體)結合于陰離子交換樹脂上，而IgG分子基本上不吸附于陰離子樹脂上。對于后續的陽離子交換層析，優選的條件是使溶液中幾乎所有IgG單體結合于陽離子交換樹脂上。沒有結合于陰離子交換樹脂上的蛋白雜質和沉淀劑，在陽離子樹脂洗脫時被清除。
本方法的優選的實施方案中，陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂串聯使用。本文中，術語“串聯使用”用于離子交換樹脂時，是指蛋白流經陰離子交換樹脂后直接進入陽離子交換樹脂而不改變緩沖液或其它條件。
一些原因可說明在一個步驟中用兩個串聯連接的層析柱而不是兩個獨立的層析步驟，例如使用不同的緩沖液進行陰離子交換和陽離子交換是有利的。使用兩個串聯連接的層析柱使操作更為可行，例如不需要在兩個離子交換層析方法之間收集含IgG組分的中間步驟，因為在收集時有可能需要調節pH和離子強度。此外緩沖液的流速需要同時適用于兩個柱子，并且兩個柱子用同一種緩沖液平衡。然而，如果將層析過程換為兩步也是可行的，即不要串聯連接陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂。但是如上所述兩步層析與兩個離子交換柱串聯連接相比更費力。
目前認為本發明IVIG產品的高純度、高IgG單體和二聚體含量和低IgA含量，部分是由于使用了串聯連接的層析柱。
正如本領域熟練技術人員所熟知的，離子交換是以不同基質及結合不同帶電基團的不同材料為基礎的。例如，下述基質都可使用，所提到的材料可有不同程度的交聯以瓊脂糖為基礎(諸如SepharoseCL-6B,SepharoseFast Flow和Sipharose High Performance)，以纖維素為基礎(諸如DEAE Sephacel)，以右旋糖苷為基礎(諸如Sephadex)，以二氧化硅和合成的聚合物為基礎。對于陰離子交換樹脂，共價結合于基質上的帶電基團可以是如二乙氨乙基(DEAE)，季氨乙基(QAE)，和/或季銨(Q)。對于陽離子交換樹脂，共價結合于基質上的帶電基團可以是如羧甲基(CM)，丙磺基和/或甲磺基(S)。本發明方法的一個優選的實施方案中，陰離子交換樹脂使用DEAE Sepharose Fast Flow，也可使用其它陰離子交換樹脂。優選的陽離子交換樹脂是CM Sepharose Fast Flow，也可使用其它的陽離子交換樹脂。
填充進離子交換層析柱所用樹脂的合適體積由柱的尺寸即柱的直徑和樹脂的高度反映，并根據例如上樣溶液中的IgG量和所用樹脂的結合能力而變化。
進行離子交換層析前，優選使用可結合緩沖液平衡離子的交換樹脂。陰離子和陽離子交換樹脂優選使用同一種緩沖液平衡，因為僅僅配制、使用一種緩沖液可以簡化操作步驟。
例如，如果選用的陰離子交換樹脂是DEAE Sepharose FF而陽離子交換樹脂是CM Sepharose FF，且柱子串聯相接，那么兩個柱子都有利的是用與注入的IgG溶液有相同pH和離子強度的非變性酸性緩沖液平衡。多種緩沖液的任一種都適合于平衡離子交換柱，例如醋酸鈉，磷酸鈉，三羥甲基氨基甲烷。本領域的熟練技術人員清楚大量的其它緩沖液只要pH、電導與IgG溶液大致相同就可使用。平衡串聯使用的陰離子交換柱和陽離子交換柱的優選緩沖液是濃度在5-25mM之間的醋酸鈉緩沖液，例如在10-20mM的范圍內，優選濃度是約15mM。平衡柱子的醋酸鈉緩沖液的pH優選在5.0至6.0的范圍內，諸如在5.4-5.9之間，優選的pH是約5.7。電導范圍是1.0-1.4mS/cm，優選值是約1.2mS/cm。使用的醋酸鹽緩沖液可用醋酸鈉三水合物和冰醋酸制備。
在將澄清的經過濾的含IgG的上清上離子交換柱之前，如果有必要，其緩沖液濃度和pH值優選調節到與所用平衡緩沖液濃度和pH相同值。
將含IgG的上清加入串聯的柱子后，為了保證含IgG的溶液完全從陰離子交換柱轉入陽離子交換柱中，優選用一個柱體積的洗脫緩沖液洗柱(初始洗脫)。接著，陰離子交換柱和陽離子交換柱分開，優選用pH和離子強度足以洗脫陽離子樹脂上的所有雜質而基本上不洗脫IgG的緩沖液洗陽離子交換柱去除蛋白質雜質。
即使可以使用其它相似濃度和pH值的緩沖液，在初始洗脫時，有利的是仍使用平衡緩沖液。優選使用醋酸鹽緩沖液洗脫陽離子交換樹脂上的雜質。緩沖液的pH可從5.0至6.0，例如在5.2-5.4的范圍內，如約5.4。
陽離子交換樹脂上的IgG的洗脫優選用pH和離子強度足以使IgG有效洗脫的基本上非變性緩沖液，然后回收含IgG的洗脫液。本文中，有效洗脫是指上樣于串聯的陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂的IgG蛋白含量至少75％，如至少80％，至少85％，從陽離子交換樹脂上洗脫下來。有利的是按照梯度洗脫的步驟洗脫。本發明方法中，優選使用pH在5.0-6.0之間，如5.2-5.8，優選值是5.4，濃度在5-40mM范圍內，如10-25mM，優選值是15mM的醋酸鈉緩沖液。
優選的洗脫緩沖液鹽濃度高至足以從樹脂上置換下IgG。但也認為升高pH和降低鹽濃度可從樹脂上洗脫IgG。本方法的一個優選的實施方案中，用濃度在50-500mM范圍內的氯化鈉溶液進行連續鹽梯度洗脫，優選氯化鈉濃度是約125mM至約350mM。
也可進行逐步梯度洗脫。認為也可以進行恒定鹽洗脫，其中所用的陽離子交換柱洗脫緩沖液與梯度洗脫相反只有一種鹽濃度。如果進行恒定鹽洗脫，有利的是使用的氯化鈉鹽濃度范圍在約350mM至約500mM。與恒定鹽洗脫相比梯度洗脫的優點是用鹽梯度洗脫更有效，而另一個優點是洗脫液的鹽離子強度低，因為高鹽離子強度對IgG的穩定性至關重要，因此低鹽離子強度是優選的。洗脫緩沖液可進一步含有如下文所述蛋白穩定劑。正如本領域熟練技術人員所知道的，也可用其它適當的緩沖系統洗脫IgG。
洗脫時或洗脫后優選直接在IgG組分中至少加入一種蛋白穩定劑。蛋白穩定劑是本領域熟練技術人員所熟知的，包括如不同的糖醇和糖類(諸如山梨醇，甘露糖，葡萄糖，海藻糖，麥芽糖)。蛋白(諸如白蛋白)，氨基酸(諸如賴氨酸，甘氨酸)和有機試劑(諸如PEG)。有利的是選用的中間穩定劑能在后續步驟中從含IgG的溶液中去除。
IgG的溶液中蛋白穩定劑的合適濃度根據所使用的試劑而定。一個優選的實施方案中，穩定劑是蘇糖醇，優選的最終濃度是2-15％(w/v)的蘇糖醇，如約2.5％。
陽離子交換柱洗脫后，洗脫液優選脫鹽(如透析)并有利的是濃縮。結合使用透濾/超濾方法改變IgG的緩沖液和濃度。術語“透濾/超濾”是指透析和濃縮各通過透濾和超濾在一步進行。透濾和超濾也可以按照兩步進行。但為了防止產品不必要的損失，目前優選用透濾和超濾法同一步進行透析和濃縮。
有利的是使用的透濾/超濾膜標稱透過分子量范圍是10,000-100,000Da。本方法優選的膜類型是標稱透過分子量是30,000Da的聚砜膜，來自Millipore。也可使用有相當材料和多孔性的其它超濾膜。
濃縮的程度可有相應的變化。濃縮溶液從約10g/l至100g/l IgG,優選的是10g/l到50g/l。濃縮后，IgG濃縮液有利的是對低鹽離子強度的緩沖液透析。不僅去除鹽離子，此步還可從溶液中去除低分子量雜質并提供了為下步純化改變緩沖液的方法。透濾緩沖液優選含2.5％(w/v)山梨醇的15mM醋酸鈉。直到超濾的溶液的電導值降至1.5mS/cm以下，優選小于1.3mS/cm時停止改變緩沖液。在透濾/超濾過程中，pH優選保持在4.0-6.0范圍內，優選5.1-5.7，最優選的值是約5.4。
透濾/超濾后，如果有必要有利的是將溶液中的蛋白穩定劑的濃度調節至所用特定蛋白穩定劑特有的最適終濃度。如果使用了山梨醇，其濃度優選調至約10％(重量)。
優選用孔直徑在0.2-1.0μm范圍內的濾膜過濾穩定的溶液，優選的直徑是0.45μm左右，以便在下一步驟之前去除聚集體。在這一步驟中，作為高純度、低離子強度、酸性pH、相對高濃度的IgG和添加的穩定劑最終形成的溶液看起來是澄清的。
在IVIG的生產過程中，目前已明確證實至少有兩種清除病毒和滅活病毒的方法，在清除病毒的過程中，優選加入PEG，而針對有脂類包膜病毒應先用S/D處理。除了對起始原料的病毒安全性有嚴格的要求外，根據國際準則以及眾所周知的多步純化可降低病毒的作用，綜合使用兩個獨立的降低病毒的步驟對有包膜病毒和無包膜病毒都是有效的，本發明的藥物基本上是無病毒毒性的。
優選在本方法的此步驟中，向IgG的溶液中加入病毒致死劑量的病毒滅活劑，滅活IgG的溶液中的可能具感染性的脂類包膜病毒。病毒滅活劑的“病毒致死劑量”意來用來說明在溶液中加入的劑量，使得溶液中的病毒顆粒基本上無感染能力，并由此形成本領域所定義的含IgG的無病毒毒性溶液。這樣的“致死劑量”根據使用的病毒滅活劑及諸如培養時間、pH、溫度、脂類含量和蛋白濃度確定。
術語“病毒滅活劑”意在說明一種能夠滅活有脂類包膜病毒和無脂類包膜病毒的試劑或方法。術語“病毒滅活劑”在適當情況下應理解為包括這些試劑和/或方法的結合使用，及這些試劑或方法的一種。
優選的病毒滅活劑是去污劑和/或溶劑，最優選的是去污劑-溶劑混合物。可以理解病毒滅活劑可以是一種或多種去污劑和一種或多種溶劑的混合物。溶劑/去污劑(S/D)處理是廣泛使用的滅活血液產品中脂類包膜病毒(例如HIV1和HIV2，丙型肝炎病毒和非A-B-C(甲、乙、丙)型肝炎病毒，HTLV1和2型，皰疹病毒家族，包括CMV和埃-巴(EB)病毒)的步驟。多種去污劑和溶劑可以滅活病毒。可從含非離子和離子的去污劑中進行挑選，并且選取不導致變性的去污劑。由于非離子去污劑可以簡化IgG制備中清除去污劑的后續步驟，所以優選非離子去污劑。合適的去污劑，如Shanbrom等，US專利4,314,997中，和US專利4,315,919所述。優選的去污劑是市場所售的Triton X-100和吐溫-80。可以滅活病毒的試劑，如Neurath和Horowitz，在US專利4,764,369中所述的二-或三烷基磷酸酯。優選溶劑是三(正丁基)磷酸酯(TNBP)。本發明優選使用的一種病毒滅活劑是TNBP和吐溫80的混合物，也可選擇使用其它混合物。優選加入的混合物，使TNBP在IgG的溶液中的濃度在0.2-0.6％(重量)之間，優選濃度是約0.3％。吐溫80在含IgG的溶液中的重量濃度在0.8-1.5％之間，優選重量濃度是約1％。
在滅活有包膜的病毒后，可以得到基本上無病毒毒性的含IgG溶液，通常這些條件包括溫度為4-30℃，諸如19-28℃,23-27℃，優選約25℃，及證實性研究發現的培養時間。通常培養1-24小時是足夠的，優選為4-12小時，諸如約6小時，以保證病毒充分滅活。然而，適當的培養條件(溫度和培養時間)根據所用的病毒滅活劑，pH，和溶液中蛋白濃度及脂類含量而定。
預期也可使用其它的方法去除或滅活病毒制備無病毒毒性的產品，諸如加入亞甲基藍再進行紫外光照射或納米過濾。
溶劑/去污劑處理后，有利的是用緩沖液稀釋溶液。或者，過濾基本上無病毒毒性的含IgG的溶液，優選用先前所述的本發明方法的上一步驟中的厚濾紙或無菌濾器。
病毒滅活后，優選進行過濾，離子交換層析去除病毒滅活劑和蛋白雜質。優選按照所述的本發明方法中先前的離子交換層析步驟進行，不同之處是陰離子交換樹脂的體積大約是陽離子交換樹脂的一半，且IgG洗脫之前用大量緩沖液洗柱，至少用六個柱體積的緩沖液。另外，本發明的優選的實施方案中平衡緩沖液是濃度在5-25mM之間的醋酸鈉，優選濃度是15mM,pH范圍在5.0-5.8之間，優選5.4。如前所述，優選將醋酸鈉的含量和含IgG溶液的pH調節至與平衡緩沖液相同的濃度和pH。此外，本發明的一個優選的實施方案中，加入到回收的洗脫液中的穩定劑，優選麥芽糖，終濃度在1-5％(重量)之間，優選為2.5％。
優選的消除病毒滅活劑的方法是離子交換層析。但是，其它方法，諸如油抽提和其它的層析方法，預期是有效的。適當的方法根據所用的病毒滅活劑而定。溶劑/去污劑的清除，可通過先使IgG結合于樹脂上，接著再用緩沖液完全洗去滅活劑。陽離子交換層析是一種有用的方法。在本發明的優選的實施方案中，除陽離子交換層析外也可進行陰離子交換層析以提高本發明方法最終產品的質量和總體純度。
離子交換層析步驟之后，優選透析和濃縮含IgG的洗脫液；這樣殘余的小蛋白組分的含量也被有效的降低。如前所述可有利地進行透濾/超濾完成透析和濃縮。超濾用的緩沖液是醋酸鈉，優選濃度大約從4至10mM，優選7.5mM,pH在4.0至6.0，優選約5.1-5.7，諸如大約5.4。或者，也可用諸如磷酸鈉或酸等緩沖液進行超濾。電導小于或等于1mS/cm時停止超濾。或者，進一步無菌過濾含IgG的溶液。
如果需要，將基本上無病毒滅活劑的含純化的IgG的溶液進行進一步處理，達到可用于如靜脈內、皮下、或肌肉內應用的液體產品的目的。
從實用的角度講，免疫球蛋白的液體產品含量在儲存和使用時是一樣的。產品中IgG的終濃度優選在0.25-20％(重量)的范圍內(相當于2.5-200g的IgG/L)，諸如大約1-20％(重量)，即2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,12％,14％,16％,18％。
眾所周知高蛋白濃度可得到更高的IgG穩定性。另一方面，IgG的高濃度意味著病人在靜脈給藥時，由于本產品的滲透壓很高，為了避免在輸注時發生事故，所以最大輸注率必須維持在很低水平。本文推薦European Pharmacopoeia(Ph.Eur.)的靜脈內給藥濃度是5％(w/v)。另一方面，高度濃縮的產品(例如10％或上文所述)適合用于靜脈或皮下注射。
即使不是優選的，顯而易見通過本發明的多個方法步驟獲得的產品也能夠用作如凍干品而不作為液體產品，盡管它與即時可用的免疫球蛋白產品液體成品形式的使用相比略顯不足。下文將會詳細敘述后一實施方案。
在離子強度顯著低于血漿時液體免疫球蛋白產品最穩定，例如電導優選低于1.0mS/cm，優選約0.8mS/cm。
PH對IgG穩定性和輸注速度有影響。液體免疫球蛋白產品在酸性條件下最穩定，例如低于IgG的等電點，pH6.4-8.5。pH值與生理pH值越接近(7.1-7.3)，使用的輸注速度越高。由于穩定性的需要，本發明免疫球蛋白產品的pH優選在5.7-5.1之間，諸如5.2和5.6之間，如約5.4。
而且，免疫球蛋白產品可包含如前所述的蛋白穩定劑。除了糖醇和糖類(諸如山梨醇，甘露糖，海藻糖，麥芽糖)，還有蛋白(諸如白蛋白)，氨基酸(諸如賴氨酸，甘氨酸)和有機試劑(諸如PEG和吐溫80)也可用作穩定劑。含IgG的溶液中穩定劑的適當濃度如前所述根據所用的特定試劑確定。
如果需要可以調整純化的IgG溶液以獲得穩定的等滲溶液。術語“等滲”意在說明與血漿中滲透壓相等的溶液。如上文所述，本發明免疫球蛋白產品液體成品的離子強度顯著低于血漿。因為這個原因優選使用單糖或雙糖提高溶液的重量摩爾透濾壓濃度而并不影響離子強度。本發明一個優選的實施方案中，加入的甘露糖濃度保證溶液是等滲的，而且甘露糖發揮了免疫球蛋白穩定劑的功能。這步操作優選加入的甘露糖終濃度在約5％到15％(w/v)范圍內，優選10％(w/v)；也可選擇使用其它糖類，諸如甘露糖和葡萄糖。
優選的免疫球蛋白產品最終條件既需保證蛋白的穩定性又要考慮如pH，離子強度和漲度等生理上可接受的條件。而且，免疫球蛋白產品必須符合如Monograph No.918,Ph.Eur.,1997中所指定的質量管理測試。
本發明方法獲得的產品的主要優點是，如是液體產品，該產品是液體的即時可用的化合物，它而且很穩定，高度純化，有大量的正常IgG亞類分布，極低的IgA含量和低IgM含量，且保留了抗體活性和如Fc功能所示的生物活性。
而且，它基本上不含免疫球蛋白聚集體和/或可檢測到的其它高于二聚體的聚合物血漿蛋白并具有低抗補體活性，并且有很高含量的IgG單體和二聚體。單體IgG含量至少有90％，這一點很理想。由于它的高穩定性可以避免添加其它穩定劑，諸如白蛋白，甘氨酸，去污劑，或PEG。最后，由于方法中有明確的經驗證的旨在消除和/或滅活脂類包膜和無脂類包膜病毒的降低病毒步驟，所以產品是無病毒毒性的。
驗證一個生產步驟是降低病毒步驟旨在提供證明生產方法可以有效滅活/消除已知的污染初始原料的病毒或是可能造成污染的病毒的證據。驗證性研究包括在待驗證的生產步驟前有意加入病毒再在此生產步驟或幾步后檢測消除病毒/滅活病毒的程度。GMP抑制防止了有意在生產設備中引入病毒。因此，應該在為生產步驟按比例縮減形式的病毒學研究獨立裝備的實驗室進行驗證性研究且研究人員應有專門的病毒學技術并有有關工程師配合。在待驗證的生產步驟前加入的病毒的量應盡可能的高以確定該生產步驟充分滅活/消除病毒的能力。但是，應加入病毒刺突使得生產原料的組成不會發生顯著性改變。優選的病毒刺突的最大體積小于等于10％。
應根據GLP原則進行定量感染性分析并且可涉及噬斑形成，檢測其它諸如合胞體或轉化灶形成的致細胞病變作用，終點滴定(如，TCID50分析)，檢測病毒抗原合成或其它方法。方法必須足夠敏感重復性能好且有充分的重復試驗和對照進行檢測以保證結果有充分的統計學準確性。
典型的，用6logs病毒檢測一個方法步驟，如果降低了大約4logs或更多病毒，提示對研究中的特定的測試病毒有明顯的效果。相同的，降低了大約4.5logs,5logs，或甚至5.5logs，說明對研究中特定的測試病毒有明顯的效果，且此步驟是已驗證的病毒降低步驟。
使用最有可能污染該產品的病毒進行病毒驗證性研究，然后提供盡可能多的物理化學特性，以檢測該體系總的清除病毒能力。
進行病毒的驗證性研究應按照病毒驗證性研究指南的注意事項研究的設計、結果和解釋，以證實病毒的失活和清除(CPMP/BWP/268/95)，以及血漿類的醫藥產品指南的注意事項(CPMP/BWP/268/95)進行以下工作。
本方法的驗證性研究見實施例5。
本發明產品的純度大于95％，甚至大于98％。本發明之所以能夠獲得純度如此之高的產品是由于該產品是通過至少一種，最好是兩種任選地串聯的陰-陽離子交換層析步驟而獲得的。盡管可以使用許多種方法獲得高產量，但是使用本文所提及的方法所獲得的產量顯著的高，每公斤的新鮮冰凍血漿中至少可以獲得3.5克IgG蛋白。
已進行的比較研究(見實施例2)表明，使用本發明的方法所獲得的免疫球蛋白產品具有理想的功能特性，如顯著的抗原結合特性和很高的Fc功能。由本發明人制備的優選藥物是5％(重量)免疫球蛋白的溶液。穩定性檢測表明，該產品在4℃下可以存放一年以上，也就是說免疫球蛋白產品IgG不聚結成團塊或者降解為片段、不喪失必需的生物活性、或者不產生不必需的活性，如體外檢測抗補體活性、激肽釋放酶原活性。
根據本發明的方法，可獲得純度達95％以上的IgG產品，如至少是96％，或至少97％，例如至少98％，優選至少99％，更優選純度在99.5％。IgG產品中IgA的含量應小于6mg/L，如IgA小于4mg/L，優選小于3mg/L者，IgA低于2mg/L更優選。
需要強調的是其它產品含有不同形式的穩定劑，如去污劑、PEG或白蛋白。在一個優選的實施方案中，本發明的產品不含上述任何穩定劑，而是選擇耐受性非常好的糖類作為穩定劑。
本發明產品的一個特征是聚合物和聚集體的濃度非常低。在一個優選方案中，本發明產品中含有少于1.5％的聚合物和聚集體，如低于1％，低于0.5％或低于0.25％。IgG單體和二聚體的含量至少為95％，或至少97％，如至少為98％，優選為至少98.5％或99％。本產品中IgG單體含量至少為90％。
臨床試驗表明，本發明產品的臨床效應與注冊使用的IVIG產品具有可比性。患者對該產品具有很好的耐受性，該免疫球蛋白在血循環中的滯留時間為4周。本發明試驗表明，IVIG,SSI的免疫調節作用是可信的(見實施例3中的數據)。
IVIG的適應癥有原發性低γ球蛋白血癥或原發性γ球蛋白缺乏癥，包括常見的多種免疫缺陷性疾病、Wiskott-Aldrich綜合征和重癥聯合免疫缺陷癥(SCID)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)和多發性骨髓瘤患者所引起的繼發性低γ球蛋白血癥或γ球蛋白缺乏癥、AIDS和細菌感染的兒童、急性和慢性原發性血小板減少性紫癜(ITP)、異原性骨髓移植(BMT)、Kawasaki病和格林-巴利(Guillan-Barre)綜合征。
神經病學慢性炎性脫髓鞘多發性神經病(CIDP)、多灶性運動神經病變、多發性硬化、Myasthenia Gravis病、Eaton-Lambert綜合征、視神經炎、癲癇病。
婦科學習慣性流產、原發性抗磷脂綜合征。
風濕病學類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、系統性硬皮病、脈管炎、Wegner肉芽腫、Sjogren綜合征、青少年類風濕性關節炎。
血液病學自身免疫性嗜中性粒細胞減少癥、自身免疫性溶血性貧血、嗜中性粒細胞減少癥。
胃腸道疾病Crohn病、結腸性潰瘍、腹部疾病。
其它哮喘、敗血癥性休克、慢性疲勞綜合征、銀屑病、中毒性休克綜合征、糖尿病、副鼻竇炎、擴張性心肌病、心內膜炎、動脈粥樣硬化、成年感染AIDS和細菌感染。
除了上述所提及的可以用IVIG產品治療的適應癥外，還有一些重癥的自身免疫性疾病也可以用本發明產品進行治療，這些疾病通常用皮質類固醇類激素和免疫抑制劑進行治療。這些疾病中包括幾種神經性疾病，如多發性神經根炎，以及一些免疫介導的外周多發性神經根炎，但是還有一些慢性炎性風濕性疾病和血管性疾病，如全身性脈管炎包括小血管，多發性肌炎和其它疾病。
本發明產品不同的作用方式可以清除慢性感染的感染性抗原和提高IgG的代謝。
本發明通過以下實施例作進一步闡明(不局限于這些例子)。
實施例實施例1免疫球蛋白的純化方法步驟(除實施例5外，其它均在5±3℃的條件下進行操作)步驟1Cohn組分Ⅱ+Ⅲ糊狀物的制備通過經Kristler-Nitschmann(Kristler P和Nitschmann HS,1952,Vox Sang,7,414-424)改進的標準Cohn分級分離法(Cohn E，等，1946，美國化學學會雜志，459-475)，從人血漿中分離制備Cohn組分Ⅱ+Ⅲ的糊狀物。在除去冷沉淀物后，并且如果需要將某些血漿蛋白(如因子Ⅸ和抗凝血酶)吸附在諸如一種離子交換材料和/或一種稱為Heparin Sepharose(肝素瓊脂糖)基質上之后，用乙醇進行沉淀。
制備組分Ⅱ-Ⅲ糊狀物所需合適的條件(pH、乙醇濃度、溫度、蛋白質濃度)，請參見Hams主編的《血液分離和血漿成分》一書，Wiley-Liss，紐約，1991。在過濾前添加一種助濾劑，在壓力濾器上分離該糊狀物。
步驟2從Cohn組分Ⅱ+Ⅲ糊狀物中提取免疫球蛋白提取是向140公斤組分Ⅱ和Ⅲ糊狀物(含有30公斤的助濾劑，Schenk，德國)(相應于1150公斤血漿起始體積)中先添加525公斤的pH為4.0，濃度為2.33mM的磷酸鈉/醋酸鈉緩沖液，緩慢攪拌1.5小時，接著連續兩次添加350公斤注射用水(WFI)，每次加水后均攪拌1.5小時。最后，大約添加280公斤濃度為21.5mM磷酸鈉/醋酸鈉，pH為7.0，懸浮，調節pH值為5.4。
懸浮液用厚濾紙進行過濾(C-150AF,Schenk，德國)。濾液中含有免疫球蛋白和其他蛋白質。
步驟3用PEG6000沉淀蛋白質的聚集體以及除去病毒將PEG6000(德國默克公司)加入到步驟2中所制備的過濾液中，最終濃度為6％(重量)。沉淀4小時，用極限沉降離心機(WestfaliaBKA28，德國)離心上述PEG懸液，使之澄清，然后再進行過濾(50LA,Cuno，法國)，接著用0.22微米的過濾器過濾除菌(Durapore,Millipore，美國)。用緩沖液調節濾后PEG上清的pH值，方法是一份pH為0.45M的醋酸鈉與29份上清混合，pH值為5.7。
步驟4通過系列陰離子和陽離子交換層析法進行純化(Ⅰ)兩根層析柱分別填充56升的DEAE-Sepharose FF(PharmaciaBiotech，瑞典)和56升的CM-Sepharose FF(Pharmacia Biotech，瑞典)。兩根柱子串聯相連，液體先流經DEAE-Sepharose樹脂，接著再通過CM-Sepharose樹脂。柱子中的樹脂用pH值為5.7的15mM的醋酸鈉緩沖液平衡。然后，步驟3中的溶液通過串聯的兩根柱子。
在進行離子交換層析時，溶液中的大多數蛋白質結合在DEAE-Sepharose樹脂上。在溶液流經柱子時，IgG不與DEAE-Sepharose樹脂結合，直接穿過柱子，但與CM-Sepharose樹脂結合。在溶液流經柱子后，并用相當于一個柱體積的平衡緩沖液沖洗后，將DEAE柱與CM柱斷開。然后CM柱用3倍柱體積的pH值為5.4的15mM的醋酸鈉緩沖液沖洗，再用一種pH值為5.4,NaCl濃度為125mM至350mM，醋酸鈉為15mM的梯度液進行洗脫。將洗脫下來的IgG收集在山梨醇中，最終濃度為2.5％(重量)。
步驟5溶劑/去污劑(S/D)處理IgG組分洗脫的IgG組分用超濾/透濾法進行濃縮和除鹽，至每升大約含有50克的IgG的濃度。所使用的膜為一種聚砜膜，最大透過分子量為30kD(Millipore)。對pH值為5.4，含2.5％的山梨醇的15mM醋酸鈉的緩沖液進行透濾，直到溶液的電導率小于1.4mS/cm為止。溶液中IgG的含量用分光光度法進行測量，波長為280nm(納米)(A280)。將山梨醇的濃度調整到10％(重量)，溶液用孔徑為0.45微米的濾膜過濾(Pall公司，英國)。然后加入Tween-80和TNBP，最終濃度分別為1％和0.3％(均是重量)，進行S/D處理。25℃下，S/D處理至少6小時。
步驟6離子交換層析法去除S/D(Ⅱ)兩根分別填充DEAE28升和CM56升Sepharose FF層析柱串聯連接，并用pH值為5.4,15mM醋酸鈉進行平衡。在步驟5中經S/D處理的IgG用5份pH值為5.4，濃度為15mM醋酸鈉緩沖液稀釋，然后用厚濾紙(Cuno90 LA)進行過濾，接著進行過濾除菌(Sartobran,Sartonius)，再用兩根串聯相連的柱子進行層析。除CM柱用6倍于柱體積的緩沖液進行沖洗，以除去來自S/D處理所帶來的雜質一步外，離子交換層析和隨后從CM柱上洗脫IgG方法均按步驟4所述的方法進行操作。洗脫下的IgG收集在終濃度為2.5％的麥芽糖(默克，德國)溶液中。
步驟7用于靜脈內應用的免疫球蛋白終濃度和配方對步驟6所洗脫下來的IgG進行超濾，并用透濾法進行除鹽，透濾液為含2.5％麥芽糖的7.5mM的醋酸鈉溶液，pH值為5.4，直到最終溶液的電導率小于1mS/cm為止。使用的膜為聚砜膜，最大透過分子量為100kD，也就說大于100KD的蛋白質不能透過膜，只允許小于100KD的分子透過，從而被清除。將IgG的最終濃度調整為50克/升，而麥芽糖的最終濃度調整為10％(W/V)。最終經麥芽糖調節的制備液通過滅菌的濾器(Sartopure GF2,Sartorius)進行過濾除菌。
實施例2本方法方法所獲得的產品與其他IVIG產品比較分析結果Gammonativ Octagam Gammagard IVIG,SSI凍干 液體 凍干 液體純度 45.4％199.1％ 94.6％199.8％白蛋白 50mg/ml2少量 3mg/ml2未檢出單體和二聚體含量 98.3％396.8％ 97.6％399.4％聚合物和聚集體 0.8％31.6％＜0.1％3＜0.1％ACA26％ 30％ 34％ 32％PKA＜8.5IE/ml ＜8.5IE/ml ＜8.5IE/ml ＜8.5IE/ml血凝素，3％溶液抗-A＞1∶2 陰性 陰性 陰性 陰性抗-B＞1∶2 陰性 陰性 陰性 陰性Fc功能 169％ 121％132％ 178％亞類分布IgG1 60.0％ 61.9％ 67.7％ 56.6％IgG2 35.8％ 33.1％ 27.2％ 39.4％IgG3 3.5％ 3.6％4.4％ 2.6％IgG4 0.7％ 1.4％0.6％ 1.5％IgA2.96mg/l 54.7mg/l 0.85mg/l 1.36mg/lIgM0.28mg/l 39.1mg/l 0.99mg/l 0.16mg/lTween80＜20ppm＜20ppm 未確定 ＜20ppmTNBP 2.0ppm 1.5ppm 1.5ppm 1.5ppmPEG0.01mg/ml 0.01mg/ml1.6mg/ml40.02mg/mlPH 6.75.7 6.75.6總蛋白濃度 97g/l 45g/l50g/l 51g/l麥芽糖或葡萄糖 20mg/ml92mg/ml 15mg/ml88mg/ml1沒有對HSA校正；2制造商聲明；3經HSA峰值的校正；4用作為穩定劑純度(蛋白質組成)藥典純度要求IVIG制備物的IgG至少為95％，也就是說含有的非IgG成分不超過5％。有多種理由說明純度是非常重要的。從理性上看，只應含有具所需功能的蛋白質，而其它雜質蛋白質可能有潛在危害性，如引起不必要的副反應和/或影響產品的穩定性。
純度可以借助Ph Eur,1997，第964-965頁所述的電泳技術進行分析，蛋白質可以用醋酸纖維素凝膠進行分離。但是為了實際目的，用瓊脂糖凝膠進行分離。電泳后，分別進行凝膠的固定、干燥和染色。最后對蛋白質帶進行掃描檢測。由上表顯示，本發明產品是非常純的(99.3％)。
白蛋白白蛋白的含量可通過C.B Laurell(分析生物化學，1965,10,358-361)所介紹的方法應用免疫電泳技術進行分析。取5微升的產品用抗人白蛋白抗體(DAKO A/S，丹麥，No A0001(1/100))分析。由于純度高，所以本發明產品沒有檢測出白蛋白。
IgG單體和二聚體的含量IgG的單體和二聚體可用凝膠滲透層析法進行分析，通過積分單體和二聚體峰值面積從層析譜監控，參見Ph.Eur。不同的分析結果均列入上述表中，發現單體和二聚體的量占該產品在整個層析譜面積的99.3％(其中IgG單體占92％)。
聚合物和聚集體的含量產品中所含的聚合物和聚集體是造成一系列的副反應的原因，如流感樣癥狀。由于制備方法非常溫和，所以產品的純度非常高，由本發明所制備的免疫球蛋白產品基本不含有聚合物和聚集體。
聚合物可以通過凝膠滲透層析法進行分析，任何比二聚體IgG的滯留時間短的蛋白質峰值均認為是聚合物，這正如Ph.Eur所述的那樣。
按照Ph.Eur和其他指南，蛋白質聚集體的含量最好低于3％。由本方法所制備的產品測不出聚集體，因此認為所含的聚合物和多聚物的含量小于0.1％。
抗補體活性(ACA)和激肽釋放酶原激活劑活性(PKA)ACA和PKA的測量方法參見Ph.Eur。
ACA應盡可能的低。根據Ph.Eur，補體消耗應低于或等于50％。對本發明產品的樣本進行補體消耗的測量發現為30％，也就是與其他所測量分析樣本具有可比性。值得注意的是白蛋白可以抑制補體的消耗(本發明人觀察發現)。
如果本產品中PKA含量達到一定水平，可以引起血壓降低的副反應。因此，免疫球蛋白產品中PKA應盡可能的低。根據Ph.Eur，PKA應小于35IU/ml這一由Ph.Eur所規定的標準，本產品與所分析的其他產品一樣，均小于該法所規定的量，如低于8.5IU/ml。
血凝素血漿免疫球蛋白的IgM組分包括血凝素，它是A型和B型抗原的抗體。在這些抗體存在時，可以引起副作用，可能由于使用者的血型為A型和/或B型，從而導致溶血反應。
按照藥典的要求，免疫球蛋白產品中血凝素的含量必須低于經過1∶64的稀釋后可以造成A/B型紅細胞凝集時的含量。所有產品均符合這一要求。
Fc功能保留的結合抗原的活性對IVIG的生物學功能是非常重要的。對免疫調理作用活性也同樣重要。另一方面，保留的Fc功能對IVIG作用于各種吞噬細胞以及補體的激活均非常重要。Fc功能通過許多技術方法可以證實，但是Ph.Eur中所述的方法已被認可，通過該方法可以測量在制備抗風疹抗體的過程中抗體激活補體的潛能。該活性可以與設定為100％的一種推薦的免疫球蛋白生物學制備物(BRP,Ph.Eur)進行比較。如果相對活性大于60％的參考制備標準的話，該產品就可以進行一系列的檢測。已表明，本產品Fc功能的穩定性非常高，尤其是與其他液態產品進行比較分析時更是如此，最可能的原因是純化方法較溫和。
亞類的分布IgG亞類的分布通過A Ingild(斯堪的納維亞免疫學雜志，1983,17,41)所介紹的標準Mancini免疫擴散法進行測定。濃度用WHO的參考血清(67/97)進行判定。亞類的分布必須在正常人的血漿范圍之內，即中位濃度為3.7-10.2克IgG1/升血清，1.1-5.9克IgG2/升血清，0.15-1.3克IgG4/升血清和0.06-1.9克IgG4/升血清(R Djurup等，斯堪的納維亞臨床實驗室調查雜志，48,77-83)。因此，所有產品的亞類的分布是可以接受的。
IgA含量據認為IgA的存在具有潛在的使IgA缺乏的受體致敏。如果IgA缺乏的患者使用了含有IgA的免疫球蛋白的制劑，IgA就會被認為是外來抗原，結果患者體內就會產生IgA的抗體。該患者下次再用含有IgA的制劑時，就會激發過敏性反應。因此，免疫球蛋白中應盡量不含有IgA是非常重要的。在IVIG產品中含有的IgA可以用ELISA法進行檢測，如使用一種多克隆抗IgA的抗體與IgA結合，一種標記的抗IgA用來檢測結合的IgA。標準品通過含有已知含量的IgA的校正器(No X908,DAKO A/S，丹麥)稀釋來構建。
用實施例1中所描述的方法制備的產品中IgA的含量小于2mg/L，其中IgA的含量遠遠低于其他液態產品中的含量。由于IgG與IgA之間的物理化學特性非常相似，所以在純化時很難將它們區分開。但是，本發明方法中的兩步陰離子/陽離子交換層析，可以使IgA的含量降低到非常低的水平。
IgM含量
Ig(免疫球蛋白)中IgM可以用ELISA法進行檢測，如使用一種多克隆抗IgM的抗體與IgM結合，一種標記的抗IgM用來檢測。標準品通過含有已知含量的IgM的校正器(No X908,DAKO A/S，丹麥)稀釋來構建。從上表可以看出，該產品中IgM的含量非常低，并顯著低于在其他液態產品中含量。
Tween80、TNBP和PEGTween80、TNBP和PEG通過標準法進行測量。總的來說，這些添加物的含量越低越好。
pH值所分析的液態產品的pH值呈酸性，pH為5.6-5.7，而凍干產品在溶解后呈中性，pH為6.7。
總蛋白質濃度根據Ph Eur，蛋白質的濃度至少應為50g/L±10％；所有產品均符合這一要求。蛋白質濃度用Kjeldahl法進行測量。
麥芽糖和葡萄糖穩定劑糖類常常用作免疫球蛋白的穩定劑，它們具有很好的穩定性，并很快被清除。麥芽糖、蔗糖和葡萄糖用商品化的試劑盒進行檢測(寶靈曼，德國)，麥芽糖作為參照。
結果顯示兩種分別用單獨用白蛋白和白蛋白加PEG進行穩定處理的凍干產品，還含有一種糖類穩定劑，其濃度在15mg/ml至20mg/ml。本發明的產品和其他液態產品的穩定性幾乎相同，即約9％，麥芽糖的濃度分別為88mg/ml和92mg/ml。如果將聚合物和多聚物的含量作為衡量穩定性的一個參數，本發明產品與其他液態產品次相比，穩定性更高，盡管它們的結構組成非常相似。
實施例3臨床試驗結果按照ICH和CPMP/388/95指南，對本發明產品進行臨床研究，本發明產品也稱為IVIG，SSI。
已經進行了藥物動力學、藥效和安全性試驗。臨床試驗已經包括4組患者原發性免疫缺陷綜合征(15例)，繼發性免疫缺陷綜合征(6例)，特發性血小板減少性紫癜(15例)和慢性炎性脫髓鞘多發性神經病(5例)。
原發性免疫缺陷綜合征或繼發性免疫缺陷綜合征患者所使用的劑量為0.2-0.4g/kg，間隔2-5周。特發性血小板減少性紫癜患者使用的劑量每天為400mg/kg體重，連用5天，或者每天1000mg/kg體重，連用兩天。
安全性為檢測所有患者的血清轉氨酶、血清肌苷和病毒標記物。對5例特發性血小板減少性紫癜患者進行總共24周的檢測病毒、腎臟和肝臟安全性標記的檢測。
藥物動力學該產品的半衰期(T1/2)為30.5天(中位值)。這與其他IVIG藥物結果一致。
效果對具有以下癥狀的患者原發性免疫缺陷綜合征或繼發性免疫缺陷綜合征、嘔吐不止、住院治療、連續使用抗生素和各種肺炎等患者，在患者已經使用其它注冊的IVIG藥物治療時，均登記進行6個月的回顧性研究。隨后的6個月，患者用免疫球蛋白SSI、液體進行治療，獲得相同的參數。
結果液體免疫球蛋白SSI，與其他IVIG成分具有相同的效應，用于預防/防止原發性和繼發性免疫缺陷綜合征患者的感染。
在80％的特發性血小板減少性紫癜患者中，血小板數再用液體的免疫球蛋白SSI治療前的＜30X109/L升到治療后的大于等于50X109/L。個別患者的血小板計數的升高和癥狀消失的時程延長的程度與使用相同劑量的其他IVIG藥物治療相比，效果相同。一位首次接受IVIG治療的患者用該藥治療無效。這種情況不經常對IVIG來說不經常發生，因此不必對此大驚小怪。血小板的升高和癥狀消退時間延長的詳細機制還正在研究之中。
結果液體免疫球蛋白SSI在治療慢性特發性血小板減少性紫癜患者的血小板降低時，與其他IVIG藥物具有相同療效。
臨床醫生認為，IVIG,SSI對慢性炎性脫髓鞘多發性神經病患者而言，與以前進行的IVIG試驗具有相同的功效。患者對IVIG,SSI的耐受性與其他IVIG產品相同。
安全性除一例嚴重的副反應外，在切除脾臟后就不再發生如此嚴重的副反應，僅僅有輕微的副反應。這些副反應主要包括頭痛、發熱和嘔吐。迄今為止，在輸入IVIG,SSI時，還未見有嚴重危及生命的事件報道。也未見有病毒血清轉化事件的報道。也未見有腎臟和肝臟受或過敏性休克的報道。
臨床研究表明免疫球蛋白SSI(液體)有很好的耐受性。副反應發生的頻率、程度和類型與其他類型的IVIG藥物沒有差別。
實施例4液體的IVIG的穩定性研究結果為了檢測液體IVIG產品是否長期保持穩定，進行一種稱為“實時”和“實情”的穩定性研究。總共取4種連續的IVIG產品批號(每種取250ml樣本)進行研究，在2℃-8℃時，保存至少12個月。4個批號的樣本分別在0個月、存放6個月和存放12個月時進行分析。研究結果見下述。存放0個月 存放6個月 存放12個月外觀 輕微乳白色輕微乳白色 輕微乳白色和無色和無色 和無色單體和二聚體含量 100％ 99.6％ 99.5％聚合物和聚集體 ＜0.1％ ＜0.1％＜0.1％ACA 39.7％38.2％ 37.3％PKA ＜8.5IE/ml＜8.5IE/ml ＜8.5IE/mlFc功能 107％ 113％ 111％亞類分布IgG1 59.2％57.7％ 57.1％IgG2 36.4％38.1％ 38.6％IgG3 2.7％ 2.6％ 2.5％IgG4 1.8％ 1.6％ 1.7％PH 5.5 5.55.5蛋白組成(％IgG) 99.8％99.7％ 99.1％總蛋白濃度 48.8g/l 48.3g/l49.2g/l滲透性 348mOsm/kg347mOsm/kg 350mOsm/kg上述所提到的檢測均按Ph.Eur.和實施例2中所述的方法進行。
觀察發現單體和二聚體含量經過12個月也保持穩定，提示樣本中未有聚合物形成。已知免疫球蛋白聚合物是導致嚴重副反應的原因，常表現為流感樣癥狀。由于使用本發明的方法制備的免疫球蛋白產品穩定性非常高，所以即使經過長時間的保存也不會形成聚合物和聚集體。
經過長時間觀測，該產品中ACA的含量也未見升高，盡管有意使這些批次的產品含有很高濃度的ACA。如果發現ACA的含量升高，這可能提示在儲存過程中形成了聚集體。因此，ACA長時間保持穩定提示沒有聚集體的形成。
上述結果進一步提示該產品在儲存過程中沒有激肽釋放酶原激活劑活性，因為PKA的活性沒有升高。但是需要注意的是所測量的數值低于規定水平值。
測量Fc功能提示完整的有功能的IgG的存在在儲存中保持穩定。因此，在該樣本中沒有發現存在蛋白酶，因為蛋白酶可以降解蛋白質，因此降低Fc的功能。IgG分子沒有發生變性，否則就會降低其結合抗原的活性。
本領域技術人員已知IgG不同亞類的穩定性可能存在差異。從本實驗結果可以看出，所有亞類在儲存過程中保持穩定，提示該產品是穩定的。還可以通過樣本在經過長時間的儲存后，IgG的含量在總蛋白質中基本保持恒定這一事實中進一步證實上述觀點，提示IgG基本沒降解，也就是說本發明產品是穩定的，在2-8℃下至少可以儲存12個月，其特性不發生顯著改變，并仍表現出相應的療效和安全性。
實施例5本發明制備IVIG方法中經驗證的降低病毒的步驟通過分離步驟除去病毒應用聚乙二醇(PEG)沉淀免疫球蛋白溶液中的病毒。
使用兩種無包膜小病毒進行病毒的驗證性研究，可以獲得下述病毒降低結果清除6.3log10甲型肝炎病毒(HAV)清除7.2log10脊髓灰質炎病毒應用兩種有包膜病毒進行病毒驗證性研究，可以獲得下述的降低病毒水平的結果清除7.6log10人獲得性免疫缺陷病毒(HIV)清除7.5log10BVDV。
通過S/D處理步驟使病毒失活用1％的Tween80和0.3％TNBP處理免疫球蛋白溶液，溫度為25℃，處理至少6小時。
使用4種有包膜病毒進行病毒驗證性研究，可以獲得下述的病毒減少程度使7.4log10HIV失活使5.3log10Sindbis病毒失活使4.1log10BVDV失活使5.1log10PRV失活共對本發明方法中的兩種不同步驟進行8項驗證性研究。PEG沉淀一步證實可以用于四種不同病毒的清除，兩種為無包膜小病毒HAV和脊髓灰質炎病毒，兩種為有包膜病毒HIV和BVDV，可以作為丙型肝炎的模型。這些研究表明所有四種病毒通過PEG處理，均可以被有效地清除。因此，PEG沉淀被證實可以有效地清除病毒。S/D處理已證實可用于四種不同的有包膜病毒。從驗證性實驗的數據可以看出，S/D處理可以有效地失活全部四種病毒。因此，S/D處理被證實可以作為有效地滅活病毒的步驟。IVIG方法中用PEG沉淀清除病毒和用S/D處理使病毒失活等步驟，已經證實每種方法均可有效清除和失活四種不同病毒。本發明方法中HIV和BVDV累加性降低倍數分別為15和11.6。本發明方法所制備的產品不含病毒。
權利要求
1.從含免疫球蛋白的粗制血漿蛋白組分中純化免疫球蛋白即免疫球蛋白G(IgG)的方法，包括以下步驟(a)制備含免疫球蛋白的粗制血漿蛋白組分的水相懸浮液；(b)在上述步驟(a)的懸浮液中加入足夠量的一種可溶于水的不使蛋白變性的沉淀劑，沉淀大部分非免疫球蛋白G的蛋白、免疫球蛋白聚集體和諸如病毒顆粒的潛在感染性顆粒的顆粒，而基本上不造成免疫球蛋白G單體的沉淀，這樣形成了一種固體沉淀和液體上清的混合物；(c)從步驟(b)的混合物中回收澄清的含免疫球蛋白G的上清；(d)將步驟(c)澄清的含免疫球蛋白G的上清加至陰離子交換樹脂，再加至陽離子交換樹脂；(e)用pH和離子強度足以去除樹脂中的蛋白雜質，而基本上不造成免疫球蛋白G洗脫的的緩沖液洗去蛋白雜質和蛋白沉淀劑；(f)用pH和離子強度足以有效洗脫免疫球蛋白G的基本上非變性緩沖液洗脫免疫球蛋白G，從而回收含免疫球蛋白G的洗脫液；(g)將步驟(f)含免疫球蛋白G的洗脫液進行透濾/超濾以濃縮和/或透析洗脫液并任選地加入穩定劑；(h)在步驟(g)已透濾/超濾并任選地加入穩定劑的含免疫球蛋白G的組分中加入病毒致死劑量的病毒滅活劑形成基本上無病毒的含免疫球蛋白G的溶液；(i)將步驟(h)含免疫球蛋白G的溶液加至陰離子交換樹脂純化再接著加至陽離子交換樹脂；(j)用pH和離子強度足以從樹脂中有效洗去蛋白雜質和病毒滅活劑而基本上不造成免疫球蛋白G的洗脫的緩沖液洗步驟(i)的陽離子交換樹脂；(k)用pH和離子強度足以有效洗脫免疫球蛋白G的基本上非變性緩沖液從步驟(ｊ)的陽離子交換樹脂洗脫免疫球蛋白G，由此回收含免疫球蛋白G的洗脫液；以及(l)透濾/超濾步驟(k)的含免疫球蛋白G的洗脫液以降低離子強度并濃縮免疫球蛋白G溶液，加入糖類物質調節重量摩爾滲透濃度。
2.根據權利要求1的方法，其中含有免疫球蛋白的血漿蛋白組分選自Cohn組分Ⅱ；Cohn組分Ⅱ和Ⅲ；以及Cohn組分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。
3.根據權利要求1或2的方法，其中步驟(a)中的懸浮液維持在0℃到12℃，步驟(a)中的懸浮液的pH值保持在6以下。
4.根據前述任一項權利要求的方法，其中步驟(b)中蛋白質的沉淀劑選自聚乙二醇(PEG)、辛酸和硫酸銨。
5.根據權利要求4的方法，其中蛋白質的沉淀劑選自分子量為3000-8000Da的PEG，如PEG3350、PEG4000、PEG5000和PEG6000。
6.根據前述任一項權利要求的方法，其中在步驟(d)和/或步驟(i)中陰離子交換樹脂柱和陽離子交換樹脂柱串聯連接。
7.根據權利要求6的方法，其中用于陰離子交換層析和陽離子交換層析的緩沖液相同，緩沖液的pH值也相同，均低于6.0。
8.根據前述任一項權利要求的方法，其中步驟(d)和/或步驟(i)中的陰離子交換樹脂含有二乙氨乙基基團，和/或步驟(d)和/或步驟(i)中的陽離子交換樹脂含有羧甲基基團，樹脂優選是DEAESepharose FF和CM Sepharose FF。
9.根據前述任一項權利要求的方法，其中從步驟(b)到(l)中所使用的緩沖液是醋酸鹽緩沖液，如pH為5.0-6.0的醋酸鹽緩沖液，濃度為5-25mM。
10.根據前述任一項權利要求的方法，其中步驟(h)中的病毒滅活劑為至少含一種非離子或離子去污劑和至少一種溶劑的混合物。
11.根據前述任一項權利要求的方法，其中步驟(h)中的病毒滅活劑為至少一種基本上非變性的去污劑和至少一種三(低級烷基)磷酸酯溶劑的混合物。
12.通過權利要求1-11任一項的方法獲得的免疫球蛋白產品。
13.通過權利要求6-8任一項的方法獲得的免疫球蛋白產品。
14.一種免疫球蛋白產品，具有下列特征a)純度大于98％，b)IgG單體和二聚體的含量大于98.5％，c)IgA的含量小于4mg/L，和d)含有IgG1,IgG2,IgG3和IgG4。
15.根據權利要求14的免疫球蛋白產品，其不含作為穩定劑的去污劑，PEG或白蛋白。
16.根據權利要求14或15的免疫球蛋白產品，其中IgA的含量小于3mg/L。
17.根據權利要求14-16任一項的免疫球蛋白產品，其所含的IgG1為55％-65％,IgG2為30％-40％,IgG3為2％-5％,IgG4為1％-4％之間。
18.根據權利要求14-17任一項的免疫球蛋白產品，其中聚合物和聚集體的含量小于0.5％。
19.根據權利要求14-18任一項的液體免疫球蛋白產品。
20．根據權利要求14-19任一項的液體免疫球蛋白產品，可直接靜脈應用。
21．根據權利要求14-20任一項的免疫球蛋白產品作為藥物的應用。
22．根據權利要求14-21任一項的免疫球蛋白產品在制備治療患下列疾病的哺乳動物及感染AIDS和細菌感染的成年患者的藥物中的應用，所述疾病為PID(原發性免疫缺陷癥)，SID(繼發性免疫缺陷癥)，ITP(特發性血小板減少性紫癜)，多神經根炎，外周多發性神經病變，川崎病，多發性肌炎，重癥慢性自身免疫性疾病，慢性感染性脫髓鞘多發性神經病變(CIPD)，多灶性運動神經病變，多發性硬化，Myasthenia Gravis,Eaton-Lambert綜合征，Opticus神經炎，癲癇病，習慣性流產，原發性抗磷脂綜合征，類風濕性關節炎，系統性紅斑狼瘡，系統性硬皮病，脈管炎，Wegner肉芽腫，Sjogren綜合征，青少年類風濕性關節炎，自身免疫性嗜中性粒細胞減少癥，自身免疫性溶血性貧血，嗜中性粒細胞減少癥，Crohn病，結腸性潰瘍，腹部疾病，哮喘，敗血癥性休克綜合征，慢性疲勞綜合征，銀屑病，中毒性休克綜合征，糖尿病，副鼻竇炎，擴張性心肌病，心內膜炎，動脈粥樣硬化。
23．根據權利要求22的應用，其中哺乳動物是人。
全文摘要
本發明涉及一種從含免疫球蛋白的粗制血漿蛋白組分中純化免疫球蛋白G的方法。所述的方法包括一系列步驟,其中優選依次結合使用陰離子交換柱和陽離子交換柱。在整個純化方法中優選使用一種pH5.0－6.0摩爾濃度約5－25mM的醋酸鹽緩沖液。本發明進一步包括通過本發明方法獲得的免疫球蛋白產品。本發明還涉及一種純度超過98%、IgG單體和二聚體含量大于98.5%、IgA含量少于4mg/L并含有少于0.5%的聚合物和聚集體的免疫球蛋白產品。所述產品不包含作為穩定劑的去污劑,PEG或白蛋白。所述產品穩定、無病毒、呈液體,可直接用于靜脈給藥。
文檔編號C07K16/06GK1311797SQ9980928
公開日2001年9月5日 申請日期1999年6月9日 優先權日1998年6月9日
發明者因加·勞森, 伯厄·泰斯納 申請人:斯塔滕斯血清研究所