人工t輔助細胞表位作為包括免疫原性lhrh肽的合成肽免疫原的免疫刺激物的制作方法

專利名稱：人工t輔助細胞表位作為包括免疫原性lhrh肽的合成肽免疫原的免疫刺激物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種肽免疫原，其含有一種新的人工T輔助細胞表位(Th)，它與一種所需要的含有B細胞表位的目標抗原位點共價相連，和任選地一種常規免疫刺激序列。該人工Th表位賦予肽免疫原誘導強烈的T輔助細胞-介導的免疫應答的能力，并使其產生抗“目標抗原位點”的抗體。本發明還提供了用這種新的人工T輔助細胞表位替換已經建立的肽免疫源中的載體蛋白和來源于病原體的T輔助細胞位點。
在預測T細胞表位的氨基酸序列中已經形成一些規則。然而，因為在如何或怎樣制備一個可用作T細胞表位的特定氨基酸序列方面沒有核心統一理論，已有規則是經驗性的，不具備普遍適用性。在明了這些規則的基礎上，開發了本發明的新的人工T輔助細胞表位，可是它是通過經驗研究得到。
本發明的肽免疫原可用于在被免疫的宿主中誘導對所需目標抗原位點，包括來自病原有機體的位點、和來自正常免疫沉默(immunosilent)自身抗原和腫瘤相關目標物位點的抗體應答。因此，本發明的肽適于多方面的醫學和獸醫學應用，例如對感染性疾病提供保護性免疫的疫苗治療源于正常生理過程功能障礙疾病的免疫治療；治療癌癥的免疫治療和作為干擾正常生理過程產生所需結果的試劑。
例如，本發明的新的人工T輔助細胞表位提供誘導針對促黃體生成激素-釋放激素(LHRH)的抗體的新的短肽免疫原，用于避孕、控制激素依賴型腫瘤、預防公豬膻味、和免疫閹割。已經發現當本發明的新的人工Th表位與各種微生物/蛋白質/肽的目標B細胞表位結合后，誘發免疫應答。除了LHRH，還發現本發明的人工Th表位可用于與其它目標抗原位點結合，包括改善飼養動物生長的生長激素抑制素；治療過敏癥的IgE；治療和預防HIV感染和免疫疾病的T輔助細胞的CD4受體；以及預防口足病的口足病病毒衣殼蛋白。
背景技術：
已知大多數抗體免疫應答是細胞介導的，需要抗原呈遞細胞、B細胞(同樣發揮抗原呈遞細胞功能的抗體生成細胞)、和T輔助(Th)細胞之間的協同相互作用。因此，有效抗體應答的誘導作用需要B細胞識別受檢免疫原的目標抗原位點(B細胞表位)，以及T輔助細胞識別Th表位。通常，受檢免疫原上的T輔助表位與其B細胞表位不同(Babbitt等，自然，1985:317:359-361)。B細胞表位是由能夠應答產生抗所需目標位點抗體的B細胞識別的所需目標上的位點。一般認為，目標物的天然構象決定了抗體直接結合的區域。然而，蛋白質的T輔助細胞識別更為復雜，且缺乏深入了解。(Cornette等，《酶學方法》178卷，AcademicPress,1989,pp611-634)。
根據目前的理論，誘發Th細胞的應答需要T輔助細胞受體識別抗原-呈遞細胞膜上的復合物，而非識別所需的目標物，所述復合物是由目標蛋白質的經處理的肽片段與相關的Ⅱ類主要組合相容性復合物(MHC)聯合形成的。因此，目標蛋白質的肽處理以及三-方式識別是T輔助細胞應答所需的。該三部分復合物非常難于定義，因為關鍵的MHCⅡ類接觸殘基位于不同的MHC結合肽(Th抗原表位)內，且這類肽是具有各種長度的不同氨基酸序列(Rudensky等，自然，1991:353:622-627)。而且，MHC Ⅱ類分子本身依宿主的基因組成高度多樣化。因此對特定Th表位的免疫應答部分由宿主的MHC基因而定。事實上，已經顯示某些肽僅結合特定的Ⅱ類MHC等位基因產物。因此，很難鑒定混雜Th表位，即與物種間以及單一物種的個體間交叉反應的Th表位。已經發現Th表位的反應性即使在同一種群的個體間也是不同的。
T細胞識別的各組成步驟中的多重和變化因素，即通過抗原處理細胞處理合適的肽，通過一種遺傳確定的Ⅱ類MHC分子呈遞肽，和通過T輔助細胞上的受體識別MHC分子/肽復合物，使確定廣泛反應性的混雜Th表位的需要變得困難(Bianchi等，EP 0427347；Sinigaglia等，《醫學和生物學中肽的免疫識別》第6章，Zegers，等編，CRC Press,1995,pp79-87)。
對于誘導抗體，免疫原必需包括B細胞決定簇和Th細胞決定簇，這一點已很清楚。通常，為了增加目標物的免疫原性，通過將目標物偶聯到載體蛋白質上提供TH應答。該方法存在一些不利之處。由于下列原因很難生產定義清楚、安全、有效的肽-載體蛋白結合物1．化學偶聯是導致大小和組成不均一的隨機反應，例如，與戊二醛的結合作用(Borras-Cuesta等，歐洲免疫學雜志，1987:17:1213-1215)；2．載體蛋白質誘導潛在的不期望的免疫應答，例如過敏和自主免疫反應(Bixler等，WO 89/06974)；3．巨大的肽-載體蛋白質誘導大部分錯誤地指向載體蛋白質而不是目標位點的不相關免疫應答(Cease等，美國國家科學院科學進展，1987:84:4249-4253)；和4．載體蛋白質還在以前曾被含有同樣載體蛋白的免疫原免疫的宿主中誘導潛在的表位抑制作用。當宿主隨后用不同半抗原偶聯同樣載體蛋白質的其它免疫原免疫時，得到的免疫應答對載體蛋白質增強，但對半抗原卻抑制(Schutze等，免疫學雜志，1985:135:2319-2322)。
為了避免這些風險，需要替換載體蛋白質。T細胞輔助可以通過與一種清楚表征的混雜Th決定簇共價結合提供給目標抗原肽。已知的混雜TH來源于強效病原性物質例如麻疹病毒F蛋白(Greenstein等，免疫學雜志，1992:148:3970-3977)和乙肝病毒表面抗原(Partidos等，遺傳病毒學雜志1991:72:1293-1299)。本發明人已經發現一些已知的混雜Th在加強微弱免疫原性肽方面有效，例如十肽激素促黃體激素-釋放激素(LHRH)(US 5759551)。已經研制出含有已知混雜Th表位和微弱免疫原性合成肽而產生強效免疫原的其它嵌合肽(Borras-Cuesta等，1987)。在大多數遺傳多樣性種群中，精心設計的混雜Th/B細胞表位嵌合肽能夠誘導Th應答，產生的抗體響應指向B細胞位點(US 5759551)。
已知的混雜Th表位的綜述顯示它們的長度范圍為約15-50個氨基酸殘基(US 5759551)，通常具有共同的結構特征，即具有特定的標志序列。例如，共同特征是存在兩性分子螺旋。它們是疏水氨基酸殘基占據螺旋一面，帶電荷和極性殘基占據周圍面的α-螺旋結構(Cease等，美國國家科學院科學進展，1987,84:4249-4253)。已知的混雜Th表位通常還含有其它的一級氨基酸模式，例如一個帶電荷殘基—Gly，跟著兩到三個疏水殘基，其后跟隨一個帶電荷或極性殘基(Rothbard和Taylor,EMBO雜志，1988:7:93-101)。具有該模式的表位被稱為Rothbard序列。還發現混雜Th表位通常遵循1、4、5、8規則，其中一個帶陽性電荷的殘基后第四位、第五位和第八位為疏水殘基，與1、4、5、8位定位在同一側上的兩性螺旋一致。疏水和帶電荷和極性氨基酸的這種模式可能在一個單一Th表位中重復(Partidos等，遺傳病毒學雜志(J GenVirol),1991,72:1293-99；Alexander等，免疫學，1994,1:751-761)。即使不是全部，但大多數已知的混雜T細胞表位含有至少一種上述周期性。
來源于病原體的混雜Th表位包括乙肝表面抗原和核心抗原輔助T細胞表位(HBsTh和HBcTh)，百日咳毒素輔助T細胞表位(PT Th)，破傷風毒素輔助T細胞表位(TT Th)、麻疹病毒F蛋白輔助T細胞表位(MVF Th)、沙眼衣原體主要外膜蛋白輔助T細胞表位(CT Th)、白喉毒素輔助T細胞表位(DT Th)、鐮狀瘧原蟲環孢子體輔助T細胞表位(PF Th)、曼森氏血吸蟲三糖磷酸鹽異構酶輔助T細胞表位(SM Th),及大腸桿菌TraT輔助T細胞表位(TraT Th)。病原體衍生的Th在US5759551中的SEQ ID NOS:2-9和42-52列出，引入本文作為參考；衣原體輔助位點P11在Stagg等，免疫學，1993,79:1-9中列出；HBc肽50-69在Ferrari等，臨床研究雜志，1991,88:214-222中列出，也引入本文作為參考。
US 5759551中描述了應用于LHRH的、Greenstein等(1992)描述了應用于HIV的、EP 0427347中描述的應用于瘧疾的、Borras-Cuesta等(1987)描述的應用于輪狀病毒的、和Partidos等(1991)描述的應用于麻疹的用于加強肽B細胞位點免疫作用的這類病原體來源位點的應用。
有用的Th位點還可以包括組合的Th表位。在Wang等(WO95/11998)中，描述了一類被稱之為“結構性合成抗原文庫”(SSAL)的特別組合Th表位。SSAL表位包括大量Th表位，其具有一種在特定位置具有取代的不變殘基的結構框架周圍組織的氨基酸序列。SSAL的序列通過保留相對不變殘基同時改變其它殘基進行確定的，用于識別多樣化MHC限制元件。這可以通過以下方法實現排列混雜Th的一級氨基酸序列、選擇和保留負責Th肽的獨特結構的殘基作為骨架、和按照已知的MHC限制元件改變保留的殘基。MHC限制元件的不變和可變位置以及優選的氨基酸的列表已有公開，以獲得MHC-結合基元。在設計SSAL Th表位時可參考這些資料(Meister等，疫苗，1995,13:581-591)。
SSAL成員可以在一個單一固相肽合成中與目標B細胞表位和其它序列同時產生并相互串聯。如此設計Th表位文庫序列保留了混雜Th表位的結構基元，并同時提供對廣泛的單倍體的反應性。例如，從麻疹病毒F蛋白質中得到一種混雜表位之后，對簡并的Th表位“SSAL1TH1”進行模型化(Partidos等，1991)。設計SSAL1 TH1，與目標抗原，LHRH,串聯使用。象來源于它的麻疹表位一樣，SSAL1 TH1被設計遵循Rothbard序列和1、4、5、8規則15 10 15Asp-Leu-Ser-Asp-Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Leu-His-Lys-Leu-Asp-Gly-LeuGlu Ile Glu Ile Arg Ile Ile Ile Arg Ile Glu IleVal Val Val Val Val Val ValPhe Phe Phe Phe Phe Phe Phe(SEQ ID NO:1)將帶電荷殘基Glu或Asp加在位置1，以增加Th疏水側周圍的電荷。然后在兩性螺旋疏水側的2、5、8、9、10、13和16位保留疏水殘基。在2、5、8、9、10、和13位改變，以提供了一種具有結合廣泛MHC限制元件能力的表面。SSAL特征的靜作用在于增大了人工Th的免疫應答的范圍(WO 95/11998)。
還進行了其它努力，設計結合所有已知的混雜Th表位的特性和特征的“理想化”人工Th表位。已經構建了包括這些人工混雜Th表位的幾種肽免疫原，包括SSAL形式的那些。將人工Th表位與取自自身-抗原和外源抗原的肽序列組合，提供對已經被描述為高度有效的位點特異性目標物(WO 95/11998)的抗體應答。這些肽免疫原對于提供有效安全的抗體應答，以及提供由所述理想化混雜Th位點賦予的廣泛的反應性應答產生的其免疫效力是優選的。
發明概述本發明提供了一種含有連接于合成的肽B細胞表位或“目標抗原位點”的混雜人工T輔助細胞表位的免疫原性肽組合物。該免疫原性肽組合物含有一種人工T輔助細胞(Th)表位和一種含有B細胞表位的目標抗原位點，以及任選地一種常規免疫刺激序列。人工Th表位在該免疫原性肽中的存在使其能夠誘導強烈的T輔助細胞-介導的免疫應答，產生高水平的抗“目標抗原位點”的抗體。本發明進一步提供了用特別設計用來改進肽免疫原的免疫原性的人工T輔助細胞表位替換已建立的肽免疫原中載體蛋白質和病原體來源的T輔助細胞位點。具有本發明的人工Th表位的新的短肽免疫原誘導高水平的指向促黃體激素-釋放激素(LHRH)的抗體，用于避孕、控制激素-依賴性腫瘤、預防公豬膻味、和免疫閹割。
根據預測混雜T細胞表位的已知規則，憑經驗得出所述人工Th表位。在缺乏解釋Th表位機理的統一理論情況下，這些“推測性”規則僅作為設計有效人工Th表位的指導原則。已經發現當本發明的人工Th表位與目標抗原位點以及任選地與一種免疫刺激序列結合時有用。本發明的免疫原性肽可以由下式表示(A)n-(目標抗原位點)-(B)o-(Th)m-X或(A)n-(Th)m-(B)o-(目標抗原位點)-X或(目標抗原位點)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
或(Th)m-(B)o-(目標抗原位點)-(A)n-X其中A為一種氨基酸，或一種一般性免疫刺激序列，例如，侵染素結構域(Inv)(SEQ ID NO:27)[還有其它的嗎 ]其中n大于1，每一個A可能相同或不同；B選自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亞胺(ε-N)Lys-，或-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亞胺)-；Th是一種選自SEQ ID NOS:3-16、21-25之一或其類似物或片段的人工輔助T細胞表位；“目標抗原位點”是一種所需的B細胞表位，一種肽半抗原，或一種它們的免疫反應類似物；X為氨基酸的α-COOH或α-CONH2；n為從1到約10；m為從1到約4；和o為從0到約10。
作為一種目標抗原位點的肽半抗原的實例是LHRH(SEQ ID NO:28)。
本發明的組合物含有能夠在被免疫的宿主中激發對所需目標抗原位點抗體應答的肽。該目標抗原位點可以來源于病原性有機體和正常免疫沉默自身-抗原和腫瘤-相關目標物，例如LHRH。
因此，本發明的組合物可應用于很多醫學和獸醫學應用中。它們包括對感染性疾病提供保護性免疫的疫苗、治療來源于正常生理過程功能障礙疾病的免疫治療、治療癌癥的免疫治療、和期望干擾或改變正常生理過程的物質。
除了LHRH，其它有用的目標物包括促進飼養動物生長的生長激素抑制素；用于治療過敏的IgE；治療和預防HIV感染和免疫疾病的T輔助細胞CD4受體；以及作為預防口足病的口足病病毒衣殼蛋白。
附圖簡述在附圖中，施用免疫原的時間間隔由各圖底部的箭頭表示。附圖中個體實驗動物的數據由實心圓、實心三角和實心方框表示。


圖1圖示說明了給豬施用在明礬中配制的Th/LHRH肽(SEQ IDNOS:42、50和57)混合物后，通過RIA檢測的抗-LHRH血清抗體水平，通過RIA檢測的血清睪酮濃度，通過交叉剖面區域確定的平均睪丸大小。
圖2顯示了在IFA(不完全弗氏佐劑)中配制的同樣混合物所得出的結果。
圖3顯示了在ISA206/DDA(二甲基二-十八烷醇酯溴化銨)中配制的同樣混合物所得出的結果。
發明詳述理想化人工Th表位已有提供。它們是以兩種已知的天然Th表位及SSAL肽原型為模型的，其被公開于WO95/11998。SSALS整合了結合基元的組合MHC分子(Meister等，1995)，試圖在遺傳多樣化種群的成員中誘導廣泛的免疫應答。基于通過導入多重MHC-結合基元修飾的麻疹病毒和乙肝病毒抗原的Th表位，設計SSAL肽原型。按照其它已知Th表位通過簡化、添加、和/或修飾多重MHC-結合基元模擬設計其它Th表位，以產生一系列新的人工Th表位。將新的適合的混雜人工Th表位整合到攜帶多種目標抗原位點的合成肽免疫原中。得到的嵌合肽能夠刺激對目標抗原位點的有效抗體應答。
表1a所示的“SSAL1 TH1”(SEQ ID NO:1)的原型人工輔助T細胞(Th)表位是一種從麻疹病毒F蛋白的混雜Th表位模擬出來的理想化Th表位(Partidos等，1991)。表1a所示的“MVF Th”(SEQ ID NO:2)的模型Th表位對應麻疹病毒F蛋白的288-302位殘基。通過在1位加入一種帶電荷殘基Glu/Asp，以增加表位疏水側周圍的電荷；在4、6、12和14位添加或保留一種帶電荷殘基或Gly；以及按照“Rothbard規則”在7和11位添加或保留一種帶電荷殘基或Gly，將MVF Th(SEQ IDNO:2)修飾成SSAL1 Th1原型(SEQ ID NO:1)。Th表位的疏水側包括2、5、8、9、10、13和16位的殘基。在上述位置上的與混雜表位相關的疏水殘基被取代，以提供組合Th SSAL表位，SSAL1 Th1(SEQ IDNO:1)。遵循Rothbard序列規則的疏水殘基以黑體字顯示(表1a,SEQID NO:1)。序列中遵循1、4、5、8規則的位置以下劃線表示。原型SSAL1Th1(SEQ ID NO:1)的另一個顯著特征是，位置1和4在位置9任意一側缺陷重復成為一種回文結構，以模擬MHC-結合基元。在SEQ IDNO:3(表1a)中進一步修飾該SSAL1 Th1的“1,4,9”回文模式，以更為密切地反映原始MVF模型Th(SEQ ID NO:2)的序列。另外，在SEQ ID NO:3中，通過在1、12、和14的可變位置添加甲硫氨酸殘基調整SSAL1 Th1原型(SEQ ID NO:1)的疏水性。實驗數據顯示偶聯一種目標抗原位點的SEQ ID NO:3在被免疫的動物中增強對目標抗原位點的抗體應答。
將SEQ ID NO:3簡化成SEQ ID NOS:4和5(表1a)，以提供另一種免疫原性SSAL Th表位。將SEQ ID NO:3進一步簡化成SEQ IDNOS:6-9(表1a)，以提供一系列單一序列表位。偶聯目標抗原位點的SSAL Th SEQ ID NOS:4和5以及單一序列Th表位SEQ ID NOS:6-9也提供了增強的免疫原性。
發現用一種非-極性和極性無電荷氨基酸，例如Ile和Ser延伸SEQ IDNO:3的N端，用一種帶電荷疏水氨基酸例如lys和Phe延伸C端，可以改進SEQ ID NO:3的免疫原性。這如表1a的SEQ ID NO:10所示，簡化的SSAL Th表位SEQID NOS:11和12來源于SEQ ID NO:10。含有一種目標抗原位點和一種選自SEQ ID NOS:10、11、或12的Th表位的肽免疫原表現增強的免疫原性。還合成了單一-序列肽，例如SEQID NOS:13-16，并測試了它們在動物中的免疫原性。發現它們也是有效的Th表位。
按照來自乙肝病毒表面抗原的相應于乙肝表面抗原(HbsAg)殘基19-33的SEQ ID NO:18的混雜表位，模擬表1b所示為“SSAL2 Th2”(SEQ ID NO:17)的SSAL人工輔助表位(Greenstein等，1992)。將病原體-來源的模型Th添加三個賴氨酸，修飾成為SEQ ID NO:19，以改進其在水中的溶解性；將SEQ ID NO:20中的C端Asp刪除，以便于引入Gly-Gly作為間隔區的嵌合肽的合成。通過改變SEQ ID NO:19的1、2、3和5位的正電荷殘基進一步修飾SSAL2 Th2(SEQ ID NO:17)，以改變螺旋結構疏水側周圍的電荷。還將可變位置3的帶電荷氨基酸構建成一種所需的殘基，以產生理想化的Th表位，SSAL2 Th2(SEQ IDNO:17)，其遵循1、4、5、8規則(下劃線的殘基)。兩親螺旋的疏水側由SEQ ID NO:17的4、6、7、10、11、13、15和17位疏水殘基構成。Rothbard序列殘基在原型SSAL2 Th2(SEQ ID NO:17)中以黑體顯示。
SEQ ID NOS:21-25從上述理想化SSAL2 Th2原型(SEQ ID NO:17)簡化得到。例如，用單氨基酸，例如Ile或Met取代可變疏水殘基(SEQ ID NOS:21-25)。在位置4插入疏水Phe，作為SEQ ID NO:24的特征，同時刪除三個賴氨酸。C端刪除Asp作為SEQ ID NOS:22、24、和25的特征。進一步的修飾包括C端用一種常見MHC-結合基元AxTxIL取代(Meister等，1995)。
將各種新的人工Th表位，SEQ ID NOS:3-16和21-25與多種目標抗原位點偶聯，提供肽免疫原。目標抗原位點包括肽類激素、LHRH和生長激素抑制素、來源于免疫球蛋白IgE的B細胞表位、T細胞CD4受體、以及口足病病毒的VPI衣殼蛋白。結果顯示產生了與多種自身抗原和外源抗原發生有效交叉反應的抗-目標位點的抗體。最為重要的是，抗體應答指向目標抗原位點，而不是新的Th表位。表2和3顯示了新的LHRH肽免疫原的結果。免疫原性結果同樣顯示產生的抗體能夠有效抗LHRH，但不抗Th表位自身。需要強調的是，LHRH是一種缺少T細胞表位的目標抗原位點(Sad等，免疫學，1992:76:599-603和US 5759551)。因此，本發明的新的人工Th表位代表了一類新的混雜T輔助表位。
本發明的人工Th表位是包括Ⅱ類MHC分子結合位點的連續氨基酸序列(天然或非天然氨基酸)。它們足以增強或刺激對目標抗原位點的抗體應答。因為Th表位可以由連續或不連續氨基酸片段組成，因此不是每一種Th表位的氨基酸都必需參與MHC識別。本發明的Th表位進一步包括免疫功能類似物。功能性Th類似物包括免疫增強類似物、交叉反應性類似物和這些Th表位的片段。功能性Th類似物進一步包括保守取代、添加、刪除和插入1到10個氨基酸殘基，同時提供給Th表位Th-刺激功能。
本發明的混雜Th表位共價連接于目標抗原位點的N-或C-端，以產生嵌合Th/B細胞位點肽免疫原。本文使用的術語“肽免疫原”指含有與目標抗原位點共價連接的Th表位的分子，所述共價連接無論是通過常規肽鍵以形成一種單一較長肽還是通過其它形式的共價連接例如硫醚鍵均可。因此，將Th表位(例如，SEQ ID NOS:3-16合21-25)經化學偶聯或經直接合成與目標抗原位點(例如，SEQ ID NOS:28)共價結合。Th表位可以指結合于目標位點，或者通過一種間隔區例如Gly-Gly結合。除了使Th表位與B細胞表位(例如，SEQ ID NOS:31-54、57、59-61、63、65-68、69、70)物理分隔，間隔區還可以破壞經Th表位或其功能類似物與目標抗原位點連接產生的任何人工二級結構，由此削弱了Th和/或B細胞應答的任何干擾。一種增強Th和IgE結構域分隔作用的彈性絞鏈間隔區也是有用的。彈性絞鏈序列通常富含脯氨酸。一種特別有用的彈性絞鏈具有的序列如下Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ IDNO:26)，它是從免疫球蛋白重鏈中發現的彈性絞鏈區模擬出來的。其中Xaa是任意一種氨基酸，優選天冬氨酸。通過間隔區(參見SEQ ID NOS:55和56)提供的構象分隔，允許本發明的肽免疫原和適當的Th細胞和B細胞之間更有效的相互作用。因此增強了對Th表位的免疫應答，以提供改進的免疫反應性。
本發明的肽結合物免疫原任選地還可以含有一種常見的免疫刺激肽序列。例如，來自細菌耶爾森氏鼠疫桿菌屬的侵染素蛋白(Inv)的結構域(Brett等，歐洲免疫學雜志，1993,23:1608-1614)。該免疫刺激性質來源于這種侵染素結構域與T細胞，尤其是活化的免疫或記憶T細胞上存在的β1整聯蛋白分子相互作用的能力。連接混雜Th表位的侵染素結構域(Inv)的優選實施方式在US5759551中已有描述，通過參考插入本發明。Inv結構域具有如下序列Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gln-Phe(SEQ ID NO:27)或來源于其它耶爾森氏鼠疫桿菌侵染素蛋白中相應區域的免疫刺激類似物。因此這些類似物可能含有氨基酸殘基的取代、刪除、或插入，以適應株系到株系的變異，只要類似物保留免疫刺激性質。可以任選地用一種間隔序列將常見免疫刺激序列連接到Th表位上。
本發明的肽結合物，即含有所述人工Th表位的肽免疫原可以由下式表示(A)n-(目標抗原位點)-(B)o-(Th)m-X或(A)n-(Th)m-(B)o-(目標抗原位點)-X或(目標抗原位點)-(B)o-(Th)m-(A)n-X或(Th)m-(B)o-(目標抗原位點)-(A)n-X其中A為任選的，并且為一種氨基酸，或一種一般性免疫刺激序列，其中n大于1，每一個A可能相同或不同；B選自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亞胺(ε-N)Lys-，或-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亞胺)-；Th是一種選自SEQ ID NOS:3-16、21-25之一或其類似物或片段的人工輔助T細胞表位；“目標抗原位點”是一種所需的B細胞表位或肽半抗原，或其類似物；X為氨基酸的α-COOH或α-CONH2；n為從1到約10；m為從1到約4；和o為從0到約10。
本發明的肽免疫原含有約25到約100個氨基酸殘基，優選約25-80個氨基酸殘基。
如果A為一種氨基酸，它可以是任何天然的或非天然的氨基酸。非天然氨基酸包括但不限于D-氨基酸、β-丙氨酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、甲狀腺氨酸、γ-氨基丁酸、高絲氨酸、瓜氨酸等。天然氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、和纈氨酸。而且，如果n大于1，二個或三個A基團為氨基酸，那么每個氨基酸可以獨立地相同或不同。
如果A為一種侵染素結構域序列，則它優選是如SEQ ID NO:27所述的來自耶爾森氏鼠疫桿菌種的侵染素蛋白的免疫刺激表位。
在一個實施方式中，n為3，每種A依次為一種侵染素序列(Inv)、甘氨酸和甘氨酸。
B是任選的，并且為一種含有一種或多種天然或非天然氨基酸的間隔區。在(B)o中，當o＞1時，每個B可能相同或不同。B可以是Gly-Gly或Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO:26)或-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亞胺(ε-N)Lys-、和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亞胺)-。
Th是一種選自SEQ ID NOS:3-16和21-25及其類似物的混雜T輔助細胞表位。
本發明的肽免疫原可以通過本領域技術人員已知的化學方法制備。參見，例如，Fields et al.，《合成肽用戶手冊》第3章，Grant,W.H.編，Freeman & Co.,New York,NY,1992,p.77。該肽可以利用自動匹配Merrifield固相肽合成法，應用t-Boc或Fmoc保護α-NH2或側鏈氨基酸，來合成。肽合成的設備由商業提供。一個實例是430A或431型應用型生物系統肽合成儀。
完成所需肽免疫原的組裝后，按照標準程序處理樹脂，以從樹脂上切除肽，并使氨基酸側鏈上的功能基團脫封閉。通過HPLC純化游離肽，通過例如氨基酸分析、通過測序、或通過質譜鑒定生化特征。純化和鑒定肽的方法是本領域的普通技術人員公知的。
其它產生含有本發明的Th表位的肽免疫原的化學方法包括通過形成一個“硫醚鍵”連接鹵族乙酸鹽和半胱氨酰化肽。例如，可以將一個半胱氨酸添加到含Th肽的C端，半胱氨酸的巰基可以用于與一種親電基團例如N氯乙酰修飾的或馬來酰亞胺來源的賴氨酸殘基的α-或ε-NH2形成共價鍵，其順序結合目標抗原位點肽的N端。在該模式中，可以得到Th表位/B細胞位點結合物。
本發明的免疫原還可以被聚合。可以應用常規方法通過例如戊二醛和賴氨酸殘基的-NH2基團反應實現聚合。通過另一種方法，即可以利用在線形結構的N-端添加一個附加的半胱氨酸聚合或共聚合線形Th/B細胞位點免疫原。N-端半胱氨酸的巰基可以被用于與氯乙酰基-修飾的氨基酸或馬來酰亞胺-來源的賴氨酸殘基的α-或g-NH2形成硫醚鍵，所述賴氨酸殘基結合于分支多聚賴氨酸核心分子(例如，K2K,K4K2K或K8K4K2K)的N-端。還可以通過在分支的多聚-賴氨酸核心樹脂上直接合成所需肽構建體，使本發明的免疫原聚合成為一種分支結構(Wang，等，科學，1991:254:285-288)。
或者可以通過已知的核酸克隆技術合成較長的合成肽結合物。任何有關分子克隆方法的標準手冊都提供了通過表達重組DNA和RNA，制備含有本發明Th表位的肽的詳細方案。為了構建一種表達本發明的Th/目標抗原位點肽(例如，SEQ ID NOS:29-57)的基因，將氨基酸序列逆翻譯成核酸序列，優選應用用于基因將在其中表達的有機體的優化密碼子。接著，通常通過合成編碼所述肽和必需的調控元件的重疊寡核苷酸制備編碼所述肽的基因。組裝合成的基因，將其插入所需的表達載體。本發明涵蓋的合成的核酸序列包括編碼本發明的Th表位和含有這些Th表位、其免疫功能類似物的肽的核酸序列，以及特征在于非編碼序列發生改變而不由此改變被編碼的肽或Th表位的免疫原性質的核酸構建體。將合成基因插入適當的克隆載體，由此得到重組體，并對其鑒定。然后在選擇的表達系統和宿主適合的條件下表達Th表位和含有Th表位的肽。通過標準方法純化Th表位或肽，并鑒定特征。
本發明的肽免疫原可以單獨使用，或者組合使用，以誘導抗促黃體生成激素釋放激素的抗體應答。促黃體生成激素釋放激素(LHRH)或促性腺激素釋放激素(GnRH)是調控男性和女性性生殖的主要激素。LHRH調節LH和FSH的釋放，LH和FSH接著控制精子發生、排卵和發情、性成熟。LHRH最終控制男性激素—雄性荷爾蒙和睪酮的分泌，以及女性激素—雌性激素和黃體酮的分泌，這些激素分別對于雄性和雌性的生殖是必需的。(基礎和臨床內分泌學(Basic and ClinicalEndocrinology)FS Greenspan和JD Baxter編，Appleton&Lange:NorwalkCT.1994)。
很久以來已經知道抗LHRH的主動免疫能夠在雄性中發揮多種作用包括降低血清和垂體中的LH和FSH，減少血清睪酮，抑制精子發生和可逆地使性腺和附性器官委瑣。(參見，例如，Fraser等，內分泌學雜志，1974；63:399-405；Giri等，實驗分子病理學，1991；54:255-264；Ladd等，生殖免疫學雜志，1989；15:85-101；被參考引證)。已經證明抗LHRH的免疫作用可以用于雄性避孕，并具有治療前列腺癌的潛力(Thau,Scand JImmunol.1992:36 Suppl 11:127-130；和US 5759551)。
通過抗LHRH的主動免疫，在下丘腦-垂體性腺軸側進行免疫影響，也可以用于抑制雌性體內的性激素。因為LHRH通過近前側的垂體調節FSH是產生，而近前側的垂體接著通過卵巢調節雌激素的產生，阻斷LHRH的作用可以治療婦女性激素依賴性疾病。例如，子宮內膜組織外側子宮肌肉組織異常的形成和維持是由雌激素介導的。因此，阻斷LHRH的作用可用于治療子宮內膜炎。而且，LHRH免疫治療也會對乳腺的類似前列腺癌、雌激素驅動腫瘤產生影響。事實上，已經顯示誘導抗-LHRH的疫苗在降低婦女血清LH和FSH水平方面有效，它是一個說明這種方法具備影響避孕和治療激素依賴性疾病的潛力的實例。(Gual等待，生育和節育(Fertility and Sterility),1997:67:404-407)。
除了能夠治療男性和女性大量重要疾病和可逆性不育，基于LHRH的免疫治療還提供在雄性和雌性動物(例如，狗、貓、馬和兔)中可逆性避孕的方法以及減輕不期望的雄性激素驅動行為例如發熱、領域標記和好斗。
最近，免疫閹割(例如，基于抗體的LHRH活性抑制)已經應用于畜牧業。來自雄性動物的肉由于存在令人厭惡的氣味和口感(例如公豬膻味)而不能加工成上等肉制品。公豬膻味常規地通過機械閹割消除；然而，雄性肉食動物的閹割不能被考慮應用于人類。而且，機械閹割導致生長狀況不良，并留下身體部分損傷，與非閹割動物相比也稱之為蓄體特征。而免疫閹割動物的生長狀況和蓄體特征比機械閹割動物較少被影響(Bonneau等，動物科學雜志，1994:72:14-20和US 5573767)。因此，免疫閹割優于機械閹割。
LHRH(或GnRH)是一種自身分子，必需將它與Th成分連接，才能產生抗-LHRH的抗體(Sad等，免疫學，1992:76:599-603)。已經測試了幾種這類LHRH免疫原形式。例如，通過結合載體蛋白質產生或通過肽合成連接LHRH免疫原，以強化來源于病原性有機體的Th位點(WO 94/07530,US 5759551,Sad等，1992)。含有LHRH和人工Th表位的改進的LHRH肽免疫原在實施例1-3中舉例說明。
本發明還提供了用于使用肽免疫原的含有藥物可接受的給藥系統的組合物。所述組合物含有一種免疫有效量的一種或多種本發明的肽免疫原。當如此配制時，含有LHRH或其類似物作為目標抗原位點的本發明的組合物用于治療前列腺癌，預防公豬膻味，動物的免疫閹割，治療子宮內膜炎、乳腺癌和其它性腺甾類激素引起的婦產科癌癥。
因此，可以應用佐劑、乳化劑、藥物可接受載體或其它疫苗組合物中常規提供的成分將本發明的肽組合物配制成一種免疫原性組合物。可以用于本發明的佐劑或乳化劑包括明礬、不完全弗氏佐劑、liposyn、皂甙、角鯊烯、L121、emulsigen、單磷脂酰脂類A(MPL)、二甲基-二-十八烷基溴化氨(DDA)、QS21、ISA206、和ISA 720，以及其它已知的有效佐劑和乳化劑。本領域普通技術人員能夠容易地確定所述制劑，所述制劑還包括速釋和/或緩釋制劑。本發明的疫苗可以通過任何常規途徑給藥，包括皮下、口服、肌內、或其它非腸道或腸道途徑給藥。同樣，免疫原可以作為單劑量或多劑量給藥。本領域普通技術人員能夠容易地確定免疫方案。
本發明的免疫原性組合物含有一種有效量的一種或多種本發明的肽免疫原和一種藥物可接受的載體。在一種適當劑量單位劑型中的組合物通常含有每公斤體重約0.5μg到約1mg的免疫原。如果以多劑量給藥，可以方便地分成每劑量單位制劑適當量。例如，劑量，例如0.2-2.5mg；優選1mg可以通過注射優選肌肉內注射施。然后施用重復劑量(增強量)。劑量將根據患者的年齡、體重和一般健康狀況而定，正如疫苗和治療領域公知的那樣。
含有本發明的肽免疫原混合物的疫苗，特別是含有來源于MVF Th,即SEQ ID NOS:3-16和HBsAg Th即SEQ ID NOS:21-25的Th表位的混合物，可以在廣泛種群中提供增強的免疫原性，因此提供了一種對LHRH或其它目標抗原位點的改進的免疫應答。
對Th/LHRH肽結合物或其它Th/目標抗原位點結合物的的免疫應答可以通過捕獲入O’Hagan等(疫苗，1991；9:768)描述的生物可降解微粒類型中或其上傳送來改進。可以將免疫原與或不與佐劑一起包封，所述微粒能夠運載一種免疫刺激佐劑。微粒還可以與肽免疫原一同給藥，以加強免疫應答。
作為具體實施例，本發明提供了一種通過在一段時間和一定條件下給哺乳動物施用含有Th/LHRH肽免疫原的藥物組合物誘導抗-LHRH抗體的方法，以在哺乳動物中產生不育狀態。本發明所述的不育狀態是防止懷孕的狀態。可以通過本領域已知方法例如，通過評價精子發生或排卵，以及通過實驗動物數據的統計模型測定不育。在雄性不育的其它指標包括血清睪酮降低到閹割水平和睪丸退化。所述組合物的合適劑量為每種肽每公斤體重約0.5μg到約1mg。當以多劑量給藥時，可以將該劑量常規地分成每劑量適當量。
同時，本發明的LHRH實施方式涉及通過在一段時間內和預防雄激素依賴性癌進一步發展的條件下給哺乳動物施用本發明的肽組合物治療雄激素依賴性癌。適當的單位劑量為每公斤體重約0.5μg到約1mg。當以多劑量給藥時，可以將其常規地分成每劑量適當量。
另外，LHRH實施方式涉及改進雄性家蓄動物肉食的口感和嫩度的方法，同時維持未經閹割雄性動物的有利生長狀況。未經閹割雄性的雄性甾類激素導致快速生長，但它們的存在伴隨非-雄性甾類激素(例如，5∝雄性雄甾酮)和糞臭素(色氨酸的微生物代謝產物)，它們使肉產生不愉快的口感和氣味。這種對于豬被稱之為公豬膻味的狀況降低了肉的質量。然而，在屠宰之前的幾周內，按照實現免疫閹割的方案，用含有本發明的LHRH肽的組合物主動免疫小雄性，則可以保留未閹割雄性的一些生長有時，同時提供味覺和嫩度改善的肉食。
含有目標抗原位點—LHRH的本發明肽組合物的功效可以通過實施例1-3描述的方案測試。
實施例1用含有LHRH的肽免疫原免疫大鼠合成表2a和2b中列出的肽，并如下所述試驗。
A．肽的合成。通過Merrifield固相合成技術，在Applied Biosystems自動匹配肽合成儀(Models 430、431和433A)上，用Fmoc化學物質分別合成表2a和2b中列出的肽。通過提供選擇用于特定位置的所需氨基酸的混合物制備包含構建的合成抗原文庫(SSAL)例如，被指定為SEQID NO:3的人工Th位點的肽構建體。完成組裝所需肽或組合肽后，按照標準程序，應用三氟乙酸處理樹脂，以便從樹脂上切除肽，并使氨基酸側鏈上的保護基團脫封閉。
通過HPLC純化被切除、提取并清洗的肽，通過質譜和反相HPLC鑒定其特征。
合成肽，使LHRH目標抗原肽(SEQ ID NO:28)依次與每一種表2a和2b中列出的設計的Th表位連接。Th表位是表1a和1b(SEQ IDNOS:3-16和21-25)中所示的那些。為了比較的目的，也制備和試驗了含有模型Th位點(SEQ ID NOS:29和71)和原型Th位點(SEQ IDNOS:30和72)的已有肽免疫原以及肽/載體蛋白結合物，KLH-LHRH(表2b)。有gly-gly作為目標抗原位點和TH表位之間的間隔區，以及有或沒有gly-gly作為TH表位和Inv免疫刺激序列之間的間隔區，合成了Th/THRH和Inv/Th/LHRH肽構建體。另外，用SEQ ID NO:26作為Th位點和目標抗原位點之間的間隔區合成了SEQ ID NOS:55和56(表2a和2b)。SEQ ID NOS:55和56的肽免疫原的結果尚未提供。
B．免疫方案。在每組5到10只大鼠中，按照下面列出的試驗免疫方案和用于確定血清樣品免疫原性的血清學分析的說明，評價表2a和2b中所示的LHRH肽免疫原
動物 Sprague-Dawley大鼠，雄性每組動物數5-10只大鼠/組免疫原個體肽免疫原劑量 在0.5ml中，重量如說明所示(μg)佐劑 (1)弗氏不完全佐劑(IFA)；或(2)明礬(氫氧化鋁)；每組每種免疫原一種佐劑劑量方案 如說明，0、3和6周或0、3周途徑 肌內采血并處理成血清，儲藏用于進行ELISA和放射免疫分析(RIA)，以確定血清睪酮濃度。
C．確定免疫原性的方法。通過ELISA(酶聯免疫吸附分析)，應用事先用LHRH肽(SEQ ID NO:28)作為免疫吸附劑涂布的96-孔平底微滴平板，確定抗體活性。濃度為5μg/ml的肽免疫原溶液的等分樣(100μL)在37℃保溫1小時。用3％明膠/PBS溶液封閉平板，再次于37℃保溫1小時。然后干燥封閉平板，用于分析。將在樣品稀釋緩沖液中用1∶100的稀釋度起始然后進行十倍連續稀釋的實驗免疫血清的等分樣(100μL)加入肽涂布的平板中。平板在37℃保溫1小時。
用0.05％TWEEN的PBS緩沖液沖洗平板六次。加入適當稀釋度的在結合稀釋緩沖液(含有0.5M NaCl、和正常山羊血清的磷酸鹽緩沖液)中的100μL辣根過氧化物酶標記的山羊-抗-品種特異性抗體。平板在37℃保溫1小時，然后如上述清洗。然后加入間苯二胺底物溶液的等分樣(100μL)。用5-15分鐘的時間形成顏色，然后加入50μL 2N H2SO4終止酶顏色反應。在平板讀數儀中記錄各孔A492的含量。基于吸收度的線性回歸分析，將截止A492置于0.5，計算以吸收度倒數的Log10顯示的ELISA效價。該截止值是精確的，因為進行每次分析稀釋正常豚鼠對照樣品的值均少于0.15。
D．確定免疫效果。通過確定血清睪酮濃度的RIA評價免疫原效果。應用來自Diagnostic Products(Los Angeles,CA)的RIA試劑盒，按照生產商的說明，測定血清睪酮的濃度。測定睪酮的最低檢測限范圍為0.01-0.03nmol/L。每個樣品分析兩次。當睪酮濃度為檢測下限而且＜0.1nMol/L時為“接近閹割”，對血清樣品記分作為閹割水平。與機械閹割大鼠血清中的睪酮水平比較，驗證結果。
E．結果。第10或12周采集的血清樣品中得到的結果列在表2a和2b中。(該表中的肽通過它們Th表位的來源而定，如表1a和1b中的那樣)。ELISA數據(未顯示)證明所有列出的免疫原的免疫在所有動物中均產生抗體應答。通過確定血清睪酮濃度，證實了抗-肽抗體應答，以及隨后的對天然LHRH的交叉反應性的效果。這些結果在表2a和2b的右欄中，以每組所有動物中閹割水平的血清睪酮的動物數概述。
結果表明，本發明肽，無論與強效佐劑IFA一同以最高劑量給藥3次，還是與弱效佐劑明礬一同以低劑量給藥2次，在產生免疫閹割方面同樣有效。通過附加Inv結構域序列改善Th位點SEQ ID NOS:4和13的免疫原性。參見SEQ ID NOS:32和33與SEQ ID NOS:44和45之間的比較。然而，附加Inv結構域序列不會總是導致免疫原性改善，例如比較SEQ ID NOS:38和39、SEQ ID NOS:46和47、以及SEQ ID NOS:53和57。本發明的兩種肽(SEQ ID NOS:37和54)僅測試了其低劑量與弱效佐劑組合，沒有產生免疫閹割，但其它肽例如SEQ ID NO:52的結果表明，它們與在較高劑量與強效佐劑的組合同樣有效。本發明的某些LHRH肽免疫原比KLH/LHRH肽載體蛋白結合物或具有HbsAg Th(SEQ ID NOS:71和72)的肽免疫原在誘導免疫閹割方面顯著地更為有效。參見表2b。
同時，本發明的肽免疫原比肽/載體結合蛋白質或具有現有技術的更復雜原型Th表位(SEQ ID NOS:1或17)的肽免疫原更容易合成。然而，含有本發明的人工Th表位的肽免疫原得到等量或劑量更少或更低的改進的免疫原性。
接受本發明LHRH肽的大鼠的抗體應答的血清學分析證明，對肽的抗體應答特異性地指向目標抗原位點，而不是新的人工Th位點。這是這些肽免疫原不同于常規肽/載體蛋白結合物的獨特優點。通過ELISA,應用LHRH肽(SEQ ID NO:28)和適當的Th表位(SEQ ID NOS:11、21、或24)作為基于肽的ELISA中的固相底物，比較了用表3所示的肽免疫原，以25μg劑量在明礬中配制，在0和3周免疫的大鼠得到的血清樣品對LHRH目標位點和對Th表位的反應性。這些ELISA的結果在表3中列出，其表明盡管對Th/LHRH肽結合物的LHRH部分具有高效價的反應性，但對人工Th位點的反應性處于背景水平。
實施例2在大鼠中誘導更廣泛免疫閹割的LHRH肽混合物確證實施例1中所示的各種人工TH表位/LHRH構建體的相對效果能夠選擇一種組合成免疫原性增強的更有效的肽混合物。Th/LHRH肽免疫原混合物比US 5795551的混合物中的任何個體肽更為有效。而且，攜帶來源于MVF Th(SEQID NO:2)和HbsAg Th(SEQ ID NOS:18-20)的混雜Th表位的個體構建體混合物在遺傳多樣性種群中提供了比具有來源于僅一種混雜Th表位的Th表位的肽組合物更廣泛的應答。因此，組裝了一種含有來源于MVF Th和HbsAg Th的本發明的肽混合物的肽組合物，并測試的該混合物的效果，并將其與含有混合物個體肽的組合物進行了比較。
用25μg劑量(總劑量)的表4所示的肽組合物對每組6或8只雄性大鼠免疫。混合物中的肽以等當量比例混合。用0.4％的明礬配制肽，在0和3周肌內給藥。跟蹤測試22周的血清睪酮水平，結果記錄為每組動物總數中睪酮為閹割水平的動物數。這些結果在表4中顯示。它們證明，與效果相對較低的佐劑一同配制的低劑量的肽組合物到第5周獲得睪酮的閹割水平，該反應一直持續到第22周。而且，該肽混合物的表現明顯優于任何一個含有個體肽的肽組合物。可以預見該混合物將比其它個體肽組合物表現改進的免疫原性，試驗動物的數目更多更能代表真實種群。
實施例3用于豬免疫閹割的LHRH肽混合物和制劑一組試驗動物顯示對具有不同TH表位的肽免疫原混合物比對含有單一肽免疫原的組合物表現更廣泛的應答性。然而，對于預防豬的公豬膻味，免疫強效LHRH肽免疫原效果必需足夠強烈，以在大多數動物中誘導所需的應答，同時還必需能被肉食動物的應用所接受。重要的是沒有對生長速率的直接不利影響，無殘存的肽免疫原或佐劑遺留在肉食中或者導致畜體可鑒定部位的損傷。
為了評價本發明LHRH肽混合物的有用的免疫原性，在0.4％明礬、IFA、或ISA 206/DDA中配制的三種混合物給豬施用。ISA 206/DDA是一種水包油型乳劑，其中二甲基-二-十八烷酯溴化銨(DDA)以30mg/ml分散于MONTANIDEISA 206中(MONTANIDEISA 206是一種油狀可代謝溶液，由Fairfield.NJ的SEPPIC Inc.提供)。然后將油懸浮液以1∶1的體積比在肽濃度被調整到0.5ml中制備物中含有所需劑量肽的水基肽溶液中乳化。
免疫方案動物Yorkshire Hampshire雜交豬，雄性，3-4周齡，未閹割組動物數2-3只動物/組免疫原 SEQ ID NOS:42、50和57的等當量混合物劑量0.5mL中400μg肽佐劑(1)0.4％明礬(2)IFA，(3)ISA 206/DDA方案0、4、和13周或0、4周途徑肌內通過分析研究過程全程采集的豬血清樣品，監測肽免疫原制劑的效果，結果在圖1-3中圖示說明。分析包括如下述的用于確定與溶液中自身LHRH交叉反應的抗體是否存在的RIA，以及如實施例1所述用于確定睪酮的RIA。另外，用卡鉗通過心悸測定了平均睪丸橫截面積。
將用于抗-LHRH RIA的抗血清在1％牛血清白蛋白(BSA),pH7.4中以1∶100的比例稀釋。將等體積的稀釋血清加到100μL在1％BSA中稀釋的[125I]-LHRH(New England Nuclear Company,Boston,MA)，使5.25 pg LHRH約為15000cpm。使溶液在室溫下保溫過夜，結合LHRH的抗體用400μL 25％聚乙二醇(MW 8000)的0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),pH7.6和200μL 5mg/ml牛γ-球蛋白的PBS沉淀。抗LHRH抗體的濃度表示為每升血清中被結合的碘處理LHRH的nM(ladd等，1988，美國免疫學報道雜志，17:121-127)。
這三個分析的結果在圖1-3中圖示說明。施用免疫原的間隔在圖的底部用箭頭表示。各圖中個體試驗動物的確定由實心圓、三角、和方框表示。豬對所有三種制劑產生免疫應答，如抗-LHRH抗體的出現和睪酮的伴隨抑制所示。
明礬制劑(圖1)效果較差，產生低水平的抗體應答。該組的一個動物直到第11周一直沒有獲得睪酮的閹割水平，該組的總共兩只動物沒有表現睪丸的完全萎縮。明礬組的動物在第13周沒有接受免疫，接著處理效果被逆轉。
IFA組的動物(圖2)表現較高水平的抗體應答，三只動物中的兩只在第6周達到并維持睪酮的閹割水平。然而，到第13周施用加強劑量之后，三只動物中應答最低的豬沒有產生應答，睪酮恢復到正常水平，未見睪丸萎縮。該組的兩只應答動物在第23周實現睪丸的完全萎縮。
ISA 206/DDA組(圖3)的兩只豬表現高且相對均一水平的抗體應答。該組的睪酮的免疫閹割水平在第9周達到，穩定維持到第12周。兩只動物均對第13周的增強量反應，維持睪酮的閹割水平。兩只動物的睪丸在第23周已經檢測不到。
因此，從ISA 206/DDA制劑得到的結果對于預防公豬膻味是最優選的。ISA 206/DDA制劑在兩只動物中獲得高且均一的效果。而且，該制劑與導致損傷的IFA制劑相比，更容易為豬接受，似乎因為IFA制劑不容易代謝。
這些證明了本發明的人工Th表位在刺激抗LHRH的有效抗體應答方面的效果。
表1模型、原型、和人工理性化Th表位a．MVF Th和由此來源的Th表位
b．HBsAg Th原型和衍生物ivatives
表2LHRH肽的免疫原性a．MVF Th衍生物
aLHRH=EHWSYGLRPG(SEQ ID NO:28)bINV=侵染素結構域(SEQ ID NO:27)cKLH=匙孔帽貝血藍蛋白d鉸鏈間隔區=PPXPPXP(SEQ ID NO:26)“dose”表示“劑量”；“Alum”表示“明礬”
表3對目標抗原位點的抗體特異性評價
a抗-LHRH效價＞1∶1000的動物/免疫的總動物數目。ELISA肽是SEQ IDNO:28。b抗-Th反應性＞0.100 A490的動物數目/免疫的總動物數目。血清稀釋1∶100倍，所有A490值均在代表性Th肽的背景值中。cELISA肽是SEQ ID NO:11。dELISA肽是SEQ ID NO:21。eELISA肽是SEQ ID NO:24。
表4包括混合物的人工Th/LHRH肽組合物的評價
a 單個LHTH肽組合物或混合LHRH肽組合物在明礬中配制。免疫方案25μg/劑量，0和3wpi。b 在組中免疫閹割的動物數目/總動物數目。當血清睪酮濃度為＜0.1nmol/L至不可檢測時，動物被記錄為免疫閹割。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人美國聯合生物醫學公司(ⅱ)發明名稱人工T輔助細胞表位作為含有免疫原性LHRH肽的合成肽免疫原的免疫刺激物(ⅲ)序列數目72(ⅳ)通訊地址(A)地址Morgan & Finnegan,L.L.P.
(B)街道345 Park Avenue(C)城市New York(D)州NY(E)國家USA(F)郵政編碼10154-0054(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒體形式軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC Windows(D)軟件Word 97(ⅵ)當前申請數據(A)申請號待定(B)申請日16-JUNE-1999(ⅶ)在先申請數據(A)申請號09/100,414(B)申請日20-JUNE-1998(ⅷ)代理機構/代理人信息(A)名稱Maria H.Lin(B)注冊號29,323(C)參考/案號1151-4157PC(ⅸ)電訊信息(A)電話212-758-4800(B)傳真212-751-6849(2)SEQ ID NO的信息1
(ⅰ)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點1(D)其它信息/注=＂Asp或者Glu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅱ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Asp或者Glu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點8(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點9(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Asp或者Glu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點16(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa His Xaa15 10Xaa Xaa Gly Xaa15
(2)SEQ ID NO的信息2(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu1 5 10Glu Gly Val15(2)SEQ ID NO的信息3(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點l(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點11(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點15(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Xaa15 10Glu Xaa Xaa15
(2)SEQ ID NO的信息4(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點11(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點
(B)位點14(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile1 5 10Glu Xaa Ile15(2)SEQ ID NO的信息5(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點1(D)其它信息/注=＂Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Ile或者Met＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂His otThr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點11(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂Leu或者Met＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點15(D)其它信息/注=＂Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Xaa1 5 10Glu Xaa Xaa
15(2)SEQ ID NO的信息6(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile1 5 10Glu Gly Ile15(2)SEQ ID NO的信息7(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile15 10Glu Thr Ile15(2)SEQ ID NO的信息8(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Met Ser Glu Met Lys Gly Val Ile Val His Lys Met1 5 10Glu Gly Met15(2)SEQ ID NO的信息9(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Leu1 5 10Glu Thr Val15(2)SEQ ID NO的信息10(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點3(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點7(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點8(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點16(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點17(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Ile Ser Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1 5 10Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Leu Phe15(2)SEQ ID NO的信息11(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點7(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點8(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性
(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點16(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1 5 10Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe15(2)SEQ ID NO的信息12(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點3(D)其它信息/注=＂Leu或者Met＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4
(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Ile或者Met＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點7(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點8(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Leu或者Met＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點16(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點17(D)其它信息/注=＂Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Ile Ser Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1 5 10Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Leu Phe15(2)SEQ ID NO的信息13(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His1 5 10Lys Ile Glu Gly Ile Leu Phe15(2)SEQ ID NO的信息14(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr1 5 10Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe15(2)SEQ ID NO的信息15(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:Ile Ser Met Ser Glu Met Lys Gly Val Ile Val His1 5 10Lys Met Glu Gly Met Leu Phe15(2)SEQ ID NO的信息16(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Ile Ser Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr1 5 10Arg Leu Glu Thr Val Leu Phe15(2)SEQ ID NO的信息17
(ⅰ)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點1(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點3(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Phe,Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點7(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點9(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點11(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點15(D)其它信息/注=＂Gln,Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點17(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性
(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點18(D)其它信息/注=＂Asp或者Arg＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr1 5 10Xaa Pro Xaa Ser Xaa Xaa15(2)SEQ ID NO的信息18(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln1 5 10Ser Leu Asp15(2)SEQ ID NO的信息19(ⅰ)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr1 5 10Ile Pro Gln Ser Leu Asp15(2)SEQ ID NO的信息20(ⅰ)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln1 5 10Ser Leu(ⅰ)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(2)SEQ ID NO的信息21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1 5 10Ile Ile Thr Thr Ile Asp15(2)SEQ ID NO的信息22(ⅰ)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1 5 10Ile Ile Thr Thr Ile15(2)SEQ ID NO的信息23(ⅰ)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:Lys Lys Lys Met Met Thr Met Thr Arg Met Ile Thr1 5 10Met Ile Thr Thr Ile Asp15(2)SEQ ID NO的信息24(ⅰ)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:Phe Ile Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu Leu Ala Ser1 5 10Thr His Ile Leu15
(2)SEQ ID NO的信息25(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:Lys Lys Lys Phe Ile Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu1 5 10Leu Ala Ser Thr His Ile Leu15(2)SEQ ID NO的信息26(ⅰ)序列特征(A)長度6氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:
Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro1 5(2)SEQ ID NO的信息27(ⅰ)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe15(2)SEQ ID NO的信息28(ⅰ)序列特征(A)長度10氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:
Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10(2)SEQ ID NO的信息29(ⅰ)序列特征(A)長度27氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu1 5 10Glu Gly Val Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu15 20Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息30
(ⅰ)序列特征(A)長度28氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點1(D)其它信息/注=＂Asp或者Glu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Asp或者Glu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點8(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點9(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Asp或者Glu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點16(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa His Xaa1 5 10Xaa Xaa Gly Xaa Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly15 20Leu Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息31(ⅰ)序列特征(A)長度27氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點1(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點11(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點15(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Xaa1 5 10Glu Xaa Xaa Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu15 20Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息32(ⅰ)序列特征(A)長度27氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點11(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile551 5 10Glu Xaa Ile Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu15 20Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息33(ⅰ)序列特征(A)長度45氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點20(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點23(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點24(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點28(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點
(B)位點29(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點32(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa15 20Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Xaa Ile Gly Gly Glu25 30 35His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly40 45(2)SEQ ID NO的信息34(ⅰ)序列特征(A)長度27氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點1(D)其它信息/注=＂Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Ile或者Met＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂His otThr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點11(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂Leu或者Met＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點15(D)其它信息/注=＂Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Xaa1 5 10Glu Xaa Xaa Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu15 20Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息35(ⅰ)序列特征(A)長度45氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1510Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Ile Ser Glu Ile Lys Gly15 20Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile Gly Gly Glu25 30 35His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly40 45(2)SEQ ID NO的信息36(ⅰ)序列特征(A)長度27氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile1510Glu Thr Ile Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu15 20Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息37(ⅰ)序列特征(A)長度27氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:Met Ser Glu Met Lys Gly Val Ile Val His Lys Met1 5 10Glu Gly Met Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu1520Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息38(ⅰ)序列特征(A)長度27氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Leu1 5 10Glu Thr Val Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu15 20Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息39(ⅰ)序列特征(A)長度45氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1510Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Leu Thr Glu Ile Arg Thr15 20Val Ile Val Thr Arg Leu Glu Thr Val Gly Gly Glu25 30 35His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly4045(2)SEQ ID NO的信息40(ⅰ)序列特征(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點3
(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點7(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點8(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點16(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點17(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:Ile Ser Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1 5 10Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Leu Phe Gly Gly Glu His Trp15 20Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30(2)SEQ ID NO的信息41(ⅰ)序列特征(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點7(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點8
(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點16(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41:Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1 5 10Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Gly Gly Glu His Trp15 20Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30(2)SEQ ID NO的信息42(ⅰ)序列特征(A)長度49氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點
(B)位點22(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點25(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點26(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點30(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點31(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點34(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Ile Ser Ile Xaa Glu Ile15 20Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu25 30 35Phe Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro
40 45Gly(2)SEQ ID NO的信息43(ⅰ)序列特征(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點3(D)其它信息/注=＂Leu或者Met＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Ile或者Met＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點7(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點8(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Leu或者Met＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點16(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點17(D)其它信息/注=＂Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43:Ile Ser Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1 5 10Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Leu Phe Gly Gly G1u His Trp15 20Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30(2)SEQ ID NO的信息44
(ⅰ)序列特征(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:44:Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His1 5 10Lys Ile Glu Gly Ile Leu Phe Gly Gly Glu His Trp15 20Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30(2)SEQ ID NO的信息45(ⅰ)序列特征(A)長度47氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly15 20Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile Leu Phe Gly25 30 35Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly40 45(2)SEQ ID NO的信息46(ⅰ)序列特征(A)長度31氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:46:Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr1 5 10Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe Gly Gly Glu His Trp15 20Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30(2)SEQ ID NO的信息47(ⅰ)序列特征(A)長度49氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:47:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Ile Ser Ile Thr G1u Ile15 20Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr Ile Leu25 30 35Phe Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro40 45Gly(2)SEQ ID NO的信息48(ⅰ)序列特征(A)長度47氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:48:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Ile Ser Met Ser Glu Met Lys Gly15 20Val Ile Val His Lys Met Glu Gly Met Leu Phe Gly25 30 35Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly40 45(2)SEQ ID NO的信息49(ⅰ)序列特征(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:49:Ile Ser Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr1 5 10Arg Leu Glu Thr Val Leu Phe Gly Gly Glu His Trp15 20Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30(2)SEQ ID NO的信息50(ⅰ)序列特征(A)長度30氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:50:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1 5 10Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Glu His Trp Ser15 20Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30(2)SEQ ID NO的信息51(ⅰ)序列特征(A)長度29氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:51:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1 5 10Ile Ile Thr Thr Ile Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr15 20Gly Leu Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息52(ⅰ)序列特征(A)長度30氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:52:Lys Lys Lys Met Met Thr Met Thr Arg Met Ile Thr1 5 10Met Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Glu His Trp Ser15 20Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30(2)SEQ ID NO的信息53(ⅰ)序列特征(A)長度28氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:53:Phe Ile Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu Leu Ala Ser1 5 10Thr His Ile Leu Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly15 20Leu Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息54(ⅰ)序列特征(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:54:Lys Lys Lys Phe Ile Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu1 5 10Leu Ala Ser Thr His Ile Leu Gly Gly Glu His Trp15 20Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30(2)SEQ ID NO的信息55(ⅰ)序列特征(A)長度35氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點7(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點8(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點16(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:55:lle Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1 5 10Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Pro Pro Xaa Pro Xaa15 20Pro Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30 35(2)SEQ ID NO的信息56(ⅰ)序列特征(A)長度34氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:56:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1 5 10Ile Ile Thr Thr Ile Asp Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro15 20Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30(2)SEQ ID NO的信息57(ⅰ)序列特征(A)長度46氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:57:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Phe Ile Thr Met Asp Thr15 20Lys Phe Leu Leu Ala Ser Thr His Ile Leu Gly Gly25 30 35Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly40 45(2)SEQ ID NO的信息58(ⅰ)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:58:Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr1 5 10Ser Cys(2)SEQ ID NO的信息59(ⅰ)序列特征(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點l(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點11(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點15(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:59:Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Xaa1 5 10Glu Xaa Xaa Gly Gly Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe15 20Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys25 30(2)SEQ ID NO的信息60(ⅰ)序列特征(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點17(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點18(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點21(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點22(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點26(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點27(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點28(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點30(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點31(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:60:Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr1 5 10Ser Cys Gly Gly Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile15 20Val Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa25 30(2)SEQ ID NO的信息61(ⅰ)序列特征(A)長度34氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:61:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1 5 10Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Ala Gly Cys Lys15 20Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys25 30(2)SEQ ID NO的信息62(ⅰ)序列特征(A)長度30氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:62:Cys Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser1 5 10Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu15 20Trp Asp Gln Gly Asn Cys25 30(2)SEQ ID NO的信息63
(ⅰ)序列特征(A)長度47氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點1(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點11(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點15(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Val＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:63:Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Xaa1 5 10Glu Xaa Xaa Gly Gly Cys Asn Gln Gly Ser Phe Leu15 20Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp25 30 35Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Cys40 45(2)SEQ ID NO的信息64(ⅰ)序列特征(A)長度25氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:64:Cys Gly Glu Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr His Pro1 5 10His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys15 20Cys25(2)SEQ ID NO的信息65(ⅰ)序列特征(A)長度46氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點7(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點8(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點
(B)位點13(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點16(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:65:Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1 5 10Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Gly Gly Cys Gly Glu15 20Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr His Pro His Leu Pro25 30 35Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys40 45(2)SEQ ID NO的信息66(ⅰ)序列特征(A)長度42氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點1(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Ser或者Thr＂
(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂His或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點11(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點12(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Leu＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點14(D)其它信息/注=＂Gly或者Thr＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點15(D)其它信息/注=＂Ile,Met或者Val＂
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:66:Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Xaa1 5 10Glu Xaa Xaa Gly Gly Cys Gly Glu Thr Tyr Gln Ser15 20Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met25 30 35Arg Ser Thr Thr Lys Cys40(2)SEQ ID NO的信息67(ⅰ)序列特征(A)長度45氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:67:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1 5 10Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Cys Gly Glu Thr15 20Tyr Gln Ser Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg25 30 35Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys40 45(2)SEQ ID NO的信息68(ⅰ)序列特征(A)長度63氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:68:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Lys Lys Lys Ile Ile Thr15 20Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr Ile Asp25 30 35Gly Gly Cys Gly Glu Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr40 45His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr50 55 60Thr Lys Cys(2)SEQ ID NO的信息69(ⅰ)序列特征(A)長度56氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:69:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1 5 10Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Cys Lys Tyr Gly15 20Glu Asn Ala Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln25 30 35Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr40 45Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys50 55(2)SEQ ID NO的信息70(ⅰ)序列特征(A)長度72氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:70:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Lys Lys Lys Ile Ile Thr15 20Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr Ile Asp25 30 35Gly Gly Cys Thr Tyr Gly Thr Gln Pro Ser Arg Arg40 45Gly Asp Met Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Arg50 55 60Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys65 70(2)SEQ ID NO的信息71(ⅰ)序列特征(A)長度27氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:71:Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln1 5 10Ser Leu Asp Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu15 20Arg Pro Gly25(2)SEQ ID NO的信息72(ⅰ)序列特征(A)長度30氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點1(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點2(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點3(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點4(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點5(D)其它信息/注=＂Phe,Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點6(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點
(B)位點7(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點9(D)其它信息/注=＂Lys或者Arg＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點10(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點1l(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點13(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點15(D)其它信息/注=＂Gln,Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點17(D)其它信息/注=＂Leu,Ile,Val或者Phe＂(ⅸ)特性(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位點18
(D)其它信息/注=＂Asp或者Arg＂(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:72:Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr1 5 10Xaa Pro Xaa Ser Xaa Xaa Gly Gly Glu His Trp Ser15 20Tyr Gly Leu Arg Pro Gly25 30
權利要求
1．一種由下式表示的肽免疫原(A)n-(目標抗原位點)-(B)o-(Th)m-X或(A)n-(Th)m-(B)o-(目標抗原位點)-X或(目標抗原位點)-(B)o-(Th)m-(A)n-X或(Th)m-(B)o-(目標抗原位點)-(A)n-X其中A為一種氨基酸，或一種一般性免疫刺激序列，其中n大于1，每一個A可能相同或不同；B選自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)LYs-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亞胺(ε-N)Lys-，或-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亞胺)-；Th是一種選自SEQ ID NOS:3-16、21-25之一或其類似物的人工輔助T細胞表位；“目標抗原位點”LHRH或其類似物；X為一種氨基酸的α-COOH或α-CONH2；n為從1到約10；m為從1到約4；和o為從0到約10。
2．按照權利要求1的肽免疫原，其中免疫刺激序列是SEQ ID NO:27。
3．按照權利要求1的肽免疫原，其中B選自Gly-Gly,Pro-Pro-Xaa-Pro-Pro,-NHCH(X)CH2SCH2CO-,-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-,-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亞胺(ε-N)LYs-，或-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亞胺)-。
4．按照權利要求2的肽免疫原，其中B選自Gly-Gly,Pro-Pro-Xaa-Pro-Pro,-NHCH(X)CH2SCH2CO-,-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-,-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亞胺(ε-N)Lys-，或-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亞胺)-。
5．按照權利要求1的肽免疫原，其中B是Gly-Gly。
6．按照權利要求2的肽免疫原，其中B是Gly-Gly。
7．按照權利要求1或5的選自SEQ ID NOS:31、36、38、40、43、46、或49的肽免疫原。
8．按照權利要求7的選自SEQ ID NOS:36、38、40、41、43、46、或49的肽免疫原。
9．按照權利要求2或6的選自SEQ ID NOS:33、35、39、42、45、47、或48的肽免疫原。
10．按照權利要求9的選自SEQ ID NOS:33、39、42、和45的肽免疫原。
11．一種藥物組合物，其含有一種免疫有效量的權利要求1-6之一的肽免疫原，并進一步含有一種藥物可接受的載體。
12．一種藥物組合物，其含有一種免疫有效量的權利要求7的肽免疫原，并進一步含有一種藥物可接受的載體。
13．一種藥物組合物，其含有一種免疫有效量的權利要求8的肽免疫原，并進一步含有一種藥物可接受的載體。
14．按照權利要求11的藥物組合物，其中所述肽或肽結合物的所述免疫有效量為每劑量每公斤體重約0.5μg到約1mg之間。
15．按照權利要求12的藥物組合物，其中其中所述肽或肽結合物的所述免疫有效量為每劑量每公斤體重約0.5μg到約1mg之間。
16．按照權利要求13的藥物組合物，其中其中所述肽或肽結合物的所述免疫有效量為每劑量每公斤體重約0.5μg到約1mg之間。
17．一種在哺乳動物中誘導抗LHRH抗體的方法，包括給所述哺乳動物施用權利要求11的藥物組合物。
18．一種在哺乳動物中誘導抗LHRH抗體的方法，包括給所述哺乳動物施用權利要求12的藥物組合物。
19．一種在哺乳動物中誘導抗LHRH抗體的方法，包括給所述哺乳動物施用權利要求13的藥物組合物。
全文摘要
本發明涉及新的用于誘導抗LHRH抗體的肽免疫原,其包括設計用于提供優化免疫原性的人工T輔助細胞表位(Th表位)。人工Th表位與LHRH以及任選的一種免疫刺激序列共價連接。
文檔編號C07K19/00GK1315869SQ99806646
公開日2001年10月3日 申請日期1999年6月21日 優先權日1998年6月20日
發明者王長怡 申請人:美國聯合生物醫學公司