四肽的制備方法

專利名稱：四肽的制備方法
技術領域：
本發明領域本發明涉及一種新的制備四肽、更準確地說是四肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2或其藥學上可接受鹽的方法。在其它方面，本發明也涉及用于該方法中的新的中間體。
背景和現有技術本發明涉及一種新的用于制備肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2或其藥學上可接受的鹽的方法。
WO97/07129公開了一種尤其用于制備肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2的方法。該肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2也公開于WO97/07130中。所述肽顯示出外周止痛活性和對阿片樣物質受體μ亞型的選擇性，并特別適用于疼痛的治療。此外，該肽可以采用根據本領域中成熟方法的固相合成法制備。固相合成法(一種用于肽合成的常用及成熟的方法)的缺陷在于除了成本昂貴外，難用于大規模生產。
本發明方法以與本領域已知方法相比成本更低和對環境更有利的方式提供高純度的四肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2。此外，本申請的方法提供更高收率的產品。
因此，本發明的目地是提供一種適合大規模合成使用的新方法。本方明的另一個目地是提供一個包括盡可能少的反應步驟的方法。
本發明概述本發明提供一種大規模地制備肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2的新方法，它是一種如式(Ⅰ)所示的肽或其藥學上可接受的鹽 根據本發明制備如上式(1)化合物的方法包括如下反應步驟步驟1(ⅰ)一個偶合步驟，其中通過預先活化步驟或就地產生預先制備的、活化的p-氟苯丙氨酸衍生物(Ⅲ)與苯丙氨酸的氨基(其中羧基作為酯或酰胺被保護，即式Phe-R1化合物，其中R1是酯或酰胺殘基)在溶劑的存在下反應，得到被保護的二肽衍生物(Ⅳ)，式(Ⅲ)和(Ⅳ)的結構式如下 其中A是氨基保護基團，和R是活化劑殘基； 其中A是氨基保護基團，和R1是酯或酰胺殘基；(ⅱ)一個脫保護步驟，其中在以上步驟中制備的被保護的二肽衍生物(Ⅳ)，根據所用的氨基保護基團，通過催化氫化作用、堿或酸處理來脫保護，得到二肽衍生物(5) 其中R1是酯或酰胺殘基；步驟2(ⅰ)一個偶合步驟，其中通過預活化步驟或就地產生預先制備的活化丙氨酸衍生物(Ⅶ)，與步驟1的產物即二肽衍生物(5)在溶劑的存在下反應，得到被保護的三肽衍生物(Ⅷ)，式(Ⅶ)和(Ⅷ)化合物的結構式如下 其中A是氨基保護基團，和R是活化劑的殘基； 其中A是氨基保護基團，和R1是酯或酰胺殘基；(ⅱ)脫保護步驟，其中在前面步驟中制備的、被保護的三肽衍生物(Ⅷ)根據使用的氨基保護基，通過催化氫化作用或酸處理被脫保護，得到三肽衍生物(9) 其中R1是酯或酰胺殘基；步驟3(ⅰ)一個偶合步驟，其中通過預先活化步驟或就地產生預先制備的一種活化酪氨酸衍生物(Ⅹ)，在溶劑存在下，與三肽衍生物(9)(步驟2的產物)反應，提供保護的四肽衍生物(Ⅺ)。式(Ⅹ)和(Ⅺ)化合物的結構式如下； 其中A是一種氨基保護基團，R是一種活化劑殘基，和R2是H或類似芐基的基團； 其中A是一種氨基保護基，和R1是一種酯或酰胺殘基；(ⅱ)如果在前面步驟(ⅰ)中制備的被保護的四肽衍生物(Ⅺ)是一種酯，則進行任選的轉化反應，其中酯化合物(Ⅺ)在有機醇中與氨反應，優選與甲醇中的氨反應，提供保護的二肽衍生物(Ⅻ) (ⅲ)一個脫保護步驟，其中被保護的四肽衍生物(Ⅻ)，根據所使用的氨基保護基團，通過催化氫化作用、堿或酸處理而脫保護，提供最終的四肽(Ⅰ)，其可任選轉換為四肽(Ⅰ)的鹽。
如果需要，可以使肽H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(Ⅰ)與一種藥學上可接受的酸如AcOH、磷酸、檸檬酸、乳酸和鹽酸反應。根據本發明，鹽酸是優選使用的酸。可以使用的鹽在S.M.Berge,L.D.Bighley和D.C.Monkhouse,J.Pharmaceut.Sci,66(1977)1-19中描述。
因此，根據以上敘述的本發明方法可簡述為包括下列步驟步驟1(ⅰ)一個偶合步驟，(ⅱ)一個脫保護步驟。步驟2(ⅱ)一個偶合步驟，(ⅱ)一個脫保護步驟。步驟3(ⅰ)一個偶合步驟，
(ⅱ)一個任選的轉化步驟，(ⅲ)一個脫保護步驟。
在以上步驟3(ⅱ)中描述的任選轉化步驟可代之以在步驟1或步驟2中偶合步驟(ⅰ)之后進行。優選該轉化步驟在步驟1中的偶合步驟(ⅰ)之后進行。因此，進行本發明方法的優選方式簡述為包括以下步驟步驟1(ⅰ)一個偶合步驟，(ⅱ)一個任選的轉化步驟，(ⅲ)一個脫保護步驟。步驟2(ⅰ)一個偶合步驟，(ⅱ)一個脫保護步驟。步驟3(ⅰ)一個偶合步驟，(ⅱ)一個脫保護步驟。
Nα-氨基保護基可以從適合肽合成的任何保護基中選擇，例如，叔丁氧基羰基(Boc)或芐氧基羰基(經常縮寫為Z-)，僅是提到的兩種可能的氨基保護基。然而，芐氧基羰基特別優選用于本合成，因為它容易通過催化氧化作用去除，與保護基Boc相反，它不需要中和釋放出的胺。本領域的技術人員可了解根據本發明可使用的合適的氨基和羧基保護基。參照J.Meienhofer in The Peptides，笫1卷，編輯E.Gross& J.Meienhofer,Academic Press,Inc,London,1979,264-309頁；Thepeptides,1-9卷，E.Gross&J.Meienhofer，編輯，Academic PressInc,London,1979-1987；Houben-Weyl,Methoden der organischenChemie,E.Muller，編輯，15卷，Ⅰ-Ⅱ部分，Thieme,Stuttgart 1974；和M.Bodanszky,Principles of peptide Synthesis,Springer Verlag,Berlin1984。
上述步驟1-3前的預活化步驟，或就地產生活化的活性氨基酸衍生物，可通過一種氨基酸在叔胺和有機溶劑的存在下，與一種活化劑反應完成，其中所述氨基酸的氨基官能團通過合適的保護基保護，例如叔丁氧基羰基(Boc)或芐氧基羰基(Z)(這些保護基可以購買到或通過本領域已知技術獲得)，提供活化的氨基酸衍生物。預先活化步驟可簡略表示如下 其中A是一種氨基保護基，和R是一種活化劑殘基；對于上述1-3步驟中的偶合步驟而言，只要所述氨基成分為基本上可溶的并可與活化的肽衍生物直接反應，可使用各種強的溶劑。用于偶合步驟的合適的溶劑的實例為丙酮、乙腈、DMF、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和EtOAc，或它們的混合物。
這里所用術語“類似芐基的基團”，表示任何取代或未取代的芐基，它們在類似的反應條件下，作為芐氧基羰基被氫解。
術語“pF”表示對位氟取代基。
在每個步驟中可能的以及優選的反應物和反應條件如下。預活化步驟合適的活化劑可選自那些產生常用的活化氨基酸衍生物的活化劑，包括(但不限于)碳二亞胺、活化酯、疊氮化物或酸酐。氯代甲酸異丁酯(iBuOCOCI)是優選的活化劑。當氯代甲酸異丁酯(iBuOCOCI)為活化劑時，活化的肽衍生物具有以下結構，以D-丙氨酸為例 叔胺可選自任何叔胺。然而，優選NMM(N-甲基嗎啉)、二異丙基乙胺和三乙胺。另外，也可使用位阻的仲胺。
有機溶劑可以是本領域中技術人員所知的在肽化學中合適的任何有機溶劑。然而，在預活化步驟中優選乙酸乙酯、乙腈、丙酮和四氫呋喃。偶合步驟步驟1(ⅰ)、步驟2(ⅰ)和步驟3(ⅰ)用于偶合步驟的溶劑可以從許多溶劑中選擇，只要氨基成分基本上可溶和可與活化氨基酸殘基直接反應即可。用于偶合步驟合適的溶劑的實例為丙酮、乙腈、DMF,N-甲基吡咯烷酮(NMP)和EtOAc，或它們的混合物，其中優選丙酮、EtOAc、NMP和DMF。
當活化氨基酸衍生物不降解或反應速度不是太慢時，任何溫度都可使用。優選的溫度范圍是0℃至-20℃，特別優選的溫度是從-5℃至-15℃。調節加料的速度以便維持優選的溫度。脫保護步驟步驟1(ⅱ)、步驟2(ⅱ)和驟3(ⅲ)用于氫化的催化劑可以從許多本領域技術人員所知的催化劑中選擇。然而，優選5％的披鈀碳。可以使用任何至少可溶解一些肽的溶劑，除了酮(例如丙酮)或使催化劑中毒的或與反應成分起反應的溶劑之外。本領域技術人員了解溶劑的選擇。DMF是優選的溶劑。
只有在步驟3(ⅰ)中制備的保護的四肽衍生物(Ⅺ)是一種酯的情況下，才需要任選步驟3(ⅱ)因此，如果使用苯丙氨酸的酰胺，步驟3(ⅱ)將從合成流程中省去。
如果使用酸來除去α-保護基，則需要等摩爾量的堿，以使肽衍生物的氨基脫質子化。
在本發明優選的實施方案中，將保護的氨基酸(優選用芐氧羰基作為Na-氨基保護基)用異丁氧基碳酰氯或類似類型的氯代甲酸酯以混合酐的形式活化。使用的方法基于J.Meienhofer在下列文獻中所綜述的通用方法The Peptides，第一卷，編輯E.Gross & J.Meienhofer,Academic Press,Inc,London 1979,264-309頁。
我們已驚奇地發現，活化時間在0到-15℃的溫度下可延長至少30分鐘，而建議的活化時間在-15℃溫度下為1-2分鐘。我們也發現盡管其它情況下推薦，嚴格的無水條件是不必要的。這使本方法可用于大規模生產，其中較長的反應時間使得可以進行安全的和可重復的過程。立體化學的完整性全部保留，化學純度和收率一般在90％以上。生成的混合酐在約0至-15℃溫度范圍內與緩慢加入的氨基成分(氨基酸/肽酰胺或酯)偶合，然后，在產物開始直接從該反應混合物中結晶前，使反應混合物在大約30-60分鐘內或更長時間達到20-30℃。
我們還驚奇地反現當使用本方法時，如果使用適當選擇的溶劑混合物，則不需要結晶前的單獨的洗滌步驟。優選使用DMF、乙腈、EtOAc和水。控制結晶，不但可以達到高度純化，而且還可以在后處理中縮短過濾或離心的時間，如果需要干燥的中間產物，還可縮短干燥的時間。一個重要的因素是產生足夠量的、不阻塞過濾裝置或離心布的相對窄的粒度分布。這尤其對于產生幾乎不可能過濾的凝膠或無定形結晶的肽是很常見的。
三肽衍生物(9)是一個用于制備目標化合物(Ⅰ)的有用的中間產物 其中R1是一種酯或酰胺殘基。本發明的詳細說明現在通過下面的實施例更詳細地介紹肽H-TyrD-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2或其藥學上可接受的鹽的制備，然而該實施例不認為是對本發明的限制。另外，以下方案1提供用一種其中羧基作為酯被保護的苯丙氨酸衍生物制備根據本發明的式(Ⅰ)肽的合成途徑的詳細綜述。以下方案2提供用一種其中羧基作為酰胺被保護苯丙氨酸衍生物制備根據本發明的式(Ⅰ)肽的合成途徑的詳細綜述。參照以下實施例詳細的合成描述中的化合物編號，與方案1和2中化合物的編號一致。
方案1
方案1(續)
方案1(續) 步驟1(ⅰ)Z-Phe(pF)-Phe-OMe(方案1中化合物3)的制備3.5摩爾規模先將Z-Phe(pF)(化合物1)(1當量)溶于丙酮(4.7L/摩爾)中，冷卻，然后加入IBK(0.9-1.2當量)(實際1當量)。然后根據加入NMM(N-甲基嗎啉)(0.9-1.2當量)(實際1當量)的速度(約20分鐘)控制反應。推薦反應溫度為0到-15℃之間(實際為-9℃到-14℃)，其中加入NMM后立即反應，然而防止混合酐迅速分解。
同時將H-Phe-Ome x HCI(0.9-1.3當量)(實際1.04當量)與丙酮(2.6L/摩爾)混合，用NMM(0.9-1.5當量)(實際1.04當量)中和，冷卻至0到-20℃(實際大約-10℃)。在活化完成后，以保持溫度在約-10℃(實際從-8℃到-13℃)的速度(大約30分鐘)加入該懸浮液。然后加入EtOAc(4L/摩爾)，用水(2×2升/摩爾)洗滌有機相，然后從ACN中共沸蒸餾，于下一步驟前溶解于MeOH中。在甲醇懸浮液中純度為92％。化學移位峰裂數積分(Integral)H8.5 d 17.49d 17.31m 77.24m 57.08m 24.93m 24.5 m 14.26m 13.58s 32.99m 32.67m 1(ⅱ)Z-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中產物4)的制備2.3到3.3摩爾規模將氨加入在前面步驟中制備的化合物3溶液(大約8升MeOH/摩爾)中，壓力在1到5巴之間，在15-40℃下持續5個小時以上或直到反應接近完成為止(實際轉換率99％)。到反應完成時，蒸發氨，在過濾或離心前冷卻反應物。產物用MeOH洗滌，在20-50℃下真空干燥。由化合物1(Z-Phe(pF)計算的收率為74％，純度為100％。化學移位 峰裂數積分H8.05d 17.49d 17.24m 117.07m 34.94m 24.46m 14.21m 13.00m 12.88m 12.66m 1H-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中產物5)的制備4.3摩爾規模將在前面步驟中制備的化合物4與DMF(4.2升/摩爾)混合，加入Pd/C催化劑(Pd實際含量5％)(0.2-10％w/w/LEF-581)(實際7％)，將得到的混合物在25℃、3巴H2壓力下氫化0.5小時以上(實際1.2小時)。然后過濾反應混合物，在下一步驟前冷卻至大約-15℃。在溶液中的純度為99.6％。步驟2(ⅰ)Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物8)的制備4.4摩爾規模將Z-D-Ala(化合物6)(1當量)溶解在乙腈(ACN)(2.3L/摩爾)中，在加入IBK(0.9-1.2當量)(實用1當量)前冷卻。然后以上述的制備化合物3同樣的方式加入NMM(0.9-1.2當量)(實用1當量)。在大約30分鐘內加入化合物5(24.5升)的溶液，維持溫度在約-10℃(實際從-8℃到-14℃)。偶合完成后，通過慢慢加入水(3×3.6升/摩爾+1×1.3升/摩爾)，每次加水間隔時間為約25分鐘，開始溫度大約為30℃，結束溫度大約為20℃，從反應混合物中結晶出產物。然后離心結晶，在20-50℃下真空干燥前用水/乙腈(4∶1)洗滌。收率為90％，純度為99.5％。化學移位 峰裂數積分H8.14d 18.05d 17.43d 17.29m 127.05m 25.01m 24.44m 24.01m 12.92m 32.73m 10.96d 3H-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物9)的制備將在前面步驟中制備的化合物8與DMF(4.2升/摩爾)混合，加入Pd/C催化劑(Pd實際含量5％)(0.2-10％w/w/化合物3)(實際7％)，將得到的混合物在25℃和3巴H2壓力下氫化0.5小時以上(實際1.2小時)。然后過濾反應混合物，在下一步驟前冷卻至約-15℃。純度為97％，原料轉化率大于98％。步驟3(ⅰ)Z-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物12)的制備4.1摩爾規模使用與前面兩次偶合同樣的方法偶合。將Z-Tyr(化合物10)(1當量)溶解于ACN(2.3L/摩爾)中，在加入IBK(0.9-1.2當量)前冷卻。然后，以上述化合物3時同樣的方式加入NMM(0.9-1.2當量)。在大約30分鐘內加入從前步驟中得到的化合物3的溶液，維持溫度在約-10℃(實際從-7℃到-14℃)。偶合完成后，通過緩慢加入乙腈和水(2升/摩爾ACN+0.3升/摩爾25％氨的水溶液)，放置2小時，加入1.5升/摩爾CAN∶水(1∶1)，放置1小時，升溫到35℃，加入晶種(大約1％w/w)，放置1小時，加入1.3L/摩爾CAN∶水(1∶1)，放置1小時，加入1.2升/摩爾水并在35℃下放置0.5小時，加入1.2升/摩爾水并在20℃下放置2小時，加1.2升/摩爾水并在20℃下放置1小時，加1.2L/摩爾水并在20℃下放置0.5小時，從反應混合物中結晶出產物。離心，先水洗然后用ACN洗，然后在20-50℃真空干燥。
由化合物8計算的收率為81％，純度為98.4％。化學移位 峰裂數積分H9.18s 18.18d 18.11d 18.05d 17.43d 17.24m 127.04m 46.63d 24.92m 24.45m 24.22m 23.00m 12.83m 12.64m 10.89d 3(ⅱ)H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案1中化合物1)的制備3.1和3.2摩爾規模將化合物4與DMF(實際操作2-2.6升/摩爾)混合，加入5％的Pd/C催化劑(實際含量)(0.2-10％w/w/化合物3)(實際6-7％)，將得到的混合物在20-40℃(實際操作20-25℃)、3巴H2壓力下氫化0.5小時以上(實際操作1-2小時)。然后，過濾反應混合物以除去Pd/c，加入EtOAc(一般10升/摩爾)直至使所有物質結晶。經過過濾或離心作用分離固體，用EtOAc洗滌，在20-50℃下真空干燥。H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2鹽酸鹽的制備2.1摩爾規模將游離堿化合物I溶解于加有1當量氯化氫的水和丙酮的混合液中并過濾(在實際操作中146克/摩爾25％氯化氫/水，2升丙酮/摩爾)。此鹽在丙酮中的溶解度有限，因此，用額外量的丙酮/水(95∶5)的混合液(0.5升/摩爾)洗滌一次。在高速攪拌下，通過緩慢加入丙酮(3.4升/摩爾)，然后加入至少1％w/w晶種，誘發結晶。30分鐘后，緩慢加入第一份MIBK(31/mde)，緩慢攪拌下放置直到配料明顯變稠。分三次再加入MIBK(3升/摩爾)，每次間隔30-60分鐘，同時維持反應器內部溫度在約20℃。然后，經過離心或過濾分離該固體，用MIBK洗滌，然后在20-50℃下真空干燥16小時以上或直到溶劑含量低于規定的技術規范的要求。
方案2
方案2(續)
方案2(續) 步驟1(ⅰ)Z-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物13)的制備6.7摩爾規模首先將Z-Phe(pF)(1當量)溶解于乙腈(EtOAc)(1.7升/摩爾)中，在加入氯代甲酸異丁酯(0.9-1.2當量)(實際1.05當量)前冷卻。然后，通過加入N-甲基嗎啉(0.9-2.0當量)(實際1.4當量)的速度(大約20分鐘，實際15分鐘)控制反應。推薦反應溫度為0到-15℃(實際從-8℃到-11℃)，其中，加入N-甲基嗎啉后反應立即發生，然而防止混合酐迅速分解。
同時將H-Phe-NH2x HCI(0.9-1.3當量)(實際1.04當量)溶解于DMF(4.0升/摩爾)中，用N-甲基嗎啉(0.9-1.5當量)(實際1.04當量)中和并冷卻至0到-20℃(實際大約-10℃)。在活化完成后，以維持溫度在大約-10℃(實際從-6℃到-13℃)的速度(大約15分鐘)實際8分鐘加入該懸漿液。
偶合完成后，通過緩慢加入50％乙醇/水(3.6升/摩爾)，由反應混合物中結晶出產物。等待30分鐘后，于約20℃下，分三部分加入總量為2.85升/摩爾的水，每次加入間隔大約25分鐘。大約17小時后，過濾或離心結晶，用50％乙醇/水、隨后用若干份的乙腈洗滌，然后在20-60℃下真空干燥。收率為90％，純度為99.9％。H-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物14)的制備6.7摩爾規模將在前面步驟中制備的Z-Phe(pF)-Phe-NH2與DMF(3.5升/摩爾)混合，加入Pd/C催化劑(Pd實際含量為5％)(0.2-10％w/w/LEF-582)，在25-30℃、大約3巴H2壓力下氫化得到的混合物0.5小時以上(實際1.3小時)。然后過濾反應混合物，在下一步驟前冷卻至約-15℃。在溶液中的純度為99.6％，原料轉化率大于99％。步驟2(ⅰ)Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物15)的制備5.9摩爾規模將Z-D-Ala-OH(化合物x)(實用1.03當量)溶于乙腈(1.9升/摩爾)中，冷卻，然后加入氯代甲酸異丁酯(0.9-1.2當量)(使用1.07當量)。以上述的制備Z-Phe(pF)-Phe-NH2的類似方式加入N-甲基嗎啉(0.9-2.0當量)(使用1.2當量)。然后在大約15分鐘內(實際8分鐘內)加入H-Phe(pF)-Phe-NH2(25升)溶液，維持溫度在-10℃左右(實際從-8℃到-11℃)。偶合完成后，通過于約20℃溫度下緩慢加入水(4×1.9升/摩爾)，每次加入間隔大約15-30分鐘，使產物從混合物中結晶。然后，過濾或離心結晶，用水/乙腈(4∶1)、隨后用乙腈洗滌，然后任選在20-60℃真空干燥。由Z-Phe(pF)-Phe-NH2計算的收率為93.8％，純度為99.6％。H-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物16)的制備5.5摩爾規模將前面步驟制備的Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2與DMF(2.9升/摩爾)混合，加入Pd/C催化劑(Pd實際含量為5％)(0.2-10％w/w/化合物3)(實際5％)，在25-35℃及大約3巴H2壓力下，將得到的混合物氫化0.5小時以上(實際3小時)。然后過濾反應混合物，在下一步驟前冷卻至約-15℃。純度為99.4％，原料轉化率大于99％。步驟3(ⅰ)Z-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物17)的制備5.5摩爾規模使用與前兩次偶合類似的方法偶合。將Z-Tyr(化合物x)(1.05當量)溶于MeCN(1.9升/摩爾)中，冷卻，加入氯代甲酸異丁酯(0.9-1.2當量)(實際1.05當量)。以上述制備Z-Phe(pF)-Phe-NH2的類似的方式加入N-甲基嗎啉(0.9-2.0當量)(實際1.3當量)。在大約20分鐘(實際6分鐘)內加入從前一步驟得到的H-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2溶液，維持溫度在-10℃左右(實際從-8℃到-9℃)。偶合步驟完成后，通過緩慢加入乙腈和水(3.4升/摩爾MeCN+0.9升/摩爾15％氨水)，放置5分鐘，加入晶種，放置4-24小時，然后分四份加入總量為13.9升/摩爾的水，在每次加入之間放置大約30分鐘或以上，使產物從反應混合物中結晶。過濾或離心，用水洗，然后用MeCN洗滌，任選在20-60℃下真空干燥。由Z-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2的收率為87.7％，純度為95.1％。
經發現，通過加熱反應物到大約60℃并加入氨，使pH為9左右2小時可增加收率及純度。這可以將主要的雜質Z-Tyr(O-(異丁氧基羰基))-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2轉化為產物(ⅱ)H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2(方案2中化合物I)的制備5.4摩爾規模將Z-Tyr-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2與DMF(實際操作2.6升/摩爾)混合，加入5％的Pd/C催化劑(實際含量)(0.2-10％w/w/化合物3)(實際6.4％)，在20-40℃(實際操作20-25℃)和大約3巴H2壓力下，氫化得到的混合物0.5小時以上(實際操作1.8小時)。過濾反應混合物以除去Pd/C，然后通過加入EtOAc直到所有物質結晶(一般為約14升/摩爾)為止，使產物結晶。經過濾或離心分離固體，用EtOAc洗滌，然后在20-50℃下真空干燥。純度為96.7％。原料轉化率大于99％。H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2鹽酸鹽的制備4.6摩爾規模將游離堿H-Tyr-D-Ala-Phe(pF)-Phe-NH2溶解于加有1當量氯化氫的水和丙酮混合液中，過濾(在實際操作中146克/摩爾25％氯化氫/水，2升/丙酮/摩爾)。該鹽幾乎不溶于乙酮中，因此，過濾器用額外量的丙酮/水(95∶5)的混合物(0.5升/摩爾)洗滌一次。通過高速攪拌下，緩慢加入丙酮(3.4升/摩爾)，然后加入大約1％w/w的晶種，誘發結晶。30分鐘后，緩慢加入第一份MIBK(3升/摩爾)，緩慢攪拌下放置直到配料明顯變稠。再分三次加入MIBK(3升/摩爾)，間隔30-60分鐘，同時維持反應器內部溫度在大約20℃左右。然后，經離心或過濾使固體分離，用MIBK洗滌，在20-50℃下真空干燥16小時以上或直到溶劑含量低于規定的技術規范的要求。收率為95.8％，純度為99.8％。后處理沒有達到藥用物質技術要求的產物可通過上述結晶化合物I同樣方法進行重結晶，但不加入氯化氫。H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH2x HCI即化合物I的鹽酸鹽形式的NMR光譜確定36mg所述化合物在大約0.7ml DMSO-d6(99.95％原子-D)中的溶液，在27℃下，在Varian UNITY加400MHz儀上獲得NMR光譜。對于質子光譜化學位移參考標準為2.49ppm的DMSO-d6的多峰的中間峰值。對于碳譜化學位移參考標準為39.5ppm的DMSO-d6的多峰的中間峰值。 在確定中使用的原子編號是任意的，參考上圖質子光譜一維質子光譜用于α位質子(3.9-4.4ppm)、芐基-CH2(2.6-3.1ppm)、酰胺-NH和酚-OH(8.2-8.5ppm)的以組確定(groupwiseassignment)，也用于Ala-CH3(14-CH3)(0.74ppm)專門確定(specificassignment)。
二維DQFCOSY光譜用干對每個氨基酸殘基中自旋糸統(α位、β位和NH質子)以組確定，每個芳環中的芳基質子以組確定。所有Ala殘基中的質子也可專門確定。碳譜一維碳譜用于α位碳、芐基-CH2、羰基和芳基碳的組確定，當然用于C-14的專門確定。APT譜用于對每個碳的CH-峰裂數的確定。由于C-F偶合引起的譜線裂分用于氟代芳環中碳的專門確定。二維異型相關譜二維碳-質子相關譜(HMQC)產生質子化的碳與所有直接連接的質子間的相關性。可以專門確定所有Ala殘基中的質子化碳。
二維碳-質子多鍵相關譜(HMBC)產生碳與相隔2-3個鍵的質子間的相關性。這使得借助α氫和以及借助NH和鄰接氨基酸殘基的羰基(三鍵相關)，以及借助NH和鄰接氨基酸殘基(二鍵相關)確定氨基酸順序。類似，芐基-CH2和芳基碳之間以及芳基質子和芐基-CH2之間的二-和三-鍵相關使得可以專門確定各芳香氨基酸的芳基質子和碳。
用這種方法，可以以確定的方式專門確定所有四種氨基酸殘基中的所有(不能互換的)質子和碳。表1質子確定化學位移(ppm) 積分 峰裂數 確定9.4 1H s 300H8.481H d 9NH8.371H d 1NH8.351H d 8NH8.262H s7.531H s7.282H m 18H,19H7.262H m 21H,22H7.222H m 6H,7H7.181H m 24H7.121H s7.042H m 10H,11H6.982H m 26H,27H6.682H m 28H,29H4.431H m 1H4.391H m 8H4.261H m 9H3.961H m 20H3.39 HDO3.021H m 12Hb2.991H m 2Hb2.872H m 23Ha,23Hb2.851H m 12Ha2.671H m 2Ha0.743H d 14H表2碳確定化學位移(ppm) 峰裂數確定JC-F172.99 s 13171.08 s 5170.81 s 3167.39 s 17162.11 s 15 241Hz159.70 s 15 241Hz156.50 s 30137.98 s 16133.96 s 43.1Hz133.93 s 43.1Hz131.16 d 6.7 8.4Hz131.08 d 6.7 8.4Hz130.46 d 26.27129.26 d 18.19128.09 d 21.22126.30 d 24124.73 s 25115.16 d 28.29114.63 d 10.11 21.3Hz114.41 d 10.11 21.3Hz54.33 d 854.01 d 153.37 d 2047.96 d 937.57 t 1236.83 t 236.17 t 2318.45 q 1權利要求
1．制備式(Ⅰ)四肽H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH2或其藥學上可接受的鹽的方法，包括以下步驟 (ⅰ)一個偶合步驟，其中在標準條件下，一種活化酪氨酸衍生物(Ⅹ)，在溶劑存在下，與三肽衍生物(9)反應，提供保護的四肽衍生物(Ⅺ)，式(Ⅹ)、(9)和(Ⅺ)化合物的結構式如下 其中A是一種氨基保護基團，R是一種活化劑殘基，和R2是H或類似芐基的基團； 其中R1是一種酯或酰胺殘基； 其中A是一種氨基保護基，和R1是一種酯或酰胺殘基；(ⅱ)一個脫保護步驟，其中被保護的四肽衍生物(Ⅻ)，在標準條件下，在溶劑存在下，通過催化氫化作用、堿或酸處理而脫保護，得到(Ⅰ)。
2．根據權利要求1的方法，其特征在于包括如下另外的步驟(ⅰ)一個偶合步驟，其中在標準條件下，一種活化的丙氨酸衍生物(Ⅶ)與二肽衍生物(5)在溶劑的存在下反應，得到被保護的三肽衍生物(Ⅷ)，式(Ⅶ)、(5)和(Ⅷ)化合物的結構式如下 其中A是一種氨基保護基團，和R是一種活化劑的殘基； 其中R1是酯或酰胺殘基； 其中A是一種氨基保護基團，和R1是酯或酰胺殘基；(ⅱ)脫保護步驟，其中在前面步驟中制備的、被保護的三肽衍生物(Ⅷ)在標準的條件下，在溶劑存在下，通過催化氫化作用、堿或酸處理被脫保護，得到三肽衍生物(9) 其中R1是酯或酰胺殘基。
3．權利要求2的方法，其特征在于包括如下另外的步驟(ⅰ)一個偶合步驟，其中在標準的條件下，在溶劑的存在下，活化的p-氟苯丙氨酸衍生物(Ⅲ)與苯丙氨酸的氨基反應，其中羧基作為酯或酰胺被保護，得到被保護的二肽衍生物(Ⅳ)，式(Ⅲ)和(Ⅳ)化合物的結構式如下 其中A是氨基保護基團，和R是活化劑殘基； 其中A是氨基保護基團，和R1是酯或酰胺殘基；(ⅱ)一個脫保護步驟，其中在以上步驟中制備的被保護的二肽衍生物(Ⅳ)，在標準的條件下，在溶劑的存在下，通過催化氫化作用、堿或酸處理被脫保護，得到二肽衍生物(5) 其中R1是酯或酰胺殘基。
4．根據權利權求1-3的方法，其特征在于所述偶合步驟(ⅰ)之一后跟著任選的轉化步驟，如果所述氨基酸衍生物的羧基作為酯衍生物被保護，其中酯化合物在有機乙醇中與氨反應進行。
5．根據權利權求1-3的方法，其特征在于在至少一個偶合步驟中使用的活化氨基酸衍生物選自碳二亞胺、活化酯、疊氮化物或酸酐。
6．根據權利要求5的方法，其中所述活化劑是氯代甲酸異丁酯。
7．根據權利要求1-6中任何一項的方法，其特征在于用于至少一個偶合步驟中的溶劑是丙酮、乙腈、NMP、DMP或EtOAc。
8．根據權利要求1-3的方法，其中在偶合步驟中的溶劑是DMF。
9．根據權利要求1-3中任何一項的方法，其特征在于所述脫保護步驟使用披鈀木炭進行。
10．根據權利要求1-9中任何一項的方法，其特征在于至少一個反應是在0℃到-20℃的溫度下進行。
11．根據權利要求10的方法，其中所述溫度為從-5℃到-15℃。
12．根據權利要求1的方法制備的式Ⅰ肽
13．根據權利要求12的肽，為鹽酸鹽的形式。
14．式(9)的肽衍生物 其中R1是一種酯或酰胺殘基。
全文摘要
本發明公開了一種新的和改進的制備四肽H－Tyr－D－Ala－Phe(F)－Phe－NH
文檔編號C07K5/107GK1300293SQ9980607
公開日2001年6月20日 申請日期1999年3月16日 優先權日1998年3月16日
發明者H·弗蘭岑 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司