蛋白質酪氨酸磷酸酶的調節物的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：3551448閱讀：2350來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：蛋白質酪氨酸磷酸酶的調節物的制作方法
            
技術領域：
            本發明提供涉及新的化合物，新的組合物，它們的應用方法，和它們的鑒定方法，其中這類化合物是蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP酶，PTP)如PTP1B、TC-PTP、CD45、SHP-1、SHP-2、PTPα、PTPε、PTPμ、PTPδ、PTPσ、PTPζ、PTPβ、PTPD1、PTPD2、PTPH1、PTP-MEG1、PTP-LAR和HePTP或磷酸酪氨酸單位之配體的藥理學有效抑制物。這些化合物顯示能控制或治療多種疾病如自身免疫病、急性和慢性炎癥、骨質疏松癥、各種類型的癌癥和惡性腫瘤疾病、以及Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。
            
背景技術：
            根據對蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP酶)如以下非限制性實例PTPα、LAR、TC-PTP、SHP-1、SHP-2、PTPβ、CD45、TPT1B、HePTP的體內活性的確定，已發現它們的單一活性在代謝、生長、增殖和分化所涉及的基本的細胞信號傳導機制的細胞內調變及調節中起主要作用(Flint et al.,The EMBO J.121937-46,1993；Fischer et al,Science 253401-6,1991)。酪氨酸磷酸酶的過度表達或變更的活性也是引起各種疾病的癥狀和進展的原因(Wiener,et al.,J.Natl.cancer Inst.86372-8,1994；Hunter and Cooper,Ann.Rev.Biochem,54897-930,1985)。此外，有越來越多的證據提示，對這些PTP酶的抑制可能有助于治療某些類型的疾病如糖尿病、自身免疫病、急性和慢性炎癥以及各種類型的癌癥。
            
現已公認蛋白質磷酸化是細胞用于在細胞功能的不同階段傳導信號的一種重要機制(Fischer et al,Science 253401-6(1991)；Flint et al.,The EMBOJ.121937-46(1993))。至少有兩類主要的磷酸酶(1)使在絲氨酸或蘇氨酸部分包含磷酸基團的蛋白質(或肽)去磷酸化的磷酸酶(稱為Ser/Thr磷酸酶)和(2)使酪氨酸除去磷酸基團的磷酸酶(稱為蛋白質酪氨酸磷酸酶或PTP酶)。
            
PTP酶是可以分為以下兩組的一個酶家族1)細胞內或非跨膜的PTP酶和2)受體類型的或跨膜的PTP酶。
            
細胞內的PTP酶大多數已知的細胞內PTP酶包含一個由220-240個氨基酸殘基組成的單一保守性催化的磷酸酶結構域。據信該PTP酶結構域以外的區對于PTP酶在細胞內的進一步定位具有重要作用(Mauro,L.J.andDixon,J.E.TIBS 19151-155(1994))。第一個純化并得到鑒定的細胞內PTP酶是PTP1B，它分離自人的胎盤(Tonks et al.,J.Biol.Chem.2636722-6730(1989))。不久，克隆出PTP1B(Charbonneau et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865252-5256(1989)；Chemoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA872735-2789(1989))。細胞內PTP酶其它的實例包括(1)T細胞PTP酶(Cool et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865257-5261(1989))，(2)大鼠腦PTP酶(Guan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871501-1502(1990)),(3)神經元磷酸酶STEP(Lombrosoet al.,Proe.Natl.Acad.Sci.USA 887242-7246(1991))，(4)含埃茲蛋白結構域的PTP酶PTPMEG1(Guet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885867-5871(1991))，PTPH1(Yang and Tonks,Proc.Natl.Acad.Sci.USA885949-5953(1991)),PTPD1和PTPD2(Moller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA917477-7481(1994)),FAP-1/BAS(Sato et al.,Science 268411-415(1995)；Banville et al.,J.Biol.Chem.26922320-22327(1994)；Maekawa et al.,FEBSletters 337200-206(1994))，以及含SH2結構域的PTP酶PTP1C/SH-PTP1/SHP-1(Plutzky et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA891123-1127(1992)；Shen et al.,Nature Lond.352736-739(1991))和PTP1D/Syp/SH-PTP2/SHP-2(Vogel et al.,Science 2591611-1614(1993)；Feng et al,Science 2591607-1611(1993)；Bastein et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.196124-133(1993))。
            
低分子量的磷酸酪氨酸蛋白質磷酸酶(LMW-PTPase)與上述細胞內PTP酶的序列同一性很小。但由于以下特點,該酶屬于PTP酶家族(Ⅰ)它擁有PTP酶的活性位點基元Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Arg(Cirri et al.,Eur.J.Biochem.214647-657(1993))；(ⅱ)該Cys殘基在條件類似于“經典”PTP酶催化的反應中形成磷酸中間體(Cirri et a1.,出處同上；Chiarugi et al.,FEBS lett.3109-12(1992))；(ⅲ)這一分子的完全折疊顯示與PTP1B以及耶爾森菌屬的PTP的完全折疊具有令人驚訝的相似程度(Su et al.,Nature 370575-578(1994))。
            
受體型PTP酶由(a)一假定的結合配體的細胞外結構域、(b)一跨膜片段、以及(c)一細胞內催化區組成。受體型PTP酶的假定結合配體的細胞外結構域的結構和大小差異很大。對比之下，受體型PTP酶的細胞內催化區在受體型PTP酶相互間以及與細胞內PTP酶之間均具有很高的同源性。大多數受體型PTP酶均有兩個串聯重復的PTP酶催化結構域。
            
首先得到鑒定的受體型PTP酶是(1)CD45/LCA(Ralph,S.J.,EMBO J.61251-1257(1987))和(2)LAR(Streuli et al.,J.Exp.Med.1681523-1530(1988))，根據它們與PTP1B的同源性將它們歸于這一酶類(Charbonneauet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865252-5256(1989))。CD45是高分子量糖蛋白家族，而且是白細胞表面最豐富的糖蛋白之一，傾向于只在造血系統的細胞上表達(Trowbridge and Thomas,Ann.Rev.Immunol.1285-116(1994))。
            
CD45和LAR被鑒定為PTP酶家族的成員后不久，又鑒定和克隆出數個不同的受體型PTP酶的成員。故，在一項早期研究中鑒定了5種不同的PTP酶(3)PTPα、(4)PTPβ、(5)PTPδ、(6)PTPε、和(7)PTPζ(Krueger et al.,EMBO J.93241-3252(1990))。受體型PTP酶的其它實例包括(8)PTPγ(Barneaet al.,Mol.Cell.Biol.131497-1506(1995))，它與PTPζ(Krueger and Saito,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897417-7421(1992))一樣在胞外區中含有一碳酸酐酶樣結構域,(9)PTPμ(Gebbink et al.,FEBS Letters 290123-130(1991)),(10)PTPK(Jiang et al.,Mo1.Cell.Biol.132942-2951(1993))。根據結構差異，受體型PTP酶可進一步分為亞型(Fischer et a1.,Science 253401-406(1991))(Ⅰ)CD45；(Ⅱ)LAR,PTPδ,(11)PTPσ；(Ⅲ)PTPβ,(12)SAP-1(Matozaki etal.,J.Biol.Chem.2692075-2081(1994)),(13)PTP-U2/GLEPP1(Seimiya et al.,Oncogene 101731-1738(1995)；Thomas et al.,J.Biol.Chem.26919953-19962(1994)),和(14)DEP-1；(Ⅳ)PTPα,_PTPε。除了Ⅲ型以外，所有受體型PTP酶均含有兩個PTP酶結構域。陸續有新的PTP酶得到鑒定，預計人類基因組中可找到的超過500種不同的PTP酶，即與所預計的蛋白質酪氨酸激酶超家族的大小接近(Hanks and Hunter,FASEB J.9576-596(1995))。
            
PTP酶是蛋白質酪氨酸激酶(PTK)的生物配對物。因此，PTP酶的重要功能之一是控制并下調PTK的活性。然而，PTP酶現已顯示出更復雜的功能。幾項研究表明，某些PTP酶實際上可作為細胞信號傳導的正調節介質。如，含有SH2結構域的SHP-2似乎作為胰島素刺激的Ras活化過程(Nogucheet al.,Mol.Cell.Biol.146674-6682(1994))和生長因子誘導的有絲分裂信號傳導過程(Xiao et al.,J.Biol.Chem.26921244-21248(1994))的正調節介質，而同源的SHP-1似乎作為生長因子刺激的增殖過程的負調節物(Bignon andSiminovitch,Clin.Immunol.Immunopathol.73168-179(1994))。在為確定酪氨酸激酶之Src家族的活化過程而設計的研究中提出了PTP酶作為正調節物的另一實例。具體是，多組證據表明，CD45對造血細胞具有正調節作用，可能是通過使Fyn和Lck的C末端酪氨酸去磷酸化而實現(Chan et al.,Annu.Rev.Immunol.12555-592(1994))。
            
雙特異性蛋白質酪氨酸磷酸酶(dsPTPase)定義了PTP酶家族內的一個亞類，其既可以從磷酸酪氨酸又可以從磷酸-絲氨酸/蘇氨酸水解磷酸基團。dsPTPase含有PTP酶的信號序列Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Arg。至少有三種dsPTPase已顯示能使細胞外信號調節的激酶(ERK)/有絲分裂原活化的蛋白質激酶(MAPK)去磷酸化并失活MAPK磷酸酶(CL100,3CH134)(Charles et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905292-5296(1993))；PAC-1(Ward et al.,Nature 367651-654(1994))；rVH6(Mourey et al.,J.Biol.Chem.2713795-3802(1996))。dsPTPase的轉錄受不同刺激如氧化應激或熱休克的誘導(Ishibashi et al.,J.Biol.Chem.26929897-29902(1994)；Keyse andEmslie,Nature 359644-647(1992))。此外，它們可能參與對細胞周期的調節cdc25(Millar and Russell,Cell 68407-410(1992))；KAP(Hannon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91173l-1735(1994))。有趣的是，對酵母有絲分裂的誘導需要由雙特異性磷酸酶cdc25對cdc2的酪氨酸去磷酸化作用(綜述見Walton and Dixon,Annu.Rev.Biochem.62.101-120(1993))。
            
PTP酶最初是用各種人工底物從細胞和組織的裂解物中鑒定并純化的，因此對它們天然的去磷酸化功能未能得到公認。由于酪氨酸激酶的酪氨酸去磷酸化作用通常與細胞增殖、細胞轉化以及細胞分化相關，故認為PTP酶也與這些事件相關。這一相關性如今已在多種PTP酶參與的事件中得到證實。PTP1B，一種其結構最近才得到闡明的磷酸酶(Barford et al.,Science2631397-1404(1994))已顯示與胰島素誘導的卵母細胞成熟相關(Flint et al.,TheEMBO J.121937-46(1993))，最近有人提出，該酶的過度表達與p185c-erbB2相關的乳腺癌和卵巢癌有關(Wiener,et al.，J.Natl.Cancer Inst.86372-8(1994)；Weiner et al.,Am.J.Obstet.Gynecol.1701177-883(1994))。胰島素誘導的卵母細胞成熟機制與PTP1B對S6激酶活化的封閉能力有關。與癌癥的相關性是最近得到的證據，它們提示PTP1B的過度表達與卵巢癌和乳腺癌中p185c-erb B2水平提高具有統計學相關性。PTP1B在病因學和疾病進展中的作用尚不清楚。PTP1B抑制物可能因此而有助于說明PTP1B在癌癥及針對特定類型的癌癥采取了治療措施的某些病例中的作用。
            
另外的多種新近討論的磷酸酶目前正對它們的活性進行研究。其中兩個SHP-1和Syp/PTP1D/SHPTP2C/SHP-2最近證實參與了對血小板衍生的生長因子及上皮生長因子誘導的應答的活化作用(Li et al.,Mole.Cell.Biol.14509-17(1994))。由于這兩種生長因子均涉及正常細胞加工以及諸如癌癥和動脈硬化這樣的疾病狀態，故有假說稱，這些磷酸酶的抑制物還將顯示具有治療效力。因此，本發明的顯示對各種PTP酶具有抑制活性的化合物顯示能治療或監控上述疾病。
            
PTP酶胰島素受體信號傳導途徑/糖尿病胰島素是不同代謝過程的重要調節物，并在血糖的控制中起關鍵作用。與其合成或信號傳導有關的缺陷導致糖尿病。胰島素與其受體的結合使B亞單位的細胞內部分中的數個酪氨酸殘基快速(自動)磷酸化。必須使三個空間位置上接近的酪氨酸殘基(酪氨酸-1150結構域)全部磷酸化，以使通過其它細胞底物，包括胰島素受體底物-1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化而進一步將信號向下游傳遞的胰島素受體酪氨酸激酶(IRTK)獲得全部活性(Wilden et al.,J.Biol.Chem.26716660-16668(1992)；Myers and White,Diabetes 42643-650(1993)；Lee and Pilch,Am.J.Physiol.266C319-C334(1994)；White et al.,J.Biol.Chem.2632969-2980(1988))。對IRTK的最新X射線晶體成像研究提供了針對酪氨酸三聯體的功能的結構基礎，該研究顯示酪氨酸-1150可在其非磷酸化狀態下具有自我抑制能力(Hubbard et al.,Nature 372746-754(1994))。
            
幾項研究清楚地表明，自我磷酸化的IRTK的活性可通過體外去磷酸化作用逆轉(綜述見Goldstein,Receptor 31-15(1993)；Mooney and Anderson,J.Biol.Chem.2646850-6857(1989)),其中三磷酸化的酪氨酸-1150結構域與二磷酸化和單磷酸化形式相比是蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP酶)最敏感的靶(Kinget al.,Biochem.J.275413-418(1991))。因而有人推測該酪氨酸三聯體可作為IRTK活性的一個控制開關。事實上，IRTK傾向于由PTP介導的體內去磷酸化嚴密調節(Khan et al.,J.Biol.Chem.26412931-12940(1989)；Faure et al.,J.Biol.Chem.26711215-11221(1992)；Rothenberg et al.,J.Biol.Cehm.2668302-8311(1991))。PTP酶與胰島素信號傳導途徑的緊密聯系可進一步由以下研究結果證實胰島素對大鼠肝癌細胞中的PTP酶活性(Meyerovitch etal.,Biochemistry 3110338-10344(1992))和四氧嘧啶糖尿病大鼠肝臟中的PTP酶活性(Boylan et al.,J.Clin.Invest.90174-179(1992))進行不同的調節。
            
對涉及IRTK調節的PTP酶的特性相對知之甚少。但可如上述證實具有針對胰島素受體之活性的PTP酶的存在。而且，將PTP酶的強效抑制物過釩酸鹽(pervanadate)加入完整細胞中時，可在脂肪細胞(Fantus et al.,Biochemistry 288864-887l(1989)；Eriksson et al.,Diabetologia 39235-242(1995))和骨骼肌(Leighton et al.,Biochem.J.276289-292(1991))中產生幾乎完整的胰島素應答。此外，近期研究顯示，一類新的過釩化合物是有效的體內降血糖化合物(Posner et al.,出處同上)。這些化合物中有兩個已證實對胰島素受體之去磷酸化作用的抑制比對EGF受體的更有效。
            
最近還發現，廣泛表達的含SH2結構域之PTP酶，SHP-2(Vogel et al.,1993,出處同上)與IRS-1相關并使IRS-1去磷酸化，但顯然對IR本身沒有這些效應(Kuhne et al.,J.Biol.Chem.26811479-11481(1993)；Kuhne et al.,J.Biol.Chem.26915833-15837(1994))。此前的研究提示,負責IRTK調節的PTP酶屬于膜相關分子(Faure et al.,J.Biol.Chem.26711215-11221(1992))和糖基化的分子(Haring et al.,Biochemistry 233298-3306(1984)；Sale,Adv.Prot.Phosphatases 6159-186(1991))。Hashimoto等人提出LAR可能在完整細胞中胰島素受體的生理調節過程中起作用(Hashimoto et al.,J.Biol.Chem.26713811-13814(1992))。他們比較了用重組PTP1B以及LAR和PTPα的胞漿區使純化的IR去磷酸化/失活的速率，從而得出了以上結論。近來在LAR對大鼠肝癌細胞系中胰島素信號傳導的影響的研究中還用到反義抑制作用(Kulas et al.,J.Biol.Chem.2702435-2438(1995))。對LAR蛋白質水平的約60％抑制伴有胰島素誘導之自我磷酸化的近150％的增長。但所觀察到的IRTK活性的增長只有35％，而胰島素依賴型磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶)活性則顯著增長達350％。LAR水平的降低并未改變IRTK酪氨酸磷酸化作用或活性的基礎水平。作者們推測，LAR能使對PI3激酶活化十分關鍵的，位于胰島素受體上或某個下游底物上的酪氨酸殘基特異性去磷酸化。
            
盡管此前的報道指出了PTPα在通過src活化作用(Zheng et al.,Nature359336-339(1992)；den Hertog et al.,EMBO J.123789-3798(1993))和與GRB-2的相互作用(den Hertog et al.,EMBO J.133020-3032(1994)；Su et al.,J.Biol.Chem.26918731-18734(1994))而傳遞信號的過程中具有一定作用。一項近期研究提出了這一磷酸酶的功能以及它作為胰島素受體信號傳遞的負調節物與PTPε的密切相關性(Moller et al.,1995，出處同上)。該研究還指出，受體樣PTP酶在IRTK的調節中具有顯著作用，而細胞內PTP酶似乎對胰島素受體的活性即使有也很小。盡管表面看來PTP酶α和ε的負調節活性是針對受體自身，細胞內TC-PTP的下調效應似乎歸因于在IR活化的信號傳遞中的下調功能。雖然PTP1B與TC-PTP密切相關，但PTP1B對胰島素處理的細胞的磷酸化模式只有很小的影響。這兩種PTP酶之間，決定它們的亞細胞定位以及由此導致的它們進入特定細胞底物的結構特征互不相同(Frangione et al.,Cell 68545-560(1992)；Faure and Posner,Glia 9311-314(1993))。因此，PTP1B和TC-PTP對IRTK缺乏活性可以至少部分用以下事實解釋它們與活化的胰島素受體不在同一部位。為支持這一觀點，PTP1B和TC-PTP已根據亞細胞定位研究而排除在肝細胞中IR相關的PTP酶的候選之外(Faure et al.,J.Biol.Chem.26711215-11221(1992))。
            
在一項近期研究中發現，被認為是造血細胞特異性的跨膜PTP酶CD45可負調節人多發性骨髓瘤細胞系U266中的胰島素受體酪氨酸激酶(Kulas etal.,J.Biol.Chem.271755-760(1996))。
            
基因敲除(K.O.)小鼠對于闡明多種疾病中特定基因的重要性具有重要意義。根據上述結果可預期，具體的LAR K.O.小鼠、PTPα K.O.小鼠和PTPlBK.O.小鼠可分別提供與胰島素信號傳遞有關的重要信息。已有兩個工作小組培養成功LAR K.O.小鼠(Schaapveld et al.,Developmental Biology 188134-146(1997)；Skames et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.926592-6596(1995))。Goldstein及其同事分析了Skames等人(出處同上)的LAR K.O.小鼠，并聲稱這些小鼠表現出深度的葡萄糖自身穩定的缺陷(Ren et al.,Diabetes47493-497(1998))。但該研究中的對照小鼠與K.O.小鼠的遺傳背景不同。其它應用Schaapveld等人(出處同上)的LAR K.O.小鼠的研究未能證實Pen等人(出處同上)得到的結果(A.R.Sorensen et al.,Diabetologia 40(suppl 1)556-556(1997))。
            
在最近的一次全面研究中，比較了PTP1B K.O.小鼠(即PTP1B-/-小鼠)與具有相同遺傳背景的+/+和+/-小鼠(Elchebly et al.,Science 2831544-1548(1999))。在這后一項研究中(Elchebly等人，出處同上)，發現編碼PTP1B的基因被破壞產生了正常小鼠，即在喂食期，與它們的同窩出生的PTP1B+/+幼鼠相比，血糖水平略低、胰島素濃度約為其1/2。此外，胰島素和葡萄糖耐量檢驗均顯示胰島素的敏感性在PTP K.O.小鼠中增強。在高脂飲食中，PTP1B-/-和PTP1B-/+小鼠體重不增加且維持對胰島素的敏感性-相對于體重快速增長且變為胰島素抗性的PTP1B+/+小鼠而言。對胰島素受體及胰島素受體底物-1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化水平進行分析顯示，PTP1B-/-小鼠體內(肝臟和肌肉)這些蛋白質的磷酸化作用比PTP1B+/+小鼠的增加。所有這些發現均與以下看法一致PTP1B可能作為胰島素受體信號傳遞途徑的負調節物而發揮主要作用-而與上述體外研究大不相同。作者們得出結論“這些結果說明PTP1B是治療2型糖尿病和肥胖癥的有效治療靶”(Elcheby et al.,出處同上)。
            
PTP酶生長激素抑制因子生長激素抑制因子抑制數種包括細胞增殖在內的生物功能(Lamberts etal.,Molec.Endocrinol.81289-1297(1994))。生長激素抑制因子的一部分抗增殖活性次于對激素和生長因子(如生長激素和表皮生長因子)分泌的抑制作用，而生長激素抑制因子的其它抗增殖效應可歸因于對靶細胞的直接效應。如生長激素抑制因子的類似物可能通過對單一的PTP酶、或PTP酶的亞單位進行刺激，而不是對細胞內PTP酶總體水平的活化，抑制胰腺癌生長(LieboWet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862003-2007(1989)；Colas et al.,Eur.J.Biochem.2071017-1024(1992))。最近一項研究發現，生長激素抑制因子對于在CHO-K1細胞中穩定表達的生長激素抑制因子受體SSTR1，而非SSTR2的刺激作用能刺激PTP酶活性，而且該刺激作用對百日咳毒素敏感。生長激素抑制因子對激素和生長因子分泌的抑制效應是否因對激素生成細胞中PTP酶活性的類似刺激所造成還有待確定。
            
PTP酶免疫系統/自身免疫幾項研究提出，受體型PTP酶CD45不僅在引發T細胞的活化時起關鍵作用，而且在維持T細胞受體介導的信號傳遞級聯反應時也起關鍵作用。這些研究均綜述于(Weiss A.,Ann.Rev.Genet.25487-510(1991)；Chan et al.,Annu.Rev.Immunol.12555-592(1994)；Trowbridge and Thomas,Annu.Rev.Immunol.1285-116(1994))。CD45是細胞表面最豐富的糖蛋白之一，而且只在造血細胞上表達。在T細胞中，已顯示CD45是淋巴細胞信號傳遞的關鍵成分之一。具體地，已有證據提出，抗原與T淋巴細胞受體結合后，在T細胞受抗原刺激而增殖時，CD45磷酸酶起關鍵的作用(Trowbridge,Ann.Rev.Immunol,1285-116(1994))。幾項研究提出，CD45的PTP酶活性在Lck，一個Src家族的蛋白質酪氨酸激酶淋巴細胞特異性成員的活化中起作用(Mustelin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866302-6306(1989)；Ostergaardetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868959-8963(1989))。這些作者們假設，CD45磷酸酶的活性通過使一個C末端酪氨酸殘基去磷酸化而活化Lck，這可能也與T細胞活化有關。最近一項研究發現，重組p56lck與重組CD45胞漿區蛋白質特異性相關，但不與有關的PTPα的胞漿區相關(Nget al.,J.Biol.Chem.2711295-1300(1996))。p56lck與CD45的相互作用似乎可通過非常規SH2結構域而無需磷酸酪氨酸的相互作用而介導。在未成熟的B細胞中，Src家族的蛋白質酪氨酸激酶另一成員Fyn與Lck和Syk相比，似乎更是CD45的選擇性底物(Katagiri et al.,J.Biol.Chem.27027987-27990(1995))。
            
用帶有CD45外顯子6的一個突變的轉基因小鼠進行的研究顯示成熟T細胞的缺乏。這些小鼠對抗原攻擊不產生典型的T細胞介導的應答(Kishiharaet al.,Cen 74143-56(1993))。因此CD45磷酸酶的抑制物可能是相關于自身免疫病的病癥的有效治療藥物。
            
CD45還顯示是抗體介導的肥大細胞脫顆粒所必不可少的(Berger et al.,J.Exp.Med.180471-6(1994))。這些研究還用CD45缺陷性小鼠進行。在這一例中，證實小鼠體內野生型T細胞有IgE介導的脫顆粒，而CD45缺陷型T細胞沒有。這些資料提示，CD45抑制物也能在過敏性疾病的癥狀處理或治療中起作用。
            
另一近期發現的PTP酶，一種可誘導的淋巴特異性蛋白質酪氨酸磷酸酶(HePTP)也參與了免疫應答。該磷酸酶在靜息的T淋巴細胞和B淋巴細胞中均有表達，但在非造血細胞中不表達。通過刺激這些細胞，使HePTP基因的mRNA水平提高了10-15倍(Zanke et al.,Eur.J.Immunol.22235-239(1992))。在T細胞和B細胞中，HePTP可能在持續刺激下起作用，通過使特定殘基去磷酸化而調節免疫應答。但它的真正作用仍待確定。
            
同樣，造血細胞特異性SHP-1似乎在造血細胞的發育中作為負調節物并起必不可少的作用。因此，SHP-1在紅細胞生成素信號傳遞途徑的調節中起著顯著作用，這種調節在缺乏完整SHP-1的小鼠體內得到加強(Schultz et al.Cell 731445-1454)。根據CD45、HePTP和SHP-1的上述重要功能，PTP酶的選擇性抑制物可能是，能作為免疫抑制劑和免疫刺激物，也能作為造血系統的抑制物和刺激物的很有吸引力的候選藥物。一項最新研究通過證實基于釩的PTP酶抑制物BMLOV誘導表觀B細胞相對于T細胞選擇性凋亡的能力，而闡明了PTP酶抑制物作為免疫調節物的潛力(Schieven et al.,J.Biol.Chem.27020824-20831(1995))。
            
PTP酶細胞與細胞間的相互作用/癌癥當成纖維細胞于適當的基質上生長時形成特異性接觸點，這種體外現象稱為粘著斑空斑，它們似乎至少部分模仿了細胞以及它們的天然環境。當成纖維細胞粘附于細胞外基質并在其上展開生長時，數種粘著斑蛋白質均在酪氨酸殘基上磷酸化(Gumbiner,Neuron 11,551-564(1993))。然而，這些蛋白質的異常酪氨酸磷酸化可導致細胞轉化。PTP酶與粘著斑之間的緊密聯系可通過數種帶有埃茲蛋白樣N末端結構域的細胞內PTP酶的發現證實，這樣的酶如PTPMEG1(Gu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885867-5871(1991))、PTPH1(Yang and Tonks,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885949-5953(1991))和PTPD1(Moller et a1.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 917477-7481(1994))。該埃茲蛋白樣結構域顯示與被認為能起細胞膜與細胞骨架之間的連接作用的數種蛋白質具有相似性。有發現稱PTPD1在體外被c-src磷酸化并與c-src相關，并假設PTPD1參與了對粘著斑磷酸化的調節(Moller et al.,出處同上)。
            
PTP酶可能與酪氨酸激酶，包括負責粘著斑蛋白質磷酸化的那些酪氨酸激酶的作用相反，并可能因此而具有轉化的天然抑制物的功能。TC-PTP以及特別是此酶的截短形式(Cool et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 877280-7284(1990))能抑制v-erb和v-fms的轉化活性(Lammers et al.,J.Biol.Chem.26822456-22462(1993)；Zander et al.,Oncogene 81175-1182(1993))。此外，還發現HER2/neu基因的癌基因形式所引起的轉化在過度表達PTP1B的NIH3T3成纖維細胞中受到抑制(Brown-Shimer et al.,Cancer Res.52478-482(1992))。
            
有發現稱PTP1B的表達水平在neu所轉化的哺乳動物細胞系中增加(Zhay et al.,Cancer Res.532272-2278(1993))。在癌癥進展中酪氨酸激酶與PTP酶之間的緊密聯系可進一步由以下最新發現證明發現PTPε在過度表達c-neu和v-Ha-ras而非c-myc或int-2的轉基因小鼠體內的鼠乳腺腫瘤中高度表達(Elson and Leder.J.Bio1.Chem.27026116-26122(1995))。此外，編碼PTPg的人類基因定位于3p21，這一染色體區在腎臟及肺部的癌癥中經常缺失(LaForgia et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885036-5040(1991))。
            
在本文中，似乎較顯著的是，PTP酶看來涉及對成纖維細胞生長的控制。在一近期研究中發現，高密度收獲的Swiss 3T3細胞含有膜相關PTP酶，其平均酶活性為低密度或中密度收獲的細胞的8倍以上(Pallen and Tong,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 886996-7000(1991))。作者們假設，對細胞生長的密度依賴性抑制與所討論的PTP酶活性的調節上升有關。根據這一觀點，一種新的膜結合、受體型PTP酶DEP-1顯示，在增加WI-38人胚肺成纖維細胞的細胞密度時以及在AG1518成纖維細胞系中，表達水平提高(≥10倍)(Ostmanet al.,Proe.Natl.Acad.Sci.USA 919680-9684(1994))。
            
兩種十分相似的受體型PTP酶，PTPκ和PTPμ，當在非粘附昆蟲細胞中表達時能介導同種細胞間的相互作用，說明這些PTP酶可能在細胞至細胞的信號傳遞過程中具有正常生理功能(Gebbind et al.,J.Biol.Chem.26816101-16104(1993)；Brady-Kalnay et al.,J.Cell.Biol.122961-972(1993)；Sap et al.,Mol.Cell.Biol.141-9(1994))。有趣的是，盡管PTPκ和PTPμ的結構相似，但它們并無相互作用(Zondag et al.,J.Biol.Chem.27014247-14250(1995))。從上述研究中可明顯看出，PTP酶有可能在對正常細胞生長的調節中具有重要作用。但正如以上所指出，近期研究表明，PTP酶也可作為細胞內信號傳遞的正調節物并因此誘導或增強對有絲分裂原的應答。某些PTP酶的增強的活性可能因此導致細胞轉化和腫瘤形成。事實上，在一項研究中發現PTPα的過度表達導至大鼠胚胎成纖維細胞的轉化(Zheng，出處同上)。另外，已發現一種新的PTP,SAP-1，在胰腺癌和結直腸癌細胞中高度表達。SAP-1定位于染色體19區q13.4并可能與定位于19q13.2的癌胚抗原相關(Uchida et al.,J.Biol.Chem.26912220-12228(1994))。此外，cdc25這種dsPTPase使cdc2在Thr14/Tyr-15處去磷酸化，并因此可作為有絲分裂的正調節物而起作用(綜述見Hunter,Cell 80225-236(1995))。特定PTP酶的抑制物因此而可能在某些形式的癌癥的治療中具有顯著的治療價值。
            
PTP酶血小板凝集近期研究顯示，PTP酶主要涉及血小板凝集。激動劑誘導的血小板活化導致鈣激活中性蛋白酶催化的PTP1B裂解，并伴有對PTP酶活性的2倍刺激(Erangioni et al.,EMBO J.124843-4856(1993))。PTP1B的裂解導致此酶在細胞中重新定位，并與富含血小板的血漿中血小板凝集由可逆到不可逆的轉變有關。此外，發現含SH2結構域的PTP酶，SHP-1/SH-PTP1在血小板中受到凝血酶以凝集依賴性方式刺激后轉位至細胞骨架(Li et al.,FEBS Lett.34389-93(1994))。
            
盡管上述兩項研究中的某些細節最近受到質疑，但基本公認的是，PTP1B和SHP-1在血小板凝集中起顯著作用(Ezumi et al.,J.Biol.Chem.27011927-11934(1995))。根據這些發現，用PTP酶抑制物過釩酸鹽處理血小板導致酪氨酸磷酸化、分泌以及凝集的顯著增加(Pumiglia et al.,Biochem.J.286441-449(1992))。
            
PTP酶骨質疏松癥骨質形成速率由成骨細胞的數量和活性決定，而成骨細胞的數量和活性又分別由成骨細胞始祖細胞的增殖和分化速率決定。組織形態學研究顯示，成骨細胞的數量是人體內骨質形成速率的主要決定因素(Gruber et al.,Mineral Electrolyte Metab.12246-254(1987)；綜述見Lau et al.,Biochem.J.25723-36(1989))。酸性磷酸酶/PTP酶可能參與對成骨細胞增殖的負調節。因此，已發現具有磷酸酶抑制活性的氟化物可通過增加成骨細胞的增殖而提高骨質疏松癥的脊椎骨密度(Lauet al.，出處同上)。與該發現一致的另一發現是，一種具有PTP酶活性的成骨細胞酸性磷酸酶對可導致有絲分裂的氟化物濃度高度敏感(Lauet al.,J.Biol.Chem.2604653-4660(1985)；Lau et al.,J.Biol.Chem.2621389-1397(1987)；Lau et al.,Adv.Protein Phosphatases 4165-198(1987))。有趣的是，最近發現，將成骨細胞樣細胞系UMR 106.06于Ⅰ型膠原蛋白基質上培養時，比在未包被的組織培養平板上培養，其膜結合PTP酶活性的水平戲劇性地增加。由于在密度依賴性生長所收獲的成纖維細胞中發現PTP酶活性顯著增加(Pallen and Tong,Proc.Natl.Acad.Sci.886996-7000(1991))，可推測所增加的PTP酶活性直接抑制細胞生長。氟化物及其它磷酸酶抑制物(鉬酸鹽和釩酸鹽)的致有絲分裂作用可能因此而用它們對能負調節成骨細胞增殖的酸性磷酸酶/PTP酶的抑制來進行解釋。骨質形成中PTP酶的參與的復雜特性可通過最近對一種新的表達在骨和睪丸中的、甲狀旁腺調節的、受體樣PTP酶，OST-PTP的鑒定而進一步提示(Mauro et a1.,J.Biol.Chem.26930659-30667(1994))。OST-PTP在初級成骨細胞分化并形成基質后上調，然后在培養中主動礦化骨的成骨細胞中下調。可假設，PTP酶抑制物可能通過抑制OST-PTP或其它PTP酶而阻止分化并因此導致持續增殖。這一觀點與上述氟化物的效應以及關于酪氨酸磷酸酶抑制物正釩酸鹽似乎能增強成骨細胞之增殖和基質形成的發現相符合(Lauet al.,Endocrinology 1162463-2468(1988))。此外，近來發現，釩酸鹽、氧釩基以及過釩酸鹽都能增加成骨細胞樣細胞系UMR106的生長。氧釩基和過釩酸鹽比釩酸鹽對細胞生長的刺激更強。經測定細胞堿性磷酸酶活性發現，只有釩酸鹽能調節細胞分化(Cortizo et al.,Mol.Cell.Biochem.14597-102(1995))。
            
PTP酶微生物Dixon及其同事已注意到，PTP酶可能是耶爾森菌致病特性的關鍵因素(綜述見Clemens et al.Molecular Microbiology 52617-2620(1991))。由于一直認為細菌中缺乏酪氨酸磷酸酶，因而這一發現尤其令人吃驚。耶爾森菌屬包括3個種鼠疫耶爾森菌(引起腺鼠疫)、假結核耶爾森菌鼠疫亞種以及小腸結腸炎耶爾森菌(引起腸炎和腸系膜淋巴結炎)。有趣的是，已在牛痘病毒中鑒定出VH1這種雙特異性磷酸酶(Guan et al.,Nature 350359-263(1991))。這些發現說明，PTP酶可能在微生物以及寄生蟲感染中起關鍵作用，它們還說明PTP酶抑制物可作為傳染病治療的新的假定治療藥物。
            
發明簡述如上述，PTP酶是多種細胞信號傳遞途徑必需的元件。這些酶的抑制物或調節物、或PTP酶的特定亞群、或甚至一種具體的PTP酶均因此而成為十分令人感興趣的候選藥物。然而，迄今文獻中只報道了數量有限的抑制物。某些最有效的抑制物是酪氨酸磷酸化的肽的類似物并因此不適于作為口服使用的候選藥。
            
Ⅰ.釩酸鹽及過釩酸鹽。釩酸鹽及過釩酸鹽/過氧釩化合物在細胞和動物體內誘導胰島素樣的效應。少數幾個無對照的，用釩酸鹽配方進行的臨床研究顯示在Ⅱ型糖尿病患者體內產生陽性效應。據信細胞水平的作用機制是通過抑制PTP酶抑制而實現的。近來發現過釩酸鹽(釩酸鹽與過氧化氫的復合物)是通過氧化活性位點的催化性半胱氨酸的PTP酶不可逆抑制物(Huyer et al.,J.Biol.Chem.272843-851(1997))。此外，該效應對諸如EDTA和還原劑(如二硫蘇糖醇，DTT)等試驗成分十分敏感。應注意到，釩酸鹽和基于過氧釩的化合物抑制很多種PTP酶。可以想象，該作用機制，即對活性位點半胱氨酸的氧化，在嘗試開發能選擇性抑制特定PTP酶的化合物時將引起實質性問題。而且，釩酸鹽、過釩酸鹽和基于過氧釩的抑制物的毒性效應將很可能對它們在諸如糖尿病這樣的慢性病治療中的應用造成阻礙。
            
Ⅱ.二磷酸酯。二膦酸酯已成功地作為治療藥物用于治療諸如骨質疏松癥和Paget病等骨病。二膦酸酯對導致骨更新的減少以及骨礦密度的凈增的破骨細胞吸收產生抑制(綜述見Rodan and Fleisch,J.Clin.Invest.972692-2696(1996))。現在人們相信，細胞水平的作用機制是通過二膦酸酯對PTP酶(破骨細胞中)的抑制活性實現(Skorey et al.,J.Biol.Chem.27222472-22480(1997)；Opas et al.,biochemical Pharmacology 54721-727(1997))。但是，已發現alendronate對諸如EDTA和DTT等試驗成分十分敏感。而且還顯示，該抑制作用為時間依賴性的。近來顯示生化水平的作用機制是通過對活性位點中的催化性半胱氨酸進行氧化(Skorey et al.，出處同上)。應注意，二膦酸酯能抑制很多種PTP酶。可以想象，該作用機制，即對活性位點半胱氨酸的氧化，在嘗試開發能選擇性抑制特定PTP酶的基于二膦酸酯的化合物時將引起實質性問題。
            
Ⅲ.金化合物。近來指出，已成功用于治療自身免疫病和炎性疾病的金硫蘋果酸二鈉(AuTM)可作為PTP酶的抑制物起作用(Wang et al.,BiochemicalPharmacology 54703-711(1997))。但是，AuTM似乎是通過它與這些酶中活性位點的親核半胱氨酸相互作用而抑制PTP酶。二硫蘇糖醇能阻止或幾乎完全阻止該抑制作用，這與本發明的化合物大不相同。對二膦酸酯而言，如果將該金化合物用于開發選擇性抑制物則有可能產生實質性問題。
            
上述抑制物均無選擇性。至少部分由于它們缺乏選擇性，很可能導致某些所觀察到的毒性效應或副作用。
            
因此，對能用于進一步優化有效且具有選擇性的抑制物的非肽的、通用的、競爭性或混合型、可逆轉的經典PTP酶抑制物或化合物存在著強烈的需求。
            
附圖簡述
            

            
圖1．穩態酶動力學分析。PTP1B在96孔板上與不同濃度的底物和抑制物一起溫育。底物磷酸對硝基苯酯(pNPP)和抑制物2-(草酰氨基)苯甲酸的濃度為0,7.4,22.2,66.7和200μM-最終試驗濃度。緩沖液為100mM醋酸鈉pH5.5,50mM NaCl,5mM二硫蘇糖醇，0.1％(w/v)牛血清白蛋白。溫育時間45分鐘；溫度25℃。加入氫氧化鈉，于405nm處讀取吸收值。(A)Michaelis Menten曲線；(B)相對于抑制物濃度的表觀Km值曲線；(C)相對于抑制物濃度的表觀Vmax曲線。更詳細資料參見定義部分.Exp.no.1230-5。
            
圖2．穩態酶動力學分析。條件如圖1，不同的是緩沖液(最終試驗濃度)為100mM醋酸鈉pH5.5,50mM NaCl,5mM谷胱甘肽，1mMEDTA，和0.1％牛血清白蛋白。溫育時間60分鐘。Exp.1167-3圖3．時間進程實驗。(A)在室溫下在96孔板上以含有2.5mM磷酸對硝基苯酯(pNPP)的緩沖液溫育PTP1B。加入化合物2-(草酰氨基)苯甲酸至試驗終濃度為250,125和62.5μM。反應通過酶的加入而起始，通過在指定的時間間隔內加入NaOH而中止。最后測定所有孔的405nm處吸收值。(B)如(A)，不同的是加入EDTA至終濃度為1mM。
            
圖4．穩態酶動力學分析。PTP1B在96孔板上與不同濃度的底物和抑制物一起溫育。底物磷酸對硝基苯酯和抑制物3-(草酰氨基)萘-2-羧酸的濃度為0,3.7,11.1,33.3和100μM-最終試驗濃度。緩沖液(最終試驗濃度)為100mM醋酸鈉pH5.5,50mM NaCl,5mM谷胱甘肽，1mM EDTA,和0.1％牛血清白蛋白。溫育時間60分鐘；溫度25℃。加入氫氧化鈉，于405nm處讀取吸收值。(A)Michaelis Menten曲線；(B)相對于抑制物濃度的表觀Km值曲線；(C)相對于抑制物濃度的表觀Vmax曲線。更詳細資料參見定義部分。
            
圖5.穩態酶動力學分析。PTP1B在96孔板上與不同濃度的底物和抑制物一起溫育。底物磷酸對硝基苯酯和抑制物2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸的濃度為0,18.5,55.6,166.7和500μM-最終試驗濃度。緩沖液(最終試驗濃度)為100mM醋酸鈉pH5.5,50mM NaCl,5mM二硫蘇糖醇，0.1％(w/v)牛血清白蛋白。溫育時間60分鐘；溫度25℃。加入氫氧化鈉，于405nm處讀取吸收值。(A)Michaelis Menten曲線；(B)相對于抑制物濃度的表觀Km值曲線；(C)相對于抑制物濃度的表觀Vmax曲線。更詳細資料參見定義部分。
            
圖6．穩態酶動力學分析。(A)Michaelis Menten曲線。PTPα在96孔板上與不同濃度的底物和抑制物一起溫育。底物磷酸對硝基苯酯(pNPP)和抑制物5-(1,3-二氧-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸的濃度為0,7.4,22.2,66.7和200μM-最終試驗濃度。緩沖液(最終試驗濃度)為100mM醋酸鈉pH5.5,50mM NaCl,5mM谷胱甘肽，1mM EDTA，和0.1％牛血清白蛋白。反應溫度25℃。60分鐘后，每孔加入10μl0.5M氫氧化鈉溶液(溶于50％(體積比)乙醇中)，于405nm處讀取吸收值。(B)Michaelis Menten曲線。PTPα在96孔板上與不同濃度的底物和抑制物一起溫育。底物磷酸對硝基苯酯和抑制物5-(1,3-二氧-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸的濃度為0,37,111.1,333.3和1000μM-最終試驗濃度。緩沖液(最終試驗濃度)為50mM HEPES pH7.0,100mM NaCl,5mM谷胱甘肽，1mMEDTA，和0.1％牛血清白蛋白。反應溫度25℃。60分鐘后，每孔加入20μl0.5M氫氧化鈉溶液(溶于50％(體積比)乙醇中)，于405nm處讀取光吸收值。更詳細資料參見定義部分。
            
圖7．基于PTP酶結構域1的多重序列對比的同源性關系樹。
            
發明詳述以人工合成的生物素化33P-磷酸化的肽為底物，用PTP1B開發出一種大容量篩選閃爍近似性試驗(SPA-Amersham)。這個肽底物對應于胰島素受體激酶的活化環，即Thr-Arg-Asp-Ile-Tyr-Glu-Thr-Asp-Tyr-Tyr-Arg-Lys-NH2，它用胰島素受體酪氨酸激酶在酪氨酸殘基處33P-磷酸化。對化合物文庫進行篩選，鑒別出多個選中(hit)。令人驚訝的是，這些選中之一，草酰氨基苯甲酸經證實可作為經典的、競爭性、可逆轉的、活性位點指導的抑制物(見下)。2-(草酰氨基)苯甲酸最初由Friedlaender et al.Chem.Ber.,14,1921(1881)描述。盡管對該化合物已認識了數十年，但沒有報道指出它具有任何PTP酶抑制活性。
            
首先我們用經典的穩態酶動力學方法分析了2-(草酰氨基)苯甲酸及其類似物的抑制方式，所用方法描述于R.A.Copeland,Enzymes-A PracticalIntroduction to Structure,Mechanism and Data Analysis,VCH Publishers,Inc.,New York,1996(Figure 1)。所作舉例說明在任何意義上均不是對本發明范圍的限制。具體的，本發明并非將發明范圍限制在未能顯示出任何時間依賴性的抑制物上。同樣的，本發明并非將發明范圍限制在經典的，競爭性抑制物上。
            
從圖1可看出，本發明的某些化合物(如草酰氨基苯甲酸)表現為PTP1B的可逆性、經典競爭性抑制物(抑制物濃度與表觀Km之間的線性關系(圖1(B)；對Vmax沒有影響(圖1(C))。測得Ki值約為30μM。對Ki的計算下文將詳細描述，并由定義部分的一個實施例作進一步舉例說明。
            
我們還研究了試驗成分的影響，曾發現它們對其它PTP酶抑制物的抑制作用具有顯著影響-如上述。試驗緩沖液中加入了EDTA，二硫蘇糖醇由谷胱甘肽代替(圖2)。
            
從圖2可看出，本發明的抑制物作為一個重要特征，并與上述抑制物截然不同的是，它們均對諸如EDTA和還原劑的試驗成分不敏感(抑制物濃度與表觀Km之間的線性關系(圖2(B)；對Vmax沒有影響(圖2(C))。測得Ki值約為50μM。抑制過程的可逆性可通過Vmax不依賴抑制物濃度的事實而清楚地說明。
            
此外，已在圖3中證實，本發明的一些化合物未顯示任何時間依賴性的跡象。這再次說明抑制作用的可逆性。
            
我們開始通過分析一系列新的化學類似物而更精確地鑒別限制PTP酶抑制能力的化學因素。重要的是，如下文將舉例說明的，該選中的類似物(即2-(草酰氨基)苯甲酸)基本上保持了同樣的酶動力學曲線，即其行為類似于經典的競爭性抑制物。因此，本發明的化合物可用本領域技術人員眾所周知的方法通過以系統方式改變以下元件而衍生，這類元件是可與PTP酶和/或其它具有pTyr識別單位之分子的活性位點結合/對這些位點進行抑制/調節所必需的。
            
2-(草酰氨基)苯甲酸類似物的酶動力學行為的實例示于圖4和5。令人驚訝的是，這些新的化合物保留了用2-(草酰氨基)苯甲酸發現的抑制作用的經典競爭模式。由此看來本領域技術人員可制出最初化合物的新類似物，它們仍然可以作為蛋白質酪氨酸磷酸酶的抑制物而起作用。在不限制本發明的范圍的前提下，例如，本領域技術人員可在2-(草酰氨基)苯甲酸中引入取代基，以改變效力及選擇性而成為本發明另外的優選化合物。這類新化合物可以是蛋白質-酪氨酸磷酸酶或帶有pTyr識別單位的其它分子的抑制物或調節物，它們可以是經典的競爭性抑制物或混合型抑制物。因此，本發明提供制備帶有pTyr識別單位的包括蛋白質酪氨酸磷酸酶在內的分子的非選擇性及選擇性抑制物和調節物的方法。
            
本發明的化合物還可經進一步修飾而作為藥物前體起作用。
            
在藥物發現物中眾所周知的是，諸如酶抑制物這樣的化合物可能在生化試驗中具有較高的效力和選擇性但在體內卻沒有活性。這種所謂的生物可利用性的缺乏可歸因于諸多不同因素，如缺乏腸吸收或腸吸收太少、肝臟的一過代謝、細胞攝取太少。盡管決定生物可利用性的因素仍未徹底弄清，但科學文獻中已有很多實例-為本領域技術人員眾所周知-說明了如何對在生化試驗中具有較高效力及選擇性而在體內活性較低或沒有活性的化合物進行修飾，使之成為具有生物活性的藥物。通過使本發明的化合物，即“最初的化合物”，連接能通過促進細胞或哺乳動物的攝取而提高這類化合物之生物可利用性的化學基團，這樣的修飾將包含在本發明的范圍中。在不限制本發明范圍的前提下，上述修飾的實例包括使一或多個羧基變為酯(如甲基酯、乙基酯、乙酸基甲基酯或其它酰氧基甲基酯)。通過使本發明的化合物，即最初的化合物，連接化學基團而修飾后即成為“修飾的化合物”。上述化學基團在本發明的權利要求書中可能指明也可能未指明。在不限制本發明范圍的前提下，修飾的化合物的其它實例有已在特定位點環化的化合物-所謂“環狀化合物”-當它們被攝入細胞或哺乳動物后即在該分子中相同的特定位點水解以產生本發明的化合物，即最初的化合物，因此而被稱為“非環化合物”。為了避免疑問，應理解大多數實例中這后一種最初的化合物包含經細胞或哺乳動物攝入后不水解的其它環化或雜環化結構。上述修飾的化合物在生化試驗中的表現一般不會與最初的化合物，即本發明的未連接化學基團或未進行上述修飾的對應化合物類似。上述修飾的化合物可能在生化試驗中也沒有活性。但被細胞或哺乳動物攝入后，這些修飾的化合物上連接的化學基團自發地或經內源性酶或酶體系處理被除去，從而形成本發明的化合物，即最初的化合物。“攝入”定義為造成化合物在細胞內或哺乳動物體內實質性集中的過程。上述化合物被攝入細胞或哺乳動物內并去除了上述連接的化學基團或上述環狀化合物水解后，這些化合物可能具有了與最初的化合物相同的結構，因而重新獲得它們的活性并因此在攝入后變成細胞內或體內有活性的狀態。可用本領域技術人員眾所周知的很多方法檢驗當攝入細胞或哺乳動物內部之后所連接的化學基團是否已除去或上述環狀化合物是否已水解。在不限制本發明范圍的前提下，下文給出了一個實例。將一種可從美國典型培養物保藏中心或其它類似的政府或商業機構獲得的哺乳動物細胞系與上述修飾的化合物共同進行培養。經在本領域技術人員眾所周知的條件下培養后，對細胞進行適當的洗滌、裂解并分離裂解物。期間必須包括本領域技術人員眾所周知的適當控制。然后可用本領域技術人員眾所周知的眾多不同方法從上述裂解物中提取并純化上述化合物。上述化合物可能保留或未保留所連接的化學基團，或上述環狀化合物可能已水解或未水解。同樣，可用本領域技術人員眾所周知的眾多不同方法對上述純化的化合物進行結構及化學表征。因上述純化的化合物已從上述細胞裂解物中分離出并因此已被該細胞系攝入，對上述結構及化學表征的化合物與最初未修飾的化合物(即不含上述連接化學基團或上述非環狀化合物)進行對比將很快為本領域技術人員提供信息，即所連接的化學基團是否已從細胞中除去或該環狀化合物是否已水解。進一步分析時，可對上述純化的化合物按本發明詳述的進行酶動力學分析。如果動力學曲線與不含上述連接的化學基團的最初化合物的相似，但與上述修飾的化合物不同，這證實上述化學基團已除去或上述環狀化合物已水解。可用類似的技術分析所有動物以及哺乳動物個體內的本發明的化合物。
            
一種優選的藥物前體是本發明化合物的乙酸基甲基酯，可通過以下方法一般制備(C.Schultz et al,The Joumal of Biological Chemistry,1993,268,6316-6322)。
            
將羧酸(1當量)懸浮于干乙腈(2ml/0.1mmol)中。加入二異丙胺(3.0當量)，再加入乙酸溴甲酯(1.5當量)。室溫下在氮氣氛中將混合物攪拌過夜。減壓下除去乙腈以產生一種油，將其稀釋于乙基乙酯中并用水洗(3次)。用無水硫酸鎂干燥有機層。過濾，隨后減壓除去溶劑，得到粗的油。在硅膠上用相應的溶劑體系經柱色譜純化該產品。定義信號傳遞是用于定義特定細胞或組織活化后的所有細胞過程的一個總稱。不限制要求保護的本發明范圍的信號傳遞的實例是由多肽激素和生長因子(如胰島素、胰島素樣生長因子Ⅰ和Ⅱ、生長激素、表皮生長因子、血小板衍生的生長因子)、細胞因子(如白細胞介素類)、細胞外基質成分、以及細胞間相互作用所誘導的細胞事件。
            
磷酸酪氨酸識別單位/酪氨酸磷酸識別單位/pTyr識別單位均定義為對含有磷酸化酪氨酸殘基(pTyr)的分子具有親和力的蛋白質或糖蛋白區或結構域。不限制要求保護的本發明范圍的pTyr識別單位的實例有PTP酶、SH2結構域以及PTB結構域。此外，在某些受體型或受體樣PTP酶中，第二結構域(C末端結構域)很可能不具備催化活性。作為非限制性實例，CD45的第二結構域似乎不能作為有活性的PTP酶(參見Kashio et a1.,J.Biol.Chem.273,33856-22863(1998)及其參考文獻)。但是，CD45的第二結構域似乎作為一個磷酸酪氨酸識別單位起著重要作用，并且是體內白細胞介素-2的分泌以及TCRz的物質更新的關鍵(Kashio et al.，出處同上)。因此，CD45的第二結構域在此例中可能作為SH2結構域起相似作用，并因此作為磷酸酪氨酸識別單位。盡管沒有正式證實，與PTP酶類似的其它分子，如IA-2和IA-2b也許能作為pTyr識別單位。
            
帶有磷酸酪氨酸識別單位的蛋白質定義為包含磷酸酪氨酸識別單位的蛋白質或糖蛋白。
            
配體定義為與另一分子結合的分子或化合物。不限制本定義之范圍的配體的實是分子量等于或小于2500道爾頓，可與某蛋白質或糖蛋白結合的非肽分子。
            
磷酸酪氨酸識別單位的配體定義為與有磷酸酪氨酸識別單位的蛋白質或糖蛋白的磷酸酪氨酸識別單位結合的分子。因此，磷酸酪氨酸識別單位的配體的非限制性實例包括PTP酶抑制物和/或PTP酶調節物。磷酸酪氨酸識別單位的配體的另一非限制性實例是與SH2結構域和/或PTB結構域結合的化合物。
            
PTP酶定義為能使含pTyr的蛋白質或糖蛋白去磷酸化的酶。不限制要求保護的本發明范圍的PTP酶的實例有“經典”PTP酶(細胞內PTP酶(如PTP1B,TC-PTP,PTP1C,PTP1D,PTPD1,PTPD2)和受體型PTP酶(如PTPα,PTPε,PTPβ,PTPγ,CD45,PTPκ,PTPμ))、雙特異性磷酸酶(VH1,VHR,cdc25)、LMW-磷酸酶或酸性磷酸酶。已向GenBank報告的最近已知的經典PTP酶以及其它PTP酶列于表1(附有相應錄入號)。
            
表1PTP酶目錄(部分及全長cDNA)名稱  錄入號牛bPTPBA14 U20807雞cLAR L32780cPTP1B   U86410cPTPα  Z32749,L22437cPTPcryp2U65891cPTPγ  U38349cPTPλ  L13285,Z21960cPTPsyp  U38620cPTPζ  L27625人類hCD45  Y00638 Y00062 p08575hchPTP1U42361hGLEPP1U20489HLAR   Y00815hLCPTP D11327hLypTP1AF001846hLyPTP2AF001847hMEG1  M68941hMEG2  M83738hPCPTP1D64053  U42361hPEST  D13280  M93425hPTP1B M31724  M33689hSHP1  M74903  X62055 M77273   X82817*  X82818**hSHP2  X70766  L08807 D13540   L03535   L07527hPTP1E U12128  D21209 D21210   D21211hPTPα M34668  X54130 X54890   X53364hPTPBDP1   X79568hPTPβ X54131hPTPch1g   U77917  U77916*hPTPCOM1   Z79693hPTPD1 X79510hPTPD2 X82676hPTP δ   X54133  L38929hPTPDEP1   U10886  D37781hPTPEC X82635  E09724*hPTPεX54134
            
表1(續)PTP酶目錄(部分及全長cDNA)名稱  錄入號hPTPFMI   X95712hPTPγL09247   X54132hPTPHLM64572hPTPHEM64322hPTPIA2   L18983   Z48226hPTPIA2β U65065hPTPIAR   AF007555 L76258hPTPICA512X62899hPTPχL77886   Z70660hPTPL1X80289hPTPμX58288hPTPPCP2  X97198hPTPpiU81561hPTPPNP1  X79676hPTPψ   U60289  U73727hPTPρ   AF043644AL024473   A1022239   AQ02047hPTPROU71075hPTPS31   I32035  I32036 I32037 I32038I32039hPTPSAP1  D15049hPTPσU35234  U40317 U41725hPTPU2Z48541hPTPζM93426  X54135 U88967hTCPTPM25393  M81478 M80737hPTP-af007118 AF007118hchPTPU42361小鼠mCD45 M14342  M92933 M33482mDPZPTP   D28529mLAR  Z37988mMEG2 Af013490mPEP  M90386mPEST X8678LmPTP1BM97590 U24700mPTP1CM68902 M90389mPTP1DL08663 D84372mPTP35X74438mPTP36D31842mPTPαM33671 M36033
            
表1(續)PTP酶目錄(部分及全長cDNA)名稱錄入號mPTP β X58289mPTPBL  Z32740mPTPBR7 D31898mPTPbyp D45212mPTPδD13903  E09890 E09891   E09892mPTPεU35368  U36758 D83484   U62387  U40280mPTPesp U36488mPTPFLP1U52523  U49853mPTPftp1D88187mPTPγ   L09562mPTPGMC1AF073998AF073999mPTPGMC1AF0T3998AF073999mPTPHA2 L40595mPTPLA2 U11812mPTPK1  U35124mPTPχ   L10106mPTPλ   U55057mPTPμ   X58287mPTPNP  U57345mPTPP19 X63440  S36169mPTPphi U37467  U37466 U37465mPTPRIP D83966mPTPRL10D37801  D83072mPTPNU3 X82288mPTPT9  D28530  D28531*mPTPSL  Z30313  Z23058mPTPtestis  D64141mSTEP61 U28217  S80329 U28216mTCPTP  S52655  M81477 M80739大鼠rCBPTP  M10072  Y00065rLARL11586  U00477 X83546 X83505rLCPTP  U28356rPC12PTP1   U14914rPTP- E10496E10496rPTP-E09723 E09723rPTP1B  M33962rPTP1D  U09307  U05963rPTP20  U69673
            
表1(續)PTP酶目錄(部分及全長cDNA)名稱  錄入號rPTP2EU17971   U18293rPTPα  L01702rPTPBEM1(部分cds) D45412rPTPBEM2  D45413rPTPBEM3  D45414rPTPD30(完全cds)  U28938rPTPDEP1  U40790rPTPε  D78610   D78613rPTPGMC1  AF063249rPTPICA105X92563   D38222rPTPNE6   U73458   Z50735rPTPOST   L36884rPTPP1L19180rPTPPSL19181rPTPpsi   U66566rPTPδ  L11587L12329 L19933rPTPζ  U09357rRKPTPD38072rSTEP S49400rSHP1 U77038rTCPTPX58828rPTPTD14  AF077000兔rabPTP-oc U32587其它PTP酶類似VH1的PTP酶(即是雙特異性又針對酪氨酸)
            
表1(續)PTP酶目錄(部分及全長cDNA)名稱 錄入號hTYP1S80632hVH1hVH2 U21108hVH5 U27193hVHRmERP S64851mI29-PAC1U09268mMKP-1   X61940mNTTP1   X95518mPAC-1   L11330mPRL-1   U84411mSty U11054mSTYXU34973mVH1 X61940粘液瘤PTPL31960nostocPTPL11392raccPTP  L13165rCL100   S81478   X84004rMKP-2   U23438RpRL-1   L27843ru02553  U02553rVH6 U42627肖普乳頭狀瘤PTP   L32180yVH1 L04673hPRL3AF041434LMWbPTPlmw  M83656hRBClmw  M83653M83654yLMPTP1  L33929yLTP1U11057L48604cdc25-家族hPTPcdc25a   M81933hPTPcdc25b2  Z68092hcdc14B  AF023158
            
表1(續)PTP酶目錄(部分及全長 cDNA)名稱錄入號非經典的哺乳動物PTP酶hPTPCAAX1  U48296hPTPCAAX2  U48297hPTPCIP2   L25876hPTPCdi1   U02681hPTPICAAR  Y08569hPTPTEP1   U96180hPTPkiaa0283   AB006621bPTPPRL-1  AF051160hPTPPRL-3  AF041434hPTP假定的  AF007118mPTP-IF1   Y17345mPTP-IF2   Y17344mPTP-IF2P  Y17343微生物PTP酶(即真細菌的以及病毒的)autOVPTP   M96763aalnptpU63293strepPTP   U37580核型多角體病毒npvPTP AF068270其它真核生物(即，果蠅、酵母、真菌、瓜蟾等)擬南芥atPTP1 AF055635atPTP1-外星子-內含子AJ006309秀麗新標線蟲ceCosmid   Z80216cePTP2 AF015882cePTP6 Z70284cePTPc1r-1 AF047880cePTPPRL-1 AF063401
            
表1(續)PTP酶目錄(部分及全長cDNA)名稱 錄入號果蠅dLAR M27700dPTP10D  M80465M80538dPTP4E   L20894dPTP61F  L11253L14849L11252 L11251dPTP69D  M27699dPTP99A  M80464M80539M81795dPTPcork U19909dPTPPRL-1AF047880  AF047881盤基網柄菌dictPTP  L07125dictPTP2 L15420dictPTP3 U38197Emericella nidulansfPTPncdc25   X64601S37934胚胎三毛滴蟲triPTP.pep   U66070粟酒裂殖酵母表1(續)PTP酶目錄(部分及全長cDNA)名稱  錄入號釀酒耶爾森菌(Yersinea cerivisiae)yscPTPM64062yscPTP2   M38723   M82872yscPTP3   AF006304瓜蟾xCD45 AF024438xPTP-SH2  U15287xPTPalpha U09135xPTPX1L33098xPTPX10   L33099歐洲水蛭hmLar1AF017084hmar2 AF017083蜿豆peaPTP1   AJ005589大豆soybeanPTP1  AJ006308
            
PTP酶調節物是使PTP酶活性發生變化的化合物。PTP酶調節物既可使PTP酶活性降低也可使之活性更高。根據本定義PTP酶調節物可與PTP酶的活性位點結合或與PTP酶活性位點以外的區域結合(所謂別構調節物)。PTP酶調節物的另一非限制性實例是使PTP酶的底物特異性發生改變的化合物。
            
PTP酶結構域定義為通常-但并不總是-具有其特征性酶活性，即能使含pTyr的蛋白質或糖蛋白去磷酸化的完整PTP酶分子的部分。一種經典PTP酶的結構域通常由220-350個氨基酸殘基組成，并與PTP1B的30-270位氨基酸殘基相對應。PTP酶結構域可在真核和原核表達系統中以結構域或以融合蛋白的一部分的形式表達。
            
SH2結構域Src同源物2(SH2)結構域是與含pTyr(磷酸酪氨酸殘基)之蛋白質結合的非催化蛋白質調節物，即SH2結構域均為pTyr識別單位。由大約100個氨基酸殘基組成的SH2結構域在參與信號傳遞過程的多種不同分子中均有發現。以下是含有SH2結構域的蛋白質的非限制性舉例Src,Hck,Lck,Syk,Zap70,SHP-1,SHP-2,STATs,Grb-2,Shc,p85/P13K,Gap,vav(參見Russell et al.,FEBS Lett.30415-20(1992)；Pawson,Nature 373573-580(1995)；Sawyer,biopolymers(Peptide Science)47243-261(1998)；以及其中的參考文獻)。已用人工合成的酪氨酸磷酸化的肽分析了SH2結構域與pTyr蛋白質相互作用所需的結構，并進一步以X-射線晶體成像技術以及NMR進行說明。該特征基元FLVRES(單個氨基酸密碼)形成了與pTyr結合的口袋的一部分。此外，其它結合口袋在決定親和力以及選擇性時具有一定作用。因此，在Src SH2結構域中有一個疏水口袋結合位于pTyr殘基C末端第3位殘基的氨基酸(即pY+3)。已有多項研究指出位于pTyr殘基C末端的殘基的重要性(綜述見Pawson，出處同上)。
            
對結合SH2結構域的配體的確定。已開發出可用于評估含有非磷酸基團的配體對SH2結構域的結合的數種方法-為本領域技術人員熟知。不限制本發明范圍的最近由Yao及其同事公布了一個實例(Yao et al.,J.Med.Chem.4225-35(1999))。這些作者用表面胞質基因共振法確定含非磷酸基團的配體對Grb2 SH2結構域結合(IC50)的抑制能力。簡單說，使重組體GST-Grb2 SH2結構域與不同量配體一起溫育，并流過表面結合的SHC磷酸肽DDPSpYVNVQ(單個氨基酸密碼，其中pY指磷酸酪氨酸)。測定平衡時的結合量并與沒有配體時的結合比較。以上述SHC磷酸肽DDPSpYVNVQ為對照。類似地，可用相應的表面結合的本領域技術人員熟知的酪氨酸磷酸化的肽測定對另一SH2結構域的配體結合。
            
評估肽配體對SH2結構域之結合的其它非限制性方法已由數個實驗室開發出來(Fantl et al.,Cell 69413-423(1992)；Ward et al.,J.Biol.Chem.2715603-5609(1996)；及其參考文獻)。這類方法也可用于評估非肽配體對已略作修飾的SH2結構域的結合，對此本領域技術人員能較好理解的。
            
PTB結構域，最近在shc這種接頭蛋白質中鑒定出一種新型pTyr識別單位(PTP結構域即為磷酸酪氨酸結合結構域)(Kavanaugh and Williams,Science 2661862-1865)。PTB結構域比SH2結構域長(約190個殘基)。最近已由Kavanaugh及其同事開發出對結合shcPTB結構域的配體進行分析的方法(Kavanaugh et al.,Science 2681177-1179(1995)；Laminet et al.,J.Biol.Chem.271264-269(1996))。
            
PTP酶家族指一組結構相關的PTP酶。因此，一個可讓人接受的方法是根據PTP酶結構域以外的PTP酶初級結構或它們的總結構定義PTP酶家族(Fischer et al.(1991)Science 253401-406；B.J.Goldstein(1995 in ProteinProfile,volume 2,number 13,Academic Press Ltd.,London)。以這類方法定義的PTP酶家族的非限制性實例有(a)含SH2結構域的PTP酶，即SHP家族SHP-1；SHP-2(b)PTP1B家族PTP1B；TC-PTP(c)含埃茲蛋白結構域的PTP家族PTPH1；PTPD1；PTPD2；PTPMEG(d)PTP-BAS家族(e)含脯氨酸-谷氨酸-絲氨酸-蘇氨酸(PEST)序列的PTP酶PTP-PEST；PEP(f)含很小的、高度糖基化的胞外區的PTP酶，即PTPα家族PTPα；PTPε(g)有一個胞內PTP結構域的受體型PTP酶，即PTPβ家族PTPβ、DEP-1、GLEPP-1、SAP-1(h)包含帶免疫球蛋白樣結構域以及纖連蛋白Ⅲ樣結構域的胞外區的PTP酶，即PTP-LAR家族PTP-LAR；PTPσ；PTPδ
            
(i)包含帶MAM結構域之胞外區的PTP酶，即PTPμ家族PTPμ；PTPκ(j)含有類似于碳酸酐酶的胞外區的PTP酶，即PTPζ家族PTPζ；PTPγ(k)IA-2家族(l)PTPψ家族(m)CD45家族應注意并非所有PTP酶均已-或能夠-歸類于任何家族。
            
或者，PTP酶也可分為以初級序列的序列對比為根據的家族(Goldstein出處同上)。本領域技術人員所熟知的計算機程序(如GCG University ofWisconsin,refs.)可用于進行這類對比。用諸如CLUSTALX等計算機程序進行的進一步分析得出所謂的系統樹。這種系統樹的一個實例示于圖7。應指出，上述將PTP酶分為不同家族的方法相互間有較大重疊。PTP酶分為不同家族的優選定義是后一種基于PTP酶初級序列對比的方法，因為這一定義有可能用于建立一種分析方法，該方法能開發出與特定PTP酶家族或特定家族之成員選擇性反應的PTP酶抑制物或調節物(即選擇性抑制物)。
            
細胞過程的調節指本發明的化合物1)增加或減少正在進行的正常或異常的信號傳遞，2)起始正常的信號傳遞，和3)起始異常的信號傳遞的能力。
            
對pTyr介導的信號傳遞的調節/對有pTyr識別單位的分子的活性的調節指本發明的化合物1)提高或降低有pTyr識別單位之蛋白質或糖蛋白(如PTP酶、SH2結構域或PTB結構域)的活性或2)通過在pTyr識別位點上的直接作用或通過某種間接機制而削弱或增強含pTyr的分子與有pTyr識別單位的蛋白質或糖蛋白的關聯。不限制要求保護的本發明范圍的對pTyr介導的信號傳遞的調節/對有pTyr識別單位的分子的活性的調節的實例有a)抑制PTP酶活性而導致正在進行的細胞過程中信號傳遞的增加或減少；b)抑制PTP酶活性而導致正常或異常的細胞活性的產生；c)刺激PTP酶活性而導致正在進行的細胞過程的信號傳遞增加或減少；d)刺激PTP酶活性而導致正常或異常細胞活性的產生；e)抑制SH2結構域或PTB結構域對有pTyr的蛋白質或糖蛋白的結合而導致正在進行的細胞過程增強或減弱；f)抑制SH2結構域或PTB結構域對有pTyr的蛋白質或糖蛋白的結合而導致正常或異常的細胞活性的產生。
            
受試者指任何哺乳動物物種，包括人類。
            
根據本發明對PTP酶抑制作用的定義一種化合物如果符合以下標準則可定義為PTP酶抑制物(a)應該按如下詳述測定抑制能力且抑制常數Ki的值應該小于1000μM；(b)本發明的化合物應該能抑制至少一種PTP酶。任何PTP酶均可用來進行分析。PTP酶的非限制性實例有PTP1B；SHP-1；SHP-2；PTP-PEST；PTPα；PTPμ；LAR；CD45。其它實例見表1。此外，也可用這里沒有提到的任何PTP酶。
            
抑制常數的確定抑制常數(Ki值)的確定可按多個不同的實驗方案包括抑制物熒光淬滅而進行。但在所有例子中，為了評價本發明的化合物，這類方法應添加測量該化合物對酶的催化活性的影響的步驟。這類試驗的條件舉例說明如下。
            
PTP酶用于分析的PTP酶可表達為完整分子或表達為PTP酶結構域。
            
試驗條件選擇試驗條件應確保酶的穩定性，即在沒有底物的情況下酶在整個試驗階段應保留最初活性的至少50％。
            
緩沖系統可選用本領域技術人員已知的任何緩沖系統分析本發明的化合物。用于對PTP酶的抑制或調節進行分析的優選緩沖液如下緩沖液1100mM NaAc(醋酸鈉)pH5.50.1％BSA(牛血清白蛋白)15mM DTT(二硫蘇糖醇)緩沖液2100mMNaAc pH5.550mMNaCl0.1％BSA5mMDTT緩沖液3
            
100mM NaAc pH5.550mM NaCl0.1％BSA5mM GSH(谷胱甘肽)1mM EDTA緩沖液450mM HEPES pH7.0100mM NaCl0.1％BSA5mMDTT緩沖液550mM HEPES pH7.0100mM NaCl0.1％BSA5mM GSH1mM EDTA緩沖液620mM MES pH6.0150mM NaCl5mM DTT0.1％BSA緩沖液7(如Ellis&Morrison(1982)Methods Enzymol.117301-342所述的穩定離子強度緩沖液)50mM Tris50mM Bis-Tris100mM醋酸鹽pH范圍4.5-9.0有或沒有還原劑(DTT、GSH、2-巰基乙醇)有或沒有載體蛋白(如BSA、明膠)反應時間反應時間優選2-60分鐘。
            
反應溫度可選擇本領域技術人員熟知的任何反應溫度分析本發明的化合物。優選反應溫度在以下范圍內4℃-37℃。
            
底物反應中所用底物可從以下選擇(a)磷酸對硝基苯酯(pNPP)；(b)酪氨酸磷酸化的肽；(c)天然底物(如自我磷酸化的胰島素受體)或其部分(如胰島素受體上自我磷酸化的酪氨酸激酶結構域)。如果用pNPP為底物，酶反應后可在約405nm的波長下測定光密度。如果用(b)和(c)，酶反應后可對所釋放的磷酸基團進行測定或根據本領域技術人員熟知的步驟采用分光光度測量法/熒光測量法測定。
            
化合物和底物的濃度為確保對抑制常數的最佳測定，底物和抑制物的濃度應根據以下指標分別變化。
            
底物濃度的變化范圍應有一優選最大值，這一試驗終濃度的優選最大值應比相同條件下測得的酶Km值大至少10倍。試驗終濃度的最小值優選等于或小于相同條件下測得的酶的Km值。
            
應使用至少2種不同的抑制物濃度。該濃度取決于實際使用的化合物，但對它們的選擇應使非線性回歸分析能保證對抑制常數的確定達到本領域技術人員所能接受的精確度。
            
抑制常數Ki的計算定義V0，起始速率，是對應于0時間的反應速率。
            
Km定義為用于使起始速率與底物完全飽和時酶可能獲得的最大速率(Vmax)的50％相應的底物濃度。對Km進行測定時無需加抑制物。
            
Vmax是底物完全飽和時所測定的可能獲得的最大起始速率(限制速率)。
            
Kapp是有抑制物時所測定的表觀Km。
            
Vapp是有抑制物時所測定的表觀Vmax。
            
競爭性抑制物指與酶的底物結合位點結合的化合物，或與該底物結合位點十分靠近足以封閉的化合物。真正的競爭性抑制物，也稱為經典的競爭性抑制物，無需對Vmax造成任何影響即可增加Kapp。
            
混合型抑制物指對Km和Vmax均有影響的抑制物。
            
非競爭性抑制物指無需對Km造成任何影響就能降低Vapp的抑制物。
            
根據經典的Michaelis-Menten動力學，競爭性抑制物的抑制常數Ki可從以下公式計算Kapp=(Km/Ki)*[i]+Km(公式1)其中[i]是抑制物的濃度混合型抑制物之Ki的競爭性部分Kic可如下計算Kic=i/((Vm/Km)*(Kapp/Vapp)-1)(公式2)混合型抑制物之Ki的非競爭性部分Kiu可如下計算Kiu=i/(Vmax/Vapp-1)(公式3)特定化合物的Ki值可用假定競爭性或混合型抑制時符合上述經典Michaelis Menten酶動力學模式的線性轉化程序或非線性回歸法計算。本發明的優選化合物屬于競爭性或混合型抑制物。
            
可在任何關于酶動力學的參考書中找到更多對上述酶動力學參數定義的其他數據。這類參考書的非限制性實例有(a)Copeland(出處同上)；(b)M.Dixon&E.C.Webb,Enzymes,2nd Edition,Longmans,London,1996；(c)A.Cornish-Bowden,Fundamentals of Enzyme Kinetics,Portland Press,1995。
            
抑制物常數的計算一一個實例通過以下實例可使Ki值的計算變得更為明確，但該實例并非對發明范圍的限制。
            
PTP1B與本發明的化合物一起溫育(如實施例2所述)。使PTP1B中相應于N末端321個氨基酸的一種截短形式在大腸桿菌中表達，并用已公開的本領域技術人員熟知的方法純化，使之為明顯同質性。在基本如Burke et al(Biochemistry 3515989-15996(1996))所述的常規條件下進行酶反應。試驗條件如下。
            
用一半的96孔板進行這項試驗。以磷酸對硝基苯酯(pNPP)為底物(見表2)。所用pNPP的試驗終濃度如下10mM(加在A排的所有孔中)、5mM(加在B排的所有孔中)、2.5mM(加在C排的所有孔中)、1.25mM(加在D排的所有孔中)、0.63mM(加在E排的所有孔中)、0.31mM(加在F排的所有孔中)、0.16mM(加在G排的所有孔中)。H排不加底物(將相當于pNPP體積的試驗緩沖液加入H排的所有孔中)。以溶于DMSO的3-(草酰氨基)萘-2-羧酸(實施例2)為抑制物，其試驗終濃度如下100μM(加在第1列的所有孔中)、33.3μM(加在第2列的所有孔中)；11.1μM(加在第3列的所有孔中)；3.7μM(加在第4列的所有孔中)。第5和第6列加試驗緩沖液以替代抑制物(體積與加在第1-4列之抑制物的相同)。試驗緩沖液(試驗最終濃度)100mM醋酸鈉pH5.5,50mM NaCl,5mM谷胱甘肽，1mM EDTA，和0.1％牛血清白蛋白。加入PTP1B酶以起始該反應。在第6列中加入試驗緩中液以替代酶(體積同第1-5列所加的酶)。每孔總體積為100μl，包括10μl溶于DMSO的抑制物或10μlDMSO加在沒有抑制物的對照孔中。溫度為25℃。60分鐘后，加入NaOH，在405nm處讀取吸收值。結果示于表2。
            
表2405nm處所測的吸收值 
            
Ki值的計算表2中的實際數據與試驗設計而示于表3。
            
表3 
            
首先，吸收值的測量應用對照孔H6所得的OD405值進行校正，如表4所示。
            
表4 
            
H1-H5各孔的吸收值表示抑制物本身的顏色(OD405值)。在本例中，抑制物不產生任何OD405值。第6列的值表示底物吸收的OD405值。因此，表4中校正的OD405值應進一步用抑制物和/或底物所產生的405nm處的吸收值校正，如表5所示。
            
表5 
            
現在，可用表5中校正的值計算所分析的每一抑制物濃度(分別為100,33.3,11.1和3.7μM)下的抑制物Ki值。這些數據典型Michaelis-Menten曲線圖示于圖4(A)。對表5的數據進行非線性回歸分析，計算每一抑制物濃度下的表觀Km值(單位為mM；Kapp)和表觀Vmax值(OD405值；Vapp)(表6)。
            
表6 
            
這些數據圖示于圖4(B)和(C)。用表6的數據及公式1(見上)可計算出每種抑制物濃度的Ki值(表7)。
            
表7 
            
可看出無論抑制物濃度為多少Ki值幾乎都相同。將這一點與抑制物不改變Vmax值的事實綜合考慮，可得出結論該抑制物是一種經典的競爭性抑制物。這一點可進一步通過假定有混合型抑制作用時用公式2(見上)計算Ki的競爭性部分(Kic)而進一步說明。如果該抑制物為混合型抑制物，則所計算的Kic值應顯著區別于表7中的Ki值。本抑制物的Kic值示于表8。
            
表8 
            
可看出表8中的Kic值幾乎與表7中的Ki值一樣。
            
抑制物的選擇性定義為這類化合物抑制或調節特定的一或多種PTP酶比其它PTP酶更有效的特性。一種選擇性抑制物只能抑制一種PTP酶或一個PTP酶家族。但其它選擇性抑制物也包括對一組中的多種PTP酶或PTP酶家族的抑制比其它組的PTP酶或PTP酶家族的抑制更有效。
            
不限制本發明范圍的選擇性的一個實例是對PTPlB的Ki值為50μM以及對PTPα的Ki值為500BM或更大μM的一種競爭性抑制物。不限制本發明范圍的選擇性調節物的一個實例是使SHP-1的活性在不影響PTPα活性的情況下提高2倍的一種調節物。
            
為進一步說明不同PTP酶在評估抑制物的效力時的應用，將簡短說明如何制備并表達前提PTP構建體。對本領域技術人員而言，該說明將使用于評估PTP酶抑制物的效力以及選擇性(見下文)的PTP酶其它結構域得以表達并純化。簡單地說，用適當來源的組織或細胞系分離RNA(總RNA或信使RNA)。作為非限制性實例，RNA可分離自胎盤、肝臟、骨骼肌、脂肪組織、以及外周血白細胞。用本領域技術人員熟知的標準方法(Ausubel,F.M.,et al.(Eds.).SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,2nd EDITIONAcompendium of methods from Current Protocols in Molecular Biology.JohnWiley and Sons,Inc.New YorkISBN 0-471-57735-9(1992)；Ausubel,FrederickM.Current Protocols on CD-ROM User’s Guide；Current Protocols in molecularbiology.John Wiley and Sons,Inc.(1998))用適當的RNA制劑產生cDNA。再以這樣的cDNA制劑為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)。還應注意適當的cDNA模板也可通過市場上如Clontech(1020 East Meadow Circle,Palo Alto,CA 94303)獲得。用PCR技術制備相應于以下PTP酶結構域的cDNA(Ausubelet al,出處同上)PTP1B；PTPα結構域1；PTPε結構域1；PTPβ；CD45結構域1和2。寡核苷酸中已包括了適當的限制性位點，以便克隆至適當的表達載體。在并非限制本發明的范圍的這些實例中，用pGEX表達載體(Pharmacia)。為了使克隆至其他表達載體的過程(此處并未顯示)較為方便，在部分構建體(以(M)表示)中附加了一個N末端甲硫氨酸(Met-M)。所有序列通過對雙鏈的測序證實。更詳細資料見表9。用于PCR的寡核苷酸和所要查詢的具體PTP酶的GenBank錄入號的信息使本領域技術人員能獲得編碼這些PTP酶的結構域的cDNA。插入適當的表達載體后，用編碼上述谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合蛋白的表達載體轉化大腸桿菌。過夜培養物經1∶25稀釋，在37℃培養3小時。然后加入異丙基-1-硫代-b-D-半乳糖吡喃糖苷以誘導GST融合蛋白表達，將培養物再于室溫培養3小時。按廠家建議(Pharmacia)略作修改而純化GST融合蛋白。簡單地說，所有純化步驟均在約4℃下進行。將細胞沉淀懸浮于裂解緩沖液(50mM咪唑，5mM EDTA,0.1％6-巰基乙醇，10％甘油，10μg/ml抑蛋白酶肽，0.1％溶菌酶及1mM PMSF；pH7.2)中(5ml/g)，先攪拌1小時，然后在Parr細胞破壞彈(Parr cell disruption bomb)中氮氣壓下(＞2000 psi)進行裂解。向裂解物中加入Triton X-100(0.1％)，繼續攪拌1小時，然后以40000g離心30分鐘。將上清液上樣于已用GST-平衡緩沖液(50mM咪唑，1mM EDTA,150mMNaCl和10％甘油；pH7.2)平衡好了的谷胱甘肽Sepharose柱(Pharmacia)，先用同樣的緩沖液洗滌。改變流動方向，用洗滌液(50mMTris,1mM EDTA和10％甘油；pH8)連續洗滌。最后，結合的蛋白用含有10mM谷胱甘肽的洗滌緩沖液洗脫。CD45融合蛋白進一步在G25和MonoQ柱(Pharmacia)上純化。純化的PTP結構域保存在-80℃備用。使用前適當稀釋酶制劑。應注意可用本領域技術人員熟知的相似方法獲得表1所示分子的催化結構域。用上述GST-PTP酶融合蛋白評估基本如上文對PTP1B所述的PTP酶抑制物的效力和選擇性。為進一步說明這些試驗，給出一個利用PTPα結構域1的非限制性實例。相似的方法可應用于其它PTP酶結構域。用96孔板的半數進行該實驗，以磷酸對-硝基苯酯(pNPP)為底物。pNPP的試驗最終濃度如下20mM、10mM、5mM、2.5mM、1.25mM、0.63mM、0.31mM。用溶于二甲亞砜(DMSO)的化合物5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸作抑制物，試驗終濃度為200μM、66.6μM、22.2μM、7.4μM。向相應對照孔中加試驗緩沖液以替代酶和/或底物，如上文對PTP1B所詳述。試驗緩沖液(試驗最終濃度)100mM醋酸鈉pH5.5,50mMNaCl,5mM谷胱甘肽，1mMEDTA，和0.1％牛血清白蛋白。加入酶，GST-PTPα結構域1(最終稀釋度1∶10000)以起始該反應。每孔總試驗體積為100μl，包括10μl溶于DMSO的抑制物或加在沒有抑制物的對照孔中的10μlDMSO。溫度為25℃。60分鐘后，每孔加入10μl 0.5M氫氧化鈉溶液(為50％(體積比)乙醇溶液)，在405nm處讀取吸收值。結果示于圖6A。元素分析，計算值Ki值為4μM(中位值)。圖6B顯示了當同樣的化合物(5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸)在以下緩沖液中對PTPα(最終稀釋度為1∶2000)進行檢驗的結果50mM HEPES pH7.0,100mM NaCl,5mM谷胱甘肽,1mM EDTA,和0.1％牛血清白蛋白。60分鐘后，每孔加入20μl0.5M氫氧化鈉溶液(為50％(體積比)乙醇溶液)，讀取405nm處的吸收值。或者，條件如圖6A所述。在這樣的條件下元素分析，計算值的Ki值約為70mM(中位值)。
            
表9 
            
選擇性抑制物指顯示選擇性的抑制物。
            
非選擇性抑制物指未顯示選擇性的抑制物。
            
選擇性調節物指顯示選擇性的調節物。
            
為進一步說明選擇性和非選擇性PTP酶抑制物的概念，表10中分別提供了非選擇性和選擇性抑制物的實例。應強調表10中的實例并非對本發明范圍的限制。
            
表10對PTP酶抑制物選擇性的分析。分析條件基本上與圖4所用的相同。所給數字為Ki值(μM)。 
            
從表10可看出，實施例82的化合物是非選擇性抑制物的實例，而實施例83的化合物表現為選擇性抑制物。應注意，實施例83的化合物用于檢驗其它PTP酶時可能能抑制這些酶。此外，根據本定義，實施例83的化合物為選擇性抑制物是由于它抑制PTP1B而對表10中所檢驗的其它PTP酶幾乎沒有影響。又，根據該定義，實施例82的化合物為非選擇性抑制物是由于盡管它對PTP-LAR即使有活性也較弱，但它抑制數種PTP酶。
            
化學基團定義為任何單個原子或任何共價連接的原子或任何分子，包括它們的任何基。
            
術語“鹵素”或“鹵”包括氟、氯、溴、和碘。
            
術語“烷基”包括C1-C6直鏈飽和的以及C2-C6不飽和的脂肪族烴基、C1-C6支鏈飽和的及C2-C6不飽和的脂肪族烴基、C3-C6環狀飽和的及C5-C6不飽和的脂肪族烴基、和C1-C6直鏈或支鏈飽和的及C2-C6直鏈或支鏈不飽和的脂肪族烴基，所述基團可以被具有特定數目碳原子的C3-C6環狀飽和及不飽和脂肪族烴基取代。例如，該定義應包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(Pr)、丁基(Bu)、戊基、己基、庚基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、異丙基(i-Pr)、異丁基(i-Bu)、叔丁基(t-Bu)、仲丁基(s-Bu)、異戊基、新戊基、環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環戊烯基、環己烯基、甲基環丙基、乙基環己基、丁基環戊基、等等。
            
術語“取代的烷基”表示如上定義的烷基，其中取代基分別選自鹵素、氰基、硝基、三鹵甲基、氨基甲酰基、羥基、COR5、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芳氧基、芳基C1-C6烷氧基、硫代基、C1-C6烷硫基、芳硫基、芳基C1-C6烷硫基、NR7R8、C1-C6烷基氨基、芳氨基、芳基C1-C6烷基氨基、二(芳基C1-C6烷基)氨基、C1-C6烷基羰基、芳基C1-C6烷基羰基、C1-C6烷基羧基、芳基C1-C6烷基羧基、C1-C6烷基羰基氨、C1-C6烷基-氨基COR11、芳基C1-C6烷基羰基氨基、四氫呋喃基、嗎啉基、哌嗪基、-CONR7R8、-C1-C6烷基coNR7R8、或飽和的或部分飽和的環狀有5,6或7員胺或內酰胺；其中R11是羥基、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芳氧基、芳基C1-C6烷氧基，R5如上所定義或為NR7R8，其中R7、R8均如上所定義。
            
術語“烷氧基”(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、烯丙氧基、環己氧基)表示如上定義的含有通過氧橋連接的指定數量碳原子的“烷基”。術語“烷氧基烷基”表示如上定義的含有指定數量之碳原子的烷基連接的“烷氧基”。
            
術語“芳氧基”(如苯氧基、萘氧基等)表示通過氧橋連接的如下定義的芳基。
            
術語“芳基烷氧基”(如苯乙氧基、萘甲氧基等)表示通過氧橋連接的如下定義的芳烷基。
            
術語“芳基烷氧基烷基”表示通過如上定義的有指定數量碳原子的烷基連接的“芳基烷氧基”。
            
術語“芳硫基”(如苯硫基、萘硫基等)表示通過硫橋連接的如下定義的芳基。
            
術語“烷氧基羰基”(如甲酸甲酯、甲酸乙酯等)表示通過羰基連接的如上定義的“烷氧基”。
            
術語“芳氧基羰基”(如甲酸苯基酯、甲酸2-噻唑基酯等)表示通過羰基連接的如上定義的“芳氧基”。
            
術語“芳基烷氧基羰基”(如甲酸苯甲基酯、甲酸苯乙基酯等)表示通過羰基連接的如上定義的“芳基烷氧基”。
            
術語“烷氧基羰基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的“烷基”連接的如上定義的“烷氧基羰基”。
            
術語“芳基烷氧基羰基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的“烷基”連接的如上定義的“芳基烷氧基羰基”。
            
術語“烷硫基”(如甲硫基、乙硫基、丙硫基、環己烯硫基等)表示通過硫橋連接的如上定義的有指定碳原子數的“烷基”。
            
術語“芳基烷硫基”(如苯基甲硫基、苯基乙硫基等)表示通過硫橋連接的如上定義的有指定碳原子數的“芳烷基”。
            
術語“烷硫基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的烷基連接的“烷硫基”。
            
術語“芳烷硫基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的烷基連接的“芳烷硫基”。
            
術語“烷基氨基”(如甲基氨基、二乙基氨基、丁基氨基、N-丙基-N-己基氨基、(2-環戊基)丙基氨基、己烯基氨基、吡咯烷基、哌啶基等)表示通過氨橋連接的一或兩個如上定義的有指定碳原子數的“烷基”。兩個烷基可能與它們所連接的氮原子一起形成含有3-14個碳原子以及0-3個額外的選自氮、氧或硫的雜原子的飽和、部分飽和或芳環、二環或三環的環系，該環系可任選被至少一個C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、羥基、氧代基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、NR9R10、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基取代基取代，其中的烷基和芳基均可選擇如定義部分所定義的取代，R9和R10均如上述定義。
            
術語“芳烷基氨基”(例如苯甲基氨基、二苯乙基氨基等)表示通過氨橋連接的一個或兩個如上定義的含有指定碳原子數的“芳烷基”。兩個芳烷基可能與它們所連接的氮原子一起形成含有3-14個碳原子以及0-3個額外的選自氮、氧或硫的雜原子的飽和、部分飽和或芳族環、二環或三環的環系，該環系統可任選被至少一個C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、羥基、氧代基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、NR9R10、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基取代基取代，其中的烷基和芳基均可任選如定義部分所定義的取代，R9和R10均如上述定義。
            
術語“烷氨基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的烷基連接的“烷氨基”。
            
術語“芳烷基氨基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的烷基連接的“芳烷基氨基”。
            
術語“芳烷基”(如苯甲基、苯乙基)表示通過如上定義的有指定碳原子數的烷基或取代的烷基連接的如下定義的“芳基”。
            
術語“烷基羰基”(如環辛基羰基、戊基羰基、3-己烯基羰基)表示通過羰基連接的如上定義的有指定碳原子數的“烷基”。
            
術語“芳烷基羰基”(如苯環丙基羰基、苯乙基羰基等)表示通過羰基連接的如上定義的有指定碳原子數的“芳烷基”。
            
術語“芳基羰基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的“烷基”連接的“烷基羰基”。
            
術語“芳烷基羰基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的烷基連接的“芳烷基羰基”。
            
術語“烷基羧基”(如庚基羧基、環丙基羧基、3-戊烯基羧基)表示如上定義的“烷基羰基”，其中羰基也通過氧橋連接。
            
術語“芳烷基羧基”(如苯甲基羧基、苯環丙基羧基等)表示如上定義的“芳烷基羰基”，其中羰基也通過氧橋連接。
            
術語“烷基羧基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的“烷基”連接的“烷基羧基”。
            
術語“芳烷基羧基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的“烷基”連接的“芳烷基羧基”。
            
術語“烷基羰基氨基”(如己基羰基氨基、環戊基羰基-氨基甲基、甲基羰基氨基苯基)表示如上定義的“烷基羰基”，其中羰基也通過氨基上的氮原子連接。該氮原子本身可用烷基或芳基取代。
            
術語“芳烷基羰基氨基”(如苯甲基羰基氨基等)表示如上定義的“芳烷基羰基”，其中該羰基也通過氨基上的氮原子連接。該氮原子本身可用烷基或芳基取代。
            
術語“烷基羰基氨基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的“烷基”連接的“烷基羰基氨基”。該氮原子自身可用烷基或芳基取代。
            
術語“芳烷基羰基氨基烷基”表示通過如上定義的有指定碳原子數的“烷基”連接的“芳烷基羰基氨基”。該氮原子自身可用烷基或芳基取代。
            
術語“芳基羰基氨基烷基羰基”表示通過羰基連接的“烷基羰基氨基烷基”。該氮原子可進一步用“烷基”或“芳基”取代。
            
術語“芳基”表示共價連接于能形成穩定共價鍵的任何環位置的非取代，單、二、或三取代的單環、多環、二芳環和雜環芳香族基團，具體優選的連接點對本領域技術人員而言是明顯的(如3-吲哚基、4-咪唑基)。芳基取代基均分別選自鹵素、硝基、氰基、三鹵甲基、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、羥基、COR5、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、芳氧基、芳基C1-C6烷氧基、芳基C1-C6烷氧基C1-C6烷基、硫代基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷硫基C1-C6烷基、芳硫基、芳基C1-C6烷硫基、芳基C1-C6烷硫基C1-C6烷基、NR8R9、C1-C6烷基氨基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、芳基氨基、芳基C1-C6烷基氨基、芳基C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、二(芳基C1-C6烷基)-氨基C1-C6烷基、C1-C6烷基羰基、C1-C6烷基羰基C1-C6烷基、芳基C1-C6烷基-羰基、芳基C1-C6烷基羰基C1-C6烷基、C1-C6烷基羧基、C1-C6烷基羧基C1-C6烷基、芳基C1-C6烷基羧基、芳基C1-C6烷基羧基C1-C6烷基、羧基C1-C6烷氧基、C1-C6烷基羰基氨基、C1-C6烷基羰基氨基C1-C6烷基、-羰基NR7C1-C6烷基COR11、芳基C1-C6烷基羰基-氨基、芳基C1-C6烷基羰基氨基C1-C6烷基、-CONR8R9、或-C1-C6烷基-CONR8R9；其中R7、R8、R9、及R11均如上定義，烷基和芳基基團均可任選按定義部分所定義而取代。
            
芳基的定義包括但不限于苯基、二苯基、茚基、笏基、萘基(1-萘基、2-萘基)、吡咯基(2-吡咯基)、吡唑基(3-吡唑基)、咪唑基(1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基)、三唑基(1,2,3-三唑-1-基、1,2,3-三唑-2-基、1,2,3-三唑-4-基、1,2,4-三唑-3-基)、噁唑基(2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、異噁唑基(3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基)、噻唑基(2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻吩基(2-噻吩基、3-噻吩基、4-噻吩基、5-噻吩基)、呋喃基(2-呋喃基、3-呋喃基、4-呋喃基、5-呋喃基)、吡啶基(2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基)、嘧啶基(2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基)、吡嗪基、噠嗪基(3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基)、喹啉基(2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、異喹啉基(1-異喹啉基、3-異喹啉基、4-異喹啉基、5-異喹啉基、6-異喹啉基、7-異喹啉基、8-異喹啉基)、苯并[b]呋喃基(2-苯并[b]呋喃基、3-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、2,3-二氫-苯并[b]呋喃基(2-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基)、3-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基)、4-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基)、5-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基)、6-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基)、7-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基))、苯并[b]噻吩基(2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、2,3-二氫-苯并[b]噻吩基(2-(2,3-二氫-苯并[b]噻吩基)、3-(2,3-二氫-苯并[b]噻吩基)、4-(2,3-二氫-苯并[b]噻吩基)、5-(2,3-二氫-苯并[b]噻吩基)、6-(2,3-二氫-苯并[b]噻吩基)、7-(2,3-二氫-苯并[b]噻吩基))、4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩基(2-(4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩基)、3-(4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩基)、4-(4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩基)、5-(4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩基)、6-(4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩基)、7-(4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩基))、4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶基(4-(4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶基)、5-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶基、6-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶基、7-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶基))、吲哚基(1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、吲唑基(1-吲唑基、3-吲唑基、4-吲唑基、5-吲唑基、6-吲唑基、7-吲唑基)、苯并咪唑基(1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基、6-苯并咪唑基、7-苯并咪唑基、8-苯并咪唑基)、苯并噁唑基(1-苯并噁唑基、2-苯并噁唑基)、苯并噻唑基(1-苯并噻唑基、2-苯并噻唑基、4-苯并噻唑基、5-苯并噻唑基、6-苯并噻唑基、7-苯并噻唑基)、咔唑基(1-咔唑基、2-咔唑基、3-咔唑基、4-咔唑基)、5H-二苯并[b,f]氮雜庚因基(5H-二苯[b,f]氮雜庚因-1-基、5H-二苯并[b,f]雜庚因-2-基、5H-二苯并[b,f]氮雜庚因-3-基、5H-二苯并[b,f]氮雜庚因-4-基、5H-二苯并[b,f]氮雜庚因-5-基)、10,11-二氫-5H-二苯并[b,f]氮雜庚因基(10,11-二氫-5H-二苯并[b,f]氮雜庚因-1-基、10,11-二氫-5H-二苯并[b,f]氮雜庚因-2-基、10,11-二氫-5H-二苯并[b,f]氮雜庚因-3-基、10,11-二氫-5H-二苯并[b,f]庚因-4-基、10,11-二氫-5H-二苯并[b,f]庚因-5-基)、哌啶基(2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基)、吡咯烷基(1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基)、苯吡啶基(2-苯吡啶基、3-苯吡啶基、4-苯吡啶基)、苯嘧啶基(2-苯嘧啶基、4-苯嘧啶基、5-苯嘧啶基、6-苯嘧啶基)、苯吡嗪基、苯噠嗪基(3-苯噠嗪基、4-苯噠嗪基、5-苯噠嗪基)。
            
術語“芳羰基”(如2-硫代苯羰基、3-甲氧基-蒽羰基、唑羰基)表示通過羰基連接如上定義的“芳基”。
            
術語“芳烷基羰基”(如(2,3-二甲氧苯基)-丙羰基、(2-氯萘基)戊烯羰基、咪唑基環戊羰基)表示如上定義的“芳烷基”，其中的“烷基”也通過羰基連接。
            
本發明中具有不對稱中心的化合物可以外消旋物、外消旋混合物、以及獨立的對映異構體或非對映異構體形式存在，所有異構形式及它們的混合物均包括在本發明中。
            
本發明化合物結構中有堿性或酸性基團的化合物可藥用的鹽也包括在本發明的范圍內。當有酸性取代基如-COOH、5-四唑基和P(O)(OH)2時，可形成銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等，能作為劑型使用。當有堿性取代基如氨基或堿性雜芳基如吡啶基時，可形成酸的鹽類如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、醋酸鹽、馬來酸鹽、棕櫚酸鹽(palmoate)、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等作為劑型使用。
            
當有-COOH或-P(O)(OH)2時，還可使用可藥用的酯，如甲基酯、叔丁基酯、新戊酰氧甲基酯等，以及本領域用于改進溶解度或水解特征以便作為緩釋劑或藥物前體的那些已知酯。
            
此外，本發明化合物中一部分可與水或常用有機溶劑形成溶劑化物。這樣的溶劑化物也包括在本發明范圍內。
            
術語“治療有效量”應指能引起將由科研人員、獸醫、醫生或其他人進行研究的組織、系統、動物或人類的生物學或醫學反應的藥物或藥劑的用量。發明說明意想不到的是包含特定結構片段的化合物顯示出對一或多種PTP酶或其它有磷酸酪氨酸識別單位的分子有抑制或調節能力。
            
因此，本發明涉及符合以下所有3個標準的化合物(1)具有式Ⅰ所表示的結構 其中R、R2和R4均為任何化學基團或化學基團的組合；(2)作為磷酸酪氨酸識別單位的配體，優選為一或多種PTP酶或包含SH2結構域的蛋白質的抑制物或調節物；及(3)分子量小于或等于2500道爾頓。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物具有式Ⅱ表示的結構 其中R，R1和R4為任何化學基團或化學基團的組合，R1優選為H。
            
在另一優選實施方案中，該化合物符合以下所有3個標準(1)具有式Ⅲ所表示的結構 其中R1、R2、R3、R4和R5均為任何化學基團或化學基團的組合，R3和R5可相互共價連接；(2)作為磷酸酪氨酸識別單位的配體，優選為一或多種PTP酶或包含SH2結構域的蛋白質的抑制物或調節物；及(3)分子量小于或等于2500道爾頓。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物具有式Ⅳ表示的結構 其中R1,R3、R4和R5均為任何化學基團或化學基團的組合，R3和R5可相互共價連接，R優選為H。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物具有式Ⅴ表示的結構 其中R1,R3、R4和R5均為任何化學基團或化學基團的組合，R3和R5可相互共價連接，R優選為H。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物具有式Ⅵ表示的結構 其中R3、R4和R5均為任何化學基團或化學基團的組合，R3和R5可相互共價連接，R優選為H。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物具有式Ⅶ表示的結構 其中A與雙鍵一起表示如上定義的任何芳基，R1,R2、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物具有式Ⅷ表示的結構 其中A與雙鍵一起表示如上定義的任何芳基，R,R1、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合，R優選為H。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物具有式Ⅸ表示的結構 其中A與雙鍵一起表示如上定義的任何芳基，R1、R2、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物具有式X表示的結構 其中A與雙鍵一起表示如上定義的任何芳基，R2、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物具有式Ⅺ表示的結構 其中A與雙鍵一起表示如上定義的任何芳基，R,R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合，R優選為H。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物具有式Ⅻ表示的結構 其中R1是能作為質子供體和/或質子受體的化學基團，優選-COOH、5-四唑基、-NH2、-CONH2，而R,R2、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物具有式XX表示的結構 其中A與雙鍵一起表示苯基、二苯基、茚基、笏基、笏基-9-酮、萘基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基或吡嗪基；或A與雙鍵一起表示吲哚基、苯并[b]噻吩基、苯并[b]呋喃基、吲唑基、苯并[b]異噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、9H-噻吩并[2,3-c]苯并吡喃基、4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩基、4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶基、4,5,6,7-四氫-噻吩并[3,2-c]吡啶基、4,5,6,7-四氫-噻吩并[3,2-b]吡啶基、4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃基、4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]噻喃基或4,5,6,7-四氫-4,7-橋亞乙基-噻吩并[2,3-b]吡啶基；或A與雙鍵一起表示呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、異噁唑基、異噻唑基、1,2,3-噁唑基、呋咱基或1,2,3-噻唑基；
            
或A與雙鍵一起表示呋喃并(furo)[2,3-b]吡啶基、噻吩并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、呋喃并[2,3-c]吡啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、噻吩并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、呋喃并[3,2-d]吡啶基、噻吩并[3,2-d]吡啶基、吡咯并[3,2-d]吡啶基、呋喃并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、吡咯并[2,3-d]嘧啶基、呋喃并[2,3-b]吡嗪基、噻吩并[2,3-b]吡嗪基、吡咯并[2,3-b]吡嗪基、呋喃并[2,3-c]噠嗪基、噻吩并[2,3-c]噠嗪基、吡咯并[2,3-c]噠嗪基、呋喃并[2,3-d]噠嗪基、噻吩并[2,3-d]噠嗪基、吡咯并[2,3-d]噠嗪基、呋喃并[3,2-c]噠嗪基、噻吩并[3,2-c]噠嗪基、吡咯并[3,2-c]噠嗪基、喹嗪基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、2,3-二氮雜萘基、喹唑啉基、喹喔啉基、1,8-二氮雜萘基、苯并二氫吡喃基、二氫苯并噻喃基、異苯并二氫吡喃基、異二氫苯并噻喃基、2,3-二氫-噻吩并[2,3-b]呋喃基、4,6-二氫-噻吩并[2,3-c]呋喃基、2,3-二氫-噻吩并[3,2-b]呋喃基、4,5-二氫-噻吩并[2,3-b]噻吩基、4,6-二氫-噻吩并[3,4-b]噻吩基、5,6-二氫-噻吩并[3,2-b]噻吩基、4,5-二氫-噻吩并[2,3-b]吡咯基、噻吩并[3,2-d]異噻唑基、噻吩并[3,2-d]噻唑基、噻吩并[2,3-d]噻唑基、噻吩并[2,3-c]吡咯基-4,6-二酮、1H-噻吩并[2,3-d]咪唑基、6H-噻吩并[2,3-b]吡咯基、5,6-二氫-4H-噻吩并[2,3-c]吡咯基或4H-噻吩并[3,2-b]吡咯基；R1和R2分別選自COR5、OR6、CF3、硝基、氰基、SO3H、SO2NR7R8、PO(OH)2、CH2PO(OH)2、CHFPO(OH)2、CF2PO(OH)2、C(=NH)NH2、NR7R8以及以下5元雜環  
            
R3、R16和R17為氫、鹵素、硝基、氰基、三鹵甲基、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、羥基、羧基、羧基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳基C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、芳氧基、芳基C1-C6烷氧基、芳基C1-C6烷氧基C1-C6烷基、硫代基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷硫基C1-C6烷基、芳硫基、芳基C1-C6烷硫基、芳基C1-C6烷硫基C1-C6烷基、NR7R8、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、芳基C1-C6烷氨C1-C6烷基、二(芳基C1-C6烷基)氨C1-C6烷基、C1-C6烷基羰基、C1-C6烷基羰基C1-C6烷基、芳基C1-C6烷基羰基、芳基C1-C6烷羰基C1-C6烷基、C1-C6烷羧基、C1-C6烷羧基C1-C6烷基、芳羧基、芳基C1-C6烷羧基、芳基C1-C6烷羧基C1-C6烷基、C1-C6烷羰基氨基、C1-C6烷羰基氨基C1-C6烷基、-羰基NR7C1-C6烷基COR11、芳基C1-C6烷羰基氨基、芳基C1-C6烷羰基氨基C1-C6烷基、CONR7R8、或C1-C6烷基CONR7R8,其中烷基和芳基基團可選擇性取代，R11是NR7R8或C1-C6烷基NR7R8；或當R16和R17為氫時，R3為A-B-C-D-C1-C6烷基，其中A為C1-C6烷基、芳基或芳基C1-C6烷基；B為氨基、硫代基、SO、SO2或氧代基；C為C1-C8烷基、氨基；D為一化學鍵、氨基或C1-C8烷基，其中所述烷基和芳基基團可選擇性取代；或 其中R12、R13和R14各自為氫、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基，所述烷基和芳基均可選擇性取代；R4為氫、羥基、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、NR7R8、C1-C6烷氧基；其中所述烷基和芳基均可選擇性取代；R5為羧基、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、CF3、NR7R8；其中所述烷基和芳基均可選擇性取代；R6為氫、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基；其中所述烷基和芳基基團均可選擇性取代；R7和R8分別選自氫、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、C1-C6烷羰基、芳羰基、芳基C1-C6烷羰基、C1-C6烷羧基或芳基C1-C6烷羧基；其中所述烷基和芳基均可選擇性取代；或R7和R8與它們所連接的氮一起形成飽和、部分飽和或芳環、二環、或三環的環系統，其中含有3-14個碳原子以及0-3個其它選自氮、氧或硫的雜原子，該環系統可選擇地由至少一個C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、羥基、氧代基、C1-C6烷氧基、芳基C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、NR9R10或C1-C6烷氨基C1-C6烷基取代，其中R9和R10分別選自氫、C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、C1-C6烷羰基、芳羰基、芳基C1-C6烷基羰基、C1-C6烷基羧基或芳基C1-C6烷基羧基；其中所述烷基和芳基均可選擇性取代；或R7和R8分別為飽和或部分飽和環狀的5,6或7元胺、酰亞胺或內酰胺；本發明的化合物可通過不同作用機制調節或抑制蛋白質酪氨酸磷酸酶或其它具有磷酸酪氨酸識別單位的分子的活性。在不限制本發明范圍的這類作用機制的實例有(a)經典的競爭性抑制；(b)非競爭性抑制；(c)如上述混合型抑制。
            
本發明還涉及攝入細胞或哺乳動物后具有上述結構的化合物。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物作為一或多種PTP酶的經典的競爭性抑制物。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物作為一或多種PTP酶的混合型抑制物。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物主要作為一或多種參與對酪氨酸激酶信號傳遞途徑的調節的PTP酶的抑制物。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物主要通過與一或多種調節性PTP酶相互作用而抑制或調節受體型酪氨酸激酶的信號傳遞，優選胰島素受體、IGF-1受體和/或胰島素受體家族的其它成員、EGF-受體家族、血小板衍生的生長因子受體家族、神經生長因子受體家族、肝細胞生長因子受體家族、生長激素受體家族和/或其它受體型酪氨酸激酶家族成員的信號傳遞。在另一優選實施方案中，本發明的化合物主要通過調節一或多種調節性PTP酶而抑制或調節非受體型酪氨酸激酶的信號傳遞，優選通過對Src激酶家族或其它細胞內激酶的調節而實現。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物主要對負調節信號傳遞途徑的一或多種PTP酶的活性進行抑制或調節。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對正調節信號傳遞途徑的一或多種PTP酶，優選CD45的活性進行抑制或調節。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對在免疫細胞中正調節信號傳遞途徑的一或多種PTP酶的活性進行抑制或調節。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對負調節信號傳遞途徑的一或多種PTP酶的活性進行抑制或調節。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物通過與一或多種PTP酶的活性位點結合抑制這些PTP酶，或其是別構調節物，與對這些PTP酶的底物結合具有負面影響的其他位點的結合而抑制這些PTP酶。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物通過與一或多種PTP酶活性位點以外的結構，優選SH2結構域，相互作用而調節這些酶的活性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物通過結合非PTP酶信號傳遞分子的SH2結構域或PTB結構域而調節信號傳遞途徑。
            
在一實施方案中，本發明的化合物的特征是，作為選擇性PTP酶抑制物或選擇性磷酸酪氨酸識別單位之配體化合物。例如，本發明的化合物對本文未提到的PTP酶或優選表1所列的PTP酶具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物的特征是，作為非選擇性PTP酶抑制物如至少4種PTP酶或4個PTP酶家族的抑制物或調節物。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPα家族具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPα具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPε具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對CD45具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPβ家族具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPβ具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對PTP-DEP1具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTP-LAR家族具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTP-LAR具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPσ具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPδ具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPμ家族具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPμ具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPκ具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTP1B家族具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTP1B具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對TC-PTP具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對SHP-PTP家族具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對SHP-1具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對SHP-2具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPζ家族具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPγ具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTP-PEST家族具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPH1家族具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPH1具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPD1具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPD2具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPMEG1具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對IA-2家族具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對IA-2具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對IA-2β具有選擇性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPψ家族具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPψ具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPρ具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對PTPφ具有選擇性。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物分子量小于1000道爾頓，優選大約100道爾頓。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對一或多種PTP酶的Ki值小于200μM。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對一或多種PTP酶的Ki值小于2μM。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對一或多種PTP酶的Ki值小于100nM。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對一或兩種PTP酶或PTP酶家族的Ki值小于2μM，而對至少兩種其它PTP酶或PTP酶家族的Ki值大于50μM。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對一或兩種PTP酶或PTP酶家族的Ki值小于100nM，而對至少兩種其它PTP酶或PTP酶家族的Ki值大于10μM。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物對一或多種帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的IC50值小于200M。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對一或多種帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的IC50值小于2M。
            
在另一優選實施方案中，本發明的化合物對一或多種帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的IC50值小于100nM。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物是一或多種PTP酶如參與酪氨酸激酶信號傳遞途徑之調節的蛋白質酪氨酸磷酸酶的抑制物。優選的實施方案包括通過與調節性PTP酶相互作用而調節受體-酪氨酸激酶信號傳遞途徑，如胰島素受體、IGF-1受體和其它胰島素受體家族的成員、EGF受體家族、血小板衍生的生長因子受體家族、神經生長因子受體家族、肝細胞生長因子受體家族、生長激素受體家族和其它受體型酪氨酸激酶家族的成員的信號傳遞途徑。本發明更優選的實施方案是通過對調節性PTP酶的調節，如對Src激酶家族成員和其它非受體酪氨酸激酶進行調節，而調節非受體酪氨酸激酶的信號傳遞。本發明的一類優選實施方案涉及對能負調節信號傳遞途徑的PTP酶的活性進行調節。一個不限制本發明范圍的實例是負調節紅細胞生成素的信號傳遞途徑的SHP-1。本發明的另一類優選實施方案涉及對能正調節信號傳遞途徑的PTP酶的活性進行調節。對后者的不限制本發明范圍的實例是使Src家族的酪氨酸激酶去磷酸化，從而在造血干細胞系統來源的細胞的信號傳遞中起正調節作用的CD45。CD45抑制物的一優選類別可用于調節淋巴細胞，包括T淋巴細胞和/或B淋巴細胞的活性。
            
在一優選實施方案中，本發明的化合物作為一或多種PTP酶活性位點的調節物或抑制物。在另一優選實施方案中，本發明的化合物通過與一或多種PTP酶活性位點以外的結構，優選SH2結構域，相互作用而調節這些酶的活性。又一優選實施方案包括通過使本發明的化合物與非PTP酶信號傳遞分子中SH2結構域或PTB結構域結合而調節信號傳遞途徑。
            
在優選實施方案中，本發明的化合物是選擇性抑制物，它們對某一PTP酶家族的抑制比對另一PTP家族的抑制能力大10倍以上。
            
在一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、葡萄糖耐量異常、胰島素抗性、肥胖、免疫功能紊亂包括自身免疫病和艾滋病、伴有凝血系統功能紊亂的疾病、過敏性疾病、骨質疏松癥、增生性病癥包括癌癥和牛皮癬、伴有生長激素的合成或效應降低或增加的疾病、伴有調節生長激素釋放和/或對生長激素的應答的激素或細胞因子合成的減少或增加的疾病、腦部疾病包括早老性癡呆和精神分裂癥、以及傳染病。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、受損的葡萄糖耐量、胰島素抗性、和/或肥胖。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防伴有免疫功能紊亂的疾病，包括自身免疫病如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可作為免疫抑制劑使用。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制或治療伴有免疫功能紊亂如艾滋病的疾病。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防過敏性疾病，包括哮喘和過敏性皮膚病。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防增生性疾病，包括癌癥。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防骨質疏松癥。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防牛皮癬。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防伴有生長激素的合成或效應降低或增加的疾病、伴有調節生長激素釋放和/或對生長激素的應答的激素或細胞因子合成的減少或增加的疾病。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防伴有凝血系統功能紊亂的疾病。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防腦部疾病如早老性癡呆和精神分裂癥。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制、治療或預防傳染病。
            
本發明的化合物還可用于制備能控制、治療或預防上述疾病或病癥的藥物。
            
其它優選實施方案包括用本發明的化合物調節細胞與細胞間的相互作用以及調節細胞與基質間的相互作用。
            
本發明還涉及藥用組合物，其中包括作為活性成分的至少一種本發明的化合物以及一種藥用載體或稀釋劑。任選地，該藥用組合物可包含至少一種本發明的化合物，和具有不同活性的化合物，如抗生素或其它藥理活性物質。
            
作為優選實施方案，本發明的化合物可作為治療藥物用于對Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、受損的葡萄糖耐量、胰島素抗性、和肥胖患者體內參與胰島素受體酪氨酸激酶信號傳遞的一或多種PTP酶進行抑制或調節。其它優選實施方案包括用本發明的化合物控制伴有PTP酶活性的一般性或特異性功能紊亂的疾病，如牛皮癬和腫瘤等增生性疾病。作為另一實施方案，可在控制骨質疏松癥的藥物的制劑中應用本發明的化合物。
            
本發明的優選實施方案還包括在藥物制劑中應用本發明的化合物，以通過調節一或多種PTP酶、或其它對磷酸酪氨酸有親和力的參與控制或誘導這些激素作用的信號傳遞分子、或任何調節分子的活性，而增加生長激素及其類似物或包括IGF-1和IGF-2在內的生長調節素的分泌或作用。
            
本發明的化合物可用于藥物制劑中以控制免疫系統各種疾病，作為正常或紊亂的免疫功能，包括自身免疫反應的刺激物或抑制物使用。本發明的其它實施方案包括將本發明的化合物用于控制過敏反應，如哮喘、皮膚反應、結膜炎。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于免疫抑制的藥物制劑中。這類應用的一個非限制性實例與器官和/或組織移植的控制有關。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于預防或誘導血小板凝集的藥物制劑中。
            
在另一實施方案中，本發明的化合物可用于控制傳染病的藥物制劑中。具體地，本發明的化合物可用于控制由耶爾森菌及其它細菌引起的傳染病以及由病毒或其它微生物引起的疾病。
            
本發明的化合物還可用于控制或預防動物，包括具有重要商業價值的動物體內的疾病。
            
本發明還包括用本領域技術人員眾所周知的方法經應用固定化的本發明化合物的親和純化過程分離PTP酶的方法。本領域技術人員熟知的這類方法可用于鑒定新的PTP酶或其它具有磷酸酪氨酸識別單位的分子。一個非限制性實例是，本發明的化合物可通過與某固相的結合而固定化。用本領域技術人員熟知的方法對組織樣品或細胞系來源的樣品進行裂解得到裂解產物，使之流過上述結合了本發明化合物的固相。經過為除去與該固相非特異性結合的物質而設計的適當洗滌步驟后，用本領域技術人員已知的標準方法，可使大部分PTP酶或其它有磷酸酪氨酸識別單位的分子連接在該固相所結合的本發明化合物上。上述PTP酶或其它具有磷酸酪氨酸識別單位的分子再用本領域已知的方法釋放，然后按本領域技術人員熟知的標準方法進行氨基酸序列分析。通過用適當的遺傳密碼進行推導而將上述氨基酸序列反向翻譯為相應cDNA的核苷酸序列。該核苷酸序列可用于設計并產生等價寡核苷酸，后者可用于從與所分離的PTP酶或帶pTyr識別單位的分子對應或類似的蛋白質或糖蛋白的相應cDNA編碼文庫中鑒別出部分或全長cDNA克隆。上述寡核苷酸或分離的cDNA克隆同樣可用于分離與這些cDNA克隆相應的基因組克隆。可用本領域技術人員熟知的方法將上述部分或全長cDNA插入適當的載體并表達和純化蛋白質。上述純化的蛋白質，具體是PTP酶，可用于按所述進一步分析本發明化合物的抑制能力以及選擇性。
            
本發明還涉及偶聯在適當固相基質如Wang-樹脂或Rink-樹脂上的本發明的化合物。
            
本發明還涉及從生物樣品中分離與本發明化合物有親和力的蛋白質或糖蛋白的方法，包括●使用偶聯在適當固相基質上而固定化的本發明化合物與生物樣品接觸，以使上述固定化的化合物通過結合上述蛋白質或糖蛋白而形成復合物，●從上述生物樣品中除去未結合的物質，并分離上述復合物，然后●從上述復合物中提取上述蛋白質或糖蛋白。
            
本發明還涉及從生物樣品中分離與本發明化合物有親和力的蛋白質酪氨酸磷酸酶的方法，包括●使偶聯在適當固相基質上而固定化的本發明化合物與生物樣品接觸，以使上述固定化的化合物通過結合上述蛋白質酪氨酸磷酸酶而形成復合物，●從上述生物樣品中除去未結合的物質，并分離上述復合物，●從上述復合物中提取上述蛋白質酪氨酸磷酸酶。
            
本發明還涉及從生物樣品中分離與本發明化合物有親和力的含Src同源性結構域2的蛋白質或含磷酸酪氨酸結合結構域的蛋白質的方法，包括●使偶聯在適當固相基質上而固定化的本發明化合物與生物樣品接觸，以使上述固定化的化合物通過結合上述含Src同源性結構域2的蛋白質或含磷酸酪氨酸結合結構域的蛋白質而形成復合物，●從上述生物樣品中除去未結合的物質，并分離上述復合物，●從上述復合物中提取上述含Src同源性結構域2的蛋白質或含磷酸酪氨酸結合結構域的蛋白質。
            
本發明還涉及偶聯在熒光分子或放射性分子上的本發明化合物。
            
本發明還涉及將熒光分子或放射性分子偶聯至在發明的化合物上的方法，包括●使上述化合物與上述熒光分子或放射性分子在反應混合物中接觸，以形成復合物，●除去未復合的物質，并從上述反應混合物中分離上述復合物。
            
本發明還涉及用偶聯在熒光分子或放射性分子上的本發明的化合物檢測細胞或受試者體內蛋白質酪氨酸磷酸酶或其它有磷酸酪氨酸識別單位的分子的方法，包括●使上述化合物接觸上述細胞或其提取物或來自上述受試者的生物樣品或通過將上述化合物注射至上述受試者，以使上述化合物與上述蛋白質酪氨酸磷酸酶或上述帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子形成復合物，●檢測上述復合物，從而測定上述蛋白質酪氨酸磷酸酶或上述有磷酸酪氨酸識別單位的其它分子的存在。
            
本發明還涉及用偶聯在熒光分子或放射性分子上的本發明的化合物定量細胞或受試者體內蛋白質酪氨酸磷酸酶或其它有磷酸酪氨酸識別單位的分子的量的方法，包括
            
●使上述化合物接觸上述細胞或其提取物或來自上述受試者的生物樣品或通過將上述化合物注射至上述受試者，以便上述化合物與上述蛋白質酪氨酸磷酸酶或上述帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子形成復合物，●測定上述復合物的量，從而測定上述蛋白質酪氨酸磷酸酶或上述有磷酸酪氨酸識別單位的其它分子的存在。
            
本發明還涉及用偶聯在熒光分子或放射性分子上的本發明的化合物測定細胞或受試者體內特定蛋白質酪氨酸磷酸酶或蛋白質酪氨酸磷酸酶組或上述有磷酸酪氨酸識別單位的其它分子的功能的方法，包括●使上述化合物接觸上述細胞或其提取物或來自上述受試者的生物樣品或通過將上述化合物注射至上述受試者，以使上述化合物形成與上述蛋白質酪氨酸磷酸酶或上述帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的復合物，●檢測上述復合物所誘導的生物效應。
            
藥理學方法根據以上說明，藥物劑量將取決于所用的本發明化合物、給藥方式以及治療目的。但一般采用每日約0.5mg-約1000mg，優選約1mg-約500mg的本發明化合物，方便地采用每日1-5次給藥，或選擇用緩釋劑型可獲得較滿意的結果。適于口服的劑型通常包含約0.5mg-約1000mg，優選約1mg-約500mg的本發明化合物，且該化合物混合了藥用載體或稀釋劑。
            
本發明的化合物可以可藥用的酸加成鹽形式或在可能的情況下以金屬鹽或C1-C6烷基銨鹽的形式給藥。這類鹽形式顯示出與游離酸的形式幾乎相同的活性水平。
            
本發明還涉及含有本發明的化合物或其可藥用的鹽的藥用組合物，且這類組合物通常還包含藥用載體或稀釋劑。包含本發明化合物的組合物可用常規技術制備并以常規形式存在，例如，膠囊、片劑、溶液或懸浮液。
            
所用藥用載體可以是常規的固相或液相載體。固相載體的實例有乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、金合歡膠、硬脂酸鎂以及硬脂酸。液相載體的實例有糖漿、花生油、橄欖油和水。
            
類似地，載體或稀釋劑可包括本領域已知的任何延時材料，如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，單獨使用或與蠟質混合使用。
            
若用的是口服藥所用的固相載體，則該制劑可以是成片的、包在較硬的明膠膠囊中的粉末或片劑形式，或可以是含片或釘劑的形式。固相載體的用量有較大范圍的變動，但通常是約25mg-約1g。若用的是液相載體，該制劑可以是糖漿、乳劑、軟明膠膠囊或無菌注射液如水或非水懸浮液或溶液的形式。
            
總而言之，是將本發明的化合物分散在單位劑型中，每一單位劑型包含10-200mg活性成分，這些活性成分容納在可藥用的載體中或與之組合。
            
本發明的化合物作為藥物給藥于患者如人時，使用劑量為1-500mg/天，如每劑量約100mg。
            
用常規成片技術制備的常見片劑包含核心活性化合物(以游離化合物或其鹽)  100mg膠態二氧化硅(Areosil_)   1.5mg纖維素，微晶(Avicel_) 70mg改良的纖維素膠(Ac-Di-Sol_)   7.5mg硬脂酸鎂包衣HPMC約9mg*Mywacett_9-40T  約0.9mg*酰化單甘油酯，作為膜包衣的增塑劑使用。
            
給藥途徑可以是能有效運送所述活性化合物至適當的或預期的作用位置的任何途徑，如口服或非胃腸道用藥，例如直腸、經皮、皮下、鼻內、肌肉、局部、靜脈、尿道、眼用溶液或軟膏劑，優選口服途徑。
            
制備本發明化合物的方法將在以下實施例中進一步舉例說明，但并非限制本發明的范圍。
            
實施例下文中，TLC為薄層色譜，CDCl3為氘氯仿，CD3OD為四氘甲醇而DMSO-d6為六氘二甲亞砜。化合物的結構通過元素分析或NMR(標題化合物中特征性質子的指定峰值在適當的位置出現)證實。1HNMR化學位移(δH)以四甲基硅烷為內部參照標準低磁場的每百萬分之幾(ppm)表示。M.p.是熔點，以℃表示，未校正。柱色譜用W.C.Still etal.,J.Org.Chem.432923(1978)所述方法在Merck硅膠柱60(Art.9385)上進行。做HPLC分析用5μmC184×250mm色譜柱以水與乙腈的各種混合物洗脫，流速為1ml/min，如實驗部分所述。
            
作為起始物料使用的化合物為已知化合物或能通過已知方法容易制備的化合物。
            
Wang-樹脂是帶有4-羥甲基苯酚醚接頭的聚苯乙烯。
            
2-氨基噻吩按Gewald et al.,Chem.Ber. 9994(1996)制備。
            
3-氨基噻吩按H.Hartmann andJ.Liebscher,Synthesis 275(1984)制備。
            
實施例1 2-(草酰氨基)苯甲酸將乙基草酰氯(10.0 g,0.073 mol)滴加至攪拌過的鄰氨基苯甲酸(20.1 g,0.15 mol)的無水四氫呋喃(250 ml)溶液中。所得反應混合物在室溫下攪拌15分鐘，過濾，將溶劑真空蒸發，得到粗制的16.4 g(94％)的2-(乙氧草酰氨基)苯甲酸油。
            
向上述苯甲酸(10.0 g,0.042 mol)的乙醇(350 ml)溶液中加入氫氧化鈉(3.7 g,0.092 mol)的水(100 ml)溶液。所得反應混合物在室溫下攪拌60 h。加濃鹽酸至pH=1,過濾除去沉淀，水洗(3×100ml)，乙醚洗滌(3×80ml)，真空干燥得7.1 g(81％)標題化合物固體。
            
M.p.214-215℃元素分析，計算值(C9H7NO5,0.2H2O)C,51.68％；H,3.37％；N,6.70％。實測值C,50.69％；H,3.32％；N,6.52％。
            
用實施例1所述類似方法制備以下化合物。
            
實施例2 3-(草酰氨基)萘-2-羧酸M.p.227-228℃元素分析，計算值C13H9NO5C,60.24％；H,3.50％；N,5.40％。實測值C,59.98％；H,3.46％；N,5.25％。
            
實施例3 2-(草酰氨基)-5-碘-苯甲酸MS(ES)m/z=326(M+1)元素分析，計算值(C9H6MO5,0.75×H2O)C,31.01％；H,2.17％；N,4.02％。實測值C,31.14％；H,2.33％；N,3.76％。
            
實施例4 4-(草酰氨基)-二苯基-3-羧酸將苯基硼酸(2.2g,17.73mmol)的甲醇(10ml)溶液在室溫下加至5-溴-2-氨-苯甲酸甲酯(3.0g,13.04mmol)、四(三苯基膦)合鈀(o)(0.5g,0.44mmol)、甲苯(40ml)以及2N碳酸鈉水溶液(14.8ml)組成的懸浮液中。所得反應混合物在回流溫度下加熱4h，冷卻，加水(50ml)稀釋。過濾除去不溶物，分相。水相用乙基乙酯(100ml)提取，混合的有機相經水(2×80ml)，稀釋的氨水(80ml)以及飽和的氯化鈉水溶液(80ml)洗滌。將有機相干燥(MgSO4)、過濾并真空蒸發，得到3.4g粗制的4-氨-二苯基-3-羧酸甲酯，在硅膠柱(1L)上用乙基乙酯和庚烷(1∶3)的混合物作洗脫劑進行純化。收集純化級分，并真空蒸發，得到2.7g(91％)的4-氨-二苯基-3-羧酸甲酯。
            
用類似實施例1所述的方法將4-氨-二苯基-3-羧酸甲酯轉化為標題化合物。
            
M.p.223-224℃元素分析，計算值C15H11NO5,0.5×H2OC,61.23％；H,4.11％；N,4.76％。實測值C,60.96％；H,4.01％；N,4.62％。
            
實施例5 4-溴-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.71(d,J=7.5Hz,1H),8.25(s,1H),7.80(d,J=7.5Hz,1H)。
            
MSESI(-)288[M-1(81Br)),287(M-1(80Br)]。
            
實施例6 4,5-二甲氧基-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.42(s,1H),7.60(s,1H),3.95(s,3H),3.86(s,3H)。
            
MSESI(-)268[M-1]。
            
實施例7 5-硝基-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.90(d,J=7.5Hz,2H),8.42(s,1H)。
            
MSESI(-)253[M-1]。
            
實施例8 4-硝基-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ9.60(s,1H),8.36(m,1H),8.02(m,1H)。
            
MSESI(-)253[M-1]。
            
實施例9 5-氯-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.72(d,J=7.5Hz,1H),8.10(s,1H),7.60(d,J=7.5Hz,1H)。
            
MSESI(-)242[M-1(35Cl)),244(M-1(37Cl)]。
            
實施例10  
            
4-氯-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.80(s,1H),8.10(d,J=7.5Hz,1H),7.22(d,J=7.5Hz,1H)。
            
MSESI(-)242[M-1(35Cl)),244(M-1(37Cl)]。
            
實施例11 3-甲基-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ2.2(s,3H),7.2-7.7(m,3H),10.5(s,1H),12.9(s,1H)。
            
實施例12 4,5-二氟-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.03(m,1H),8.61(dd,1H),12.55(s,1H,NHCO)實施例13 N-(2-氨基甲酰基-苯基)-草酸1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.20(t,1H),7.55(t,1H),7.73(bs,1H,CONH2),7.83(d,1H),8.30(bs,1H,CONH2),8.52(d,1H),12.9(s,1H,NHCO)。
            
實施例14 2-(乙氧草酰氨基)苯甲酸1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ1.33(t,3H),4.30(q,2H),7.24(t,1H),7.65(t,1H),8.03(d,1H),8.56(d,1H),12.6(s,1H,NHCO)。
            
實施例15 6-氯-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.68(bs,1H),8.06(d,J=9Hz,1H),7.43(t,J=9Hz,1H),7.27(d,J=9Hz,1H)。
            
實施例16 3-甲氧基-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.98(bs,1H),7.37-7.25(m,3H),3.80(s,3H)。
            
實施例17 2-(草酰氨基)對苯二酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.28(s,1H),8.22(d,J=9Hz,1H),7.75(t,J=9Hz,1H)。
            
實施例18 5-氟-2-(草酰氨基)-苯甲酸1HMR(400MHz,CD3OD)δ7.50(m,1H),7.25(m,1H),7.22(m,1H)。
            
MS m/z 227.2(M-1)。
            
實施例19 3,5-二溴-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.08(s,1H),8.05(s,1H)。
            
MS m/z 366.1(M-1)。
            
實施例20 3,5-二碘-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.45(s,1H),8.25(s,1H)。
            
MS m/z 460.1(M-1)。
            
實施例21  
            
2-(草酰氨基)-5-(3-噻吩-3-基-異噁唑-5-基)苯甲酸將鹽酸羥氨(1.24g,18mmol)和三乙基氨(2.5ml,18mmol)加入噻吩-3-醛(2.0g,18mmol)的l,4-二噁烷(6.0ml)溶液中。混合物超聲振蕩0.5h，然后在室溫下攪拌116h,35℃下攪拌48小時。溶劑經真空除去，殘留物溶于二氯甲烷，經水洗，干燥(MgSO4)，過濾及真空蒸發，得到1.97g(87％)的噻吩-3-醛肟的油。
            
向已室溫攪拌的上述噻吩-3-醛肟(120mg,0.99mmol)和2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-乙炔基-苯甲酸甲酯(100mg,0.33mmol)的四氫呋喃(2.5ml)溶液中加入0.75M漂白劑(bleach)(1.3ml,0.99mmol)。該溶液先在室溫下攪拌24h，然后在35℃攪拌24h。溶劑經真空蒸發，殘留物溶于二氯甲烷，水洗，鹽水洗并干燥(MgSO4)，過濾及真空蒸發。殘留膜經制備TLC純化得到21mg(15％)的2-(叔-丁氧草酰氨基)-5-(3-噻吩-3-基-異噁唑-5-基)苯甲酸甲酯的油。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.75(s,1H),8.92(d,1H,J=11Hz),8.59(s,1H),8.06(d,1H,J=11Hz),7.91(s,1H),7.59(d,1H,J=7Hz),7.28(d,1H,J=7Hz),6.90(s,1H),4.07(s,3H),1.65(s,9H).
            
上述2-(叔-丁氧草酰氨基)-5-(3-噻吩-3-基-異噁唑-5-基)苯甲酸甲酯(10mg,0.023mmol)溶于20％三氯醋酸/二氯甲烷(0.3ml)并于室溫攪拌21h。真空除去溶劑，得到8.4mg(98％)的2-(草酰氨基)-5-(3-噻吩-3-基-異噁唑-5-基)苯甲酸甲酯的固體。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ12.75(s,1H),8.95(d,1H,J=11Hz),8.62(s,1H),8.18(d,1H,J=11Hz),7.75(m,1H),7.65(m,1H),7.60(s,1H),4.07(s,3H).
            
室溫下向2-(草酰氨基)-5-(3-噻吩-3-基-異噁唑-5-基)苯甲酸甲酯(8.4mg,0.023mmol)的甲醇(1.5ml)和四氫呋喃(0.5ml)溶液中加入1N氫氧化鋰(90μl,0.90mmol)。將該溶液攪拌48h。溶劑經真空除去，而殘留物再溶于水。該溶液用1N鹽酸酸化至pH=1，用乙酸乙酯提取。混合的提取物經鹽水洗，干燥(MgSO4)，過濾，溶劑真空蒸發，得到6.4mg(79％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.75(d,1H,J=11Hz),8.70(s,1H),7.95(s,1H),7.82(d,1H,J=11Hz),7.70(m,1H),7.60(m,1H).
            
實施例22 2-(草酰氨基)-5-(3-苯基-異噁唑-5-基)苯甲酸將鹽酸羥氨(1.3g,19mmol)和三乙基氨(2.6ml,19mmol)加入苯甲基醛(2.0g,19mmol)的1,4-二噁烷(6.0ml)溶液中。混合物經超聲振蕩0.5h，在室溫下攪拌116h,35℃攪拌24h。溶劑經真空除去，殘留物溶于二氯甲烷，水洗，干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發，得1.9g(84％)的苯甲基醛肟油。
            
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18(s,1H),7.60(m,2H),7.41(m,3H)。
            
向室溫攪拌的苯甲基醛肟(120mg,0.99mmol)和2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-乙炔基-苯甲酸甲酯(100mg,0.33mmol)的四氫呋喃(2.5ml)溶液中加入0.75M漂白劑(1.3ml,0.99mmol)。該溶液先在室溫下攪拌24h，然后在35℃攪拌24h。溶劑經真空蒸發，殘留物溶于二氯甲烷。溶液經水洗，鹽水洗，干燥(MgSO4)，過濾，溶劑真空蒸發。殘留物經乙醚洗滌，得到一種固體沉淀，經過濾，得59mg(42％)的2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-(3-苯基-異噁唑-5-基)苯甲酸甲酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.75(s,1H),8.85(d,1H,J=11Hz),8.62(s,1H),8.06(d,1H,J=11Hz),7.91(m,2H),7.52(m,3H),6.90(s,1H),4.07(s,3H),1.65(s,9H).
            
上述2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-(3-苯基-異噁唑-5-基)苯甲酸甲酯(28mg.0.07mmol)溶于20％三氟醋酸/二氯甲烷(0.5ml)溶液中，室溫攪拌6h。溶劑經真空除去，得25mg(100％)的2-氨基-5-(3-苯基-異噁唑-5-基)苯甲酸甲酯固體。
            
(復制原文第93頁第4-5行)，空3行向上述2-氨基-5-(3-苯基-異噁唑-5-基)苯甲酸甲酯(12.5mg,0.034mmol)的甲醇(2.5ml)和四氫呋喃(1.0ml)溶液中室溫下加入1N氫氧化鋰(1.4ml,0.136mmol)。溶液攪拌12h，溶劑真空除去。殘留物溶于以1N鹽酸酸化為pH=1的水中，用乙酸乙酯提取。有機相提取物經鹽水洗，干燥(MgSO4)，過濾，溶劑真空蒸發，得7.7mg(64％)的標題化合物固體。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ12.75(s,1H),8.85(d,1H,J=11Hz),8.62(s,1H),8.15(d,1H,J=11Hz),7.91(m,2H),7.52(m,3H),6.90(s,1H),4.07(s 3H)LC/MS m/z351(M-1).
            
實施例23 5-乙炔基-2-(草酰氨基)苯甲酸將2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-碘代-苯甲酸(5.0g,12.8mmol)和N,N-二甲基甲酰胺二叔丁基乙縮醛(12ml,51.2mmol)的甲苯(100ml)溶液在回流下加熱20h。反應混合物冷卻至室溫，真空濃縮，殘留物溶于乙酸乙酯(150ml)。乙酸乙酯相用水(3×35ml)、鹽水(20ml)洗滌,揮發物真空蒸發。殘留物用25％乙酸乙酯/己烷作洗脫劑經硅膠色譜純化。純化級分混合并真空濃縮得到2.3g2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-碘代-苯甲酸叔丁酯油。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(d,J=9Hz,1H),8,27(s,1H),7.83(d,J=9Hz,1H),1.62(s,18H)將2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-碘代-苯甲酸叔丁酯(0.83g,1.86mmol)、三甲基甲硅烷基乙炔(2ml)、以及三乙基胺(1ml,7.44mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5ml)中，該溶液用氬吹洗。加入二氯·二(三苯基膦)合鈀(Ⅱ)(26 mg,0.15mmol)以及碘化銅(Ⅰ)(4mg,0.15mmol)，反應混合物在60℃的氬中攪拌5h。粗制混合物用乙酸乙酯(40ml)稀釋，水洗(3×10ml)和鹽水洗(2×10ml)。溶劑真空蒸發，得0.77g(99％)的2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-三甲基甲硅烷基乙炔基-苯甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.59(s,1H),8.71(d,J=9Hz,1H),8.07(d,J=9Hz,1H),1.62(s,9H),1.61(s,9H),0.25(s,9H).
            
將2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-三甲基甲硅烷基乙炔基-苯甲酸叔丁酯(0.57g,1.37mmol)溶于四氫呋喃(5ml)中，用0.9M四丁基氟化銨和乙酸(2∶3)的四氫呋喃(1.7ml,1.51mmol)溶液處理3h。揮發物真空揮發,粗制物質在乙酸乙酯(35ml)中提取。乙酸乙酯提取物用1M鹽酸(5ml)、飽和碳酸氫鈉(5ml)、鹽水(5ml)洗滌，真空蒸發，得0.36g(76％)的2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-乙炔基-苯甲酸叔丁酯油。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.74(d,J=10Hz,1H),8.12(s,1H),7.65(d,J=10Hz,1H),3.08(s,1H),1.62(s,9H),1.58(s,9H).
            
將2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-乙炔基-苯甲酸叔丁酯(0.36g,1.04mmol)用50％三氟乙酸/二氯甲烷(15ml)室溫處理3h。反應混合物真空濃縮，殘留物用水和乙醚洗滌，干燥后得0.21g(86％)的標題化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.23(d,J=10Hz,1H),8.05(s,1H),7.76(d,J=10Hz,1H),4.24(s,1H).LC/MS[M-H]-232.07HPLC(254.4nm)3.112s,(49％).
            
實施例24 5-(3-二甲基氨-丙-1-炔基)-2-(草酰氨基)苯甲酸向5-碘代鄰氨基苯甲酸(3.0g,11.4mmol)和N,N-二異丙基乙基胺(4ml,22.8mmol)的無水四氫呋喃(40ml)溶液中加入咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(4.47g,22.8mmol)。反應混合物于室溫攪拌3h。溶劑經真空蒸發，粗制混合物在乙酸乙酯(70ml)中提取。有機提取物用1％鹽酸(2×15ml)和鹽水(10ml)洗滌，溶劑經真空蒸發，得2.8g(63％)的2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-碘代-苯甲酸固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(d,J=9Hz,1H),8.43(d,J=2Hz,1H),8.00(dd,J=9Hz,2Hz,1H),1.59(s,9H).
            
在氮中向2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-碘代-苯甲酸(2.1g,5.37mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中加入三乙胺(3.75ml,26.85mmol)和N,N-二甲氨吡啶(0.1g)。加入甲氧甲基氯(1.2ml,16.11mmol),反應混合物攪拌4h，真空濃縮至最小體積，直接上樣于硅膠色譜柱，用50％乙酸乙酯/己烷洗脫。混合純化級分并濃縮，得1.5g(64％)的2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-碘代-苯甲酸甲氧甲基酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.56(d,J=9Hz,1H),8.42(s,1H),7.89(d,J=9Hz,1H),5.54(s,2H),3.60(s,3H),1.61(s,9H).
            
制備2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-碘代-苯甲酸甲氧甲基酯(0.16g,0.37mmol)、三乙基氨(51μl,0.37mmol)和1-二甲基氨-2-丙炔(0.12ml,1.11mmol)在無水乙腈(3ml)中的溶液，并用氬吹洗。加入二氯·二(三丙基膦)合鈀(ⅱ)(5mg,0.0074mmol)和碘化銅(1mg,0.0074mmol)，在氬氣中60℃攪拌反應物18h。揮發物真空揮發，殘留物重新溶于乙酸乙酯(10ml)。有機相用1％鹽酸(5ml)洗滌，水相通過另外的乙酸乙酯提取。混合的有機相提取物用鹽水(5ml)洗滌，干燥(Na2SO4)并濃縮成油。將粗制油溶于二氯甲烷并用5％甲醇/二氯甲烷/0.1％三乙氨作為洗脫劑經硅膠色譜純化。混合純化級分得81mg(60％)的2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-(3-二甲氨-丙-1-炔基)-苯甲酸甲氧甲基酯的油。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.52(s,1H),8.75(d,J=9Hz,1H),8.21(s,1H),7.64 (d,J=9Hz,1H),5.53(s,2H),3.59(s,3H),3.46(s,2H),2.38(s,6H),1.61(s,9H).
            
用50％三氟乙酸/二氯甲烷(3ml)室溫下處理2-(叔-丁氧基草酰氨基)-5-(3-二甲氨-丙-1-炔基)-苯甲酸甲氧甲基酯(32.3mg)2h。混合物真空濃縮成固體，所得固體用二氯甲烷洗滌，得20mg(83％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz,DMSO-ds)δ8.60(d,J=9Hz,1H),8.05(s,1H),7.60(d,J=9Hz,1H),4.07(s,2H),2.73(s,6H)實施例25 5-(2-((1-苯甲基氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-異丙基-氨基甲酰基)-乙烯基)-2-(草酰氨基)-苯甲酸用50％三氟乙酸/二氯甲烷(6ml)處理5-(2-((1-苯甲基氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-異丙基-氨基甲酰基)-乙烯基)-2-(叔丁氧基草酰氨基)-苯甲酸甲氧基甲酯(0.14g,0.22mmol)2.5h。混合物真空濃縮，從水中沉淀。所得結晶固體過濾，真空干燥，得0.10g(85％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.76(d,J=9Hz,1H),8.31(s,1H),7.94(d,J=9Hz,1H),7.49(d,J=16Hz,1H),7.46-7.38(m,5H),7.13(d,J=16Hz,1H),4.49(m,1H),4.10(s,2H),3.95(m,1H),2.49(m,1H),1.90(m,1H),1.56(m,1H),1.38(d,J=6Hz,3H),1.35(d,J=7Hz,3H),0.97(d,J=6Hz,6H).LC/MS[M-H]-522.55.
            
以下化合物用如實施例1所述的類似方法制備。
            
實施例26 4-氟-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.11(m,1H),8.12(m,1H),8.42(dd,1H),12.62(s,1H,NHCO)。
            
實施例27 5-羥基-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.19(s,1H),9.78(bs,1H),8.44(d,J=10Hz,1H),7.42(d,J=2Hz,1H),7.05(dd,J=10Hz,2Hz)。
            
實施例28 5-甲基-2-(草酰氨基)苯甲酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.20(s,1H),8.51(d,J=10Hz,1H),7.83(d,J=2Hz,1H),7.42(dd,J=10Hz,2Hz,1H),2.29(s,3H)。
            
實施例29 5-(3-辛基-異噁唑-5-基)-2-(草酰氨基)苯甲酸向2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-碘代-苯甲酸(1.8g,4.6mmol)和碳酸鉀(1.6g,11.5mmol)的丙酮(15ml)溶液中加入碘代甲烷(3g)。將反應物在回流下加熱2h。然后通過tlc分析判定為完全。粗制混合物用乙酸乙酯(75ml)稀釋，水洗(2×15ml)，鹽水洗(10ml)。有機相經真空濃縮，得1.8g(94％)的2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-碘代-苯甲酸甲酯。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.52(s,1H),8.53(d,J=9Hz,1H),8.39(s,1H),8.87(d,J=9Hz,1H),3.98(s,3H),1.61(s,9H).
            
將2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-碘代-苯甲酸甲酯(0.86g,2.12mmol)、三甲基甲硅烷基乙炔(2ml)、和三乙基氨(1.2ml,8.48mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5ml)中,用氬氣吹洗該溶液。加入二氯·二(三苯甲基膦)合鈀(Ⅱ)(30mg,0.042mmol)和碘化銅(Ⅰ)(4mg,0.021mmol),反應物在60℃氬氣中攪拌3h。粗制混合物用乙酸乙酯(40ml)稀釋，水洗(3×10ml)并鹽水洗(2×10ml)。有機相真空蒸發得0.8g(99％)的2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-三甲基甲硅烷基乙炔基-苯甲酸甲酯，該物質無需進一步純化就可投入使用。
            
將2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-三甲基甲硅烷基乙炔基-苯甲酸甲酯(0.15g,0.4mmol)溶于四氫呋喃(2ml)中，用0.9M四丁基銨氟化物和乙酸(2∶3)的四氫呋喃(0.44ml,0.4mmol)溶液處理3h。揮發物經真空蒸發，粗制物質用乙酸乙酯(25ml)提取。乙酸乙酯提取物用1M鹽酸(5ml)、飽和碳酸氫鈉(5ml)、鹽水(5ml)洗滌，真空蒸發，得0.1g(83％)的2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-乙炔基-苯甲酸甲酯的油。
            
用漂白劑(bleach)(0.75M,1.3ml,0.99mmol)處理2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-乙炔基-苯甲酸甲酯(0.1g,0.33mmol)和壬醛肟(nonaldoxime)(0.15g,0.99mmol)的四氫呋喃(3ml)溶液。反應混合物在室溫下攪拌24h。Tlc分析顯示起始物質的存在，故將反應混合物在35℃加熱12h。真空除去溶劑，粗制物質溶于乙酸乙酯(35ml)，水洗(2×19ml)和鹽水洗(10ml)。有機相提取物真空蒸發得0.1g(66％)的2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-(3-辛基-異噁唑-4-基)-苯甲酸甲酯的油。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.89(d,J=10Hz,1H),8.52(d,J=1Hz,1H),7.97(dd,J=10,1Hz,1H),6.41(s,1H),4.02(s,3H),2.73(t,J=8Hz,2H),1.70(m,2H),1.62(s,9H),1.37-1.25(bm,12H),0.89(t,J=8Hz,3H).
            
向上述(異噁唑-4-基)-苯甲酸甲酯(9.1mg,0.02mmol)的50％甲醇/四氫呋喃(2ml)溶液中添加1N氫氧化鋰(60μl,0.06mmol)，所得混合物室溫攪拌48h。反應經tlc分析(30％甲醇/二氯甲烷)判定為不完全，添加另外的1N氫氧化鋰(20μl,0.02mmol)。反應混合物再攪拌72小時。將反應混合物的pH通過加1N鹽酸而調至0左右。真空濃縮該混合物，粗制物質溶于乙酸乙酯(20ml)。有機相經鹽水洗(2×5ml)并真空濃縮得5.4mg(70％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.87(d,J=10Hz,1H),8.55(s,1H),8.04(d,J=10Hz,1H),6.74(s,1H),2.70(t,J=8Hz,2H),1.72(m,2H),1.38-1.20(bm,12H),0.90(t,J=8Hz,3H).
            
實施例30 5-(2-((1-苯甲基氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-異丙基-氨基甲酰基)-乙烯基)-2-(草酰氨基)-苯甲酸向異丙胺(0.43ml,5.0mmol)的甲醇(5ml)溶液中添加異戊醛(0.54 ml,5.0mmol)。攪拌15分鐘后，添加苯甲基胩的四氫呋喃(1M,5ml,5.0mmol)溶液，再添加丙烯酸(0.34ml,5.0mmol)。反應混合物于室溫攪拌72h，真空除去揮發物，所得油溶于乙酸乙酯(40ml)。有機混合物用1N鹽酸(10ml)和鹽水(10ml)洗，干燥(Na2SO4)，溶劑真空蒸發。粗制殘留物用30％乙酸乙酯/己烷至50％乙酸乙酯/己烷的梯度色譜純化。收集純化級分，溶劑真空蒸發，得1.5g(100％)的N-(1-苯甲基氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-N-異丙基-丙烯酰胺的油。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(bs,1H),7.30-7.19(m,5H),6.49(dd,J=16Hz,12Hz,1H),6.25(d,J=16Hz,1H),5.66(d,J=12Hz,1H),4.38(d,J=6Hz,2H),4.10-4.02(m,1H),2.22-2.13(m,1H),1.76-1.70(m,1H),1.62-1.54(m,2H),1.25(d,J=7Hz,3H),1.20(d,J=7Hz,3H),0.94(d,J=7Hz,3H),0.90(d,J=7Hz,3H).
            
N-(1-苯甲基氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-N-異丙基-丙烯酰胺(0.55g,1.74mmol)、2-(叔丁氧基草酰氨基)5-碘代-苯甲酸甲氧基甲酯(0.5g,1.15mmol)，乙酸鈀(3.0mg,0.023mmol)和三(鄰甲苯基)膦(10.0mg,0.07mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液在攪拌和氬氣下，于100℃加熱3h。將反應混合物冷卻至室溫，用乙酸乙酯(50ml)稀釋。有機相經水洗(2×15ml)和鹽水洗(10ml)，干燥(Na2SO4)并真空蒸發。粗制油性物質用30％乙酸乙酯/己烷作為洗脫劑經色譜純化。收集純化級分，真空蒸發溶劑，得0.15g(20％)的5-(2-((1-苯甲基氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-異丙基-氨基甲酰基)-乙烯基)-2-(叔丁氧基草酰氨基)-苯甲酸甲氧基甲酯的油。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.58(s,1H),8.82(d,J=9Hz,1H),8.22(s,1H),7.80(d,J=9Hz,1H),7.60(d,J=16Hz,1H),7.30-7.22(m,5H),6.80(d,J=16Hz,1H),5.58(s,2H),4.43(bs,2H),4.21-4.15(m,1H),3.60(s,3H),2.21-2.16(m,1H),1.82-1.78(m,1H),1.61(s,9H),1.61-1.58(m,1H),1.35(d,J=7Hz,3H),1.24(t,J=7Hz,3H),0.99(d,J=7Hz,3H),0.94(d,J=7Hz,3H).
            
向5-(2-((1-苯甲基氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-異丙基-氨基甲酰基)-乙烯基)-2-(叔丁氧基草酰氨基)-苯甲酸甲氧基甲酯(10.7mg,0.017mmol)的甲醇(1ml)溶液中添加5％鈀/碳(2.2mg),所得混合物在氫氣(30psi)下攪拌3h。混合物經塞力特硅藻土過濾，和真空蒸發。NMR分析顯示反應不完全，所以再加氫4小時。混合物經過濾和再次真空蒸發，得8.9mg(83％)的5-(2-((1-苯甲基氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-異丙基-氨基甲酰基)-乙基)-2-(叔丁氧基草酰氨基)-苯甲酸甲氧基甲酯的油。1H NMR(400Mhz,CDCl3)δ12.41(s,1H),8.68(d,J=9Hz,1H),8.07(bs,1H),7.98(s,1H),7.43(d,J=9Hz,1H),7.30-7.22(m,5H),5.52(s,2H),4.45-4.33(m,2H),4.04-3.96(m,2H),3.58(s,3H),2.95(t,J=7Hz,2H),2.72-2.61(m,2H),2.30(m,1H),1.62(s,9H),1.59(m,1H,被相鄰的單峰部分遮藏)，1.22(d,J=6Hz,6H),0.95(d,J=7Hz,3H),0.91(d,J=7Hz,3H)。
            
5-(2-((1-苯甲基氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-異丙基-氨基甲酰基)-乙基)-2-(叔丁氧基草酰氨基)-苯甲酸甲氧基甲酯(4mg,0.0064mmol)溶于丙酮(3ml),并加3滴1N鹽酸進行處理。反應混合物攪拌2天，然后真空蒸發丙酮。殘留物溶于乙酸乙酯(10ml)，鹽水洗(2×2ml)并真空蒸發。所得油用20％三氟乙酸/二氯甲烷(3ml)處理3h。揮發物真空蒸發，得2mg(61％)的標題化合物的油。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.64(d,J=9Hz,1H),8.00(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),7.50-7.40(m,5H),4.17(t,J=8Hz,1H),4.14(s,2H),3.73(m,1H),2.95(t,J=6Hz,2H),2.82-2.63(m,2H),2.42(m,1H),1.80(m,1H),1.30(m,1H),1.26(d,J=6Hz,3H),1.10(d,J=6Hz,3H),0.90(d,J=6Hz,6H).LC/MS[M-H]-524.74實施例31 5-(2-((1-氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-異丙基-氨基甲酰基)-乙基)-2-(草酰氨基)-苯甲酸將5-(2-((1-氨基甲酰基-3-甲基-丁基)-異丙基-氨基甲酰基)-乙烯基)-2-(草酰氨基)-苯甲酸(33mg,0.063nnol)和10％鈀/碳混合于甲醇(3ml)中，并在氫氣(1atm)中攪拌18h。將混合物通過塞力特硅藻土過濾，揮發物真空蒸發，得27mg(99％)的標題化合物。
            
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.64(d,J=9Hz,1H),8.00(s,1H),7.51(d,J=9Hz,1H),4.17(t,J=8Hz,1H),3.72(m,1H),2.96(t,J=6Hz,2H),2.82-2.63(m,2H),2.41(m,1H),1.80(m,1H),1.30(m,1H),1.25(d,J=6Hz,3H),1.13(d,J=6Hz,3H),0.90(d,J=6Hz,6H).LC/MS [M-H]-435.66實施例32 2-((5-巰基-[1,3,4]噁二唑-2-羰基)-氨基)-苯甲酸向2-(乙氧基草酰氨基)-苯甲酸(2.0g,8.43mmol)的乙醇(75ml)溶液中添加水合肼(0.8g,16.86mmol)。所得混合物在回流下攪拌3h。反應物冷卻后加水(200ml),混合物用1N鹽酸酸化至pH=4。過濾得沉淀，水洗，50℃真空干燥16h，得1.4g(69％)的2-(肼基草酰氨基)-苯甲酸固體。
            
向已冷卻至0℃的上述2-(肼基草酰氨基)-苯甲酸(1.0g,4.15mmol)的甲醇(20ml)溶液中添加氫氧化鉀(0.5g,8.72mmol)和二硫化碳(0.7g,9.54mmol)。所得混合物在回流下攪拌6h。向已冷卻的反應物中加水(100ml),并用1N鹽酸使混合物酸化至pH=1。過濾得沉淀，用水和庚烷洗滌，50℃真空干燥。干燥產物(0.65g)用溶于5％乙酸的乙酸乙酯溶液作為洗脫劑經硅膠(400ml)色譜純化。收集純化級分，真空蒸發揮發物。殘留物經水洗并50℃真空干燥16h，得0.4g(36％)的標題化合物固體。
            
M.p.236-237℃元素分析，計算值C10H7N3O4SC,45.28％；H,2.66％；N,15.84％。實測值C,45.48％；H,2.66％；N,15.36％。
            
實施例33 3-(草酰氨基)-異煙酸向0℃下攪拌的3-氨基-異煙酸(0.5g,3.62mmol)和三乙基胺(1ml)的無水四氫呋喃(50ml)溶液中滴加乙基草酰氯(0.5g,3.69mmol)。所得反應混合物室溫攪拌3h，過濾，真空蒸發揮發物。向殘留物中加水(50ml)，所得混合物用乙醚提取(2×50ml)。有機相用飽和氯化鈉水溶液(50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑，得0.4g(46％)的3-(乙氧草酰氨基)-異煙酸固體。
            
向上述異煙酸(0.4g,1.7mmol)的乙醇(25ml)溶液中添加氫氧化鈉(141mg,3.53mmol)的水(10ml)溶液。所得反應混合物室溫攪拌18h。真空蒸發揮發物，殘留物溶于水(50ml)，用乙醚(50ml)洗滌。向水相加1N鹽酸至pH=1。沉淀過濾,50℃真空干燥18h。干燥的固體殘留物用沸騰的丙酮(50ml)洗滌5分鐘，過濾，50℃真空干燥，得80mg(22％)的標題化合物固體。
            
M.p.＞250℃元素分析，計算值C8H6N2O5C,45.72％；H,2.88％；N,13.33％。實測值C,45.62％；H,2.98％；N,13.04％。
            
實施例34 5-(草酰氨基)-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氫-嘧啶-4-羧酸向5-氨基乳清酸(61.1mg,0.36mmol)的四氫呋喃(1ml)溶液中加入咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(140mg,0.71mmol)和三乙基胺(50μl,0.36mmol)。反應混合物室溫攪拌20h。真空除去溶劑，殘留物溶于乙酸乙酯(5.0ml)并用1％鹽酸洗滌(2×2ml)然后水洗(2×2ml)。有機相干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑。殘留物用制備型TLC(Kieselgel 60F254,0.5mm,己烷∶乙酸乙酯，80∶20)純化，得30mg(28％)的5-(叔丁氧基草酰氨基)-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氫-嘧啶-4-羧酸固體。
            
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.80(s,9H),7.56(s,2H),8.96(s,1H)。
            
5-(叔丁氧基草酰氨基)-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氫-嘧啶-4-羧酸(28 mg,0.094mmol)在20％三氟乙酸的二氯甲烷(1.0ml)溶液中室溫攪拌2h。反應混合物與甲苯一起真空蒸發至徹底干燥,得22.6mg(100％)的標題化合物固體。
            
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.30(s,2H)。
            
實施例35 3-(草酰氨基)-吡嗪-2-羧酸向3-氨基吡嗪-2-羧酸(64.2mg,0.46mmol)的四氫呋喃(1ml)溶液中加入咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(181mg,0.92mmol)和三乙基胺(64.3μl,0.46mmol)。混合物室溫攪拌20h。真空除去溶劑，殘留物溶于乙酸乙酯(5.0ml)并用1％鹽酸洗滌(2×2ml)然后水洗(2×2ml)。有機相干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑。殘留物用乙醚(4×1.0ml)洗滌，得48mg(39％)的3-(叔丁氧基草酰氨基)-吡嗪-2-羧酸固體。
            
1H NMR(CDCl3+CD3OD)δ1.70(s,9H),8.02(d,1H,J=1.5Hz),8.36(d,1H,J=1.5Hz)。
            
3-(叔丁氧基草酰氨基)-吡嗪-2-羧酸(31.7mg,0.12mmol)在20％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液(1ml)中室溫攪拌2h。揮發物真空蒸發，殘留物與甲苯一起真空蒸發，得25mg(100％)的標題化合物固體。
            
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(d,1H,J=1.5Hz),8.15(d,1H,J=1.5Hz),8.62(s,1H)。
            
實施例36  
            
2-(草酰氨基)-煙酸向2-氨基煙酸(61.4mg,0.45mmol)的四氫呋喃溶液(1ml)中加入咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(174.2mg,0.89mmol)和三乙基胺(62μl,0.45mmol)。混合物室溫攪拌2h。真空除去溶劑,殘留物溶于乙酸乙酯(5.0ml)并用1％鹽酸洗滌(2×2ml)然后水洗(2×2ml)。有機相干燥(MgSO4),過濾，真空蒸發溶劑。殘留物(125mg)用制備型TLC(Kieselgel 60F254,1mm,CH2Cl2/MeOH,80/20)純化，得7.9mg(7％)的2-(叔丁氧基草酰氨基)-煙酸固體。
            
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ1.80(s,9H),7.40(m,1H),8.50-8.70(m,2H)。
            
2-(叔丁氧基草酰氨基)-煙酸(7.1mg,0.03mmol)在20％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液(0.5ml)中室溫攪拌2h。揮發物真空蒸發至干燥,得5.6mg(100％)的標題化合物固體。
            
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.40(m,1H),8.50-8.70(m,2H)。
            
實施例37 6-氯-5-異丙基氨基-3-(草酰氨基)-吡嗪-2-羧酸二鋰鹽向3-氨基-6-氯-5-異丙基氨基-吡嗪-2-羧酸(65.4mg,0.27mmol)的四氫呋喃溶液(1ml)中加入咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(104.8mg,0.54mmol)和三乙基胺(37.4μl,0.27mmol)。混合物室溫攪拌20h，然后50℃加熱1.5h。真空除去溶劑，殘留物溶于乙酸乙酯(5.0ml)并用1％鹽酸洗滌(2×2ml)然后水洗(2×2ml)。有機相干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑，得97mg(97％)的3-(叔丁氧基草酰氨基)-6-氯-5-異丙基氨基-吡嗪-2-羧酸的油。
            
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.50(d,6H),1.80(s,9H),4.10(s,3H),4.40(m,1H)。
            
3-(叔丁氧基草酰氨基)-6-氯-5-異丙基氨基-吡嗪-2-羧酸(30mg,0.1mmol)溶于四氫呋喃(1ml)并室溫加入1.0N氫氧化鋰(1ml,1mmol)。反應混合物在室溫下攪拌3天。真空除去溶劑后，殘留物溶于乙酸乙酯(20ml)并水洗(4×3.0ml)。使有機相干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑，得21mg(82％)的標題化合物固體。
            
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ1.42(d,6H),4.50(m,1H)。
            
MS m/z 228(M-74)。
            
實施例38 5,6-二氯-3-(草酰氨基)-吡嗪-2-羧酸二鋰鹽向3-氨基-5,6-二氯-吡嗪-2-羧酸(57mg,0.26mmol)的四氫呋喃(0.5ml)溶液中加入咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(100.6mg,0.513mmol)和三乙基胺(35.8μl,0.26mmol)。混合物室溫攪拌20h，然后40℃加熱4h。真空除去溶劑，殘留物溶于乙酸乙酯(5.0ml)并用1％鹽酸洗滌(2×2ml)然后水洗(2×2ml)。使有機相干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑。殘留的油經制備TLC(Kieselgel 60F254,1mm，己烷∶乙酸乙酯，1∶1)純化，得23.6mg(26％)的3-(叔丁氧基草酰氨基)-5,6-二氯-吡嗪-2-羧酸的油。
            
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.58(s,9H),1.80(s,9H),3.90(s,3H)。
            
向3-(叔丁氧基草酰氨基)-5,6-二氯-吡嗪-2-羧酸(23mg,0.07mmol)的四氫呋喃(0.5ml)溶液中加入1.0N氫氧化鋰的水溶液(0.5ml),所得混合物攪拌3天。真空除去溶劑后，殘留物溶于乙酸乙酯(20ml)并水洗(4×3.0ml)。使有機相干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑，得14mg(80％)的標題化合物固體。
            
MS m/z 290.3(M-74)。
            
實施例39  
            
2-甲基-4-(草酰氨基)-1H-吡咯-3-羧酸向攪拌的4-(甲氧草酰氨基)-2-甲基-1H-吡咯-3-羧酸叔丁酯(2.0g,7.09mmol)的二氯甲烷溶液(20ml)中加入三氟乙酸(10ml)。所得反應混合物室溫攪拌2h。真空除去揮發物，得1.6g(100％)的4-(甲氧草酰氨基)-2-甲基-lH-吡咯-3-羧酸固體。
            
向上述吡咯-3-羧酸(1.2g,5.31mmol)的乙醇(100ml)溶液中加入氫氧化鈉(0.47g,11.7mmol)的水(50ml)溶液。所得反應混合物室溫攪拌18h。真空蒸發揮發物后，殘留物溶于水(100ml)。向水相中加入濃鹽酸至pH=1。懸浮液用乙酸乙酯(50ml)和二氯甲烷(50ml)洗滌，沉淀經過濾后，50℃真空干燥2h。固體溶于異丙醇(100ml)中，過濾并真空蒸發得0.4g(36％)的標題化合物固體。
            
元素分析，計算值(C8H8N2O5,0.1×H2O)C,44.91％；H,3.86％；N,12.98％。實測值C,45.06％；H,3.89％；N,12.72％。
            
實施例40 1-苯甲基-3-(草酰氨基)-1H-吡唑-4-羧酸向0℃攪拌的3-氨基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(5.0g,0.032mmol)和三乙基胺(9ml)的無水四氫呋喃(150ml)溶液中滴加乙基草酰氯(5.3g,0.039mol)。所得反應混合物室溫攪拌18h,再滴加一部分乙基草酰氯(5.3g,0.039mol),反應混合物室溫下再攪拌18h。真空蒸發揮發物，殘留物溶于水(200ml)和乙酸乙酯(200ml)的混合物。不溶物過濾后50℃真空干燥18h，得4.0g(49％)的3-(乙氧草酰氨基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯固體。使有機相分離并用飽和氯化鈉水溶液(100ml)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑得3.7g(45％)的3-(乙氧基草酰氨基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯固體。總產量為7.7g(94％)。
            
向上述吡唑-4-羧酸乙酯(3.7g,0.015mol)的干N,N-二甲基甲酰胺(75ml)溶液中加入氫化鈉(640mg,0.016mol,60％,在礦物油中)。所得反應混合物室溫攪拌0.5h。向反應混合物中加入苯甲基溴(2.7g,0.016mol)，使混合物50℃攪拌4h。加水(100ml)，反應混合物用乙醚(2×100ml)提取。混合的有機提取物用水(100ml)和飽和的氯化鈉水溶液(2×100ml)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑。殘留物(3.8g)用乙酸乙酯和己烷的混合物(1∶1)作為洗脫劑在硅膠(800ml)上純化。收集純化級分，溶劑真空蒸發得0.9g(18％)的1-苯甲基酰基-3-(乙氧基草酰氨基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯固體。
            
收集非純化級分并真空蒸發溶劑。殘留物(1.0g)從乙酸乙酯(30ml)中結晶而出，過濾，50℃真空干燥2h得0.9g(18％)的1-苯甲基酰基-3-(乙氧基草酰氨基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯固體。總產量為1.8g(36％)。
            
向上述1H-吡唑-4-羧酸乙酯(0.9g,2.61mmol)乙醇(50ml)溶液中加入氫化鈉(0.26g,6.51mmol)的水(25ml)溶液。所得反應混合物室溫攪拌60h。揮發物經真空蒸發，殘留物溶于水(100ml)。向水相中加入濃鹽酸至pH=1。沉淀經過濾并50℃真空干燥18h，得0.55g(73％)的標題化合物固體。
            
M.p.189-191℃元素分析，計算值(C13H11N3O5,1.75×H2O)C,48.68％；H,4.56％；N,13.10％。實測值C,48.81％；H,4.17％；N,12.84％。
            
實施例41 4-環己基-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸向4-環己基-2-(乙氧草酰氨基)-噻吩-3-羧酸(60mg,0.18mmol)的乙醇(10ml)溶液中加入1N氫氧化鈉(0.5ml)的水(5ml)溶液。所得反應混合物室溫攪拌18h。向反應混合物中加入濃鹽酸至pH=1。沉淀經過濾，50℃真空干燥18h，得30ml(55％)的標題化合物固體。
            
M.p.＞250℃元素分析，計算值(C13H15NO5S,1.5×H2O)C,48.14％；H,5.59％；N,4.32％。實測值C,48.84％；H,9.92％；N,4.21％。
            
實施例42 2-(草酰氨基)-4-苯基-噻吩-3-羧酸向4-苯基-2-(乙氧草酰氨基)-噻吩-3-羧酸乙酯(2.2g,6.33mmol)的乙醇(50ml)溶液中加入氫氧化鈉(630mg,15.83mmol)的水(25ml)溶液。所得反應混合物室溫攪拌18h，揮發物經真空蒸發，殘留物溶于水(100ml)并用乙醚(2×100ml)洗滌。向水相中加入濃鹽酸至pH=1，所得混合物經乙醚提取(2×100ml)。混合的有機相經飽和氯化鈉水溶液(100ml)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發，得0.8g單乙酯和標題化合物的混合物，由NMR測定。將產物混合物溶于乙醇(40ml)、水(20ml)和氫氧化鈉(400mg)的混合中，所得混合物室溫攪拌18h，揮發物經真空蒸發，殘留物溶于水(50ml)并用乙醚(50ml)洗滌。向水相中加入濃鹽酸至pH=1，沉淀經過濾，用乙醚洗滌，溶于2-丙醇(25ml)中。不溶物過濾，有機相經真空蒸發，得180mg(10％)的標題化合物固體。
            
M.p.196-198℃元素分析，計算值(CO13H9NO5S,0.5H2O)C,52.00％；H,3.36％；N,4.66％。實測值C,52.21％；H,3.44％；N,4.50％。
            
實施例43 5-(4-氟-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸5-(4-氟苯基)-3-氨基噻吩-2-羧酸甲酯(1.0g,4.0mmol)和三乙基胺(11.1,80mmol)的無水四氫呋喃(40ml)溶液用冰冷卻，滴加乙基草酰氮(1.2g,9.0mmol)。攪拌2h后，將反應混合物過濾并真空蒸發溶劑。殘留物溶于二氯甲烷，用0.1N鹽酸(2x-dicared)洗滌。將有機相干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑。殘留物用甲苯/乙酸乙酯(19∶1)作為洗脫劑進行快速色譜分離，得1.19g(85％)的5-(4-氟苯基)-3-(乙氧草酰氨基)-噻吩-2-羧酸乙酯。
            
向5-(4-氟苯基)-3-(乙氧草酰氨基)-噻吩-2-羧酸乙酯(1.19g,3.4mmol)的甲醇(150ml)溶液中加入2N氫氧化鈉(20ml)。反應混合物于60℃攪拌18h。揮發物經真空蒸發。殘留物加水和1N鹽酸(pH=1)，產物用二氯甲烷/2-丙醇的混合物提取。有機相經干燥(MgSO4)，過濾，和真空蒸發溶劑。產物從甲醇/水中重結晶，得619mg(67％)的標題化合物固體。
            
元素分析，計算值(C13H15FNO5S,0.5H2O)C,49.06％；H,2.83％；N,4.40％。實測值C,49.06％；H,2.72％；N,4.31％。
            
以下化合物以類似實施例43所述的方法制備。
            
實施例44 5-(4-異丁基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸元素分析，計算值(C17H17NO5S,0.33×H2O)C,57.79％；H,5.00％；N,3.96％。實測值C,57.79％；H,5.08％；N,3.89％。
            
實施例45 5-(4-氯-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸單鈉鹽M.p.＞250℃元素分析，計算值(C13H7ClNO5SNa,1×H2O)C,42.63％；H,2.52％；N,3.55％。實測值C,42.69％；H,2.48％；N,3.83％。
            
實施例46 4-(草酰氨基)-[2,3]-二噻吩-5-羧酸M.p.220-222℃元素分析，計算值(C11H7NO5S2)C,44.44％；H,2.37％；N,4.71％。實測值C,44.17％；H,2.43％；N,4.54％。
            
實施例47 3-(草酰氨基)-5-苯基-噻吩-2-羧酸單鈉鹽M.p.＞250℃元素分析，計算值(C13H8NO5SNa,1.6×H2O)C,45.64％；H,3.30％；N,4.09％。實測值C,45.25％；H,2.93％；N,3.92％。
            
實施例48 -3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸單鈉鹽M.p.＞250℃元素分析，計算值(C7H7NO5SNa,1.5×H2O)C,31.83％；H,2.67％；N,5.30％。實測值
            
C,32.23％；H,3.14％；N,5.15％。
            
實施例49 4-甲基-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸單鈉鹽M.p.232-234℃元素分析,計算值(C8H6NO5SNa,1.5×H2O)C,34.54％；H,3.26％；N,5.03％。實測值C,34.58％；H,3.30％；N,4.81％。
            
實施例50 3-(草酰氨基)-5-(4-苯氧基-苯基)-噻吩-2-羧酸M.p.230℃(分解)元素分析，計算值(C19H13NO6S,1.25×H2O)C,56.22％；H,3.85％；N,3.45％。實測值C,56.00％；H,3.57％；N,3.39％。
            
實施例51 5-(4-苯甲基氧基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸M.p.210℃(分解)元素分析，計算值(C20H15NO6S)
            
C,60.45％；H,3.80％；N,3.52％。實測值C,59.94％；H,3.79％；N,4.45％。
            
實施例52 5-(4-(4-甲氧基-苯氧基)-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸M.p.215℃(分解)元素分析，計算值(C20H15NO7S,1.5H2O)C,54.54％；H,4.12％；N,3.18％。實測值C,54.80％；H,3.88％；N,3.15％。
            
實施例53 5-(4-羥基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸單鈉鹽M.p.205-206℃元素分析，計算值(C13H9NO6SNa,0.75×H2O)C,45.42％；H,3.08％；N,4.07％。實測值C,45.11％；H,3.16％；N,3.98％。
            
實施例54  
            
5-(3-硝基-苯基)-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸在室溫氮氣氛中向3-硝基苯乙基乙醇(102mg,0.61mmol)的二氯甲烷(2.2ml)溶液中加入Dess-Maritn periodinane試劑(285mg,0.67mmol)的二氯甲烷(2.7ml)溶液。反應物于室溫氮氣氛下攪拌45分鐘，此時tlc分析(己烷/乙酸乙酯，50/50)表明該反應完全。加入乙醚(5.0ml)，再加入10％亞硫酸鈉/飽和碳酸氫鈉(1∶1,5.0ml)溶液。該乳液靜置10分鐘后逐漸變為清亮的多相溶液。加入二氯甲烷，有機相用水(5ml)洗，干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發，得100mg(100％)的3-硝基苯-乙醛清油。這種醛無需進一步純化即可應用于后續步驟。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.90(s,2H),7.65(d,2H),8.20(s,1H),8.25(m,1 H),9.90(s,1H).
            
氰基乙酸叔丁基酯(67mg,0.47mmol)、3-硝基苯乙醛(86mg,0.52mmol)、三乙基胺(73μl,0.52mmol)和硫元素(17mg,0.52mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(0.5ml)中的混合物在60℃攪拌1.5h。冷卻至室溫后，該暗色溶液用乙酸乙酯稀釋，并用水(3×5ml)洗滌。使有機相干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑，得粗制的2-氨基-5-(3-硝基-苯基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯(191mg)。經制備型TLC(己烷/乙酸乙酯，80/20)純化，得74mg(49％)的2-氨基-5-(3-硝基-苯基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.56(s,9H),6.05(s,2H),7.20(s,1H),7.40(t,1H),7.68(d,1H),7.90(d,1H),8.25(s,1H).
            
2-氨基-5-(3-硝基-苯基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯(66mg,0.21mmol)、咪唑-1-基-氧代乙酸叔丁酯(202mg,1.03mmol)和三乙基胺(40.4μl,0。0.21mmol)的四氫呋喃(0.5ml)溶液于室溫攪拌3h。揮發物經真空蒸發，殘留物溶于乙酸乙酯并連續經水洗(3×5ml)和鹽水洗(5ml)。使有機相干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發溶劑，得粗制產物。用制備TLC純化得91mg(98％)的2-(叔丁氧草酰氨基)-5-(3-硝基苯基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.54(s,9H),1.62(s,9H),7.5(s,1H),7.55(t,1H,J=8.4Hz),7.84(d,2H,J=8.4Hz),8.16(d,1H,J=8.4Hz),8.45(s,1H).MS m/z447(M-1).
            
將上述3-硝基苯-噻吩(85mg,0.19mmol)溶于20％三氟乙酸的二氯甲烷(3.0ml)溶液中，室溫攪拌6h。該溶液與甲苯一起真空蒸發，得64mg(100％)的標題化合物。1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ7.71(t,1H,J=8.25Hz),7.8(s,1H),8.1(d,1H,J=7.5Hz),8.2(d,1H,J=9Hz),7.86(m,1H).MS m/z335(M-1).
            
以下實施例的化合物用類似于實施例54所述的方法制備。
            
實施例55 2-(草酰氨基)-5-(苯基-甲基)-噻吩-3-羧酸M.p.230-231℃元素分析，計算值(C14H11NO5S)C,54.89％；H,3.63％；N,4.40％。實測值C,54.94％；H,3.63％；N,4.43％。
            
實施例56 5-(萘-2-基)-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.42-7.49(m,2H),7.66(d,1H,J=4.5Hz),7.75(m,1H),7.8-7.9(m,3H),8.04(d,1H,J=7.5Hz).MS m/z340(M-1).
            
實施例57 2-(草酰氨基)-5-苯基-噻吩-3-羧酸M.p.238-240℃1H NMR(400Mhz,CD3OD)δ7.3(t,1H,J=4.5Hz),7.38(t,1H,J=4.5Hz),7.54(s,1H),7.61(m,3H)。
            
元素分析，計算值(C13H9NO5S,1×H2O)C,47.13％；H,3.04％；N,4.23％。實測值C,47.34％；H,3.53％；N,4.20％。
            
實施例58 5-(2-氟-苯基)-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.18-7.23(m,2H),7.30(m,1H),7.63-7.69(m,2H).MS m/z308(M-1).
            
實施例59 5-(3-氯-苯基)-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸收率99％1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.28(m,1H),7.38(m,1H),7.52-7.61(m,3H).MS m/z324(M-1).
            
實施例60 5-(2,4-二氯-苯基)-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.37(m,1H),7.39(m,1H),7.52-7.58(m,3H).MS m/z358(M-1).
            
實施例61 5-(4-溴-苯基)-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.51(s,4H),7.54(s,1H).MS m/z370(M-1).
            
實施例62 5-乙基-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ1.35(t,3H,J=3.75),2.95(q,2H),7.05(s,1H).MS m/z170.2(M-73)(-COCOOH),228.1(M-1).
            
實施例63 5-甲基-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ2.6(s,3H),7.05(s,1H).MS m/z228(M-1).
            
實施例64 5-(3-甲基-苯基)-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ2.39(s,3H),7.12(d,1H,J=8Hz),7.25(t,1H,J=7.5Hz),7.4(m,2H),7.5(s,1H).MS m/z 304,232(M-1).
            
實施例65  
            
5-二苯并呋喃-2-基-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸1H NMR(400MHz,CD3COCD3)δ7.4(t,1H,J=2Hz),7.52(t,1H,J=2Hz),7.7(m,3H),7.9(t,1H,J=2Hz),8.25(d,1H,J=2Hz),8.5(s,1H).MS m/z 380.5(M-1).
            
實施例66 5-(2-(4-氯-苯甲基)-乙基)-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸單鈉鹽M.p.＞250℃元素分析,計算值(C15H11N1Cl1O5S1Na,0.75×H2O)C,46.28％；H,3.24％；N,3.60％。實測值C,46.17％；H,3.38％；N,3.40％。實施例67 2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸M.D.225-228℃元素分析,計算值(C7H5N1O5S1,1.25×H2O)C,35.37％；H,3.18％；N,5.89％。實測值C,35.53％；H,2.82％；N,5.72％。實施例68 5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸向0℃下攪拌的2-(3-羥基-丙基)-異吲哚-1,3-二酮(0.2g,0.97mmol)、0.7N溴化鈉(0.70ml,0.46mmol)、2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基基,自由基TEMPO(3.0mg,0.02mmol)的二氯甲烷中的的混合物(1ml)中滴加漂白劑(2.1ml,4.9mmol)和碳酸氫鈉(117mg,1.4mmol)的溶液。滴加完畢后該混合物于0℃攪拌2h。該混合物用乙酸乙酯提取(3×20ml)。混合的有機提取物經10％硫代硫酸鈉洗滌(3×20ml),鹽水洗(10ml),干燥(MgSO4),過濾，真空蒸發溶劑。殘留物經乙酸乙酯洗滌(2×1ml)干燥后得161mg(81％)的3-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-丙醛固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.82(s,1H),7.85(dd,2H,J=5.6,2.8Hz),7.73(dd,2H,J=5.6,2.8Hz),4.04(t,2H,J=7.2Hz),2.89(t,2H,J=7.2Hz).
            
向上述醛(150mg,0.74mmol)、三乙基胺(113ml,0.81mmol)和硫(24mg,0.81mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中于室溫加入氰基乙酸酯叔丁基(114mg,0.81mmol)。混合物經攪拌并在氮氣氛下在回流溫度下加熱2h。冷卻至室溫后，沉淀經過濾得189mg2-氨基-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯固體。
            
濾液經真空蒸發，殘留物加入乙酸乙酯(50ml)中，經0.5N鹽酸(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉(2×10ml)、鹽水(10ml)洗滌，干燥(MgSO4)并過濾。溶劑經真空蒸發，殘留物經冷乙酸乙酯洗滌(2×1ml)，得52mg2-氨基-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯固體。總產量為241mg(91％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(dd,2H,J=7.2,4Hz),7.72(dd,2H,J=7.2,4Hz),6.97(s,1H),5.83(s,2H,NH2),4.78(s,2H),1.56(s,9H)向攪拌的上述噻吩(100mg,0.28mmol)的四氫呋喃(2ml)溶液中加入咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(60mg,0.31mmol)的四氫呋喃(1ml)溶液。該混合物室溫攪拌3h。溶劑經真空蒸發。殘留物溶于乙酸乙酯(50ml),經0.5N鹽酸(2×5ml)、飽和碳酸氫鈉(2×5ml)、鹽水(5ml)洗滌，干燥(MgSO4)并過濾。溶劑經真空蒸發，得130mg2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.23(s,1H),7.87(dd,2H,J=7.2,4Hz),7.73(dd,2H,J=7.2,4Hz),7.24(s,1H),4.93(s,2H),1.60(s,9H),1.57(s,9H).
            
向三氟乙酸(1ml)的二氯甲烷(1ml)溶液中加入上述叔丁酯(100mg,0.21mmol)。溶液在室溫攪拌1h。溶劑經真空蒸發。殘留物經二氯甲烷(3×1ml)洗滌，得63mg(82％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.05(s,1H),7.89(m,2H),7.87(m,2H),7.10(s,1H),4.83(s,2H).MS m/z373(M-1).
            
以下化合物經類似于實施例43所述的方法制備。
            
實施例69 5-(3,4-二甲氧基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸M.p.230-231℃元素分析，計算值(C15H13N1O7S1,1×H2O)C,48.78％；H,4.09％；N,3.79％。實測值C,49.01％；H,3.75％；N,3.79％。
            
實施例70 5-(3-甲氧基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸M.p.217-218℃元素分析,計算值(C14H11N1O6S1,0.75×H2O)C,50.22％；H,3.76％；N,4.18％。實測值C,50.02％；H,3.73％；N,4.16％。
            
實施例71 5-(3,5-二甲氧基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸M.p.223-225℃元素分析，計算值(C15H13N1O7S1,1.25×H2O)C,48.19％；H,4.18％；N,3.75％。實測值C,48.25％；H,4.10％；N,3.39％。
            
實施例72 5-(3-硝基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸M.p.＞250℃元素分析,計算值(C13H7N1O7S1Na1,1.25×H2O)C,41.01％；H,2.51％；N,7.36％。實測值
            
C,41.03％；H,2.38％；N,7.17％。
            
實施例73 5-(3-氨基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸M.p.＞250℃元素分析，計算值(C13H10N2O5S1,0.5×H2O)C,49.52％；H,3.52％；N,8.88％。實測值C,49.48％；H,3.44％；N,8.71％。
            
實施例74 5-(4-甲氧基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸M.p.220-221℃元素分析，計算值(C14H11N1O6S1,0.4×H2O)C,51.19％；H,3.62％；N,4.62％。實測值C,51.29％；H,3.53％；N,3.96％。
            
實施例75 5-(4-氨基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸元素分析，計算值(C13H10N2O5S1,0.5×H2O)
            
C,49.52％；H,3.52％；N,8.88％。實測值C,49.40％；H,3.87％；N,8.23％。
            
實施例76 5-(4-(2-(2-甲氧基-苯基)-2-氧代-乙氧基)-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸二鈉鹽在氮氣氛壓下向3-(乙氧基草酰氨基)-5-(4-羥苯基)噻吩-2-羧酸甲酯(524mg,1.5mmol)和碳酸鉀(275mg,2.0mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(35ml)中加入ω-溴-2-甲氧苯乙酮(460mg,2.0mmol)。攪拌3h后,過濾得沉淀粗品3-(乙氧基草酰氨基)-5-(4-(2-(2-甲氧苯基)-2-氧基-乙氧基)-苯基)-噻吩-2-羧酸甲酯(1.0g)。
            
向粗制的3-(乙氧基草酰氨基)-5-(4-(2-(2-甲氧苯基)-2-氧代-乙氧基)-苯基)-噻吩-2-羧酸甲酯(0.5g)的甲醇(15ml)溶液中加入1N氫氧化鈉(10ml)。65℃攪拌3h后,經過濾分離得到產物,用水和乙醇(1∶1)的混合物洗滌并干燥后,得290mg標題化合物固體。
            
M.p.286-287℃元素分析，計算值(C22H18N1O9S1Na2)C,50.19％；H,3.42％；N,2.66％。實測值C,51.18％；H,3.42％；N,2.58％。
            
實施例77  
            
5-(4-羧甲氧基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸三鈉鹽向3-(乙氧基草酰氨基)-5-(4-羥苯基)噻吩-2-羧酸甲酯(307mg,1.0mmol)和碳酸鉀(166mg,1.2mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液中加入2-溴乙酰胺(165mg,1.2mmol)。50℃攪拌16h后，反應混合物加水抑制，過濾分離得沉淀5-(4-氨基甲酰基甲氧基-苯基)-3-(乙氧基草酰氨基)-噻吩-2-羧酸甲酯(70mg)。
            
用1N鹽酸將濾液的pH調為l-2，經過濾分離半水解產物5-(4-氨基甲酰基甲氧基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸甲酯(300mg)。向5-(4-氨基甲酰基甲氧基-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸甲酯(295mg,0.78mmol)在甲醇(5ml)和水(5ml)中的懸浮液中加入1N氫氧化鈉(2ml)。攪拌5天后，過濾沉淀物，得105mg(88％)的標題化合物固體。
            
M.p.＞300℃元素分析，計算值(C15H12N1O10S1Na3)C,38.56％；H,2.59％；N,3.00％。實測值C,38.73％；H,2.74％；N,3.06％。
            
用類似于實施例77所述的方法制備以下化合物實施例78 5-(4-(4-氟-苯甲基氧基)-苯基)-3-(草酰氨基)-噻吩-2-羧酸1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ 5.15(s,2H),7.1(d,2H),7.25(t,2H),7.55(q,2H),7.7(d,2H),8.2(s,1H).
            
SP/MS415(M+,12％),372,353,299,218,190,162,109(100％).
            
實施例79 5-((2-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-乙酰氨)-2-(草酰氨基)-噻吩-3-羧酸向2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基-甲基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯(0.4g,0.82mmol，按實施例30所述制備的)的二氯甲烷(2m1)溶液中加入無水肼(28ml,0.9mmol)，混合物于室溫氮氣氛中攪拌19h。再加一些肼(84ml,2.7mmol)和二氯甲烷(5.5ml)，繼續再攪拌88h。加入二氯甲烷(50ml)，將反應混合物置于超聲發生器中20分鐘，經塞力特硅藻土過濾。濾液經真空蒸發，得0.24g(82％)的5-氨甲基-2-(叔丁氧基草酰氨基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯固體，該固體無需進一步純化就可應用于后續步驟。
            
向氮氣氛下冰浴中的(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-乙酸(0.17g，0.82mmol)、1-羥基苯并三唑(0.133g,0.98mmol)和2,6二甲基吡啶(0.4ml)的干乙腈(10ml)溶液中加入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物(0.21g,1.1mmol)，該溶液攪拌0.5h。加入5-氨甲基-2-(叔丁氧基草酰氨基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯(0.24g,0.68mmol)，除去冷浴，該溶液環境溫度下攪拌20h。揮發物經真空蒸發，殘留物溶于二氯甲烷，用飽和碳酸氫鈉水溶液和1N鹽酸洗滌，干燥(Na2SO4)，經真空蒸發溶劑。殘留物(0.18g)于氮氣氛下溶于無水四氫呋喃(6ml)中，加入咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(0.25g,1.3mmol)，該溶液于環境溫度下攪拌17h，真空蒸發溶劑，殘留物溶于二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液的混合物中。使有機層干燥(Na2SO4)，溶劑經真空蒸發。殘留物經硅膠色譜得0.1g2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-((2-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-乙酰氨)-甲基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.3(bs,1H),7.9(m,2H),7.8(m,2H),7.1(s,1H),6.5(m,1H),4.6(m,2H),4.4(s,2H,),1.8(s,9H),1.6(s,9H).
            
向2-(叔丁氧基草酰氨基)-5-((2-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-乙酰氨)-甲基)-噻吩-3-羧酸叔丁酯(0.1g,0.18mmol)中加入20％三氟乙酸的二氯甲烷(4ml)溶液，反應混合物于環境溫度下氮氣氛中攪拌14h。揮發物經真空蒸發，殘留物用二氯甲烷洗(chase)直至留下固體。沉淀物經過濾并真空干燥18h，得定量收率的標題化合物固體。Mp.243-244℃(dec).MS m/z430(M-1).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.1(s,1H),8.9(s,1H),7.8-7.9(m,4H),7.1(s,1H),4.4(m,2H),4.2(s,2H).
            
實施例80用固定化學法按以下反應圖解合成一個包括64個成員的文庫。 X1表示R-基團的連接點。
            
百分數表示220nm處的HPLC峰面積。
            
實施例81 6-苯甲基-2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸單鈉鹽在回流溫度下，于裝配有Dean-Stark分水器的三口反應燒瓶中將N-苯甲酰基-4-哌啶酮(20.0g,0.1mol)、氰基乙酸乙酯(10.9ml,0.1mol)、乙酸銨(2.0g)和乙酸(6ml)在苯(100ml)中的混合物加熱1h。反應混合物冷卻后用乙酸乙酯(100ml)稀釋，水洗(3×100ml)、飽和氯化鈉水溶液(80ml)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發，得定量收率的(1-苯甲酰基-哌啶-4-亞基)-氰基-乙酸乙酯的慢結晶油。
            
將上述苯甲酰基-哌啶-4-亞基的化合物(10.0g,0.034mol)、硫(1.13g,0.035mol)、嗎啉(6.5ml)在乙醇(35ml)中的混合物于50℃加熱2h，并于室溫攪拌過夜。沉淀經過濾，用96％乙醇洗滌(3×50ml)、乙醚洗滌(3×50ml)，真空干燥，得9.27g(84％)的2-氨基-6-苯甲基-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸乙酯固體。
            
向攪拌的上述4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸乙酯(5.0g,0.015mol)、三乙基胺(4.21ml,0.03mol)在無水四氫呋喃(30ml)中的混合物于0℃滴加乙基草酰氯(1.9ml,0.017mol)在無水四氫呋喃(20ml)中的溶液。所得反應混合物室溫攪拌18h，倒入冰水(300ml)中，用乙酸乙酯提取(3×100ml)。混合的有機提取物用飽和氯化鈉水溶液(100ml)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，真空蒸發，得4.2g(84％)的6-苯甲酰基-2-(乙氧基草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸乙酯結晶油。
            
向上述噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸乙酯(4.2g,9.76mmol)的乙醇(100ml)溶液中加入氫氧化鈉(0.9g,21.46mmol)的水(100ml)溶液。所得反應混合物室溫攪拌18h。揮發物經真空蒸發，殘留物溶于水(100ml)，用乙酸乙酯洗滌(2×100ml)。水相中加入濃鹽酸至pH=1，沉淀經過濾，水洗(2×50ml)，乙醚洗滌(2×30ml)并于50℃真空干燥，得2.9g(79％)的標題化合物固體。
            
M.p.無定形的元素分析，計算值(C17H13N2O6S1Na1,1×H2O)C,49.28％；H,3.65％；N,6.76％。實測值C,49.31％；H,3.86％；N,6.53％。
            
以下化合物用類似于實施例81所述的方法制備。
            
實施例82 2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-苯甲基[b]噻吩-3-羧酸M.p.230-231℃元素分析,計算值(C11H11NO5S)C,49.07％；H,4.12％；N,5.20％。實測值C,49.87％；H,4.37％；N,5.06％。
            
實施例83 6-苯甲基-2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸元素分析,計算值(C17H16N2O5S,1.75H2O)C,52.10％；H,5.01％；N,7.15％。實測值C,52.11％；H,4.81％；N,7.01％。
            
實施例84  
            
6-甲基-2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸M.P.＞250℃元素分析，計算值(C11H12N2O5S,0.6H2O)C,44.77％；H,4.51％；N,9.49％。實測值C,44.54％；H,4.17％；N,9.21％。
            
實施例85 2-(草酰氨基)-4,7-二氫-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸單鈉鹽M.p.＞250℃元素分析，計算值(C10H8N1O6SNa,0.75×H2O)C,39.16％；H,3.12％；N,4.57％。實測值C,39.29％；H,3.67％；N,4.41％。
            
實施例86 2-(草酰氨基)-6-苯乙基-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸元素分析，計算值(C18H18N2O5S,1×H2O)C,55.09％；H,5.14％；N,7.14％。實測值C,55.47％；H,5.04％；N,7.07％。
            
實施例87  
            
2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-4,7-橋亞乙基-噻吩并[2,3-b]吡啶-3-羧酸元素分析，計算值(C12H12N2O5S,0.75×H2O)C,46.52％；H,4.39％；N,9.04％。實測值C,46.48％；H,4.79％；N,8.87％。
            
實施例88 2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸氫氯化物以4-氧代-1-哌啶羧酸叔丁酯為起始物料。用25％三氟乙酸的二氯甲烷液除去Boc基團。
            
M.p.＞250℃元素分析，計算值(C10H10N2O5S,1HCl,0.5×H2O)C,38.35％；H,4.34％；N,8.64％。實測值C,38.04％；H,3.83％；N,8.87％。
            
實施例89 2-(草酰氨基)-6-吡啶-2-基甲基-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸向2-(乙氧基草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸乙酯三氟乙酸鹽(1.5g,3.40mmol)、碳酸鉀(2.4g,17.1mmol)、碘化鉀(100mg)在丙酮(40ml)中的混合物中加入2-吡啶甲基氯氫氯化物(0.61g,3.7mmol)。所得混合物在回流溫度下攪拌18h，過濾并真空蒸發。殘留物用乙醚研制，固體物質過濾，在硅膠(300ml)上用乙酸乙酯/乙醇/三乙基胺的混合物(3∶1∶0.4)作洗脫劑進行純化。收集純化級分，洗脫劑經真空蒸發，得650mg(39％)的2-(乙氧基草酰氨基)-6-吡啶-2-基甲基-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸三乙基銨鹽固體。
            
向上述三乙基銨鹽(650mg,1.40mmol)的乙醇(15ml)溶液中加入1N氫氧化鈉水溶液(4.1ml,4.1mmol)，然后加水(15ml)。所得反應混合物室溫攪拌18h。揮發物經真空蒸發，殘留物溶于水(20ml)，用乙醚(2×10ml)洗滌。向水相加入1N鹽酸至pH=1，并真空蒸發水相。殘留物懸浮于2-丙醇/水的混合物(1∶1,40ml)中，攪拌1h，固體經過濾并用2-丙醇洗滌(2×15ml)，50℃真空干燥，得181mg(38％)的粗制標題化合物。將該粗制產物(181mg)溶于水(10ml)和5N氫氧化鈉(10ml)的混合物中，用乙醚洗滌(2×10ml)。水相用1N鹽酸酸化為pH=3，沉淀經過濾并水洗(3×20ml)，50℃真空干燥18h，得51mg(11％)的標題化合物固體。
            
M.p.238-244℃元素分析，計算值(C16H15N3O5S,2.5×H2O)C,47.29％；H,4.96％；N,10.34％。實測值C,47.43％；H,4.84％；N,10.00％。
            
用實施例89所述類似方法制備以下化合物。
            
實施例90 6-(3-甲氧基-苯甲基)-2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸M.p.233-237℃元素分析,計算值(C18H18N2O6S,1×H2O)C,52.93％；H,4.94％；N,6.86％。實測值C,52.79％；H,4,99％；N,6.42％。
            
實施例91  
            
2-(草酰氨基)-6-吡啶-3-基甲基-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸氫氯化物M.p.234-238℃元素分析，計算值(C16H15N3O5S,1×HCl,0.5×H2O)C,47.24％；H,4.21％；N,10.33％。實測值C,47.35％；H,4.10％；N,10.35％。
            
實施例92 2-(草酰氨基)-6-喹啉-2-基甲基-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸M.p.＞250℃元素分析,計算值(C20H17N3O5S,1×H2O)C,55.95％；H,4.22％；N,9.61％。實測值C,55.94％；H,4.46％；N,9.78％。
            
實施例93 2-(草酰氨基)-6-吡啶-4-基甲基-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸氫氯化物M.p.230-235℃元素分析,計算值(C16H15N3O5S,1×HCl,1×H2O)C,46.21％；H,4.36％；N,10.10％。實測值C,45.82％；H,4.42％；N,10.02％。
            
實施例94 6-(草酰氨基)-1H-吲哚-7-羧酸單鈉鹽向攪拌的6-氨基-1H吲哚-7-羧酸乙酯(1.5g,7.3mmol,按J.Org.Chem.61,1155-1158(1996)所述而制備)、三乙基胺(1.55ml,11.0mmol)在無水四氫呋喃(100ml)中的溶液中于0℃滴加乙基草酰氯(980μl,88.0mmol)的無水四氫呋喃(10ml)溶液。所得反應混合物室溫攪拌2h,倒入水(300ml)中，沉淀經過濾并于50℃真空干燥，得2.25g(100％)的6-(乙氧基草酰氨基)-1H-吲哚-7-羧酸乙酯油。
            
向上述1H-吲哚-7-羧酸乙酯(2.0g,6.60mmol)的乙醇(30ml)溶液中加入1N含水氫氧化鈉(16.4ml,16.4mmo1)的水溶液(30ml)。所得反應混合物室溫攪拌18h。揮發物經真空蒸發，向殘留的水相加1N鹽酸使pH=1。沉淀經過濾，水洗(2×50m1)、乙醚洗(2×30ml)，50℃真空干燥，得1.34g(82％)的標題化合物固體。
            
M.p.＞250℃元素分析，計算值(C11H7N2O5Na,1.5×H2O)C,44.46％；H,3.39％；N,9.43％。實測值C,44.31％；H,3.34％；N,9.00％。
            
用類似于實施例94所述的方法制備以下化合物。
            
實施例95 6-(草酰氨基)-1H-吲哚-5-羧酸單鈉鹽6-氨基-1H-吲哚-5-羧酸乙酯按J.Org.Chem.61,1155-1158(1996)所述而制備。
            
M.p.＞250℃元素分析，計算值(C11H7N2O5Na,1.5×H2O)C,44.46％；H,3.39％；N,9.43％。實測值C,44.44％；H,3.68％；N,9.00％。
            
實施例96 3-[4-(3-嗎啉-4-基-丙酰)-哌嗪-1-基甲基]-6-(草酰氨基)-1H-吲哚-5-羧酸單鈉鹽向冰冷卻的37％含水甲醛(2.7g,33.0mmo1)之乙酸(8ml)溶液中滴加哌嗪-1-羧酸叔丁酯(2.7g,15mmol)溶液。攪拌15分鐘后，加入在乙酸(80ml)和四氫呋喃(80ml)混合物中的6-(乙氧基草酰氨基)-1H-吲哚-5-羧酸(4.0g,13.0mmol)溶液，所得反應混合物室溫攪拌18h。揮發物經真空蒸發，向殘留物加水(100ml)。水相用乙酸乙酯(2×100ml)提取，混合的有機提取物用水洗(2×100ml)，飽和含水氯化銨洗(1×80ml)，干燥(MgSO4)，過濾并真空蒸發。殘留物經乙醚(50ml)研制，沉淀經過濾并經乙醚洗滌，50℃真空干燥，得3.4g(51％)的3-(4-叔丁氧羰基-哌嗪-1-基甲基)-6-(乙氧基草酰氨基)-1H-吲哚-5-羧酸乙酯固體。
            
向上述6-(乙氧基草酰氨基)-1H-吲哚-5-羧酸乙酯的二氯甲烷(20ml)溶液中室溫加入三氟乙酸(20ml)。所得混合物攪拌1h，揮發物經真空蒸發，殘留物加水(50ml)，所得混合物攪拌1/2h。沉淀經過濾并水洗(50ml)，乙醚洗(50ml)，50℃真空干燥，得3.6g(100％)的6-(乙氧基草酰氨基)-3-哌嗪-1-基甲基-1H-吲哚-5-羧酸乙酯三氟乙酸鹽固體。
            
向冰冷卻的上述哌嗪(3.0g,5.81mmol)在二氯甲烷(100ml)和三乙基胺(2.5ml)中的混合物中滴加氯丙酰氯(0.6ml,6.39mmol)在二氯甲烷(10ml)中的混合物。所得混合物室溫攪拌1h，水洗(50ml)，干燥(MgSO4)，過濾并真空蒸發，得1.8g(68％)的3-(4-丙烯酰-哌嗪-1-基甲基)-6-(乙氧基草酰氨基)-1H-吲哚-5-羧酸乙酯油。
            
向上述丙烯酰-哌嗪(0.5g,1.1mmol)的乙醇(50ml)溶液中加入嗎啉(0.24g,2.74mmol)。所得混合物在回流溫度下攪拌18h，揮發物經真空蒸發。殘留物溶于水(50ml)，用1N鹽酸將pH調為2，并用乙酸乙酯洗(2×50ml)。水相用1N氫氧化鈉中和，沉淀經過濾、水洗、50℃真空干燥3h，得0.3g(50％)的6-(乙氧基草酰氨基)-3-[4-(3-嗎啉-4-基-丙酰)-哌嗪-1-基甲基]-1H-吲哚-5-羧酸乙酯固體。
            
向上述1H-吲哚-5-羧酸乙酯(0.2g,0.37mmol)的乙醇(5ml)溶液中加入氫氧化鈉(45mg,1.10mmol)的水(15ml)溶液。所得反應混合物室溫攪拌18h，加1N鹽酸將pH調至1。水相經乙酸乙酯洗(2×25ml)并加1N氫氧化鈉使pH調至5，然后加入二氟甲烷(25ml)。沉淀經過濾，水洗(50ml)及50℃真空干燥得30mg(17％)的標題化合物固體。
            
M.p.＞250℃LC-MS(E+)M/Z488實施例97 1-(3-甲氧基-苯甲基)-6-(草酰氨基)-1H-吲哚-5-羧酸向6-氨基-1H-吲哚-5-羧酸乙酯(1.0g,3.30mmol；按J.Org.Chem.61,1155-1158(1996)所述而制備)的干N,N-二甲基甲酰胺(40ml)溶液中加入氫化鈉(0.28g,7.3mmol；60％，在礦物油中)。反應混合物攪拌1.5h，滴加3-甲氧基苯甲基氯(0.5ml,3.6mmol)的干N,N-二甲基甲酰胺(2.5ml)溶液。所得反應混合物攪拌1.5h,倒入水(300ml)中并用乙醚洗滌(3×100ml)。不溶物經過濾，水相加1N鹽酸酸化為pH=4。沉淀經過濾并水洗，50℃真空干燥，得400mg(29％)的6-(乙氧基草酰氨基)-1-(3-甲氧基-苯甲基)-1H-吲哚-5-羧酸乙酯固體。
            
向上述1H-吲哚-5-羧酸乙酯(0.3g,0.7mmol)的乙醇(10ml)溶液中加入1N氫氧化鈉(2.1ml,2.1mmol)和水(10ml)。所得反應混合物室溫攪拌18h。揮發物經真空揮發,加1N鹽酸將pH調至2，沉淀經過濾和水洗，50℃真空干燥，得230mg(89％)的標題化合物固體。
            
M.p.222-226℃元素分析，計算值(C19H16N2O6,0.4×H2O)C,60.77％；H,4.51％；N,7.46％。實測值C,60.96％；H,4.44％；N,7.28％。
            
用類似于實施例81所述的方法制備以下化合物。
            
實施例98 2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]噻喃-3-羧酸元素分析，計算值(C10H9NO5S2)C,41.48％；H,3.16％；N,4.88％。實測值C,41.97％；H,3.20％；N,4.69％。
            
實施例99 2-(草酰氨基)-9H-噻吩并[2,3-c]苯并吡喃-3-羧酸單鈉鹽向苯并二氫吡喃-4-酮(chromanone)(20g,0.14mo1)、氰基乙酸乙基酯(16.8g,0.15mo1)和乙酸銨(11.4g,0.15mol)的苯(500ml)溶液中加入乙酸(5ml)，所得反應混合物在回流溫度下加熱18h，將所形成的水收集在Dean-Stark分水器中。再加入一些乙酸銨(10g,0.13mol)，繼續在回流溫度下加熱8h。揮發物經真空蒸發，向殘留物加水(500ml)，水相用乙酸乙酯(2×200ml)提取。混合的有機提取物經水洗(2×100ml)、飽和氯化鈉水溶液(100ml)洗、干燥(MgSO4)、過濾并真空蒸發，得28g以1∶1混合的未改變的起始物料和苯并二氫吡喃-4-亞基-氰基-乙酸乙酯油。
            
向該粗制品的乙醇(250ml)溶液中加入硫(2.5g,0.08mol)和嗎啉(15ml)。所得反應化合物經50℃攪拌4h并冷卻至室溫，過濾。揮發物經真空蒸發，得30g粗制品。
            
將該產物分為兩部分，用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶3)在硅膠(900ml)上半純化。收集半純化級分，溶劑經真空蒸發得粗制油，該油溶于乙醚(80ml)，加庚烷(125ml)使之結晶。沉淀經過濾，庚烷洗滌，50℃真空干燥18h，得8.9g(24％)的2-氨基-9H-噻吩并[2,3-c]苯并吡喃-3-羧酸乙酯固體。
            
向0℃攪拌的上述2-氨基-6H-噻吩并[2,3-c]苯并吡喃-3-羧酸乙酯(2.9g,10.53mmol)、三乙基胺(3ml)的無水四氫呋喃(100ml)溶液中滴加乙基草酰氯(1.6g,11.6mmol)的無水四氫呋喃(20ml)溶液。所得反應混合物室溫攪拌1.5h，倒入冰水(200ml)中，沉淀經過濾并50℃真空干燥，得2.6g(66％)的2-(乙氧基草酰氨基)-9H-噻吩并[2,3-c]苯并吡喃-3-羧酸乙酯固體。
            
向上述乙酯(1.5g,4.0mmol)的乙醇(25ml)溶液中加入氫氧化鈉(480mg,12mmol)和水(50ml)。所得反應混合物室溫攪拌42h。加水(100ml)，混合物用乙醚(100ml)洗滌。加濃鹽酸將水相的pH調至1，沉淀經過濾，水洗并50℃真空干燥6h，得0.6g(47％)的標題化合物固體。
            
M.p.227-228℃元素分析，計算值(C14H9NO6SNa,0.5H2O)C,48.01％；H,2.59％；N,4.00％。實測值C,48.39％；H,2.93％；N,3.93％。
            
實施例100 2-((2-H-四唑-5-羰基)氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸向冷卻至-20℃的N,N-二結晶甲酰胺(1.6ml)和乙腈(5ml)的混合物中滴加草酰氯(0.8g,6.31mmol)和乙腈(1ml)混合物。所得混合物攪拌15分鐘，加四唑-5-羧酸二鉀鹽(1g,5.25mmol，按J.Med.Chem.29,538-549(1986)所述而制備)，所得混合物再攪拌20分鐘。在10分鐘內向混合物中滴加2-氨基-4,5-二氫-7H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(1.3g,5.25mmol)、吡啶(2.2ml)和乙腈(2.5ml)的溶液。使反應混合物在回流溫度加熱0.5h后達到室溫。冷卻的反應混合物加入水(100ml)中，加濃鹽酸調pH為1。沉淀經過濾，庚烷洗滌，50℃真空干燥18h，得1.3g(70％)的2-((1-H-四唑-5-羰基)氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。
            
將上述叔丁酯(0.6g,1.71mmol)溶于二氯甲烷(5ml)中，加入三氟乙酸(5ml)。所得混合物室溫攪拌40分鐘。揮發物經真空蒸發，向殘留物加乙醚(50ml)、水(25ml)和1N氫氧化鈉(2ml)。經分相，水相用乙醚(50ml)洗滌，并通過加高濃度的鹽酸將pH調至1。沉淀經過濾，水洗(25ml)及50℃真空干燥18h，得190mg(38％)的標題化合物固體。
            
M.p.＞250℃元素分析，計算值(C10H9N5O4S,0.25×H2O)C,40.07％；H,3.19％；N,23.36％。實測值C,40.39％；H,3.18％；N,22.92％。
            
實施例101 N-(3-(2H-四唑-5-基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-2-基)草酸二鈉鹽將2-氨基-4,5-二氫-7H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸乙酯(26g,0.114mo1)溶于甲酰胺(200ml)中，所得化合物在回流溫度中加熱1.5h。冷卻至室溫后將沉淀物過濾，水洗(2×80ml)并50℃真空干燥18h，得10.0g(42％)的5,6-二氫-8H-吡喃[4’,3’4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-酮固體。
            
將上述嘧啶-4-酮(7.0g,0.04mo1)和N,N-二甲基苯胺(0.2m1)加至磷酰氯(70ml)中。所得混合物在回流加熱的溫度下加熱2h，冷卻并加至冰水(700ml)中。沉淀物過濾，懸浮于乙酸乙酯(400ml)和水(250ml)的混合物中并攪拌15分鐘。水相經分層除去，有機相用飽和氮化鈉水溶液(100ml)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并真空蒸發，得5.2g(68％)的4-氯-5,6-二氫-8H-吡喃[4’,3’4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶固體。
            
向溫的上述噻吩并-嘧啶(4.5g,0.02mol)的乙醇溶液(40ml)中滴加水合肼(10.0ml)的乙醇(20ml)溶液。所得溶液在回流溫度中加熱2h，冷卻至室溫，將沉淀過濾，經乙醇(20ml)洗滌并50℃真空干燥1.5h，得3.2g(73％)的5,6-二氫-8H-吡喃[4’,3’4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基肼固體。
            
將上述肼(3.0g,0.014mol)的50％乙酸(100ml)水溶液冰浴冷卻，滴加硝酸鈉(1.0g,0.015nol)的水溶液(10ml)。反應混合物攪拌2h,將沉淀過濾，水洗(25ml)并50℃真空干燥1h，得3.0g(95％)的10,11-二氫-8H-吡喃[4’,3’4,5]噻吩并[3,2-e]四唑[5,1-c]嘧啶固體。
            
向上述四唑(2.5g,0.011mol)二噁烷(30ml)溶液中滴加1N氫氧化鈉(25ml)。反應混合物攪拌3h,加至冰冷卻的水(100ml)中，用乙酸調pH至4。將沉淀過濾，水洗(25ml)并50℃真空干燥18h，得2.2g(82％)的N-(3-(2H-四唑-5-基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-2-基)甲酰胺固體。
            
將上述甲酰胺(0.6g,2.7mmol)溶于無水四氫呋喃(50ml)中，加三乙基胺(1ml)。所得混合物冰浴冷卻，滴加乙基草酰氯(0.4g,2.96mmol)的無水四氫呋喃(5ml)溶液。所得反應混合物室溫攪拌2h，揮發物經真空蒸發。向殘留物中加水(50ml)、乙醚(50ml)，并用1N鹽酸調pH=2，過濾除去一小部分沉淀。使有機相分層，干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發。殘留物(0.4g)懸浮于二氯甲烷(20ml)中并攪拌1h，將固體物質過濾并于50℃真空干燥，得0.16g(18％)的N-(3-(2H-四唑-5-基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-2-基)草酸乙酯固體。
            
向上述草酸乙酯(0.16g,0.49mmo1)的乙醇(15ml)溶液中加1N氫氧化鈉(1.0ml,1.01mmol)。所得反應混合物室溫攪拌2h。將沉淀過濾,用乙醇洗滌(10ml),50℃真空干燥，得140mg(83％)的標題化合物固體M.p.＞250℃元素分析，計算值(C10H9N5O4SNa2,3×H2O)C,30.54％；H,3.33％；N,17.81％。實測值C,30.70％；H,3.35％；N,17.49％。
            
用類似于實施例81所述的方法制備以下化合物。
            
實施例102 2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c']吡啶-3,6-二羧酸6-苯甲基酯M.p.＞250℃元素分析，計算值(C18H16N2O7S)C,53.46％；H,3.99％；N,6.93％。實測值C,53.44％；H,4.15％；N,6.69％。
            
實施例103 2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡啶-3,6-二羧酸6-乙酯M.p.245-247℃元素分析，計算值C13H14N2O7SC,45.61％；H,4.12％；N,8.18％。實測值C,45.71％；H,4.31％；N,7.86％。
            
實施例104 6-乙酰-2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸M.p.242-244℃元素分析,計算值(C12H12N2O6S,0.25×H2O)C,45.50％；H,3.98％；N,8.84％。實測值C,45.64％；H,3.97％；N,8.51％。
            
實施例105 2-(草酰氨基)-6-苯基氨基甲酰基甲基-4,5,6,7-四氫-噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸M.p.244-246℃元素分析,計算值(C18H17N3O6S,1×H2O)C,51.30％；H,4.54％；N,9.97％。實測值C,51.08％；H,4.52％；N,9.63％。
            
實施例106 5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸向苯甲基氧乙醛(8.3g,0.06mol)與苯(80ml)的混合物中加入1-甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-1,3-丁二烯(10.6g,0.06mol)。反應混合物在氮氣氛中攪拌15分鐘，冷卻至0℃，滴加0.5M氯化鋅溶液(55ml,0.03mol)。使反應混合物升至室溫保持16h并真空蒸發。所得油用乙酸乙酯(100ml)稀釋，1N鹽酸洗滌(3×50ml)，飽和碳酸氫鈉洗滌(3×50ml)，鹽水洗(3×50ml)，干燥(MgSO4)并真空蒸發。用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶2)作洗脫劑對所得油進行快速色譜。收集純化級分，真空蒸發后得7.1g(60％)的苯甲基氧基-甲基-2,3-二氫-吡喃-4-酮的油。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.31(m,6H),5.42(dd,J=6,1Hz,1H),4.61(d,J=3Hz,1H),4,57(m,1H),3.70(m,2H),2.74(dd,J=17Hz,14Hz,1H),2.41(ddd,J=17Hz,2Hz,,1Hz,1H).
            
將在乙酸乙酯(50ml)中的上述2,3-二氫-吡喃-4-酮(7.1g,0.032mol)和10％鈀/碳(0.4g)置于Parr bomb搖動器中，在30psi的壓力下加氫。將反應混合物振蕩2h，此時的TLC分析(甲醇/二氯甲烷1∶9)表明反應是完全的。將反應混合物通過塞力特硅藻土填料過濾，揮發物經真空蒸發。殘留物用乙酸乙酯作洗脫劑進行快速色譜。收集純化級分，真空蒸發后得3.0g(75％)的2-羧甲基-四氫-吡喃-4-酮的油。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.36-4.29(m,1H),3.77-3.66(m,3H),3.61-3.54(m,1H),2.65-2.43(m,2H),2.34-2.27(m,2H),2.04(bs,1H,CH2OH).
            
將上述四氫-吡喃-4-酮(1.90g,0.015mol)、氰基乙酸叔丁基酯(2.7g,0.019mol)、硫(0.51g,0.016mol)和嗎啉(2.55ml,0.03mol)溶于無水乙醇(20ml)中，50℃加熱16h。使反應混合物冷卻，過濾，濾液經真空蒸發。所得油溶于乙酸乙酯(50m1)，經水洗(2×50ml)，鹽水洗(2×50ml)并干燥(MgS04)。溶劑經真空蒸發，殘留物用乙酸乙酯/己烷(1∶1)作洗脫劑進行快速色譜。收集純化級分，真空蒸發后得3.7g(90％)的2-氨基-5-羥甲基-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.64(s,2H),3.80-3.67(m,3H),2.77-2.72(m,1H),2.57-2.53(m,1H),1.54(s,9H).
            
將上述羧酸叔丁酯(3.0g,0.015mol)、苯鄰二甲酰亞胺(2.10g,0.014mol)和三苯基膦(3.68g,0.014)溶于無水四氫呋喃(60ml)中，在氮氣氛中冷卻至0℃。于0℃滴加偶氮二羧酸二異丙基酯(DIAD)(2.71ml,0.014mol)，使該溶液攪拌過夜，緩慢升至室溫。揮發物經真空蒸發，所得固體溶于乙酸乙酯(60ml)中。有機相經鹽水洗(2×50ml)，干燥(MgSO4)并真空蒸發。對殘留物進行快速柱色譜，起始用乙酸乙酯/己烷(1∶3)的混合物洗脫。一旦產物開始洗脫，將洗脫劑混合物換成乙酸乙酯/己烷(1∶2)。收集純化級分，真空蒸發后得2.90g(47％)的2-氨基-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87-7.85(m,2H),7.83-7.71(m,2H),5.94(bs,2H),4.59(d,J=14Hz,1H),4.52(d,J=14Hz,1H),4.0-3.98(m,2H),3.83-3.79(m,1H),2.87(d,J=17Hz,1H),2.58(dd,J=17Hz,9Hz,1H),1.50(s,9H).
            
將上述4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(0.5g,1.2mmol)溶于二氯甲烷(5ml),在氮氣氛中加三乙基胺(0.33ml,2.4mmol)和咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(0.47g,2.4mmol)。使反應混合物在室溫下攪拌18小時。揮發物經真空蒸發，固體殘留物溶于乙酸乙酯(20ml)。有機相經1％鹽酸洗滌(2×10ml)，鹽水洗(2×10ml)，干燥(MgSO4)。將有機相真空蒸發得0.64g(99％)的2-(叔丁氧草酰氨基)-5-(1,3-二氧-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.48(s,1H,NHCO),7.88-7.86(m,2H),7.74-7.72(m,2H),4.78(d,J=19Hz,1H),4.65(d,J=19Hz,1H),4.07-3.90(m,2H),3.88-3.80(m,1H),2.97(d,J=17Hz,1H),2.68(dd,J=17Hz,9Hz,1H),1.58(s,9H),1.54(s,9H).
            
將上述叔丁酯(2.8g,5.16mmol)溶于三氟乙酸和二氯甲烷(1∶5)(36ml)的混合物中。反應混合物于室溫攪拌6h。沉淀物過濾，經乙醚洗滌，50℃真空干燥，得1.26g(57％)的標題化合物固體。
            
M.p.245.2-245.6℃1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.32(s,1H,NHCO),7.95-7.80(m,4H),4.75(d,J=20Hz,1H),4.62(d,J=20Hz,1H),3.96-3.69(m,3H),3.01(d,J=18Hz,1H),2.60(dd,J=18Hz,9Hz,1H).
            
元素分析，計算值(C19H14N2O8S)C，53.02％；H,3.28％；N,6.51％。實測值C,53.01％；H,3.31％；N,6.41％。
            
實施例107 5-(苯甲酰基氨-甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸將2-(叔丁氧草酰氨基)-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(0.33g,0.60mmol)溶于乙醇(2ml)和二氯甲烷(3ml)的溶液中。加入肼(28μl,0.9mmol),反應混合物于氮氣氛中室溫攪拌24h。TLC分析表明仍有起始物料。再加一些肼(28μl,0.9mmol)，反應混合物于室溫下再攪拌16h，然后于45℃攪拌5h。真空濃縮該混合物，重新溶于二氯甲烷，不溶物過濾除去。收集濾液并真空濃縮得粗制5-氨甲基-2-(叔丁氧草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體，該固體不必進一步純化便可進行后續步驟。
            
將上述5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(0.25g,0.60mmol)懸浮于二氮甲烷和乙腈的混合物(1∶1,5ml)中。依次加入三乙基胺(0.25ml,1.8mmol)、1-羥基-苯并三唑水合物固體(0.10g,0.72mmol)和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物固體(0.14g,0.72mmol)。使這種不均勻的反應混合物室溫攪拌2天，此后該混合物變得均勻。溶劑經真空蒸發，溶于二氯甲烷的殘留物用1M鹽酸洗2次，然后用飽和碳酸氫鈉洗滌。有機相經干燥(MgSO4)、過濾并真空濃縮得到一種固體，用乙酸乙酯和己烷(1∶1)的混合物作洗脫劑經快速色譜純化該固體。收集純化級分，真空蒸發得50mg(經過兩步得16％)的5-(苯甲酰氨甲基)-2-(叔丁氧草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.46(s,1H),7.81(d,J=7Hz,2H),7.51-7.42(m,3H),6.72(bs,1H),4.83(d,J=17Hz,1H),4.74(d,J=17Hz,1H),4.05-3.98(m,1H),3.86-3.78(m,1H),3.45-3.38(m,1H),2.97(d,J=19Hz,1H),2.68(dd,J=19Hz,9Hz,1H),1.61(s,9H),1.58(s,9H).
            
用20％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(2ml)處理上述苯甲酰氨-甲基-噻吩并[2,3-c]吡喃(40mg,0.078mmol)4h。揮發物經真空蒸發,用二氯甲烷洗(chase)兩次,形成沉淀,經過濾和干燥產生30mg(95％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.31(s,1H),8.63(t,J=4Hz,1H),7.86(d,J=7Hz,2H),7.51-7.43(m,3H),4.80(d,J=17Hz,1H),4.64(d,J=17Hz,1H),3.82(m,1H),3.44(m,2H),2.95(d,J=18,1H),2.52(dd,J=18Hz,9Hz,1H).LC/MS[M-H]403.39.HPLC(254.4nm)2.99s,84％.
            
實施例108  
            
5-苯甲酰基氧甲基-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸將2-氨基-5-羥甲基-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(0.23g,0.87mmol)苯甲酸(0.10g,0.96mmol)和三乙基胺(0.23ml,1.7mmol)溶于二氯甲烷(4ml)，于氮氣氛中攪拌。加入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物固體(0.17g,0.96mmol)和1-羥基-苯并三唑水合物(0.12g,0.96mmol)固體。反應混合物室溫攪拌2天，之后將溶劑真空蒸發。將該粗制混合物溶于乙酸乙酯并用1N鹽酸、飽和碳酸氫鈉、鹽水洗滌，并干燥(Na2SO4)。溶劑經真空蒸發，產生一種黃色固體，用乙酸乙酯和己烷的混合物(1∶2)作洗脫劑經快速色譜純化該固體。收集純化級分，真空蒸發得0.22g(70％)的2-氨基-5-苯甲酰氧甲基-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(d,J=7Hz,2H),7.55(t,J=7Hz,1H),7.42(t,J=7Hz,2H),4.64(s,2H),4.44(d,J=5Hz,2H),4.03-3.97(m,1H),2.88(d,J=18Hz,1H),2.64(dd,J=17Hz,10Hz,1H),1.50(s,9H).LC/MS[M+H]390.48在氮氣氛中向溶于無水四氫呋喃(5ml)的上述羧酸叔丁酯(0.18g,0.45mmol)中加入三乙基胺(0.18ml,0.14mmol)和咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(0.26g,1.4mmol)。反應混合物室溫攪拌3h。揮發物經真空蒸發,所得固體重新溶于乙酸乙酯(10ml)。有機相用1％鹽酸(2×10ml)、鹽水(2×10ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發溶劑。所得油用乙酸乙酯和己烷(1∶2)的混合物作洗脫劑經快速色譜純化，得到0.20g(90％)的5-苯甲酰氧甲基-2-(叔丁氧草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.07(d,J=7Hz,2H),7.56(t,J=7Hz,1H),7.44(t,J=7Hz,2H),4.85(d,J=15Hz,1H),4.77(d,J=15Hz,1H),4.49(d,J=5Hz,2H),4.03-3.99(m,1H),2.99(d,J=17Hz,1H),2.72(dd,J=17Hz,11Hz,1H),1.58(s,9H),1.60(s,9H).
            
將上述二叔丁酯(0.15g,0.29mmol)溶于20％三氟乙酸的二氯甲烷(3ml)溶液。該溶液迅速顯出暗桔黃色并很快變成紅色。反應混合物于室溫攪拌1.5h。揮發物經真空蒸發得到棕色固體，用乙醚和水洗滌該固體并過濾。所得固體經真空干燥，得30mg(25％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.40(s,1H),7.98(d,J=7Hz,2H),7.67(t,J=7Hz,1H),7.54(t,J=7Hz,2H),4.83(d,J=15Hz,1H),4.70(d,J=15Hz,1H),4.44(d,J=5Hz,2H),4.02-3.99(m,1H),2.99(d,J=16Hz,1H),2.70(dd,J=16Hz,9Hz,1H).LC/MS[M-H]404.05.HPLC(254.4nm)7.16s,90％.
            
實施例109 2-(草酰氨基)-5-(1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2.3-c]吡喃-3-羧酸向2-氨基-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(0.308g,0.74mmo1)的無水乙醇(5ml)溶液中加入肼(47μl,1.48mmol)。反應混合物于80℃攪拌4h，再室溫攪拌12h。形成的沉淀經過濾，濾液經真空濃縮。向該油性殘留物中加入二氯甲烷(15ml)，形成的沉淀過濾除去。濾液經真空濃縮，得到0.19g(90％)2-氨基-5-氨甲基-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.91(bs,2H),4.62(s,2H),3.64-3.60(m,1H),2.92-2.84(m,2H),2.80-2.75(m,1H),2.52-2.45(m,1H),1.53(s,9H).LC-MS[M+H]+285將鄰苯二醛(52mg,0.36mmol)溶于無水乙腈(2ml)和乙酸(44μl,0.72mmol)的混合物中。加入上述2-氨基-5-氨甲基-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(0.11g,0.36mmol),反應混合物于室溫攪拌20分鐘。揮發物經真空蒸發，殘留物溶于乙酸乙酯(25ml)。有機混合物用飽和碳酸氫鈉(5ml)、1％鹽酸(5ml)、鹽水(5ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發。殘留物用乙酸乙酯/二氯甲烷的15％-17％的梯度作洗脫劑經色譜純化，得到45mg(30％)的2-氨基-5-(1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(d,J=7Hz,1H),7.53(t,J=7Hz,1H),7.47-7.43(m,2H),4.68(d,J=17Hz,1H),4.58-4.51(m,3H),3.99(dd,J=14Hz,3Hz,1H),3.93-3.89(m,1H),3.66-3.61(m,1H),2.88(d,J=17Hz,1H),2.55(dd,J=17Hz,11Hz,1H),1.52(s,9H).
            
向2-氨基-5-(1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(45mg,1.1mmol)的無水二氯甲烷(4ml)溶液中加入咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(73mg,3.3mmol)和三乙基胺(17μl,1.1mmol)。反應混合物于氮氣氛中室溫攪拌5h。溶劑經真空蒸發，粗制物質溶于乙酸乙酯(20ml)中。有機溶液用0.5N鹽酸(3ml)、飽和碳酸氫鈉(3ml)、鹽水(5ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發溶劑。殘留物依次用100％的二氯甲烷和17％的乙酸乙酯/二氯甲烷作洗脫劑進行色譜純化，得54mg(91％)的2-(叔丁氧草酰氨基)-5-(1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.50(s,1H),7.84(d,J=8Hz,1H),7.53(t,J=7Hz,1H),7.47-7.43(m,2H),4.81-4.65(m,3H),4.53(d,J=17Hz,1H),4.01(dd,J=14Hz,3Hz,1H),3.96-3.89(m,1H),3.69-3.62(m,1H),2.97(d,J=17Hz,1H),2.63(dd,J=17Hz,11Hz,1H),1.59(s,9H),1.56(s,9H).APCI-MS[M+H]+529.5室溫下用50％三氟乙酸/二氯甲烷溶液(3ml)處理上述2-(叔丁氧草酰氨基)-5-(1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(52mg,0.098mmol)4.5h。揮發物經真空蒸發，殘留物用二氯甲烷(10ml)洗(chase)三次。形成的固體經過濾，并用二氯甲烷洗滌，得28mg(70％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.32(s,1H),7.69(d,J=8Hz,1H),7.61-7.59(m,2H),7.51-7.45(m,1H),4.81(d,J=15Hz,1H),4.65(d,J=15Hz,1H),4.60(s,2H),3.95-3.92(m,1H),3.75(d,J=5Hz,2H),2.94(d,J=16Hz,1H),2.56(dd,J=16Hz,10Hz,1H).APCI-MS[M+H]+41 7.3HPLC(254.4nm)3.079s(100％)實施例110 2-(草酰氨基)-6-氧代-4,3,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸室溫下將2-(乙氧基草酰氨基)-6-氧代-4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸(3.0g,0.013mol)溶于水(40ml)、乙醇(20ml)和四氫呋喃(20ml)的混合物中。向所得混合物中加入1N氫氧化鈉(20.24ml,20.224mmol)。所得反應混合物于室溫攪拌72h，加濃鹽酸將pH調至3。沉淀經過濾，并用水(2×15ml)、乙醚(2×15ml)洗滌，50℃真空干燥，得1.96g(73％)的標題化合物固體。
            
M.p.＞230℃元素分析，計算值(C11H9NO6S)C,46.64％；H,3.30％；N,4.94％。實測值C,46.97％；H,3.30％；N,5.80％。
            
用類似于實施例81所述的方法制備以下化合物。
            
實施例111  
            
4-羧甲基-2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸用J.Am.Chem.Soc.81,3955-3959(1959)關于2-乙氧甲酰(carbethoxg)甲基環己酮的制備方法制備2-甲氧甲酰(carbmethoxy)甲基環己酮。
            
M.p.＞250℃元素分析，計算值(C13H13N1O7S1,0.75H2O)C,45.81％；H,4.29％；N,4.11％。實測值C,45.79％；H,4.02％；N,4.08％。
            
實施例112 2-(草酰氨基)-6-氧代-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]噻喃-3-羧酸按J.Org.Chem.27,282-284(1962)所述制備1-氧代-2,3,5,6-四氫-噻喃-4-酮。
            
M.p.＞250℃元素分析,計算值(C10H9N1O6S2,0.2×H2O)C,38.13％；H,2.88％；N,4.45％。實測值C,37.98％；H,2.82％；N,4.29％。
            
實施例113 2-(草酰氨基)-6,6-二氧代-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]噻喃-3-羧酸單鈉鹽按J.Org.Chem.60,1665-1673(1995)所述制備1,1-二氧代-2,3,5,6-四氫-噻喃-4-酮。
            
M.p.＞250℃元素分析,計算值(C10H8N1O7S2Na,1×H2O)C,33.43％；H,2.81％；N,3.90％。實測值C,33.43％；H,2.78％；N,3.76％。
            
用類似于實施例107所述的方法制備以下化合物。
            
實施例114 2-(草酰氨基)-5-(((4-氧代-苯并吡喃-4H-3-羰基)氨基)甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.32(s,1H),9.47(t,J=4Hz,1H),9.08(s,1H),8.19(ddJ=8Hz,2Hz,1H),7.90(dt,J=8Hz,2Hz,1H),7.78(d,J=8Hz,1H),7.60(t,J=8Hz,1H),4.88(d,J=15Hz,1H),4.70(d,J=15Hz,1H),3.83-3.79(m,1H),3.72-3.66(m,1H),3.55-3.48(m,1H),2.95(d,J=15Hz,1H),2.60(dd,J=15Hz,8Hz,1H).LC/MS[M-H]-471.4HPLC(254.4nm)3.105s,94％.
            
實施例115 2-(草酰氨基)-5-(((4-氧代-苯并吡喃-4H-2-羰基)氨基)甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.32(s,1H),9.33(t,J=4Hz,1H),8.05(d,J=8Hz,1H),7.89(t,J=8Hz,1H),7.76(d,J=8Hz,1H),7.53(t,J=8Hz,1H),6.84(s,1H),4.83(d,J=15Hz,1H),4.66(d,J=15Hz,1H),3.89-3.84(m,1H),3.56-3.45(m,2H),2.98(d,J=18Hz,1H),2.63-2.52(m,1H,partially obscured by DMSO).LC/MS[M-H]-471.4HPLC(254.4nm)2.886s,95％.
            
實施例116 5-((3-呋喃-3-基-丙烯酰氨基)-甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.32(s,1H),8.20(t,J=5Hz,1H),7.99(s,1H),7.71(s,1H),7.33(d,J=15Hz,1H),6.68(s,1H),6.42(d,J=15Hz,1H),4.81(d,J=15Hz,1H),4.65(d,J=15Hz,1H),3.74-3.67(m,1H),3.44-3.34(m,2H),2.91(d,J=17Hz,1H),2.53(dd,1H,被DMSO部分遮蓋) 。LC/MS[M-H]-419.4HPLC(254.4nm)2.822s,91％實施例117 5-((3-呋喃-2-基-丙烯酰氨基)-甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.32(s,1H),8.37(t,1H),7.77(s,1H),7.23(d,J=15Hz,1H),6.76(d,J=3Hz,1H),6.57(dd,J=3Hz,2Hz,1H),6.50(d,J=15Hz,1H),4.81(d,J=15Hz,1H),4.65(d,J=15Hz,1H),3.74-3.67(m,1H),3.48-3.32(m,2H),2.91(d,J=17Hz,1H),2.53(dd,1H,被DMSO部分遮蓋) 。[M-H]-419.3HPLC(254.4nm)2.815s,86％
            
實施例118 2-(草酰氨基)-5-(((3-氧代-1,2-二氫化茚-1-羰基)氨基)甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.33(s,1H),8.81(bs,1H),7.74-7.62(m,3H),7.47(t,J=7Hz,1H),4.83(d,J=15Hz,1H),4.67(d,J=15Hz,1H),4.29(t,J=5Hz,1H),3.41-3.25(m,3H),2.91(d,J=15Hz,1H),2.77(d,J=5Hz,2H),2.58-2.51(m,1H,partially ob-scured by DMSO).LC/MS[M-H]-457.5HPLC (254.4nm)2.634s, 97％.用類似于實施例106所述的方法制備以下化合物。
            
實施例119 5-(2,4-二氧代-四氫噻唑-3-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸1H NMR(400MHz,CD3OD and DMSO-d6)δ4.88(m,2H),3.97-3.89(m,3H),3.72-3.69(m,2H),3.08(m,1H),3.02(m,1H).MS(ESI(-))399.HPLC(254.4nm)2.67,s,100％.用類似于實施例81所述的方法制備以下化合物。
            
實施例120 2-(草酰氨基)-5-(2’-螺[1’,3’]二氧戊環)-6,7-二氫-4H-苯并[b]噻吩-3-羧酸M.p.232-234℃元素分析，計算值(C13H13NO7S,1×H2O)C,45.22％；H,4.38％；N,4.06％。實測值C,45.24％；H,4.39％；N,3.98％。用類似于實施例107所述的方法制備以下化合物。
            
實施例121 5-((3,5-二甲氧-苯甲酰氨基)-甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.31(s,1H),8.63(t,J=5Hz,1H),7.02(s,2H),6.62(s,1H),4.80(d,J=15Hz,1H),4.64(d,J=15Hz,1H),3.82-3.79(m,1H),3.77(s,6H),3.47-3.45(m,2H),2.94(d,J=17Hz,1H),2.53(dd,J=17Hz,11Hz,1H).LC/MS [M-H]-463.4HPLC(254.4 nm)3.161s,93％實施例122 5-(5,6-二氯-1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸于0℃氮氣氛中向2-羥甲基-四氫-吡喃-4-酮(625mg,4.81mmol)在吡啶(778μlm,9.62mmol)和氯仿(6.0ml)混合物中的溶液中緩慢加入4-硝基苯磺酰氯(1.60g,7.22mmol)。使混合物升至室溫,攪拌3h。加氯仿(30ml)，溶液用2.0N鹽酸(3×10ml)、5％NaHCO3(3×10ml)和水(3×10ml)洗滌。有機相干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發溶劑。固體殘留物用二氯甲烷∶己烷∶乙酸乙酯的梯度(1∶1∶0-8∶0∶2)作洗脫劑在硅膠上進行柱色譜純化。收集純化級分，揮發物經真空蒸發，得0.98g(65％)的4-硝基苯磺酸4-氧代-四氫-吡喃-2-基甲酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.37(d,2H,J=7.8Hz),2.57(m,1H),3.63(m,1H),3.89(m,1H),4.20-4.26(m,3H),8.14(dd,2H,J=0.6Hz,J=9Hz),8.42(dd,2H,J=0.6Hz,J=9Hz).MS m/z315.3(M+).
            
4-硝基苯磺酸4-氧代-四氫-吡喃-2-基甲酯(0.5g,1.59mmo1)乙二醇(986mg,15.9mmo1)和對甲苯磺酸(61mg,0.32mmo1)在苯(20m1)中回流20h。真空蒸發溶劑后得到固體。將該固體溶于二氯甲烷(30ml)中，然后依次用碳酸氫鈉飽和水溶液(2×5ml)和水(2×5ml)洗滌。有機相干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發溶劑，得582mg(100％)的4-硝基苯磺酸1,4,8-三氧代-螺[4.5]癸-7-基甲酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.53-1.73(m,4H),3.54(m,1H),3.8(m,2H),3.96(m,4H),4.15(m,2H),8.12(dd,2H,J=1.5Hz,J=9.0Hz),8.40(dd,4H,J=1.5Hz,J=9.0Hz).MS m/z359.3.
            
室溫下使3,4-二氯苯鄰二甲酰亞胺(90.2mg,0.42mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2.0ml)中。在氮氣氛環境中加入氫化鈉(17mg,0.42mmol)。再加入4-硝基-苯磺酸1,4,8-三氧代螺[4.5]癸-7-基甲酯(100mg,0.28mmol),混合物于140℃加熱3h。冷卻至室溫后在反應混合物中加入冰水(5ml)并用乙酸乙酯(3×15ml)提取混合物。混合的乙酸乙酯提取物用1.0N鹽酸(2×5ml)、水(2×5ml)飽和碳酸氫鈉(2×5ml)和水(2×5ml)洗滌。經干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發溶劑后，得97mg(94％)的5,6-二氯-2-(1,4,8-三氧代-螺[4.5]癸-7-基甲基)-異吲哚-1,3-二酮固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.60(m,2H),1.78(m,2H),3.54(m,1H),3.64(m,1H),3.88(m,2H),3.95(m,4H),7.95(d,2H,J=3Hz).MS m/z373.7(M+).
            
將5,6-二氯-2-(1,4,8-三氧-螺[4.5]癸-7-基甲基)-異吲哚-1,3-二酮(87mg,0.234mmol)溶于四氫呋喃(2.5ml)中。向該溶液中加入1.0N鹽酸(1.0ml)，混合物于75℃加熱20h。使這一不均勻的混合物真空蒸發而干燥，所得固體溶于二氯甲烷(10ml)并水洗(3×2ml)。有機層經干燥(MgSO4)、過濾及真空蒸發溶劑，得62.1mg(81％)的5,6-二氯-2-(4-氧代-四氫-吡喃-2-基甲基)-異吲哚-1,3-二酮固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.31-2.41(m,2H),2.48(t,1H,J=2.0Hz),2.62(m,1H),3.60(m,1H),3.72(m,1H),3.99(m,2H),4.29(m,1H),7.96(d,2H,J=2.7Hz).MS m/z331.1(M+).
            
5,6-二氯-2-(4-氧代-四氫-吡喃-2-基甲基)-異吲哚-1,3-二酮(60mg,0.18mmol)與氰基乙酸叔丁酯(33.5mg,0.24mmol)、元素硫(6.44mg,0.20mmol)和嗎啉(32.7μl,0.37mmol)在乙醇中于50℃一起攪拌20h。揮發物經真空蒸發，所得固體溶于二氯甲烷(30ml)并水洗(2×10ml)。有機相經干燥(MgSO4)、過濾并真空蒸發溶劑。殘留物(111mg)用己烷和乙酸乙酯的混合物(1∶1)作洗脫劑經制備TLC(Kieselgel 60F254,1mm)純化。真空蒸發溶劑后獲得純化的化合物28mg(32％)的2-氨基-5-(5,6-二氯-1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.54(s,9H),2.90(m,1H),3.35(m,2H),2.60(m,2H),2.90(m,1H),4.62(m,1H),7.95(d,2H,J=1.8Hz).MS m/z483.3(M+),427(M-57).
            
室溫下將2-氨基-5-(5,6-二氯-1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(27,5mg,0.057mmol)、咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(55.8mg,0.29mmol)和三乙基胺(16μl,0.114mmol)在四氫呋喃(2ml)中的混合物攪拌20h。揮發物真空蒸發，所得漿液溶于二氯甲烷(15ml)并水洗(3×3ml)。有機相經干燥(MgSO4)、過濾并真空蒸發溶劑。殘留物(35.7mg)用己烷和乙酸乙酯(8∶2)的混合物作洗脫劑經制備TLC(Kieselgel60F254,0.5mm)純化。分離得8.5mg(24％)的2-(叔丁氧草酰氨基)-5-(5,6-二氯-1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.58(s,18H),2.68(m,1H),2.97-3.02(m,1H),3.82(m,1H),4.63-4.68(m,1H),4.77-4.82(m,1H),7.97(d,2H,J=2.1Hz).MS m/z 611.4(M+).
            
將2-(叔丁氧草酰氨基)-5-(5,6-二氯-1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(3.5mg,5.7×10-3mmol)溶于20％三氟乙酸的二氯甲烷(1.0ml)溶液中并于室溫攪拌2h。揮發物經真空蒸發，得2.7mg(95％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ2.66(m,1H),3.10(m,1H),3.80(m,1H),3.98(m,2H),4.66(m,1H),4.74(m,1H).MS m/z 498.3(M-).以下化合物用類似于實施例122所述的方法制備。
            
實施例123 5-(1,3-二氧代-1,3,4,5,6,7-六氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸2-(1,4,8-三氧代-螺[4.5]癸-7-基甲基)-4,5,6,7-四氫-異吲哚-1,3-二酮的油73.1mg(62％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.42-1.58(m,2H),2.24(m,2H),2.62(m,2H),3.10(m,2H),3.50(m,2H),3.71(m,3H),3.94(m,6H),5.9(m,2H).
            
2-(4-氧代-四氫-吡喃-2-基甲基)-4,5,6,7-四氫-異吲哚-1,3-二酮的固體50mg(92％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.86(m,2H),1.64(m,2H),2.22(m,1H),2.34(m,2H),2.61(m,3H),3.13(m,2H),3.79(m,1H),3.95(m,1H),4.28(m,1H),5.92(m,2H).
            
2-氨基-5-(1,3-二氧代-1,3,4,5,6,7-六氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯的固體，經制備TLC(Kieselgel 60F254,1mm,己烷∶乙酸乙酯,1∶1)純化而得(36mg,47％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.53(s,9H),2.22(m,2H),2.62(m,2H),2.83(m,1H),3.11(m,2H),3.56(m,1H),3.83(m,2H),4.50(m,2H),5.89(m,2H).MS m/z 419.5(M+),363.4(M-57).
            
2-(叔丁氧草酰氨基)-5-(1,3-二氧代-1,3,4,5,6,7-六氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯,經制備TLC(Kieselgel 60F254,0.5mm,己烷∶乙酸乙酯，8∶2)純化而得。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.60(s,18H),2.24(m,2H),2.92(m,3H),3.14(m,2H),3.90(m,2H),4.11(m,1H),4.63(m,1H),4.78(m,1H),5.91(m,2H)MS m/z 545.4(M-),489.4(M-57).標題化合物以固體形式獲得(17.2mg，定量收率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ2.28(m,2H),2.55(m,2H),2.97(m,2H),3.31(m,2H),3.56-3.93(m,3H),4.70(m,2H),5.91(m,2H).MS m/z 433.3(M-).
            
實施例124 2-(草酰氨基)-5-(1,1,3-三氧代-1,3-二氫-1H-苯并[d]異噻唑-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.09-7.8(m,4H),4.85-4.67(m,3H),4.21-4.12(m,1H),4.02-3.94(m,1H),3.11-3.06(m,1H),2.90-2.80(m,1H).MS(ESI(-))465.HPLC(254.4nm)2.31,s,99％.
            
實施例125  
            
5-[(4-甲氧-苯磺酰氨基)-甲基]-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸向2-氨基-5-氨甲基-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(101mg,0.35mmol)的二氯甲烷(1ml)中溶液加入吡啶(32μl,0.39mmol)和4-甲氧基苯磺酰氯(82mg,0.39mmol)。反應混合物于室溫攪拌48h。反應混合物用二氯甲烷(2ml)稀釋，然后進行制備TLC(1∶1己烷/乙酸乙酯)，得10mg(10％)的2-氨基-5-((4-甲氧基-苯磺酰氨基)-甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(d,J=9Hz,2H),6.93(d,J=9Hz,2H),5.3(bs,2H),4.57(s,2H),3.84(s,3H),3.72(m,1H),3.10-3.06(m,1H),2.95-2.87(m,1H),2.69-2.64(m,1H),2.41-2.32(m,1H),1.47(s,9H).MSAPCl(-)453[M-H].
            
向2-氨基-5-((4-甲氧基-苯磺酰氨基)-甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(8mg,0.017mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液中加入三乙基胺(7.4μl,0.051mmol)和咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(10mg,0.051mmol)，室溫攪拌16h。揮發物經真空蒸發除去，向殘留物中加二氯甲烷(2ml)。該溶液經制備TLC(10％甲醇/90％二氯甲烷)純化，得10mg(100％)的2-(叔丁氧草酰氨基)-5-((4-甲氧基-苯磺酰氨基)-甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J=9Hz,2H),6.93(d,J=9Hz,2H),4.68(m,2H),3.85(s,3H),3.7(m,3H),3.29-3.22(m,1H),2.80-2.75(m,1H),2.53-2.43(m,1H),1.56(s,18H).MSAPCl(+)582.8[M+H],527(-1tert-Bu).
            
將2-(叔丁氧草酰氨基)-5-((4-甲氧基-苯磺酰氨基)-甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(10mg,0.017mmol)加至25％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(2ml)中。反應混合物于室溫攪拌2h，溶劑經真空除去。殘留物加乙醚后沉淀，用乙醚洗2次，干燥后得2mg(25％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz, CD3OD)δ7.78(d,J=9Hz,2H),7.02(d,J=9Hz,2H),4.76-4.63(m,2H),3.84(s,3H),3.75(m,1H),3.50-3.47(m,2H),2.89-2.83(m,1H),2.52-2.42(m,1H).MSAPCl(+)471[M+H]；實施例126 N-(6-羥基-3-羥甲基-4,5,6,7-四氫-苯并[b1噻吩-2-基)-草酸0℃下將2-(乙氧基草酰氨基)-6-(2’-螺[1’,3’]二氧戊環)-6,7-二氫-4H-苯并[b]噻吩-3-羧酸叔丁酯(20g,0.05mol)溶于含水(1ml)的三氟乙酸和二氯甲烷的(1∶4)混合物(200ml)中。反應混合物于0℃攪拌1h再于室溫攪拌20h。揮發物經真空蒸發，固體殘留物用乙醚(2×100ml)研制并真空干燥，得15.08g(100％)的2-(乙氧基草酰氨基)-6-氧代-4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸固體。
            
向乙醇(50ml)和二氯甲烷(50ml)的混合物中加入2-(乙氧基草酰氨基)-6-氧代-4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸(2.0g,6.43mmol)，然后加氫硼化鈉(sodium borhydride)(124mg，顆粒)。所得混合物室溫攪拌1h，再加氫硼化鈉顆粒。又攪拌了4h后，加水(100ml)和甲酸(100ml)的混合物于0℃下抑制反應。水相經乙酸乙酯(2×100ml)提取，混合有機相經鹽水洗(100ml)，干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發，得860mg(43％)的標題化合物固體。靜置18h后，將水相過濾，濾餅經水洗(2×15ml)、乙醚洗(2×25ml)，真空干燥，又得到710mg(48％)的標題化合物固體。
            
元素分析，計算值(C11H13N1O5S1,0.5×H2O)C,47.14％；H,5.03％；N,5.00％。實測值C,47.19％；H,5.00％；N,4.94％。
            
以下化合物用類似于實施例81所述的方法制備。
            
實施例127 2-(草酰氨基)-6-(2’-螺[1’,3’]二氧戊環)-6,7-二氫-4H-苯并[b]噻吩-3-羧酸M.p.＞250℃元素分析,計算值(C13H13NO7S)C,47.70％；H,4.00％；N,4.28％。實測值C,47.93％；H,4.09％；N,4.27％。
            
實施例128 6-羥基-2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸將2-(乙氧基草酰氨基)-6-(2’-螺[1',3’]二氧戊環)-6,7-二氫-4H-苯并[b]噻吩-3-羧酸乙酯(8.7g,22.7mmol)溶于25％三氟乙酸之二氯甲烷溶液(100ml)的冰浴冷卻的混合物中，加水(0.5ml)。反應混合物于0℃攪拌2h并室溫攪拌48h。揮發物經真空蒸發，殘留物溶液乙醇(100ml)并真空蒸發(2次)。固體殘留物用乙醚洗滌(80ml)并于50℃真空干燥，得6,68g(88％)的2-(乙氧基草酰氨基)-6-氧代-4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸乙酯固體。
            
向2-(乙氧基草酰氨基)-6-氧-4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸乙酯(2.0g.5.89mmol)于二氯甲烷(40ml)和乙醇(40ml)的混合物中的溶液中加入氫硼化鈉(64mg,1.77mmol)。反應混合物室溫攪拌64h，又加入氫硼化鈉(22.3mg,0.59mmol)再繼續攪拌18h。在隨后的6h攪拌中再加兩次氫硼化鈉(23mg和15mg)。向反應混合物中加入冰冷卻的飽和氯化銨(50ml)，所得混合物用乙酸乙酯提取(3×50)。混合的有機提取物經干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發。殘留物兩次溶于乙酸乙酯(100m1)中并真空蒸發。固體殘留物用乙醚(80ml)洗滌并于50℃真空干燥，得1.46g(75％)的2-(乙氧基草酰氨基)-6-羥基-4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸乙酯固體。用1.35g該物質進行(硅膠)柱色譜，以乙酸乙酯和庚烷(1∶1)的混合物為洗脫劑。收集純化級分，真空蒸發溶劑，得0.9g純的2-(乙氧基草酰氨基)-6-羥基-4,5,6,7-四氫-苯并[b]噻吩-3-羧酸乙酯固體。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ1.42(m,6H),1.86(m,2H),2.02(m,1H),2.71(dd,1H),2.85(m,1H),3.00(m,2H),4.19(bs,1H),4.40(dq,4H),12.45(bs,1H,NHCO)向上述二乙酯(0.3g,0.88mmol)的水(10ml)溶液中加入1N氫氧化鈉(3.1ml,3.08mmol)。所得反應混合物于室溫攪拌16h。水相加濃鹽酸使之酸化為pH=1,反應混合物經真空蒸發為原體積的1/2。沉淀經過濾，用小體積的乙醚洗滌，并于50℃真空干燥16h，得130mg(52％)的標題化合物固體。
            
M.p.無定形1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ1.63(m,1H),1.86(m,1H),2.5(m,1H,被DMSO部分遮蓋),2.71(m,1H),2.86(m,2H),3.91(m,1H),4.87(bs,1H),12.35(bs,1H,NHCO).以下化合物用類似于實施例107所述的方法制備。實施例129 5-(2-甲基-4-氧代-4H-喹唑啉-3-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩[2,3-c]吡喃-3-羧酸1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.32(s,1H),8.10(d,J=8Hz,1H),7.80(t,J=7Hz,1H),7.59(d,J=8Hz,1H),7.49(t,J=7Hz,1H),4.78(d,J=15Hz,1H),4.53(d,J=15Hz,1H),4.39(d,J=15Hz,1H),4.21(dd,J=15Hz,9Hz,1H),4.00-3.94(m,1H),3.05(d,J=17Hz,1H),2.74-2.65(m,1H,被相鄰的單峰部分遮蔽),2.68(s,3H).13C NMR(100.6MHz,DMSO-d6)δ167.7,162.8,161.6,157.6,156.1,148.3,146.9,136.0,130.5,127.9,127.8,126.5,121.4,115.0,74.4,65.9,49.8,31.4,25.0.[M-H]-442.1HPLC(254.4nm)2.631s,81％.
            
實施例130 7-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩[2,3-c]吡喃-3-羧酸將苯二甲酰亞氨基乙醛二乙基縮醛(100g,0.38mol)和1N鹽酸(600ml)的混合物在回流溫度下攪拌5分鐘,或直至獲得勻相溶液。將反應混合物冷卻,沉淀過濾并于50℃真空干燥16h,得63.3g(88％)的苯二甲酰亞氨基乙醛固體。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.58(s,2H),7.76-7.78(m,2H),7.90-7.92(m,2H),9.67(s,1H).
            
使苯二甲酰亞氨基乙醛(64g,0.34mol)和反-1-甲氧基-3-(三甲基硅甲烷氧基)-1,3-丁二烯(81.5g,0.38mol)在苯(600ml)中的混合物在氮氣氛中攪拌15分鐘,于0℃向其中滴加45％氯化鋅乙醚復合物在二氯甲烷(55.5ml,0.17mol)中的溶液。使反應混合物室溫至升溫過夜。向反應混合物中加水(500ml),所得混合物用乙酸乙酯(200ml)提取。有機提取物連續用1.0N鹽酸(2×200ml)和鹽水(200ml)洗滌。有機相經干燥(Na2SO4)、過濾并真空蒸發溶劑，得到一種緩慢結晶的油(98g)。向該固體中加入乙酸乙酯和乙醚的混合物(400ml,1∶1)，所得沉淀經過濾，用小體積的乙醚洗滌并于50℃真空干燥1h，得59.8g(69％)的2-(4-氧代-3,4-二氫-2H-吡喃-2-基甲基)-異吲哚-1,3-二酮固體。濾液經真空蒸發，殘留物經硅膠柱(1L)色譜純化，以乙酸乙酯和庚烷(1∶2)的混合物為洗脫劑。收集純化級分，溶劑經真空蒸發至幾乎干燥，固體經過濾并于50℃真空干燥16h，再得15g(17％)的2-(4-氧代-3,4-二氫-2H-吡喃-2-基甲基)-異吲哚-1,3-二酮固體。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ2.61(d,2H),3.85(dd,1H),4.18(dd,1H),4.76(m,1H),5.43(d,1H),7.28(d,1H),7.69-7.77(m,2H),7.84-7.88(m,2H).
            
將2-(4-氧代-3,4-二氫-2H-吡喃-2-基甲基)-異吲哚-1,3-二酮(13g,0.051mol)溶于乙酸乙酯(250ml)并置于一Parr小瓶中。小心加入10％Pd/C(1.5g)，混合物在30psi的氫氣壓力下振蕩6.5h(Parr裝置)。過濾，然后經真空使乙酸乙酯蒸發，得粗制的11.5g2-(4-氧代-四氫-吡喃-2-基甲基)-異吲哚-1,3-二酮，其純度足以進行下一步驟。通過用己烷/乙酸乙酯的梯度(從100/0至50/50)經硅膠柱色譜純化化合物的一份小樣品(250mg)可得到分析純的化合物。收集純化級分，溶劑經真空蒸發，得142mg(55％)的2-(4-氧代-四氫-吡喃-2-基甲基)-異吲哚-1,3-二酮固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.30-2.68(m,4H),3.62(m,1H),3.74(m,1H),4.00(m,2H),7.75(m,2H),7.88(m,2H).
            
向2-(4-氧代-四氫-吡喃-2-基甲基)-異吲哚-1,3-二酮(18.7g,0.072mol)、氰基乙酸叔丁基酯(11.2g,0.079mol)和元素硫(2.5g,0.079mol)在乙醇中的混合物中加入嗎啉(20ml)，所得混合物于50℃攪拌3h。冷卻后的反應混合物經過濾，揮發物經真空蒸發。向殘留物中加入水(200ml)和乙醚100ml。沉淀物經過濾，于50℃真空干燥，得9.1g(30％)的2-氨基-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。濾液經乙酸乙酯(2×150ml)提取并經鹽水(100ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，溶劑經真空蒸發。殘留物(20g)在硅膠(1L)上以己烷和乙酸乙酯(1∶2)的混合物作為洗脫劑進行柱色譜純化。收集純化級分，溶劑經真空蒸發。殘留物用乙醚洗滌，固體經過濾并于50℃真空干燥，再得2.2g(7％)的2-氨基-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。濾液經真空蒸發,得幾乎純的10.2g(34％)2-氨基-7-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯油。
            
2-氨基-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯1H NMR(300MHz,CDCl3)δ1.50(s,9H),2.54-2.63(m,1H),2.84-2.90(m,1H),3.79(q,1H),3.96-4.04(m,2H),4.48-4.62(m,2H),5.91(bs,2H,NH2),7.70(m,2H),7.84(m,2H).
            
2-氨基-7-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯1H NMR(300MHz, CDCl3)δ1.50(s,9H),2.71-2.90(m,2H),3.67-3.77(m,2H),4.02-4.15(m,2H),4.90(m,1H),6.04(bs,2H,NH2),7.70(m,2H),7.84(m,2H).
            
將2-氨基-7-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(10.2g,0.25mo1)、咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(7.2g,0.037mol)在無水四氫呋喃(150ml)中的混合物于室溫攪拌4h。再加一些咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(2.0g,0.01mol)，所得混合物于室溫攪拌16h。沉淀經過濾并用少量乙醚洗滌，真空干燥，得3.5g(26％)的2-(叔丁氧草酰氨基)-7-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。
            
濾液經真空蒸發，向殘留物中加水(100ml)和乙酸乙酯(100ml)。沉淀經過濾并于50℃真空干燥，再得0.8g(6％)的2-(叔丁氧草酰氨基)-7-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ1.60(s,9H),1.62(s,9H),2.79-2.97(m,2H),3.73(m,1H),3.83-3.88(dd,1H),4.07-4.16(m,2H),5.09(m,1H),7.71(m,2H),7.85(m,2H),12.55(bs,1H,NHCO).
            
將上述2-(叔丁氧草酰氨基)-7-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(0.8g,1.47mmo1)加至25％三氟乙酸的二氯甲烷(30ml)溶液中。反應混合物于室溫攪拌6h，期間，溶劑經真空蒸發。殘留物通過加乙醚沉淀，過濾并于50℃真空干燥，得0.5g(79％)的標題化合物固體。
            
M.p.＞250℃元素分析，計算值(C19H14N2O8S,0.5×H2O)C,51.94％；H,3.44％；N,6.38％。實測值C,52.02％；H,3.37％；N,6.48％。
            
實施例131  
            
7-(乙酰氨-甲基)-2-(草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩[2,3-c]吡喃-3-羧酸向2-氨基-7-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(6.0g,0.014mol)在乙醇(100ml)中的混合物中加水合肼(1.4ml,0.028mol)。將反應混合物回流加熱1h，冷卻，過濾沉淀物。濾液經真空蒸發，殘留物中加水(100ml)，所得混合物用乙醚提取(2×100ml)。混合的有機提取物經鹽水洗滌(100ml)、干燥(Na2SO4)，過濾，溶劑經真空蒸發，得2.9g(71％)的2-氨基-7-氨甲基-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯油。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ1.55(s,9H),2.70-2.97(m,4H),3.69-3.78(m,1H),4.13(m,1H),4.50(m,1H),6.09(bs,2H,噻吩-NH2).
            
將上述2-氨基-7-氨甲基-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(1.5g,5.27mmol)和三乙基胺(1.5ml)在二氯甲烷(50ml)中的溶液用冰水冷卻,向其中滴加乙酰氯(0.46g,5.80mmol)。使反應混合物達到室溫，再攪拌0.5h。反應混合物經水洗(2×25ml)，干燥(Na2SO4)，過濾，溶劑經真空蒸發。殘留物在硅膠柱(1L)上先用乙酸乙酯再用乙酸乙酯和乙醇(20∶1)的混合物作為洗脫劑進行色譜純化。收集純化級分，溶劑經真空蒸發，得0.3g(17％)的7-(草酰氨基-甲基)-2-氨基-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ1.56(s,9H),1.99(s,3H),2.77(m,2H),3.19(m,1H),3.67-3.79(m,2H),4.09-4.16(m,1H),4.63(m,1H),5.91(bs,1H),6.10(bs,2H).
            
向上述7-(草酰氨基-甲基)-2-氨基-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(0.3g,0.92mmol)在無水四氫呋喃(40ml)中的混合物中滴加咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(0.22g,1.10mmol)在無水四氫呋喃(5ml)中的混合物。將該混合物于室溫攪拌3h。揮發物經真空蒸發，殘留物溶于乙酸乙酯(100ml)并用水(50ml)和鹽水(50ml)洗滌。有機相經干燥(Na2SO4)，過濾，真空蒸發。殘留物(0.4g)與二異丙基醚(5ml)和乙醚(5ml)的混合物一起攪拌。沉淀物經過濾，濾液真空蒸發，得0.25g(60％)的7-(草酰氨基-甲基)-2-(叔丁氧草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯油1H NMR(300MHz,CDCl3)δ1.64(s,9H),1.65(s,9H),2.02(s,3H),2.87(m,2H),3.29(m,1H),3.74(m,1H),3.89(ddd,1H),4.18(m,1H),4.78(m,1H),5.93(bs,1H,NHCOMe),12.5(s,1H,NHCOCOOH).
            
將上述7-(乙酰氨基-甲基)-2-(叔丁氧草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(0.2g,0.44mmol)加至25％三氟乙酸的二氯甲烷(20ml)溶液中。反應混合物于室溫攪拌4h，期間，溶劑經真空蒸發除去。殘留物通過加乙醚而沉淀，過濾并于50℃真空干燥，得0.11g(73％)的標題化合物固體。M.p.220-222℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ1.87(s,3H),2.82(bs,2H),3.19(m,1H),3.51(m,1H),3.67(m,1H),4.07(m,1H),4.69(m,1H),8.14(t,1H,NHCOMe),12.3(s,1H,NHCOCOOH).
            
實施例132  
            
向溶于二氯甲烷(30ml)的2-氨基-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯(4.5g,0.011mol)中加入碳酸氫鈉(1.0g,0.011mmol)水溶液(16ml)。使反應混合物冷卻至0℃,加入氯甲酸9-笏甲基酯(3.0g,0.012mol)。將反應混合物攪拌5分鐘后，使之升溫到室溫并強烈攪拌16h。分離有機層并用鹽水(10ml)洗滌。水相用二氯甲烷提取(2×20ml)，混合有機相經干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發，得桔黃色固體，用二氯甲烷作洗脫劑經快速色譜純化該固體。收集純化級分并真空蒸發得5.6g(81％)的5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(9H-笏-9-基甲氧基羰基氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸叔丁酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.60(bs,1H),7.87-7.84(m,2H),7.75(d,J=8Hz,2H),7.73-7.70(m,2H),7.60(d,J=8Hz,2H),7.39(t,J=8Hz,2H),7.30(t,J=8Hz,2H),4.74(d,J=14Hz,1H),4.62(d,J=14Hz,1H),4.48(d,J=7Hz,2H),4.27(t,J=7Hz,1H),4.05-4.00(m,2H),3.86-3.80(m,1H),2.92(d,J=17Hz,1H),2.64(dd,J=17,9Hz,1H),1.52(s,9H).LC/MS[M+H]+637.49于0℃將上述F-moc保護的噻吩并[2,3-c]吡喃(5.5g,8.6mmol)加至20％三氟乙酸的二氯甲烷(30ml)溶液中。反應混合物于室溫攪拌4h。揮發物經真空蒸發，殘留物用乙醚沉淀，過濾并干燥，得4.2g(85％)的5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(9H-笏-9-基甲氧基羰基氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.22(brs,1H),7.88(d,J=5Hz,2H),7.88-7.82(m,4H),7.66(d,J=5Hz,2H),7.40(t,J=5Hz,2H),7.32(t,J=5Hz,2H),4.68-4.48(m,4H),4.34(t,J=5Hz,1H),3.90-3.81(m,2H),3.72-3.67(m,1H),2.87(m,1H),2.51(m,1H).
            
向Wang-樹脂(3.75g,4.5mmol)中加入二氯甲烷(50ml),將該混合物于0℃氮氣氛下冷卻。加二異丙基乙胺(25ml),再加甲磺酰氯(2.25ml,29mmol)。反應于0℃攪拌0.5h,然后室溫再攪拌0.5h。將樹脂過濾并依次用二氯甲烷(2×30ml)、N-甲基吡咯烷酮(20ml)和二氯甲烷(2×30ml)洗滌。將Wang-樹脂甲磺酰酯真空干燥2h，直接應用于隨后步驟。
            
向上述Wang-樹脂甲磺酰酯和5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(9H-笏-9-基甲氧基羰基氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸(4.85g,8.4mmol)中加N-甲基吡咯烷酮(45ml)。加碳酸銫(2.2g,6.7mmol),反應混合物于氮氣氛中攪拌16h，然后于80℃攪拌36h。將混合物冷卻至室溫，樹脂經過濾，用水、甲醇和二氯甲烷重復洗滌，真空干燥2h，得5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-2-(9H-笏-9-基甲氧基羰基氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸Wang-樹脂酯。
            
在20％哌啶的四氫呋喃(4.85g)溶液中將上述Wang-樹脂酯攪拌45分鐘。然后使樹脂過濾，用四氫呋喃(2×20ml)、甲醇(2×20ml)和二氟甲烷(3×20ml)洗滌，真空干燥3h，得2-氨基-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸Wang-樹脂酯。
            
將上述Wang-樹脂酯懸浮于二氯甲烷(50ml)和三乙基胺(3.0ml)的混合溶液中。在氮氣氛下加咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(4.2g,0.021mmol),反應于室溫攪拌16h。使樹脂過濾,依次用甲醇(30ml),二氯甲烷(30ml)洗滌,并將該步驟重復2次。所述樹脂經真空干燥數小時,得2-(叔丁氧草酰氨基)-5-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基甲基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸Wang-樹脂酯。
            
上述Wang-樹脂酯的少量樣品均用20％三氟乙酸的二氯甲烷(3ml)溶液處理1h。樹脂經過濾,濾液經真空濃縮。殘留物從二氯甲烷中蒸發2次，得30mg固體，其1H NMR和MS與實施例106中合成的化合物一致。因此確定Wang-樹脂的上樣量為0.6mmol/g。
            
將上述Wang樹脂酯(3.0g,1.8mmol)懸浮于二氯甲烷(25ml)中。加入肼(0.14ml,4.5mmol),反應混合物于氮氣氛中室溫攪拌24小時。所述樹脂經過濾并交替使用甲醇和二氯甲烷進行多次洗滌。收集濾液并濃縮產生260mg固體。通過對副產物的分析確定反應為不完全,此時將樹脂再次懸浮于二氯甲烷(15ml)并用肼(50μl)再處理16h。樹脂經過濾并如前述洗滌，又自濾液中得到30mg副產物。此時判定反應完全，樹脂經真空干燥3h，得2.67g5-氨甲基-2-(叔丁氧草酰氨基)-4,7-二氫-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-3-羧酸Wang-樹脂酯。該樹脂在胺的茚三酮試驗中顯示陽性。
            
將上述Wang樹脂酯(2.67g)懸浮于四氫呋喃和二氯甲烷的混合溶液(1∶1,90ml)中，然后分配在OntoBlock上(80個孔，每孔0.02mmol)。將Onto Block弄干。同時，將80份羧酸經稱重分裝于小瓶中(每小瓶0.044mmol)。在N,N-二甲基甲酰胺(100ml)中制備1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物(0.85g,4.4mmol)、1-羥基-苯并三唑水合物(0.6g,4.4mmol)、以及三乙基胺(1.1ml,8.0mmol)的溶液。將該溶液加入每一小瓶中(每小瓶1ml)，然后將每一小瓶中的內容物轉移至OntoBlock的一個孔中(有時可經超聲處理使小瓶中的物質充分溶解)。然后將Onto Block搖動2天。之后將其弄干，用甲醇和二氯甲烷洗滌。再將OntoBlock置于真空干燥器中2h，然后每孔加1ml咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(0.2M，溶于二氯甲烷)溶液。將Onto Block搖動16h。用上述方法洗Onto Block。然后每孔加1ml20％三氟乙酸的二氯甲烷溶液并靜置45分鐘。將Onto Block弄干，將濾液收集在一微量滴定板上。各孔加0.5ml20％三氟乙酸的二氯甲烷溶液進行處理，再次收集濾液。揮發物經真空蒸發，在該微量滴定板中產生80個化合物固體。該板經質譜分析，其中66孔顯示有分子離子形式的預期產物。
            
X1是連接點。
            
百分數指220nm處的HPLC峰面積。
            
實施例133 3-(草酰氨基)-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-羧酸單鈉鹽向攪拌的3-氨基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(1.0g,4.8mmol)、三乙基胺(1.0ml,7.20mmo1)的無水四氫呋喃(50ml)溶液于0℃滴加乙基草酰氯(0.8g,5.76mmol)的無水四氫呋喃(5ml)溶液。所得反應混合物于室溫攪拌3h，倒入冰水(200ml)中。將沉淀物過濾并于50℃真空干燥，得0.9g(61％)的3-(乙氧基草酰氨基)-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯固體。
            
向上述噻吩并[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(0.5g,1.62mmol)的乙醇(20ml)溶液中加入氫氧化鈉(0.2g,4.87mmol)水(10ml)溶液。所得反應混合物于室溫攪拌18h,加1N鹽酸使溶液酸化為pH約4左右,沉淀物過濾并用水(2×50ml)、乙醚(2×30ml)洗滌，于50℃真空干燥，得130mg(30％)的標題化合物固體。
            
M.p.＞250℃元素分析，計算值(C10H5N2O5S1Na1,1×H2O)C,39.22％；H,2.30％；N,9.15％。實測值C,39.32％；H,2.35％；N,8.89％。
            
實施例134 7-(草酰氨基)-噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-羧酸向6-氨基-噻吩并[2,3-b]吡嗪-7-羧酸甲酯(62.7mg,0.3mmol)的四氫呋喃(0.5ml)溶液中加入咪唑-1-基-氧代-乙酸叔丁酯(117.6mg,0.6mmol)和三乙基胺(42μl,0.3mmol)。所得混合物于室溫攪拌20h。
            
揮發物經真空除去,殘留物溶于乙酸乙酯(5.0ml),用1％鹽酸(2×2ml)、水(2×2ml)洗滌,干燥(MgSO4)，過濾并真空蒸發溶劑，得96mg(95％)的6-(叔丁氧草酰氨基)-噻吩并[2,3-b]吡嗪-7-羧酸甲酯固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.60(s,9H),3.80(s,3H),8.60(d,1H,J=1.5Hz),8.70(d,1H,J=1.5Hz).
            
向上述6-(叔丁氧草酰氨基)-噻吩并[2,3-b]吡嗪-7-羧酸甲酯(37.8mg,0.112mmol)的二噁烷(1.2ml)溶液中加入氫氧化鋰(45mg)和水(0.6ml)，該混合物于室溫攪拌20h。揮發物經真空蒸發，殘留物溶于乙酸乙酯(30ml)，用1.0％鹽酸(3×3ml)、水(3×3ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾并真空蒸發溶劑，得20mg(67％)的標題化合物固體。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.64(d,1H,J=1.5Hz),8.66(1H,d,J=1.5Hz).MS m/z 150.0(M-117)，丟失了COOH和COCOOH。
            
實施例135 5-(草酰氨基)-2,3-二氫-噻吩并[2,3-b]呋喃-4-羧酸向二氫-呋喃-3-酮(11.5g,0.134mol,按Org.Syn.Coll.Vol.5,866所述而制備)的乙醇(200ml)溶液中加入氰基乙酸乙酯(16.6g,0.147mol)、硫(4.7g,0.147mol)和嗎啉(15ml)。使這一溫和的放熱反應在45℃攪拌1h。使反應混合物冷卻，過濾并真空蒸發濾液。所得油溶于乙酸乙酯(400ml)，用水(2×100ml)、鹽水(100ml)洗滌，干燥(Na2SO4)。溶劑經真空蒸發，殘留物(28g)用乙酸乙酯/己烷(1∶1)作洗脫劑進行快速柱色譜(1L硅膠)。收集半純化級分，真空蒸發后得粗制的8.4g5-氨基-2,3-二氫-噻吩并[2,3-b]呋喃-4-羧酸乙酯油。
            
將上述5-氨基-2,3-二氫-噻吩并[2,3-b]呋喃-4-羧酸乙酯(8.4g,0.039mol)溶于無水四氫呋喃(150ml)，向其中加入三乙基胺(10ml)并于0℃氮氣氛中滴加乙基草酰氯(4.9g,0.043mol)和無水四氫呋喃(25ml)混合物。使反應混合物室溫攪拌18h。揮發物經真空蒸發，殘留物溶于乙酸乙酯(400ml)。有機相用水(200ml)、鹽水(100ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，并使有機相真空蒸發。殘留物以乙酸乙酯和己烷(1∶1)的混合物為洗脫劑經硅膠過濾。溶劑經真空蒸發，殘留物以乙酸乙酯/己烷(1∶2)為洗脫劑進行快速柱色譜(1L硅膠)。收集純化級分，真空蒸發并用乙醚對殘留物清洗后得0.5g(1.2％)的5-(乙氧基草酰氨基)-2,3-二氫-噻吩并[2,3-b]呋喃-4-羧酸乙酯油。
            
向上述5-(乙氧基草酰氨基)-2,3-二氫-噻吩并[2,3-b]呋喃-4-羧酸乙酯(0.4g,1.2mmol)在乙醇(10ml)和水(25ml)的混合物中的溶液中加入1N氫氧化鈉(3.8ml,3.8mmol)。該混合物于室溫攪拌20h。反應混合物用水(50ml)稀釋并用乙酸乙酯(50ml)洗滌。水相用1N鹽酸使之酸化至pH=2。沉淀物經過濾及水洗，50℃真空干燥，根據NMR的結果獲得0.2g5-(草酰氨基)-2,3-二氫-噻吩并[2,3-b]呋喃-4-羧酸乙酯。將上述單酯溶于水(40ml)和乙醇(10ml)的混合物中,并向該混合物中加入1N氫氧化鈉(3ml,3mmol)。混合物于室溫攪拌20h。混合物用1N鹽酸酸化至pH=2,沉淀物過濾，水洗并于50℃真空干燥，得150mg(46％)的標題化合物固體。
            
M.p.＞250℃.
            
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ3.12(t,2H),4.89(t,2H),12.0(bs,1H,NHCO).
            
權利要求
            
1．一種符合以下三個標準的化合物(1)具有式1所表示的結構 其中R、R2和R4是任何化學基團或化學基團的組合；(2)作為磷酸酪氨酸識別單位的配體，優選為一或多種PTP酶或含有SH2結構域的蛋白質的抑制物或調節物；及(3)分子量小于或等于2500道爾頓
            
2．權利要求1的化合物，其具有式Ⅱ所示結構 其中R、R1和R4是任何化學基團或化學基團的組合，R1優選為氫原子。
            
3．一種符合以下三個標準的化合物(1)具有式Ⅲ所示的結構 其中R1、R2、R3、R4和R5均為任何化學基團或化學基團的組合，R3和R5可相互共價連接；(2)作為磷酸酪氨酸識別單位的配體，優選是一或多種PTP酶或含有SH2結構域的蛋白質的抑制物或調節物；及(3)分子量小于或等于2500道爾頓。
            
4．權利要求3的化合物，其具有式Ⅳ所示的結構 其中R1、R3、R4和R5均為任何化學基團或化學基團的組合，R3和R5可相互共價連接，R優選為氫原子。
            
5．權利要求4的化合物，其具有式Ⅴ所示的結構 其中R1、R3、R4和R5均為任何化學基團或化學基團的組合，R3和R5可相互共價連接，R優選為氫原子。
            
6．權利要求5的化合物，其具有式Ⅵ所示的結構 其中R3、R4和R5均為任何化學基團或化學基團的組合，R3和R5可相互共價連接，R優選為氫原子。
            
7．權利要求3的化合物，其具有式Ⅶ所示的結構 其中A與雙鍵一起表示上文所定義的任何芳香基團，R1、R2、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合。
            
8．權利要求7的化合物，其具有式Ⅷ所示的結構 其中A與雙鍵一起表示上文所定義的任何芳香基團，R、R1、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合，R優選為氫原子。
            
9．權利要求7的化合物，其具有式Ⅸ所示的結構 其中A與雙鍵一起表示上文所定義的任何芳香基團，R1、R2、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合。
            
10．權利要求9的化合物，其具有式Ⅹ所示的結構 其中A與雙鍵一起表示上文所定義的任何芳香基團，R2、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合。
            
11．權利要求10的化合物，其具有式Ⅺ所示的結構 其中A與雙鍵一起表示上文所定義的任何芳香基團，R、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合，R優選為氫原子。
            
12．權利要求3的化合物，其具有式Ⅻ所示的結構 其中R1是能作為質子供體和/或質子受體的化學基團，優選-COOH、5-四唑基、-NH2、-CONH2,R、R2、R3和R4均為任何化學基團或化學基團的組合。
            
13．上述權利要求中任一項的化合物，其主要作為一或多種PTP酶的經典的競爭性抑制物。
            
14．權利要求1-12中任一項的化合物，其主要作為一或多種PTP酶的混合型抑制物。
            
15．權利要求1-14中任一項的化合物，其主要作為與酪氨酸激酶信號傳導途徑的調節有關的一或多種PTP酶的抑制物。
            
16．權利要求1-14中任一項的化合物，其主要通過與一或多種調節性PTP酶相互作用而抑制或調節受體-酪氨酸激酶信號傳導途徑，優選胰島素受體、IGF-1受體和/或胰島素受體家族的其它成員、EGF受體家族、血小板衍生的生長因子受體家族、神經生長因子受體家族、肝細胞生長因子受體家族、生長激素受體家族和/或酪氨酸激酶其它類型受體家族的成員的信號傳導途徑。
            
17．權利要求1-14中任一項的化合物，其主要通過對一或多種調節性PTP酶的調節，優選對Src激酶家族成員或其它細胞內激酶的調節，而抑制或調節非受體酪氨酸激酶的信號傳導。
            
18．權利要求1-14中任一項的化合物，其主要對負調節信號傳導途徑的一或多種PTP酶的活性進行抑制或調節。
            
19．權利要求1-14中任一項的化合物，其對正調節信號傳導途徑的一或多種PTP酶的活性進行抑制或調節，優選CD45。
            
20．權利要求1-14中任一項的化合物，其對正調節免疫細胞中信號傳導途徑的一或多種PTP酶的活性進行抑制或調節。
            
21．權利要求1-14中任一項的化合物，其對負調節信號傳導途徑的一或多種PTP酶的活性進行抑制或調節。
            
22．權利要求1-14中任一項的化合物，其通過與一或多種PTP酶的活性位點結合抑制這些PTP酶，或其是別構調節物，與對這些PTP酶的底物結合具有負面影響的其它位點的結合而抑制這些PTP酶。
            
23．權利要求1-14中任一項的化合物，其通過與一或多種PTP酶的活性位點以外的結構，優選SH2結構域的相互作用而調節這些酶的活性。
            
24．權利要求1-14中任一項的化合物，其通過與非PTP酶信號傳導分子的SH2結構域或PTB結構域結合而調節信號傳導途徑。
            
25．上述權利要求中任一項的化合物，其特征在于是PTP酶的選擇性抑制物或作為磷酸酪氨酸識別單位的選擇性配體的化合物。
            
26．權利要求1-24的化合物，其特征在于是PTP酶的非選擇性抑制物。
            
27．權利要求26的化合物，其特征在于是至少4種PTP酶或4個PTP酶家族的抑制物或調節物。
            
28．權利要求25的化合物，其特征在于對在說明書中未描述的PTP酶具有選擇性。
            
29．權利要求25的化合物，其特征在于對表1所列的PTP酶具有選擇性。
            
30．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPα家族具有選擇性。
            
31．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPα具有選擇性。
            
32．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPε具有選擇性。
            
33．權利要求25的化合物，其特征在于對CD45具有選擇性。
            
34．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPβ家族具有選擇性。
            
35．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPβ具有選擇性。
            
36．權利要求25的化合物，其特征在于對PTP-DEP1具有選擇性。
            
37．權利要求25的化合物，其特征在于對PTP-LAR家族具有選擇性。
            
38．權利要求25的化合物，其特征在于對PTP-LAR具有選擇性。
            
39．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPσ具有選擇性。
            
40．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPδ具有選擇性。
            
41．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPμ家族具有選擇性。
            
42．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPμ具有選擇性。
            
43．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPκ具有選擇性。
            
44．權利要求25的化合物，其特征在于對PTP1B家族具有選擇性。
            
45．權利要求25的化合物，其特征在于對PTP1B具有選擇性。
            
46．權利要求25的化合物，其特征在于對TC-PTP具有選擇性。
            
47．權利要求25的化合物，其特征在于對SHP-PTP家族具有選擇性。
            
48．權利要求25的化合物，其特征在于對SHP-1具有選擇性。
            
49．權利要求25的化合物，其特征在于對SHP-2具有選擇性。
            
50．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPζ家族具有選擇性。
            
51．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPζ具有選擇性。
            
52．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPγ具有選擇性。
            
53．權利要求25的化合物，其特征在于對PTP-PEST家族具有選擇性。
            
54．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPH1家族具有選擇性。
            
55．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPH1具有選擇性。
            
56．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPD1具有選擇性。
            
57．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPD2具有選擇性。
            
58．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPMEG1具有選擇性。
            
59．權利要求25的化合物，其特征在于對IA-2家族具有選擇性。
            
60．權利要求25的化合物，其特征在于對IA-2具有選擇性。
            
61．權利要求25的化合物，其特征在于對IA-2β具有選擇性。
            
62．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPψ家族具有選擇性。
            
63．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPψ具有選擇性。
            
64．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPρ具有選擇性。
            
65．權利要求25的化合物，其特征在于對PTPφ具有選擇性。
            
66．上述權利要求中任一項的化合物，分子量小于1000道爾頓，優選大于100道爾頓。
            
67．上述權利要求中任一項的化合物，其針對一或多種PTP酶的Ki值小于200μM。
            
68．上述權利要求中任一項的化合物，其針對一或多種PTP酶的Ki值小于2μM。
            
69．上述權利要求中任一項的化合物，其針對一或多種PTP酶的Ki值小于100nM。
            
70．上述權利要求中任一項的化合物，其針對一或多種帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的IC50值小于200M。
            
71．上述權利要求中任一項的化合物，其針對一或多種帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的IC50值小于2M。
            
72．上述權利要求中任一項的化合物，其針對一或多種帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的IC50值小于100nM。
            
73．權利要求1-66中任一項的化合物，其針對一或兩種PTP酶或PTP酶家族的Ki值小于2μM，其針對至少兩種其它PTP酶或PTP酶家族的Ki值大于50μM。
            
74．權利要求1-66中任一項的化合物，其針對一或兩種PTP酶或PTP酶家族的Ki值小于100nM，其針對至少兩種其它PTP酶或PTP酶家族的Ki值大于10μM。
            
75．上述權利要求中任一項的化合物的用途，其用于制備調節一或多種PTP酶或帶有磷酸酪氨酸識別單位的其它分子的活性的藥物。
            
76．權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備一種藥物，該藥物用于控制、治療或預防Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、萄萄糖耐量異常、胰島素抗性、肥胖、免疫功能紊亂如自身免疫病和艾滋病、伴有凝血系統功能紊亂的疾病、過敏性疾病、骨質疏松癥、增生性病癥包括癌癥和牛皮癬、伴有生長激素的合成或效應降低或增加的疾病、伴有調節生長激素釋放和/或對生長激素的應答的激素或細胞因子合成的減少或增加的疾病、腦部疾病包括早老性癡呆和精神分裂癥、以及傳染病。
            
77．權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備一種藥物，該藥物用于控制、治療或預防Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、葡萄糖耐量異常、胰島素抗性、和/或肥胖。
            
78．權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備一種藥物，該藥物用于控制、治療或預防伴有免疫功能紊亂的疾病，包括諸如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡之類的自身免疫病。
            
79．權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備可作為免疫抑制劑使用的藥物。
            
80．權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備控制或治療伴有免疫功能紊亂包括艾滋病的疾病的藥物。
            
81．權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備控制、治療或預防過敏性疾病，包括哮喘和過敏性皮膚病的藥物。
            
82．對權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備控制、治療或預防增生性病癥，包括癌癥的藥物。
            
83．對權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備控制、治療或預防骨質疏松癥的藥物。
            
84．對權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備控制、治療或預防牛皮癬的藥物。
            
85．對權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備一種藥物，該藥物用于控制、治療或預防伴有生長激素的合成或效應降低或增加的疾病、伴有調節生長激素釋放和/或對生長激素的應答的激素或細胞因子合成的減少或增加的疾病。
            
86．對權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備控制、治療或預防伴有凝血系統功能紊亂疾病的藥物。
            
87．對權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備控制、治療或預防腦部疾病包括早老性癡呆及精神分裂癥的藥物。
            
88．對權利要求1-74中任一項的化合物的用途，其用于制備控制、治療或預防傳染病的藥物。
            
89．一種藥用組合物，其包括有效量的權利要求1-74中任一項的化合物以及一種可藥用的載體或稀釋劑。
            
90．權利要求89的藥用組合物，其每單位劑量包含0.5mg-1000mg的權利要求1-74中任一項的化合物。
            
91．一種在有需要的受治療體內對一或多種PTP酶或帶有磷酸酪氨酸識別單位的其它分子的活性進行調節的方法，其包括對該受試者施用有效量的權利要求1-74中任一項的化合物或組合物。
            
92．偶聯在適當的固相基質上的權利要求1-74中任一項的化合物。
            
93．一種從生物樣品中分離與權利要求1-74中任一項之化合物有親和性的蛋白質或糖蛋白的方法，包括·使固定化的權利要求89的化合物與該生物樣品接觸，以使該固定化的化合物通過結合該蛋白質或糖蛋白而形成復合物，·從該生物樣品中除去未結合的物質并分離該復合物，及·從該復合物中提取該蛋白質或糖蛋白。
            
94．一種從生物樣品中分離與權利要求1-71中任一項之化合物有親和性的蛋白質-酪氨酸磷酸酶的方法，包括·使固定化的權利要求89的化合物與該生物樣品接觸，以使該固定化的化合物通過結合該蛋白質-酪氨酸磷酸酶而形成復合物，·從該生物樣品中除去未結合的物質并分離該復合物·提取該蛋白質-酪氨酸磷酸酶。
            
95．一種從生物樣品中分離與上述權利要求中任一項之化合物有親和性的含Src-同源性結構域2的蛋白質或含磷酸酪氨酸結合結構域的蛋白質的方法，包括·使固定化的權利要求89的化合物與該生物樣品接觸，以使該固定化的化合物通過結合該含Src-同源性結構域2的蛋白質或含磷酸酪氨酸結合結構域的蛋白質而形成復合物，·從該生物樣品中除去未結合的物質并分離該復合物，·從該復合物中提取該含Src-同源性結構域2的蛋白質或含磷酸酪氨酸結合結構域的蛋白質。
            
96．偶聯在熒光性或放射活性分子上的權利要求1-71中任一項的化合物。
            
97．一種使熒光性分子或放射性分子與權利要求1-71中任一項之化合物偶聯的方法，包括·使該化合物與該熒光性分子或放射性分子在反應混合物中接觸，從而生成復合物，·除去未復合的物質并從該反應混合物中分離該復合物。
            
98．一種用權利要求93的化合物在細胞內或受試者體內檢測蛋白質酪氨酸磷酸酶或帶有磷酸酪氨酸識別單位的其它分子的方法，包括·使上述化合物接觸該細胞或其提取物或來自該受試者的生物樣品或通過將該化合物注射至該受試者體內，以使該化合物生成與該蛋白質酪氨酸磷酸酶或該帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的復合物·檢測該復合物，從而檢測該蛋白質酪氨酸磷酸酶或該帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的存在。
            
99．一種用權利要求93的化合物在細胞或受試者體內定量蛋白質酪氨酸磷酸酶或帶有磷酸酪氨酸識別單位的其它分子的含量的方法，包括·使上述化合物接觸該細胞或其提取物或來自該受試者的生物樣品或通過將該化合物注射至該受試者體內，以使該化合物生成與該蛋白質酪氨酸磷酸酶或該帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的復合物·檢測該復合物的量，從而檢測該蛋白質酪氨酸磷酸酶或該帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的存在。
            
100．一種用權利要求93的化合物在細胞或受試者體內檢測蛋白質酪氨酸磷酸酶或帶有磷酸酪氨酸識別單位的其它分子功能的方法，包括·使所述化合物接觸該細胞或其提取物或來自該受試者的生物樣品或通過將該化合物注射至該受試者體內，以使該化合物生成與該蛋白質酪氨酸磷酸酶或該帶有磷酸酪氨酸識別單位的分子的復合物，·檢測該復合物所誘導的生物學效應。
            
101．在細胞或哺乳動物體內吸收后具有權利要求1-71中任一項所定義的結構和功能的化合物。
            
全文摘要
            
本發明提供新的化合物、新的組合物、它們的應用方法、和它們的制造方法,其中所述化合物是蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP酶,PTP)如PTPIB、TC－PTP、CD45、SHP－1、SHP－2、PTPα、PTPε、PTPμ、PTPδ、PTPσ、PTPζ、PTPβ、PTPD1、PTPD2、PTPH1、PTP－MEG1、PTP－LAR和HePTP的藥理學有效抑制物。這些化合物顯示能控制或治療多種疾病如自身疫病、急性和慢性炎癥、骨質疏松癥、各種類型的癌癥和惡性腫瘤疾病、以及Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。
            
文檔編號C07C235/84GK1300279SQ9980601
            
公開日2001年6月20日 申請日期1999年3月12日 優先權日1998年3月12日
            
發明者盧茨·S·里克特, 亨里克·S·安德森, 約瑟夫·瓦格納, 克勞斯·B·杰普森, 尼爾斯·P·H·莫勒, 斯文·布蘭納, 朗·杰普森, 奧利·H·奧爾森, 拉斯·F·艾弗森, 丹尼爾·D·霍爾斯沃思, 弗蘭克·U·阿克斯, 紀雨, 托德·K·瓊斯, 威廉·C·里普卡, 羅伊·T·烏耶達, 蘇京, 法里德·巴克爾, 盧克·M·賈奇 申請人:諾沃挪第克公司, 昂托根公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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