專利名稱：尿激酶原和尿激酶親和配位體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術和生物醫藥領域，更具體地，本發明涉及一類新的尿激酶原和尿激酶的親和配位體，其制備方法，以及這類新親和配位體在純化生產尿激酶原和尿激酶(尤其是人尿激酶原和尿激酶)的應用。本發明還涉及新的純化尿激酶原和尿激酶的方法。這類新化合物還可用作抑制腫瘤的藥物。
目前溶血栓類藥物的世界市場是5億美元，而且隨著世界人口老齡化的進一步發展，對這類藥物的需求量必然隨著增加。尿激酶原是比尿激酶效果更好、副作用更小的溶血栓藥物。世界上許多國家如日、美、德、法、意等一百多家公司和科研單位投入幾億美元研究其表達純化方法。僅表達系統方面的研究就產生了54條專利(Wagner et.al.,Biotechno1.Bioeng.,1992,39(3),320-326)。
我國北京大學生命科學學院，北京生物技術研究所，南京大學等單位也都成功地在不同的表達系統中表達了尿激酶原(Pro-UK)(Gao,Y.& Hu,M.,Biotechnol.Tech.,1994,8(3),179-182.Hua et.al.,Biochem.Mol.Biol.Intl.1994,33(6),1215-1220)。然而，到目前為止國內外都還沒有找到簡單經濟的規模純化分離手段。
現有的純化技術不能經濟高效地生產醫療用尿激酶，尤其是尿激酶原。鋅離子螯合親和層析，SP-Shephadex G-50陽離子交換層析和Shephadex G-100分子篩層析是幾十年前發展的實驗室規模純化技術。在實際生產中，這種方法步驟多，每步之間需要對樣品進行特殊處理。整個純化過程操作復雜，回收率低。對比較稀釋的樣品，需要預先濃縮等。在市場激烈競爭的今天很難用于實際生產。固定化的抗體免疫親和層析柱和肌蛋白(fibrin)親和層析柱的純化效果和回收率都有很大改進(Husain et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1981),78(7),4265-4269；Stump et.al.,J.Biol.Chem.,261(3),1267-1270)。但是，由于抗體和肌蛋白(fibrin)在生產中不僅價值昂貴，易于變性失活，被化學和生物降解，也不能經受醫療用生物制品生產過程中必要的在線滅菌和在線清潔處理，而且其降解產物易于污染被純化的產品，很難適應生產需要。把層析的基本介質改用微孔玻璃也沒有從根本上改善生產工藝(葉建新等，軍事醫學科學院院刊，1987,11(2):101)。尿激酶的純化可用固定化的對氨基苯脒作為親和層析的配基。但是由于這種親和配基對胰蛋白酶一大類的酶之間沒有辨別能力，在用于生產藥用尿激酶和尿激酶原時可能有被其他胰蛋白酶類酶污染，存在潛在的危險。
腫瘤細胞能夠分泌尿激酶原(Stephens et.al.,Cell Regul 1991，2(12):1057-1065)。在腫瘤細胞擴散到新位置侵入基底膜之前，尿激酶原被激活，級次激活蛋白水解酶，降解細胞外基質，為腫瘤細胞的入侵準備條件(Kobayashi et.al.,Biochim Biophys Acta 1993 1178(1):55-62)。因此，專一抑制尿激酶和尿激酶原的活性，有可能阻止蛋白水解酶群，從而消除腫瘤細胞侵入基底膜的條件，阻止和延緩腫瘤的擴散。為了能夠抑制腫瘤細胞利用尿激酶或尿激酶原，本領域迫切需要開發與尿激酶原和尿激酶有強親和力的抑制劑。
因此，本領域迫切需要開發與尿激酶原和尿激酶有強親和力的物質，以便用作尿激酶原和尿激酶的抑制劑來抑制腫瘤，和/或用作親和層析配位體來高效率、低成本的大規模生產尿激酶原和尿激酶。
本發明的一個目的是提供一類新的化合物，這類化合物與尿激酶原和尿激酶有強親和力，因而可作為尿激酶原和尿激酶的親和配位體用于尿激酶原和尿激酶的親和純化，和/或作為尿激酶原和尿激酶的抑制劑而用于抑制腫瘤。
本發明的另一目的是提供這類化合物的制備方法。
本發明的另一目的是提供固定有該化合物的親和介質。
本發明的另一目的是提供固定有該化合物的藥物組合物。
本發明的另一目的是提供一種低成本、高效率的大規模生產尿激酶原和尿激酶的親和技術工藝。
在本發明的第一方面，提供了一種下式(Ⅰ)化合物， 式中，R1選自氨基、單取代氨基、雙取代氨基、三取代氨基、四取代氨基、脒基；R2和R3各自獨立地選自羧基、磺酸基、磷酸基；R4選自H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素；Y選自碳原子和氮原子；Z選自碳原子和氮原子；
Xn1、Xn2、Xn3和Xn4各自獨立地選自碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；Xn1、Xn2、Xn3、Xn4、Y和Z組成的線狀或/和分支狀或/和環狀飽和/或/和不飽和分子骨架使R1和R2相距13±3埃，R2和R3相距8±3埃，R1和R3相距13±3埃。
較佳地，式中，R4選自鹵原子、氨基。
在本發明的另一方面，提供了上述化合物的用途，它們被用作尿激酶原和尿激酶的親和配位體而用于尿激酶原和尿激酶的親和純化。
在本發明的另一方面，提供了一種分離純化尿激酶原和尿激酶的方法，在該方法中包括用親和分離尿激酶原和尿激酶的步驟，而且在該親和分離步驟中，使用本發明的上述的化合物作為尿激酶原和尿激酶親和配位體。
較佳地，在該親和分離步驟中，親和介質吸附尿激酶原和尿激酶的條件為用約pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉(25mM)平衡柱子、上樣并用洗脫至基線；用約pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉+0.2M NaCl洗出尿激酶原。
更佳地，在親和分離步驟之后，還可包括進一步的本領域常規的精制步驟。
在本發明的另一方面，提供了一種新的可用于分離純化尿激酶原和尿激酶的親和介質，該介質包括固相載體和偶聯于固相載體上的本發明的親和配位體。
在本發明的另一方面，還提供了上述化合物的另一用途，它被用于制備治療腫瘤的藥物。并因此還提供了一種藥物組合物，該組合物包括安全有效量的上述本發明化合物和藥學上可接受的載體。
本發明人經過多年對尿激酶原和尿激酶的研究，在尿激酶原催化功能域空間結構中發現如下特點酶的活性是由his57，asp102，ser195三個氨基酸殘基的側鏈實現的。其中asp102都是酸性基團，而且位于酶活性口袋的底部。這個特征是尿激酶識別其堿性氨基酸酶切位點的基礎。在底物結合區的邊緣，有兩個堿性基團，精氨酸(arg35)側鏈瞇基和賴氨酸(lys143)的側鏈氨基。天冬氨酸(asp102)的側鏈羧基和精氨酸(arg35)側鏈瞇基相距為16.66埃；天冬氨酸(asp102)的側鏈羧基和賴氨酸(lys143)的側鏈氨基相距為17.15埃；精氨酸(arg35)側鏈瞇基和賴氨酸(lys143)的側鏈氨基相距16.51埃。
推斷尿激酶原中催化部分的分子結構，確定其活性部位并分析其結構特征。針對其結構特征，設計出對尿激酶催化結構域具有親和作用的式(Ⅰ)化合物有機化合物(親和配位體) 式中，R1選自氨基、單取代氨基、雙取代氨基、三取代氨基、四取代氨基、脒基；R2和R3各自獨立地選自羧基、磺酸基、磷酸基；R4選自H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素；Y選自碳原子和氮原子；Z選自碳原子和氮原子；Xn1、Xn2、Xn3和Xn4各自獨立地選自碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；Xn1、Xn2、Xn3、Xn4、Y和Z組成的線狀或/和分支狀或/和環狀飽和/或/和不飽和分子骨架使R1和R2相距13±3埃()，R2和R3相距8±3埃()，R1和R3相距13±3埃()。
在Brookhaven蛋白數據庫中，尿激酶原的空間結構的數據文件有1KDU、1LMW和1URK。經過計算機輔助分子模擬尿激酶原催化功能域的結構特征，并根據分子識別的原理而設計出本發明親和配位體由分子骨架和若干個功能基團組成。其中，功能基團的作用是和尿激酶原催化功能域附近的特征氨基酸殘基側鏈發生親和作用。分子骨架則是將各功能基團固定于合適的空間位置，以使功能基團發揮最佳和特異親和作用。
根據尿激酶原催化功能域活性部位附近His57,Asp102,Ser195三個氨基酸殘基的性質及空間分布的結構特征，所設計的親和配位體的結構特征如式Ⅰ所示。
在通式(Ⅰ)其中，R1、R2、和R3是與尿激酶原催化功能域相互作用，從而產生親和力的功能基團。其中，R1可以是任何堿性基團，如氨基，單取代氨基，雙取代氨基，三取得氨基，四取代氨基，瞇基等；R2，R3可以是任何的酸性基團，如羧基，磺酸基，磷酸基等。
在通式(Ⅰ)中，當本發明化合物被用于親和配位體(例如通過固定在固相載體上而形成親和層析基質)時，R4是連接基團或分子。本領域已知的各種連接基團或連接分子都可用作本發明的R4基團。合適的例子包括(但并不限于)H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素。較佳地，R4基團選自鹵原子、氨基、羥基或羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、纖維素。較佳地，當R4連接于分子骨架時，不影響R1、R2、R3和尿激酶原的相互作用。
在通式(Ⅰ)中，當本發明化合物被用作抑制尿激酶原和尿激酶的抑制劑(例如用于抑制腫瘤擴散時)，R4可以是H或鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基。
在通式(Ⅰ)中，Xn1、Xn2、Xn3、Xn4和Y、Z構成了連接R1、R2、和R3或R1、R2、R3和R4的分子骨架。
Y選自碳原子和氮原子；Z選自碳原子和氮原子；Xn1、Xn2、Xn3和Xn4各自獨立地選自碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；Xn1、Xn2、Xn3、Xn4、Y和Z組成的線狀或/和分支狀或/和環狀飽和/或/和不飽和分子骨架使(1)R1、和R2相距13±3埃；(2)R2，R3相距8±3埃；(3)R1和R3相距13±3埃。優選的分子骨架是式(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)化合物中的分子骨架。
本發明的一些具體的優選化合物如下具有式(Ⅱ)所示結構的化合物PU07 R1是脒基，R2和R3是羧基，R4是氨基；具有式(Ⅲ)所示結構的化合物PU08 R1是二甲胺基，R2是羧基，R3是磺酸基，R4是氨基；具有式(Ⅳ)所示結構的化合物PU09 R1是三甲胺基，R2和R3是羧基，R4是氯；具有式(Ⅴ)所示結構的化合物PU10 R1是脒基，R2和R3是羧基，R4是氨基。
本發明的化合物可作為分離人或動物的尿激酶原和尿激酶的親和配位體，因而具有極大的應用價值，例如用于親和層析。
親和層析，又稱為生物選擇性吸附層析，已經成為純化生物大分子活性物質不可缺少的分離技術。隨著對生物制品中活性成分的純度和需求量的增加，雜質含量的降低，傳統分離技術如凝膠過濾和離子交換層析技術再也不能滿足工業生產和學術研究的要求。
與其它方法相比，親和層析方法具有以下幾個明顯的特點。親和層析介質允許對生物分子選擇地吸附和解離，可以取得很高的純化倍數，常常為1000多倍。此外，蛋白在純化過程中不僅得到濃縮，當結合到親和配位體上時，蛋白的性質也更加穩定；其結果又提高了目標產品的活性回收率。因此，親和分離技術非常適用于處理體積大，濃度低的生物活性物質。
在大規模生產的純化工藝中，采用親和層析技術可以大大減少純化過程的步驟，從而減少了合格產品的生產時間和成本。當下游生產成本占總生產成本的80％時顯得更加重要。在純化過程的任何環節都可以使用親和層析技術，但采用的越早，獲得的經濟效益越大。J.Bonnerjea(Biotechnology,4,954-958,1986)對生物制品生產工藝調查的結果顯示，在所有被考察的工藝中，一步純化效果最佳的單元操作中，有45％是利用親和步驟獲得的。
親和分離介質的關鍵是親和配位體(也可稱為“親和配基”)。親和配位體必須能夠選擇性地和可逆地吸附生物大分子。傳統的親和配位體為親和介質的成功使用奠定的基礎。然而，在工業生產中，天然的親和配位體，如抗體、輔酶、氨基酸、多肽、蛋白、凝集素，具有不可克服的缺點最突出的因素是成本昂貴，生物和化學性質不穩定，生產中難于維持結合活性，也不能經受在線清潔和消毒，因此，還可能被其它物質，如病毒和內毒素污染。針對根據尿激酶原和尿激酶的結構和性質，本發明人專門設計和合成了一系列化合物；這些化合物固定于層析介質上后，不僅能夠提供高效的純化倍數、重復性的結果，而且配基極少脫落。更適合工業化、大規模生產醫用和試劑用尿激酶原和尿激酶。
如本文所用，烷基通常含有約1-8個碳原子，較佳地1-6個碳原子，更佳地1-4個碳原子，它可以是直鏈、支鏈或環狀的飽和脂族烴基。合適的烷基例子包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基等。合適的環狀脂族基團例子通常含有3-8個碳原子，而且包括環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基和苯基。
在制備本發明化合物時，可用常規的有機合成方法，依次將R1、R2和R3連接于X1、X2、X3、X4、X5所構成的骨架。可選用的方法包括(但并不限于)親核取代反應、縮合反應等。
本發明的新的式(Ⅰ)化合物，因為與尿激酶原和尿激酶具有極高的親和力，因此非常適合作為尿激酶原和尿激酶的親和配位體，用于尿激酶原和尿激酶的親和純化。此外，本發明的親和配位體很穩定，可以耐受醫藥生產中必需的現場在線清洗和消毒，可以方便地滿足GMP(Good Manufacturing Practice)標準。
本發明還提供了一種新的分離純化尿激酶原和尿激酶的方法，其中用式(Ⅰ)化合物作為親和配位體進行親和純化。各種常規的親和純化技術都可用于本發明，不同點僅在于用本發明的式(Ⅰ)化合物作為親和配位體。
本發明還提供了一種新的可用于分離純化尿激酶原和尿激酶的親和介質，該介質包括固相載體和偶聯于固相載體上的本發明的親和配位體。在制備本發明親和介質時，可以將用常規方法本發明的式(Ⅰ)化合物偶聯于常規的合適載體上，從而形成親和介質。合適的固相載體的例子包括(但并不限于)瓊脂糖珠，硅膠珠，人工合成的聚合物珠等。
可用本發明純化方法提純的原料包括(但并不限于)尿液、基因工程菌或細胞和動物生物反應器表達的人尿激酶原和尿激酶的發酵液或細胞培養液。
這種親和技術工藝，由于利用尿激酶原和尿激酶和親和配位體之間的高親和力，因此經一步親和純化處理就可獲得高純度的產品，可以在大規模生產和實驗室中經濟高效地制備高純度的人尿激酶原和尿激酶，降低生產成本，提高產品質量。
本發明化合物的另一主要用途是用作尿激酶原和尿激酶的抑制劑。因此，本發明還涉及一種藥物組合物，該組合物包括安全有效量的上述本發明的化合物和藥學上可接受的載體。
這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油、緩釋劑以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內、口服的給藥途徑。尿激酶原和尿激酶以有效地治療和/或預防具體的適應癥的量來給藥。施用于患者的尿激酶原和尿激酶的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫生的判斷。通常，劑量為0.0001-10mg/千克體重，較佳地為0.001-5毫克/千克體重，更佳地為0.01-1毫克/千克體重。
在附圖中，
圖1是式(Ⅱ)化合物的制備流程圖以及尿激酶原和尿激酶親和介質(偶聯有式(Ⅱ)化合物的瓊脂糖)的制備流程圖。
下面結合實施例進一步詳細地闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于闡述目的，而不用于限制本發明范圍。
實施例1式(Ⅱ)化合物的制備 在該化合物中，R1是脒基，R2，R3是羧基，R4是氨基；在某一構象下，R1、和R2相距9.08埃；(2)R2，R3相距5.09埃；(3)R1和R3相距12.12埃；R4為氨基。
該化合物是用圖1所示的方法合成的將叔丁氧羰基(Boc)保護的天冬氨酸(2.33g,10.0mmol)溶于過量乙酐(20ml)中。室溫攪拌1小時后利用旋轉蒸發儀除去未反應的乙酐，得化合物1。化合物1溶于無水丙酮中，然后在攪拌下滴加對氨基苯脒(1.37g,10.1 mmol)的碳酸氫鈉溶液(0.5M,100ml)中，除去丙酮和水，再在90℃條件下，加水使固體物質剛好溶解，然后4℃放置過夜，結晶出來的產物-化合物2。將化合物2再與對硝基苯酚在甲碘化1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide methiodide)作用下生成化合物3。化合物3經過結晶純化后與5-氨基間苯二酸(5-aminoisophthalic acid)(12mmol)在碳酸鈉溶液(0.5M，30ml)中反應生成化合物4。然后經過三氟乙酸脫去保護氨基的BOC保護基團，得到式(Ⅱ)化合物(即化合物PU07)。式(Ⅱ)化合物再與環氧氯丙烷活化的瓊脂糖層析介質在pH10反應得到親和介質U07。
實施例2式(Ⅱ)化合物的親和層析介質的制備和尿激酶原和尿激酶的親和層析制備親和介質U07將實施例1式(Ⅱ)化合物溶解于50ml Na2CO3(0.5M,pH11.0)，加入到盛環氧基Sepharose 6B(100ml)的可密封瓶中，60℃搖振過夜。在停止之前，加入2ml的乙醇胺，保溫振蕩2小時。最后取出反應瓶中Sepharose 6B經0.5M 醋酸(100ml)，0.1M NaOH(100ml)和蒸餾水(100mlx5)分別洗滌后，得到親和層析介質，命名為U07，加入用20％乙醇儲存待用。
親和純化尿激酶原和尿激酶用pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉(25mM)平衡裝有如上制得的親和介質U07的層析柱。將尿中沉淀的尿激酶粗品，用平衡緩沖液溶解后，上樣于該層析柱。用pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉(25mM)洗滌至基線(280nm紫外檢測)，然后用pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉+0.2M NaCl從親和層析柱上洗脫尿激酶。
結果表明，尿激酶一步純化的回收率為95％，純化倍數(Purification Factor)為20，清潔倍數(Clearance Factor)可達到30。
實施例3式(Ⅳ)化合物的制備
該化合物是用如下方法合成的將5-氨基-1,3-苯二甲酸(1.90g,21.00mmol,1.05eq)溶于碳酸氫鈉溶液(0.5M,10ml)在攪拌下滴加入三氯三氮嗪(3.68g,20.0mmol,1eq)的丙酮冰水(1∶1)懸浮液。碳酸氫鈉溶液(0.5M)用于保持反應體系的pH在6到7之間。反應進行大約兩小時后，用TLC(硅膠，溶劑甲醇/乙酸，95/5)和Ehrlich’s試劑檢測不出芳香胺時，用旋轉蒸發器除去丙酮。再用乙酸酸化水相，沉淀析出得到白色粉末，過濾，干燥得到中間產物Ⅰ，4.3g(產率84％)。
用元素分析法測得C,39.87；H,1.90；N,16.50％；C11H6N4O4Cl2的理論值C,40.14；H,1.84；N,17.03％將對氨基苯甲脒鹽酸鹽(2.09g,20mmol,1eq)溶解于碳酸氫鈉溶液(0.5M,10ml)與中間產物Ⅰ(3.24g,20mmol,1eq)在NaHCO3(0.5M,15ml)中于pH6到7混合，并用NaHCO3(0.5M)維持pH在6-7，保溫過夜。當用TLC(硅膠，溶劑甲醇/乙酸，5/95)和Ehrlich’s試劑查不到芳香胺時停止反應，旋轉蒸發濃縮后，用醋酸調節pH到6.5，析出灰色沉淀，得到式(Ⅳ)化合物(即化合物PU09)(5.0g,75％)。
用元素分析法測得C,50.12；H,3.35；N,22.86％C18H14N7O4Cl理論值C,50.53；H,3.30；N:22.92％)實施例4式(Ⅳ)化合物的親和層析介質的制備和親和純化尿激酶原和尿激酶制備親和介質U09化合物PU09(200mg)溶解于NaHCO3(0.5M,10ml)中，與10ml氨基Sepharose混合，置于密封的容器中。在90℃振蕩過夜。然后取出反應器中Sepharose經0.5M醋酸(50ml)和蒸餾水(100mlx5)分別洗滌后，制得親和介質U09，加入用20％乙醇儲存待用。
親和純化尿激酶原和尿激酶大腸桿菌培養得到的尿激酶原包涵體，稱取0.23g尿激酶原包涵體。溶解在17ml變性液(6M鹽酸胍，10mM Tris,50mM ME pH8.5)中，4℃度震搖過夜。離心除去不溶物，將上清緩慢滴入劇烈攪拌的400ml復性液(2.5M urea,10mM Tris,50mM EDTA,pH8.8)中，4度攪拌24h。將復性液的pH調至4.5，離心后取上清。然后用親和介質U09吸附后，再用平衡緩沖液洗柱至280nm紫外檢測到基線后，用洗脫緩沖液從親和層析柱上洗脫尿激酶原。尿激酶原一步純化的回收率為80％，純化倍數(Purification Factor)為15，清潔倍數(Clearance Factor)可達到26。
實施例5對尿激酶活性的抑制作用將化合物PU09(分子量為427.81)，稱取0.0086g溶于1mL的緩沖液A(50mMTris pH7.8 10mMNaCl 0.5mMEDTA)。從中取出100ul，用緩沖液A稀釋至1mL，依次稀釋，得到濃度分別為20mM,2mM,200μM,20μM,2μM的系列的溶液。加入到氣泡上升法測尿激酶活力的測活系統中，測定對尿激酶活力的抑制。根據實驗所得出的抑制曲線發現，在10μM的濃度下，PU09已經能夠顯著抑制尿激酶的活力。
實施例6藥物組合物的制備局部注射和/或肌肉注射液的具體成分和含量
口服制劑的具體成分和含量
這里，藥學惰性物質指片劑、膠囊、口服水劑，包埋劑制備中用到的淀粉、緩釋劑、粘結劑，載體等不影響化合物PU09生物活性的物質。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1．一種式(Ⅰ)化合物，其特征在于， 式中，R1選自氨基、單取代氨基、雙取代氨基、三取代氨基、四取代氨基、脒基；R2和R3各自獨立地選自羧基、磺酸基、磷酸基；R4選自H、鹵原子、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基單取代和雙取代的氨基、羥基、羧基、巰基、含羥基的聚合物、多糖、瓊脂糖、或纖維素；Y選自碳原子和氮原子；Z選自碳原子和氮原子Xn1、Xn2、Xn3和Xn4各自獨立地選自碳原子、氧原子、氮原子或硫原子；Xn1、Xn2、Xn3、Xn4、Y和Z組成的線狀或/和分支狀或/和環狀飽和/或/和不飽和分子骨架使R1和R2相距13±3埃，R2和R3相距8±3埃，R1和R3相距13±3埃。
2．如權利要求1所述的化合物，其特征在于，式中，R4選自鹵原子、氨基。
3．按權利要求1所述的化合物，其特征在于，該化合物選自下組具有式(Ⅱ)所示結構的化合物 具有式(Ⅲ)所示結構的化合物 具有式(Ⅳ)所示結構的化合物 具有式(Ⅴ)所示結構的化合物
4．一種藥物組合物，其特征在于，它包括安全有效量的權利要求1所述的化合物和藥學上可接受的載體。
5．一種權利要求1所述化合物的用途，其特征在于，它被用于尿激酶原和尿激酶的親和純化。
6．如權利要求5所述的用途，其特征在于，該化合物是具有式(Ⅱ)或(Ⅳ)所示結構的化合物。
7．一種分離純化尿激酶原和/或尿激酶的方法，在該方法中包括用親和分離尿激酶原和尿激酶的步驟，其特征在于，在該親和分離步驟中，使用權利要求1所述的化合物作為尿激酶原和尿激酶親和配位體。
8．按權利要求7所述的方法，其特征在于，該尿激酶原和尿激酶是人的。
9．一種用于親和純化層析介質，其特征在于，它包括固相載體和偶聯于固相載體上的權利要求1所述的化合物。
10．一種權利要求1所述化合物的用途，其特征在于，它們被用于制備治療腫瘤的藥物。
全文摘要
本發明提供了一類新的可作為尿激酶原和尿激酶親和配位體的化合物,該化合物的制備方法,以及這類新親和配位體在純化生產尿激酶原和尿激酶(尤其是人尿激酶原和尿激酶)的應用。本發明還提供了新的用于純化尿激酶原和/或尿激酶的親和介質和方法。本發明可高效率、低成本的大規模生產人尿激酶原和尿激酶,尤其是高純度的醫用級產品。
文檔編號C07D253/00GK1298869SQ9912423
公開日2001年6月13日 申請日期1999年12月9日 優先權日1999年12月9日
發明者李榮秀, 周先碗, 蕭能慶, 劉海蘭, 王淑靜 申請人:上海中路生物工程有限公司