專利名稱：：低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉及其制備和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種類肝素物質及其制備和應用，具體為低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉及制備和應用。魔芋葡甘聚糖是一種天然高分子多糖，具有與肝素相近的骨架結構。由于其固有的生物相容性，可生物降解，因其無毒，常用作為醫用高分子材料，藥物緩釋載體或作其他制藥原料。我國魔芋資源十分豐富，每年生產魔芋精粉數億噸。魔芋精粉中魔芋葡甘聚糖(KonjacGlucomannan，簡稱KGM)占80％以上，還含淀粉、纖維素、蛋白質、游離還原糖等，是亟待開發利用的多糖資源。KGM是一種線性多糖，但又常有支鏈結構。結構不同就有不同的特性。文獻“魔芋葡甘聚糖的化學結構與流變性質”(許時嬰等，無錫輕工業大學學報，1991，(1)1-11)報導，KGM主要含D—甘露糖和D—葡萄糖，其摩爾比為2∶1，以β1.4鏈結合，少量分支以β1.3鏈結合，KGM分子中C2、C3、C6位上的-OH，均具有較強的反應活性，在適當條件下，可進行多種化學修飾，如酰基化、硫酸酯化、羧甲基化及羥乙基化等，其中最吸引人的是KGM磺酸化衍生物的研制，因為磺化衍生物是制備類肝素藥物的基礎，類肝素藥理作用廣泛、抗凝血、抗血栓、調血脂、降血粘度、抑制紅細胞或血小板聚集、改善微循環、并有降血壓、血糖的作用，可用于高凝性高血粘度綜合癥和梗塞癥的治療與防治。因此本發明的目的在于以魔芋精粉為原料制取一種魔芋葡甘聚糖磺化衍生物——低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉，即低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉類肝素新物質，及其可供生產的方法，同時提出產品在防治心腦血管疾病藥物方面的應用。為實現本發明的目的，低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉的制備方法是1、以魔芋精粉原料，用脫支酶(Ec3、2、1、4)(酶活500u)在醋酸—醋酸鈉(PH5.5-6.0)緩沖液中，恒溫40℃攪拌酶解，過濾得脫支線性魔芋葡甘聚糖。2、將酶解脫支魔芋葡甘聚糖制備成低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯，按線性魔芋葡甘聚糖與5％鹽酸水溶液比為1∶5(體積比)配料，恒溫于70℃攪拌反應，滴加5％H2O2溶液酸解氧化3小時以上，補加環氧丙烷，其量為KGM/環氧丙烷質量比1∶3，并加入低聚葡甘聚糖質量1％的NaOH或KOH或乙醇鈉作催化劑，降溫至50℃，繼續攪拌3小時以上，過濾，用醫用乙醇洗滌后于60℃烘干得低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯。3、按低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯比磺化試劑(是將甲酰胺與氯磺酸按4∶1(體積比)，恒溫5℃以下攪拌滴加氯磺酸得的白色粘稠液體)為1∶10(體積比)配料，恒溫于68℃攪拌反應4小時以上，冷卻后加入3倍體積的95％乙醇沉淀，再以截留分子量3000-8000d的透析袋置于去離子水中洗脫鹽，用NaOH溶液調PH至8，再以醫用乙醇沉淀，風干得低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉產品。其反應式為式中R＝-C3H5R’＝-HSO3n＝葡萄糖∶甘露糖摩爾比1∶2m脫支酶Ec(3、2、1、4)酶解分支度K酸解常數得到的低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉具有如下理化性質S含量9.42％(元素分析法按無機化學實驗進行)紅外吸收光譜圖(KBr壓片法)3450-1cm、2930cm-1、1640cm-1、1250cm-1、1070cm-1、800cm-1。圖1為磺化羥丙基KGM、肝素、羥丙基KGM的紅外光譜圖。圖2為低分子KGM的光譜圖。在3440cm-1處有強吸收，顯示有-OH基團的O-H伸縮振動，在2940cm-1有中強吸收，顯示CH2或-CH3基團的C-H鍵伸縮振動；在波數1640cm-1處有強吸收，顯示有-SO3H基團的C＝S鍵伸縮振動，在1070cm-1有強吸收，顯示有C-O-C(糖環)的伸縮振動；在1250cm-1處有強吸收，證明也有-OSO3-基團的S＝O鍵伸縮振動，于800cm-1處有強吸收，證明有C-O-S鍵伸縮振動。低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉(即低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉)與肝素具有相同抗凝效價及更強的抗血栓作用，低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉抗凝活性低，抗栓、溶栓效果較好，同時具有抗動脈粥樣硬化、調整血脂的作用，可作為防治心腦血管疾病的新藥應用。低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉藥理實驗溶栓作用生物實驗參照“中國醫藥工業”雜志1992、22(10)454-456進行，抗動脈粥樣生物實驗參照“中國藥理通訊”1990(7)22進行。實驗結果表明，低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉體內外均具有溶血栓作用，低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉2.5mg/kg的體內溶血栓作用明顯優于按人用劑量換算的抗栓酶3號(20μ/kg)的作用，體外溶栓實驗表明6.25mg/ml低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉即有明顯的溶栓作用，而與低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉25mg/ml具有等抗凝效價的類肝素則無作用，說明低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉不僅具有抗凝活性低、抗栓作用強的特點，而且具有較好的溶栓作用。為了探討其抗栓、溶栓作用的機理，觀察了低聚魔芋葡甘取糖雙酯鈉對纖溶功能的影響。結果表明低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉可明顯縮短ELT，說明低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉激活纖維蛋白溶解系統，提高了纖維蛋白溶解功能，FDP升高及血漿Eg含量下降的結果與ELT結果一致，進一步證實了低聚魔芋葡甘聚糖雙酯鈉的促纖溶作用。實施例1魔芋精粉KGM酶解脫支成線性KGM實驗在500L酸解釜中按魔芋中魔芋葡甘聚糖比0.2M醋酸—醋酸鈉(PH5.5-6.0)緩沖溶液為1∶5(體積比)投料，分別添加配制脫支酶Ec(3、2、1、4)酶活力500u、1000u、1500u，恒溫40℃，間隔15分鐘攪拌(500r/min)/分鐘，各處理3小時，檢測其粘度(cp)、還原糖(mg/kg)的量，試驗結果為酶活1500u粘度下降為1000cp以下需1.2小時，但殘糖升高到20mg/ml，酶活1000u時，粘度下降為1000cp以下需1.8小時，殘糖上升到17.5mg/ml，只有酶活500u粘度下降1000cp時需3小時，殘糖最少12.3mg/ml，故選用較低酶活500u，延長反應時間，可達到降低魔芋葡甘聚糖粘度和酶解魔芋葡甘聚糖的雙重目的。實施例2酶解脫支線型魔芋葡甘聚糖酸解，氧化試驗酸解、氧化劑很多，傳統酸解劑為鹽酸、硫酸，氧化劑為高碘酸鈉、過氧化氫等，用鹽酸和過氧化氫為酸解氧化劑試驗結果是HCl水溶液濃度5％以上時，魔芋葡甘聚糖混濁度OD值(KGM(A1cm550nm)OD值)1.283以下，酸值穩定為90以上。魔芋葡甘聚糖酸解與氧化為較低分子量魔芋葡甘聚糖醛酸的轉化率與魔芋葡甘聚糖量、鹽酸量、過氧化氫及水的量、反應時間、溫度、氧化劑的加入方式有關，且這些因素相互作用，采用多因素模擬放大試驗，設計了七因素、二個位級、并按Lg(27)正交表進行實驗，以低聚魔芋葡甘聚糖醛酸轉化率為指標進行比較分析，結果見表1。從結果可以看出，K1和K2的大小反應了該因素二位級對轉化率影響的強弱，極差R則判定了各因素二位級對轉化率影響的總體效應。可見對反應轉化率影響較大的為6號試驗，說明在HCl、水體系中，采用滴加H2O2方式對提高魔芋葡甘聚糖醛酸轉化率有利，溫度70℃反應5小時時比40℃反應10小時對提高轉化率有利。魔芋葡甘聚糖酸解應用凝膠過濾測定低聚魔芋葡甘聚糖的分子量在3000-7000D。應用硫酸—卡唑顏色反應將樣品水溶液配成100μg/ml濃度，用標準品葡萄糖醛酸制備標準曲線，定性定量測其氧化成醛酸的含量，計算得轉化率為67.08％。實施例3低聚葡甘聚糖醛酸丙酯化試驗從魔芋葡甘聚糖酸解氧化試驗因素直觀分析，可看出其魔芋葡甘聚糖用量、鹽酸用量、反應溫度變化可認為無影響，為了同步找出丙酯化優化條件，在丙酯化試驗時把魔芋葡甘聚糖用量、鹽酸用量、反應溫度固定為一個水平，以酯化反應效率(RE)％為指標進行比較分析，找出酯化時間、酯化催化劑用量、環氧丙烷用量比與恒定酯化溫度四因分三位級，按Lg(34)正交進行實驗，結果見表2和圖3，圖3中酯化反應效率是按20g環氧丙烷為標準計算出的酯化容量進行換算的結果。從表2看出，最佳工藝條件是A2、B2、C2、D，通過K值的計算也證明了這一點，R的計算反映了所選四因素對酯化的影響均較顯著，但反應時間好的條件在三位級(B3)，其他三因素最佳條件均在第二位級，故對反應時間而言，不能排除在三位級外還尚有較好條件，于是進行了反應時間與酯化率關系實驗，結果見表3。由表3可見，當反應達3小時后酯化反應效率達93.06％，超過3小時效率再提高不顯著。從圖3可明顯看出四因素水平，環氧丙烷與低聚魔芋葡甘聚糖醛酸酯化反應的最優組合(A2B3C2D2)，通過魔芋葡甘聚糖酸解、氧化的低聚魔芋葡甘聚糖醛酸實際得率換算，即魔芋葡甘聚糖與環氧丙烷的質量比為1∶3，在50℃添加環氧丙烷質量1％的NaOH作為催化劑反應3小時，其酯化反應效率可達95％以上。實施例4低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯磺酸化效率試驗用前述的甲酰胺—氯磺酸為磺化劑，磺化低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯，在不同溫度條件下，磺化劑與低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯用量按3水平，采用L9(33)正交表做實驗。其實驗因素水平及L9(33)正交實驗結果如表4。對以上9組實驗分別測定其含硫量，再按摩爾比轉算成磺化效率，對照各水平的結構進行評價。以磺化效率為指標方差分析結果如表5。由實驗結果可看出(1)低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯和磺化試劑的使用量對磺化效率有高度顯著影響，而溫度的變化對磺化效率無顯著效果，這說明其磺化效率的溫度范圍較寬。(2)對照磺化試劑用量選擇范圍的影響分析、磺化試劑的最佳用量為80％。(3)從低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯用量分析，隨著低聚魔芋葡甘聚糖醛酸用量的減少，磺化劑的用量也可減少。表1L8(27)KGM酸解、氧化結果注括號內值為試劑量、溫度值、加料方式。表2L9(34)KGM醛酸丙酯化試驗結果</tables>注括號內值為試劑量或溫度值。表3反應時間與酯化效率實驗結果</tables>表4L9(33)低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯用甲酰胺氯磺酸磺化正交實驗結果</tables>注括號內值為試劑濃度或溫度。Q＝(M12+M22+M32)/3-(Σy)2/9(Σy)2/9＝67583表5以磺化效率為指標的方差分析注F0.05(2.2)＝19.00F0.01(2.2)＝99.00*為高度顯著權利要求1.低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉化合物，其特征在于具有式(1)結構式的化合物式中R＝-C3H5R’＝-HSO3n＝葡萄糖∶甘露糖摩爾比1∶2m脫支酶(Ec3、2、1、4)酶解分支度K酸解常數2.一種低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉化合物的制備方法，其特征是步驟如下；(1)魔芋精粉原料加脫支酶(Ec3、2、1、4)(酶活500u)，在醋酸一醋酸鈉PH5.5-6.0緩沖液中，恒溫40℃攪拌酶解，過濾得脫支線性魔芋葡甘聚糖；(2)按線性魔芋葡甘聚糖與5％鹽酸水溶液體積比為1∶5配料，恒溫于70℃攪拌反應，滴加5％H2O2溶液酸解氧化3小時以上，補加環氧丙烷，其量為KGM∶環氧丙烷質量比1∶3，并加入低聚葡甘聚糖質量1％的NaOH或KOH或乙醇鈉作催化劑，降溫至50℃攪拌3小時以上，過濾，用醫用乙醇洗滌后于60℃烘干得低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯；(3)按低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯與甲酰胺—氯磺酸磺化劑體積比1∶10配料，恒溫于68℃攪拌反應4小時以上，冷卻后加入3倍體積的95％乙醇沉淀，再以截留分子量3000-8000d的透析袋置于去離子水中洗脫鹽，用NaOH溶液調PH至8，再以醫用乙醇沉淀，風干得低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉產品。3.權利要求1所述的低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉在制備預防或治療心腦血管疾病的藥物中的應用。4.一種預防或治療心腦血管疾病的組合物，包括治療有效量的權利要求1的低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉和在藥物學上可接受的載體或賦形劑。全文摘要魔芋葡甘聚糖磺化衍生物,即如式(1)所示的低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯硫酸酯鈉化合物,及其制備和作為預防或治療心腦血管疾病藥物和有效成分的應用。本化合物是以魔芋精粉為原料,經酶解脫支成線性魔芋葡甘聚糖后,加酸和氧化劑酸解氧化,再補加環氧丙烷,在氫氧化鈉或氫氧化鉀或乙醇鈉催化劑存在下制得低聚魔芋葡甘聚糖醛酸丙酯,再用甲酰胺－氯磺酸磺化劑磺化、沉淀、脫鹽,再沉淀風干而得,本化合物可作為預防或治療心腦血管疾病的新藥應用。式中∶R=－C文檔編號C07H11/00GK1275623SQ9911653公開日2000年12月6日申請日期1999年6月29日優先權日1999年6月29日發明者干信申請人:干信