專利名稱：高效止血原料藥三七素的制備方法
技術領域：
本發明屬于一種以藥用植物為原料生產藥物的方法，特別是以中藥材三七(Panaxnotoginseng(Burk)F.H Chen)為原料制備三七素(dencichine)原料藥的方法。
中藥材三七具有止血散瘀、活血化瘀、消腫定痛、舒筋活絡諸功能，其中尤以止血功能稱著。《本草綱目》稱“三七止血散血定痛”；《本草拾遺》稱“三七止血活血，止血不傷新”。歷版《中華人民共和國藥典》對三七的主治功能均界定其為止血。數百年來，歷代醫家將三七作為止血上品，廣泛用于跌打損傷、內傷出血等內外出血癥。但作為速效止血藥，國內外至今尚無專門的三七止血成份提純物及其制備方法，更無止血成份提純物制劑。而生化藥凝血酶類止血藥，由于使用劑量較大，給藥過程較慢，難以解決迅速止血有效急救的問題。
本發明的目的是提供一種制備高效止血原料藥——三七素(dencichine)的方法。
本發明方法依次包括以下步驟三七原料粉碎過40目或更細目篩→用75％以上濃度的醇提取→提取液另作用途，渣用水提取→過濾、濃縮→用正丁醇于40-70℃下萃取→正丁醇部份廢棄，水溶部份經一次或一次以上樹脂層析→從層析液中收集提取物。
以上步驟和工藝參數的進一步優化所說樹脂層析為兩次，第一次層析采用SephadexLH-20凝膠樹脂，第二次層析采用CM-Sephadex-C-25°離子交換樹脂。從層析液中收集提取物的過程依次包括濃縮→脫色→結晶→過濾、干燥→成品。脫色分氧化鋁過濾和活性炭吸附兩次完成；干燥采用真空干燥。
再進一步優化的步驟和工藝參數為(1)、粉碎過60目篩，(2)、醇提取用80％以上甲醇或乙醇，連續滲漉循環提取2-3次，每次24～48小時，合并提取液，(3)、水提取；用去離子水于常溫條件下，連續滲漉循環提取2-4次，每次24～48小時，合并提取液，(4)、過濾先粗濾，再用精密濾棒真空吸濾，(5)、濃縮真空減壓濃縮至8～10波美度，(6)、正丁醇萃取將濃縮液注入已清洗好的萃取鍋中，加入3～5倍量正丁醇，在55-65℃條件下攪拌20-40分鐘，靜置3-5小時，待分層后，收集水溶液，廢棄含雜質的正丁醇液，
(7)、層析分別將Sephadex LH-20凝膠樹脂和CM-Sephadex-C-25°離子交換樹脂裝入兩個層析柱中，預處理至中性水飽和狀，濾析時，先關閉柱底閥，緩緩注入水提濃縮液使分布均勻，吸附飽和后，再開啟柱底閥排出廢液，并用乙醇沖洗，吸附物(三七素)用蒸餾水反復洗脫、收集合并，(8)、脫色洗脫液過氧化鋁柱，脫去深色素，濾液加3～5％活性炭，在反應釜中加熱至75-85℃，攪拌15-25分鐘，脫去淺色素，精濾除去活性炭后，得純三七素水溶液，(9)、濃縮結晶純三七素水溶液減壓濃縮至15～20波美度后，排出靜置20小時以上，結晶析出，過濾干燥后即為成品三七素原料藥。
用本發明方法從三七中提取得到的三七素(dencichine)為β-N-乙二酸-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸，化學結構式為
性狀無色板狀結晶，味苦澀。可溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙醇等有機溶劑；熔點207～208℃；鑒別(1)本品與熒光胺試劑反應，產生強烈熒光；(2)高效薄層(HPTCL)掃描測定(檢出量4ng)，最大吸收波長395nm；(3)氨基酸層析譜測定，保留吸收峰值為5.40～5.41。
藥效學研究1、分別用大鼠、家兔作血小板生成與聚集試驗，結果證明本品具有極強的血小板生成和聚集作用。與對照品止血環酸(transamine)比，最大聚集率為4∶1；2、用絨膜激素(HCG)2單位引起未成熟雌小鼠卵巢出血點動物數為指標，注射三七素，觀察到能使卵巢出血點動物顯著減少；3、分別用毛細管折斷法、小鼠斷尾動脈法，設止血環酸為對照品，測得注射本品2mg/kg，小鼠出血縮短時間為7分鐘；而注射止血環酸100mg/kg，小鼠出血縮短時間僅為0.5分鐘。三七素的止血活性，是等量止血環酸的700倍。
毒理研究1、神經毒作用30～40g仔雞腹腔給藥20mg，2～6小時后呈現神經毒癥狀。表現為頸僵硬，腿肌麻痹伸直，6小時后癥狀逐漸消失，說明本品在過高劑量時有神經毒作用；2、急性毒性試驗大鼠每3天斷尾動脈一次，注射本品低劑量組1mg/kg，高劑量組5mg/kg，連續給藥9天，未顯毒副作用。半數致死量(LD50)為1043mg/kg，為人用劑量的522倍；3、長期毒性試驗上法連續給藥90天，恢復期30天，動物外觀無明顯變化，血液生化指標，除血小板數增多外，其他各項無明顯變化；心、肺、肝、膽、脾、腎、腸、胃、腎上腺等組織無明顯變化。本品的明顯副作用是創傷處止血后留瘀。研究結論表明(1)三七素具有極強的止血活性，其等量藥效，大大超過國內外已有止血藥；(2)本品藥效高，顯效快，可廣泛用于內外出血癥的治療，用于外科手術止血，可大大減少手術期間的失血量，提高手術安全性；對血小板缺少癥、血小板聚集無力癥，同時具有治療作用。
(3)本品一次使用劑量輕微，僅1～2mg即達到止血作用，不宜使用過高劑量，避免出現神經毒作用。
(4)本品有止血留瘀作用，應與三七皂甙等化瘀類藥物配合使用，以便祛除血瘀。
本發明的積極效果是提供了一種獲取三七止血成份提純物的方法，所得產品為高效止血原料藥——三七素(dencichine)。該藥物及其制劑具有高效快速止血的特點，且劑量極小，給藥途徑便捷，易于在危重病情時起有效急救的作用。
實施例1將三七塊根洗凈，粉碎，過60目篩，放入提取罐中用4倍量80％乙醇循環浸提3次，每次36小時，排出、合并濾液另作用途(提取三七皂甙等)；殘渣用4倍量去離子水常溫循環浸提3次，每次48小時，排出并合并提取液。經粗濾、精濾(精密沙棒吸濾)，再注入真空濃縮鍋中，加熱減壓濃縮至8波美度，排出，轉入萃取鍋中，再加4倍量正丁醇，于65℃條件下自動攪拌30分鐘后，靜置4小時，待混合液完全分層后，排出水溶液，廢棄含雜質的正丁醇液。水溶液先過Sephadex LH-20凝膠樹脂柱層析，用蒸餾水洗脫；洗脫液再過CM-Sephadex-C-25°離子交換樹脂柱層析，用蒸餾水洗脫，得粗三七素液。粗三七素液先注入氧化鋁柱濾去深色素，再放入萃取鍋中，加熱至80℃，加入4％活性炭，開啟自動攪拌器攪拌20分鐘，待色素吸附完全后，用精密濾棒吸濾，除去活性炭，得純三七素液。純三七素液傾入清洗干凈的真空濃縮鍋中，加熱減壓濃縮至20波美度，排出靜置24小時，結晶析出。再用濾布濾去廢液，晶體放入真空干燥器中，在40℃條件下抽干水份，即得含量達95％以上三七素成品。成品抽檢合格后，稱量，以塑袋密封包裝入庫。
實施例2將三七塊根洗凈，粉碎，過40目篩，放入提取罐中用5倍量80％以上乙醇循環浸提3次，每次24小時，排出、合并濾液另作用途(提取三七皂甙等)；殘渣用3倍量去離子水常溫循環浸提3次，每次24小時，排出并合并提取液。經粗濾、精濾(精密沙棒吸濾)，再注入真空濃縮鍋中，加熱減壓濃縮至8-10波美度，排出，轉入萃取鍋中，再加4倍量正丁醇，于60℃條件下自動攪拌30分鐘后，靜置4小時，待混合液完全分層后，排出水溶液，廢棄含雜質的正丁醇液。水溶液先過Sephadex LH-20凝膠樹脂柱層析，用蒸餾水洗脫；洗脫液再過CM-Sephadex-C-25°離子交換樹脂柱層析，用蒸餾水洗脫，得粗三七素液。粗三七素液先注入氧化鋁柱濾去深色素，再放入萃取鍋中，加熱至80℃，加入5％活性炭，開啟自動攪拌器攪拌20分鐘，待色素吸附完全后，用精密濾棒吸濾，除去活性炭，得純三七素液。純三七素液傾入清洗干凈的真空濃縮鍋中，加熱減壓濃縮至15～20波美度，排出靜置24小時，結晶析出。再用濾布濾去廢液，晶體放入真空干燥器中，在40℃條件下抽干水份，即得含量達95％以上三七素成品。成品抽檢合格后，稱量，以塑袋密封包裝入庫。
用以上實施例制得的三七素原料藥，可進一步制得單方或復方三七素注射劑，供靜脈注射；或制為單方或復方三七素片劑、三七素硬膠囊劑或軟膠囊劑供口服；或制為三七素散劑供外敷；或制為單方或復方三七素噴霧劑供外用；或制為單方或復方三七素止血貼供創面敷貼；或制為微纖三七素膠原，有極強的吸附與被創傷組織吸收溶解的功能，可供出血創面或手術創傷組織部位的緊急止血。
總之，用三七素原料藥可生產各種劑型藥品，他們具有劑量小、高療效、顯效快、易使用、便攜帶等特點，可廣泛用于各種內外出血癥、手術止血的治療，并具急救的特點。由于毒副作用極微，使用安全，具有較高經濟和社會效益。
以上實施利僅為了對本發明作進一步的說明，而本發明的范圍不受所舉實施例的局限。
權利要求
1.一種高效止血原料藥三七素的制備方法，其特征是依次包括以下步驟三七原料粉碎過40目或更細目篩→用75％以上濃度的醇提取→提取液另作用途，廢渣用水提取→過濾、濃縮→用正丁醇于40-70℃下萃取→正丁醇部份廢棄，水溶部份經一次或一次以上樹脂層析→從層析液中收集提取物。
2.如權利要求1所說的高效止血原料藥三七素的制備方法，其特征是第一次層析采用Sephadex LH-20凝膠樹脂，第二次層析采用CM-Sephadex-C-25°離子交換樹脂，從層析液中收集提取物的過程依次包括濃縮→脫色→結晶→過濾、干燥→成品，脫色分氧化鋁過濾和活性炭吸附兩次完成，干燥采用真空干燥。
3.如權利要求2所說的高效止血原料藥三七素的制備方法，其特征是(1)、粉碎過60目篩，(2)、醇提取用80％以上甲醇或乙醇，連續滲漉循環提取2-3次，每次24～48小時，合并提取液，(3)、水提取用去離子水于常溫條件下，連續滲漉循環提取2-4次，每次24～48小時，合并提取液，(4)、過濾先粗濾，再用精密濾棒真空吸濾，(5)、濃縮真空減壓濃縮至8～10波美度，(6)、正丁醇萃取將濃縮液注入已清洗好的萃取鍋中，加入3～5倍量正丁醇，在55-65℃條件下攪拌20-40分鐘，靜置3-5小時，待分層后，收集水溶液，廢棄含雜質的正丁醇液，(7)、層析分別將Sephadex LH-20凝膠樹脂和CM-Sephadex-C-25°離子交換樹脂裝入兩個層析柱中，預處理至中性水飽和狀，濾析時，先關閉柱底閥，緩緩注入水提濃縮液使分布均勻，吸附飽和后，再開啟柱底閥排出廢液，并用乙醇沖洗，吸附物(三七素)用蒸餾水反復洗脫、收集合并，(8)、脫色洗脫液過氧化鋁柱，脫去深色素，濾液加3～5％活性炭，在反應釜中加熱至75-85℃，攪拌15-25分鐘，脫去淺色素，精濾除去活性炭后，得純三七素水溶液，(9)、濃縮結晶純三七素水溶液減壓濃縮至15～20波美度后，排出靜置20小時以上，結晶析出，過濾干燥后即為成品三七素原料藥。
全文摘要
本發明是由中藥材三七制備三七素原料藥的方法。凝血酶類止血藥難以解決迅速止血有效急救的問題。本發明方法依次包括以下步驟:三七原料粉碎過4.0目或更細目篩→用75%以上濃度的醇提取→提取液另作用途,渣用水提取→過濾、濃縮→用正丁醇于40—70℃下萃取→正丁醇部份廢棄,水溶部份經一次或一次以上樹脂層析→從層析液中收集提取物。所得產品及其制劑能高效快速止血,且劑量極小給藥途徑便捷,易于在危重病情時起有效急救的作用。
文檔編號C07C229/00GK1267665SQ9911472
公開日2000年9月27日 申請日期1999年3月19日 優先權日1999年3月19日
發明者藍桂華, 藍鋒, 陳蓬 申請人:藍桂華