降低含細胞的生物組合物中化合物的批量設備和使用方法

專利名稱：降低含細胞的生物組合物中化合物的批量設備和使用方法
技術領域：
本申請涉及降低生物組合物中化合物的方法和設備。這些化合物的分子量為約100g/mol-約30000g/mol。
背景技術：
大量研究都集中在從血液制品中除去物質。該研究中大多數都導致白細胞降低。參見，例如M.N.Boomgaard等人的Transfusion34311(1994)、F.Bertolini等人的Vox Sang 6282(1992)和A.M.Joustra-Dijkhuis等人的Vox Sang6722(1994)。過濾血小板是用于降低血小板濃縮物中白細胞的最常見方法。參見，例如M.Bock等人的Transfusion 31333(1991)(Sepacell PL-5A，Asahi，Tokyo，Japan)、J.D.Sweeney等人的Transfusion 35131(1995)(Leukotrap PL，Miles Inc_Covina，CA)和M.van Marwijk等人的Transfusion3034(1990)(Cellselect，NPBI，Emmer-Compascuum，TheNetherlands；Immugard Ig-500，Terumo，Tokyo，Japan)。然而目前這些過濾機械不能除去分子量相對較低的化合物，包括例如補骨脂素、補骨脂素光化產物以及處理生物流體時常用的其它化合物。
已將吸附方法用于磷脂聚合物上分離選擇性血液組分。例如，已對具有不同電荷的幾種共聚物與血液組分的相互作用進行了評價，包括血小板粘著和蛋白質吸附。K.Ishihara等人的J.Biomed.Mat.Res.281347(1994)。但是沒有將這些聚合物設計用于吸附低分子量化合物。
各種透析裝置可以從血漿和全血中除去低分子量化合物。例如，透析可以成功地除去低分子量毒素和藥物化合物。因此，可以將透析用于，例如從血液制品中除去補骨脂素和補骨脂素光化產物。不幸的是，目前透析過程需要非常復雜和昂貴的設備。因此，將透析機械用于大量血液制品的去污染就不切實際。
以前已描述過使用聚苯乙烯二乙烯基苯、二氧化硅凝膠和丙烯酰酯聚合物吸附亞甲藍。例如，PCT公開號WO91/03933描述了自由吸附劑樹脂的批量研究(例如，Amberlite(Rohm and Haas(Frankfurt，Germany)和Bio Beads(Bio-Rad Laboratories(Munich，Germany))。但是，在暴露到血液制品中之后沒有非常仔細地將這些吸附劑樹脂除去，因此這些方法導致了轉輸樹脂粒的危險。
此外，也已公開了除去白細胞和病毒滅活劑(例如，補骨脂素、金絲桃素和例如亞甲藍、甲苯胺藍和結晶紫的染料)的設備和方法。具體地說，PCT公開號WO95/18665描述了包括鋪設的織物網的過濾器，該織物網含有機械穩定的聚合基質。該網本身含有形成具有間隙的基質的聯鎖織物纖維和在該間隙內分布的原纖維粒。但是，該設備使因子XI活性大大降低，這可能使處理過的產品不能適宜其預定的用途。
因此需要更簡單、更安全且更經濟的裝置，以降低含細胞的生物組合物中低分子量化合物的濃度，同時基本上保留了含細胞的處理過的生物組合物的生物活性。
發明描述本發明提供了降低含細胞的生物組合物中化合物濃度的設備。該設備包括含有被惰性基質所固定的顆粒的吸附介質，且為批量結構。典型地，在生物組合物中使用該設備所降低的化合物的分子量為約100g/mol-約30000g/mol。該生物組合物所含的細胞包括例如懸浮在生物介質如血漿或組織培養基中的細胞。該生物組合物在與這些設備接觸之后基本上保留了其生物活性。
例證化合物包括病原體滅活化合物、染料、硫醇、增塑劑和活化補體。所提供的設備包括被惰性基質固定的三維網絡吸附劑顆粒。該固定化降低了松散吸附劑顆粒漏入血液制品的危險性。而且，由惰性基質固定吸附劑顆粒簡化了減少與處理松散吸附劑顆粒相伴的問題的操作。固定吸附劑顆粒也可以提高吸附劑顆粒吸附含細胞的生物組合物中化合物的能力，且對細胞沒有機械破壞。
本發明提供了降低含細胞的生物組合物中生物反應調節物的濃度方法，其中該方法基本上保留了生物組合物的所需生物活性。該方法涉及用一種設備處理該生物組合物。
在一個實施方式中，該設備包括含大量吸附劑顆粒的惰性基質，其中吸附劑顆粒的直徑范圍在約100μm-約1500μm，并且其中將該設備用于批量加工。
在另一實施方式中，該生物反應調節物為活化補體。
在另一實施方式中，該設備的吸附劑顆粒為具有優良可濕性的聚芳香族吸附劑顆粒。
在另一實施方式中，該設備的吸附劑顆粒為來自合成源的活性炭顆粒。
在另一實施方式中，該設備的惰性基質為合成聚合物纖維，該合成聚合物纖維包括被具有低熔解溫度的鞘包圍的具有高熔解溫度的聚合物核心。
在另一實施方式中，該設備的惰性基質為顆粒網絡，該顆粒網絡包括聚乙烯顆粒。
在另一實施方式中，該生物組合物包括血小板。
在另一實施方式中，該生物組合物包括紅血球。
在另一實施方式中，該方法還降低生物組合物中補骨脂素衍生物或吖啶衍生物的濃度。
在另一實施方式中，該方法還降低生物組合物中染料或猝滅劑的濃度。
附圖簡述

圖1圖示了纖維的一個實施方式的透視圖，顯示了其內部核心和外部鞘，它們形成了固定吸附劑介質的纖維網絡。
圖2圖示了本發明固定吸附劑介質的一個實施方式的一部分。
圖3圖示了吸附劑珠固定在纖維中構成纖維化樹脂的固定吸附劑介質的一個實施方式的橫截面圖。
圖4圖示了吸附劑珠固定在固定吸附劑介質的纖維中并且熱封包圍纖維化樹脂樣品的固定吸附劑介質的一個實施方式的橫截面圖。
圖5為用Dowex_XUS-43493和Amberlite_XAD-16 HP松散吸附劑珠以及含Amberlite_XAD-16的固定吸附劑介質從血小板中除去氨基補骨脂素的吸附動力學的比較的示意圖。
圖6為用含Amberlite_XAD-16的固定吸附劑介質和具有兩種不同載荷的活性炭的固定吸附劑介質從血小板中除去氨基補骨脂素的吸附動力學的比較的示意圖。纖維化XAD-16數據由圓圈、實線表示；纖維化AQF-500-B數據由正方形、短劃線表示；纖維化AQF-375-B由三角形、長劃線表示。
圖7為用p(HEMA)-涂敷的和未經涂敷的Dowex_XUS-43493珠從血小板中除去氨基補骨脂素的吸附動力學的比較的示意圖。
圖8為用含甘油的溶液將Amberlite_XAD-16和Dowex_XUS-43493預處理對氨基補骨脂素的相對吸附能力的影響的比較的示意圖。
圖9為潤濕溶液對在100％血漿中Amberlite_XAD-16(下面)和Dowex_XUS-43493(上面)干燥吸附劑的4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素吸附能力的影響的比較示意圖，未在乙醇溶液中潤濕的樣品標為“No Tx”。吸附能力被報道為相對于最佳濕吸附劑能力的百分率。
圖10為使用在幾種不同溶液中潤濕過的Amberlite_XAD-16從血漿中經過3小時吸附氨基補骨脂素的比較示意圖。
圖11為從血漿中經過2小時吸附亞甲藍的動力學的比較示意圖。
圖12圖示了吖啶、吖啶橙、9-氨基吖啶和5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的化學結構。
圖13為繪制不同樹脂對腺嘌呤容量的數據(y-軸)和5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶容量的數據(X-軸)的示意圖。
圖14A和圖14B為用Dowex_XUS-43493和Purolite_MN-200以及Amberlite_XAD-16 HP除去5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的吸附動力學的比較的示意圖。
圖15為用Dowex_XUS-43493除去9-氨基吖啶和吖啶橙的吸附動力學的比較的示意圖。
圖16描述了固定吸附設備(IAD)的批量結構。
圖17為與Purolite MN-200相比較不同Ambersorb等溫吸附線的比較的示意圖。
圖18為經過連續或終止暴露到纖維化Pica G277 IAD(500g/m2)中24小時后在4℃下貯藏4星期的300mL PRBC單元的上層清液中的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和GSH的水平的比較的示意圖。
圖19為封閉材料對PRBC中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的吸附動力學的影響的示意圖。
圖20為含未經固定和經過固定的吸附劑顆粒Purolite MN-200的吸附劑設備的溶血百分率的比較的示意圖。
圖21為未經固定和經過固定的吸附劑顆粒Pica G-277活性炭的溶血百分率的比較的示意圖。
圖22為從血小板濃縮物中除去4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的動力學的示意圖。
圖23為纖維基質IAD(AQF，正方形)和顆粒基質IAD(Porex，三角形)的補骨脂素吸附動力學的示意圖。
實施本發明的最佳方式本發明提供了降低含細胞的生物組合物中化合物濃度的設備。該設備包括由惰性基質固定的顆粒組成的吸附介質并且為批量結構。典型地，在生物組合物中使用該設備所降低的化合物具有約100g/mol-約30000g/mol的分子量。生物組合物所含的細胞包括例如懸浮在生物介質如血漿或組織培養基中的細胞。該生物組合物在與這些設備接觸之后基本上保留了其生物活性。
例證化合物包括病原體滅活化合物、染料、硫醇、增塑劑和活化補體。所提供的設備包括被惰性基質固定的吸附劑顆粒的三維網絡。該固定降低了松散吸附劑顆粒漏入血液制品的危險性。而且，由惰性基質固定吸附劑顆粒簡化了減少與處理松散吸附劑顆粒相伴的問題的操作。固定吸附劑顆粒也可以提高吸附劑顆粒吸附含細胞的生物組合物中化合物的能力，且對細胞沒有機械破壞。
定義術語“吖啶衍生物”是指含三環結構吖啶(二苯并[b，e]吡啶；10-氮雜蒽)的化合物。這些化合物對核酸具有親和力，并且能通過插入非共價地粘附到核酸上。術語“氨基吖啶”是指這些吖啶化合物具有一個或多個含氮官能團。氨基吖啶的例子包括9-氨基吖啶和吖啶橙(圖12所示)。
術語“吸附劑顆粒”廣義上是指任意天然或合成的顆粒物，它能與液體中的分子相互作用，因此使該分子從液體中被除去。天然存在的吸附劑的例子包括但不限于活性炭、二氧化硅、硅藻土和纖維素。合成吸附劑的例子包括但不限于聚苯乙烯、聚丙烯酸和含碳吸附劑。吸附劑顆粒通常為多孔，通常具有高表面積，并且可以用各種可以影響該吸附劑與分子如何相互作用的官能團(例如離子的、疏水的、酸性的、堿性的)改性。
術語“芳香族”、“芳香族化合物”等廣義上是指具有離域電子的原子環的化合物。該單環化合物苯(C6H6)為常見芳香族化合物。但是，在一個以上的相鄰環(例如，萘(2個環)和蒽(3個環))上能夠發生電子離域。不同類型的芳香族化合物包括，但不限于，芳族鹵化物(芳基鹵)、芳雜環化合物、芳族烴(芳烴)和芳族硝基化合物(芳基硝基化合物)。
術語“生物相容的包被”廣義上是指用親水聚合物覆蓋表面(例如聚苯乙烯珠表面)，當該親水聚合物與血液制品接觸時不會導致有害、有毒或免疫反應，并且通過降低細胞粘附力、降低蛋白質粘附力或提高細胞功能賦予該表面更大的生物相容性。適宜的包被是生物相容的，即使它們對與其接觸的生物材料具有微弱影響(如果有的話)。“微弱”影響意思是與對照相比看不出大的生物學差異。在優選實施方式中，生物相容的包被提高了聚合結構的表面血相容性。例如，聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(pHEMA)經常被用于醫療設備(例如血液過濾器)的包被。
術語“生物相容的容器(housing)”廣義上是指適宜裝生物物料如含血小板或紅血球的組合物的容器、袋、管、接受器等。適宜的容器是生物相容的，即使它們對包含其中的生物材料有微弱影響(如果有的話)。“微弱”影響意思是與本文中所述的對照相比在血液制品功能中對紅血球、血小板和血漿看不出大的差異。因此，血液制品在輸血到受血者之前可以在生物相容的容器中貯藏。在優選實施方式中，生物相容的容器為血袋，包括血小板貯藏容器或紅血球貯藏容器。
術語“與生物組合物相容的容器”是指適宜裝含細胞的生物組合物的容器，該組合物例如有細胞培養組合物和含血小板或紅血球的組合物。這些容器對含細胞的生物組合物具有微弱的影響。這些容器的例子包括，但不限于，細胞培養板、細胞培養瓶和血袋。
術語“生物學液體”包括細胞培養基、貯藏細胞的合成培養基、人體或非人體的全血、血漿、血小板、紅血球、白血球、血清、淋巴、唾液、乳、尿、或來自或含任意上述單個或混合物的產品，有或者沒有化學添加劑溶液。優選地，該流體為血液或含有或不含化學添加劑溶液的血液制品，更優選血漿、血小板和紅血球，最優選分離性輸血血漿、紅血球和血小板。
術語“血袋”是指一類血液制品容器。
術語“血液制品”是指通過體循環系統的液體和/或相關細胞成份等(例如紅血球、白血球、血小板等)；血液制品包括，但不限于，血液細胞、血小板混合物、血清和血漿。術語“血小板混合物”是指一類血液制品，其中該細胞成份主要或僅有血小板。血小板濃縮物(PC)為一類血小板混合物，其中這些血小板伴隨有比正常血漿部分更小的部分。在血液制品中，合成培養基可以彌補正常血漿所占的體積；例如，血小板濃縮物可以限定血小板懸浮在35％血漿/65％合成培養基中。經常，該合成培養基含有磷酸鹽。
術語“血液分離裝置”廣義上是指能夠將血液分離成血液制品(例如，血小板和血漿)的設備、機械等。分離性輸血系統是一類血液分離裝置。分離性輸血系統通常包括血液分離設備、復雜管道和過濾器網絡、收集袋、抗凝劑和控制所有組分的電腦化裝置。
術語“經過交聯的”廣義上是指彼此連接形成兩維或三維網絡的線性分子。例如，二乙烯基苯(DVB)用作形成苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的交聯劑。該術語還包含“超交聯”，其中經過超交聯的網絡是將或者溶液中或者為溶脹狀態的線性聚苯乙烯鏈與雙官能試劑交聯制得的。可以將各種雙官能試劑用于交聯(例如，參見Davankov和Tsyurupa，Reactive Polymers 1324-42(1990)；Tsyurupa等人，ReactivePolymers 2569-78(1995))。
術語“環化合物”是指具有一個(即，單環化合物)或一個以上(即，多環化合物)環原子的化合物。該術語不限于含特定數量原子的環的化合物。盡管大多數環化合物所含的環為5或6個原子，但是其它數量原子(例如3或4個原子)的環也被本發明所認同。盡管環中原子主要是碳原子，但是對這些原子的一致性沒有限制。一般說來，多環化合物的環彼此相鄰，但是，術語“多環”化合物包括那些含多個彼此不相鄰的環的化合物。
術語“染料”廣義上是指賦予色彩的化合物。染料通常含有連接到一個或多個環化合物上的發色團和助色團的基團。色彩是由于發色團，然而染色親和力是由于助色團。染料已被分成許多類，包括吖嗪染料(例如，中性紅、藏紅和偶氮胭脂紅B)；偶氮染料；偶氮胭脂紅染料；脫苯甲烷染料；熒光黃染料；酮亞胺染料；品紅染料；三苯基甲烷染料；酞菁染料；以及金絲桃素。應認為可以將本發明的方法和設備經實踐與任意為環化合物的染料結合。
術語“纖維化樹脂”通常是指固定的吸附劑材料，包括例如，包埋在纖維網絡中或附著在纖維網絡上的樹脂。在一個實施方式中，該纖維網絡由聚合物纖維組成。在另一實施方式中，這些纖維是由被相對較低熔解溫度的聚合物鞘(例如，尼龍或改性PET)包圍的較高熔解溫度的聚合物核心(例如，聚對苯二甲酸乙二酯[PET])組成的。纖維化樹脂可以通過在不致使樹脂的吸附能力產生很大程度的負面影響的條件(溫度足夠融化鞘但不融化核心)下加熱該纖維網絡制成。在該樹脂含有珠的地方，進行加熱以便吸附劑珠附著在外部聚合物鞘上產生“纖維化珠”。通過生產每定義面積含已知數量吸附劑珠的纖維化樹脂，可以通過切割定義面積的纖維化樹脂，而不是稱重吸附劑珠來獲得用于除去環化合物(例如，補骨脂素，特別是氨基補骨脂素)和其它產品的纖維化樹脂樣品。
術語“過濾器”廣義上是指能夠使混合物中某些組分通過同時滯留其它組分的設備、材料等。例如，過濾器可以包括孔徑允許血液制品(例如紅血球組合物)通過同時保留例如樹脂粒的其它組分的網狀物。術語“過濾器”并不限于保留某些組分的裝置。
術語“雜環化合物”廣義上是指其中一個或幾個環含一種以上原子的環化合物。通常，碳原子為主要原子，同時其它原子包括例如，氮、硫和氧原子。雜環化合物的例子包括呋喃、吡咯、噻吩和吡啶。
術語“高溫活化過程”是指典型地由于原料熱解和/或氧化致使表面積、孔隙率和經過處理的材料的表面化學發生改變的高溫過程。
術語“固定的吸附劑設備(IAD)”是指包埋在惰性基質中或附著在惰性基質上的固定吸附劑材料。在惰性基質為纖維網絡的地方，術語IAD可以與術語纖維化樹脂交換地使用。例如，纖維化Ambersorb 572和Ambersorb IAD(AQF)指的是相同材料。
術語“惰性基質”是指任意合成或天然存在的纖維或聚合材料，可以將它們用于固定吸附劑顆粒，而基本上沒有影響血液制品的所需生物活性。盡管該基質對吸附或除去過程幾乎沒有貢獻，但是它可能對降低較小有機化合物的濃度有利。此外，該惰性基質可以與細胞或蛋白質組分相互作用，使得細胞除去(例如白細胞排除)或除去蛋白質或其它分子。
術語“分離”是指從含一種以上組分的混合物中分離出一種物質。例如，可以從全血中分離出血小板。所分離的產物不必是該產物從其它組分中完全分離。
術語“大孔的”通常意思是孔徑大于約500_。術語微孔是指孔徑小于約20_。術語中孔是指孔徑大于約20_小于約500_。
將術語“大孔”用于描述大量孔徑大于約500_的孔結構。
術語“大網絡”是相對術語，意思是具有高度物理多孔性(即，存在大量孔)結構，多孔吸附劑結構既有大孔又有微孔。
術語“網封閉物”、“網袋”等是指加工成含多個開口的封閉物、袋、包或類似物。例如，本發明使用一種袋，它裝有固定吸附劑顆粒，其孔尺寸使血液制品能接觸固定的吸附劑顆粒，但將固定的吸附劑顆粒保留在袋中。
術語“隔離物”是指可以將一個整體分離或分開成區段或部分的任意類型的設備或元件。例如，本發明試圖使用一種隔離物將適宜含血液制品的血袋分成兩個部分。在處理之前和處理過程中血液制品占該袋的一部分，同時吸附劑樹脂占另一部分。在一個實施方式中，在血液制品處理之后，將該隔離物移去(例如將該隔離物的完整性改變)，因此使得處理過的血液制品與吸附劑樹脂接觸。該隔離物可以位于袋的內部，也可以在其外部。當使用術語“隔離物”時，術語“移去”意思是血袋兩個部分的分開不再存在，不必是該隔離物不再以某種方式與袋相連。
術語“光化產物”是指補骨脂素或其它染料(例如亞甲藍、酞菁染料)經過暴露在紫外線輻射的光化學反應所至的產物。
術語“聚芳香族化合物”是指在主鏈中含芳香基的聚合物，例如聚對苯二甲酸乙二酯，或作為側基的聚合物，如聚苯乙烯，或既在主鏈中含芳香基又作為側基的聚合物。
術語“聚苯乙烯網絡”廣義上是指含苯乙烯(C6H5CH=CH2)單體的聚合物；這些聚合物可以是線性，由單個共價烷鏈與苯基取代基組成，或經交聯，通常與間-或對-亞苯基殘基或其它雙官能或超交聯結構交聯，從而形成二維聚合物主鏈或三維網絡。
術語“補骨脂素移去裝置”是指可以從例如血液制品中除去大于約80％補骨脂素的一種物質或設備；優選地，大于約90％；更優選地大于約99％。補骨脂素移去裝置還可以移去血液制品中的其它組分，例如補骨脂素光化產物。
短語“降低濃度”是指從生物組合物中除去一部分低分子量化合物。同時濃度的降低優選大于約70％，更優選約90％，最優選約99％。
短語“除去幾乎所有溶液中自由的所述化合物部分(例如補骨脂素、補骨脂素衍生物、異補骨脂素、吖啶、吖啶衍生物、染料、增塑劑或活化補體)”優選地是指除去大于約80％的溶液中自由的該化合物，更優選除去大于約85％，再優選大于約90％，最優選除去大于約99％。
術語“樹脂”是指一種固體載體(例如顆粒或珠等)，它能夠與溶液或液體(例如血液制品)中包括補骨脂素的各種小有機化合物相互作用并吸附，因此降低了溶液中這些成分的濃度。不將該除去過程限制在任意特定的機理中。例如，可以通過疏水或離子相互作用除去補骨脂素。術語“吸附劑樹脂”廣義上是指天然有機物和合成物及其混合物。
術語“攪拌方式”是指可以混合生物組合物的任意方法。攪拌方式的例子包括，但不限于，以下機械攪拌器往復、軌道、三維旋轉裝置和旋轉裝置型攪拌器。
術語“震動器設備”是指能夠充分混合血液制品樣血小板濃縮物的任意類型的設備。該設備可以具有使混合限制在特定階段的定時機構。
術語“燒結介質”是指通過施加熱和壓力形成多孔樹脂的結構，包括例如顆粒熱塑性聚合物。多孔樹脂可以通過以下制成將熔點相對低的聚合物顆粒混合，將它們加熱至該塑性顆粒部分熔融，但仍然以流體途徑滲透到多孔樹脂中。燒結吸附劑介質類似地可以通過將碳或其它高或不熔融的吸附劑顆粒與低熔點的粉混合并加熱制成。生產多孔塑性材料的方法描述在US3975481、4110391、4460530、4880843和4925880中，引入本文作為參考。該方法使得低熔點顆粒熔融形成多孔固體結構。通過在燒結過程中將聚合物顆粒放置在成型工具中可以將該燒結介質形成各種形狀。在進行燒結過程之前通過吸附劑顆粒與熱塑性聚合物顆粒混合可以將吸附劑顆粒加入燒結介質中。
術語“穩定劑”是指在干燥條件下能夠保留某些吸附劑(例如Amberlite)的吸附能力的化合物或組合物。一般來說，可接受的穩定劑應能溶于水和乙醇(或其它潤濕劑)，相對于水和乙醇不揮發，并能安全地以少量輸送。穩定劑的例子包括，但不限于，甘油和低分子量PEG。“潤溫劑”與“穩定劑”的區別在于前者被認為能再次打開未經超交聯的樹脂(例如Amberlite XAD-4、Amberlite XAD-16)的吸附劑孔。潤濕劑一般不能防止干燥條件下孔塌陷，然而穩定劑能夠。潤濕和潤濕劑的一般討論在Pall等人的US5501795中有陳述，這里引入作為參考。
短語“基本上保留了生物組合物的所需生物活性”是指基本上保留了生物組合物的性能(例如細胞完整性)。在一些實施方式中，細胞完整性反應了治療調整中組合物的潛在性能。例如，在涉及紅血球的地方，如果ATP水平、細胞外鉀漏出、溶血百分率基本上保留在通過本文所述方法處理的紅血球中，那么體內活性未被破壞或沒有大的降低。例如，處理過的紅血球的ATP水平的變化應小于約10％。處理過的紅血球在貯藏之后的溶血水平應小于約1％，優選小于約0.8％。處理過的紅血球的細胞外鉀漏出的變化應小于約15％。在涉及血小板的地方，如果例如血小板收率、pH、集聚反應、形狀變化、GMP-140、形態或低滲休克反應基本上保留在通過本文所述方法處理的血小板中，那么體內活性未被破壞或沒有大的降低。例如，貯藏之后生物組合物中的血小板損失優選小于15％；在貯藏5天之后更優選為15％；甚至在貯藏5天之后更優選為10％。還應認為短語“基本上保留與所述血液制品相關的每種性能”也可以包括文獻中所述本領域技術人員可接受的值，該文獻包括例如Klein H.G_ed.Standards for Blood Banks andTransfusion Services，17thEd_Bethesda，MDAmericanAssociation of Blood Banks，1996，引入本文作為參考。
術語“其同等物”當其用于本發明的設備時是指功能與保留生物組合物的生物活性相當的設備。例如，含吸附劑顆粒的“同等”設備或基質是同樣地保留了細胞活力或適宜凝血因子水平的一種。
術語“低分子量化合物”是指分子量范圍在約100g/mol-約30000g/mol的有機或生物分子。低分子量化合物包括，但不限于，以下化合物小有機化合物如補骨脂素、吖啶或染料；猝滅劑，如谷胱甘肽；塑性可提取物，例如增塑劑；生物調節物，如活化補體，具有約100g/mol-約30000g/mol的分子量；和聚胺衍生物。
術語“適宜輸注的生物組合物”是指生物組合物保留了其必要生物性能(例如血小板形態)，同時含有足夠低水平的任意不需要的化合物(例如失活化合物、反應調節物)，以便輸注提供想要的功能，但無有害副作用。
術語“對照”當其用于例如“相對對照”的短語中時是指進行不同條件的相對效果研究的試驗。例如，在生物組合物用一種設備進行處理的地方，“未經過處理的對照”應是指在相同條件下經過處理的生物組合物，只是沒有用該設備處理，或者用另一形式的設備進行處理的(例如固定的顆粒與未固定的顆粒)。
術語“4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素”還稱作“S-59”。
術語“N-(9-吖啶基)-β-丙氨酸”還稱作“5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶”。它還被稱作“S-300”。
術語“XUS-43493”還被稱作“Optipore 493”。
吸附劑顆粒為了降低含細胞的生物組合物中化合物的濃度同時基本上保留生物組合物的所需生物活性，提供用于一種設備中的吸附劑顆粒。典型地，在生物組合物中所降低的這些化合物具有約100g/mol-約30000g/mol的分子量。
吸附劑顆粒可以是使其加入到惰性基質中的任意規則或不規則形狀，但是優選為大致球形。這些顆粒的直徑大于約100μm且小于約1500μm；優選地，這些顆粒的直徑在約200μm-約1300μm之間；更優選地，這些顆粒的直徑在約300μm-約900μm之間。
表面積大是這些顆粒的特征。優選地，這些顆粒具有約750m2/g-約3000m2/g的表面積。更優選地，這些顆粒具有約1000m2/g-約3000m2/g的表面積。
適宜用于本發明設備的吸附劑顆粒可以是任意適宜的物料，其限制是該物料對與之接觸的生物組合物的生物活性基本上沒有副作用。該吸附劑顆粒可以是，例如，由例如活性炭、疏水樹脂或離子交換樹脂的材料制成的。
在一個優選實施方式中，這些吸附劑樹脂是由天然或合成源得到的活性炭。優選地這些活性炭得自合成源。活性炭的非限制性例子包括可從PICA USA Inc.(Columbus，OH)獲得的Picatiff Medicinal_，可從Norit Americas，Inc.(Atlanta，GA)獲得的Norit_ROX 0.8，可從Rohm & Haas(Philadelphia，PA)獲得的Ambersorb_572和可從PICA(Columbus，OH)獲得的G-277_。
在另一優選實施方式中，這些顆粒可以是疏水樹脂。疏水樹脂的非限制性例子包括以下聚芳香族吸附劑Amberlite_吸附劑(例如，Amberlite_XAD-2，XAD-4和XAD-16)，可從Rohm & Haas(Philadelphia，PA)獲得；可從Toso Haas(TosoHass，Montgomeryville，PA)獲得的Amberchrom_吸附劑；Diaion_//Sepabeads_吸附劑(例如Diaion_HP20)，可從MitsubishiChemical America，Inc.(White Plains，NY)獲得；Hypersol-Macronet_吸附劑樹脂(例如Hypersol-Macronet_吸附劑樹脂MN-200，MN-150和MN-400)，可從Purolite(Bala Cynwyd，PA)獲得；和Dowex_吸附劑(例如Dowex_XUS-40323、XUS-43493和XUS-40285)，可從Dow Chemical Company(Midland，MI)獲得。
優選的顆粒是含超交聯聚苯乙烯網絡的聚芳香族吸附劑的疏水樹脂，例如Dowex_XUS-43493(已知商業上為Optipore_L493或V493)和Purolite MN-200。
如Dowex_XUS-43493和Purolite MN-200的超交聯聚苯乙烯網絡為非離子大孔和大網絡樹脂。非離子大網絡和大孔Dowex_XUS-43493對包括例如4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的補骨脂素具有高的親和力，并且它具有優良的可濕性。短語“優良的可濕性”意思是干(例如基本無水)吸附劑在為了有效地降低血液制品中小有機化合物的濃度而與血液制品接觸之前不必用潤濕劑(例如乙醇)潤濕。
例如Dowex_XUS-43493和Purolite MN-200的超交聯聚苯乙烯網絡優選其形狀為直徑范圍在約200μm-約1300μm的球形顆粒。包括例如Dowex_XUS-43493的吸附劑顆粒優選具有特別大的內表面積和相對小的孔(例如平均直徑46_)。顆粒的內表面積可以在約300-約1100m2/g；優選地約900-約1100m2/g；最優選地約1100m2/g。顆粒的大部分孔可以大于25_且小于800_；優選約25_-約150_；最優選約25_-約50_。當不打算將本發明限制在進行小有機化合物的降低的機理中時，疏水相互作用被認為是吸附的主要機理。其孔性能通過使小分子進入相對大分子(例如大蛋白質)和細胞的更大比例的表面積從而選擇性地授予吸附過程。Purolite_具有許多與Dowex_XUS-43493相似的特性，例如對補骨脂素高的親和力和優良的可濕性，并且它也是最好的吸附劑顆粒。
可以按照其合成機理和物理和功能特性將聚苯乙烯分成ⅰ)傳統網絡和ⅱ)超交聯網絡。優選的吸附劑具有大的表面積，干燥時不塌陷的孔，用于包括紅血球或血小板的生物組合物時不需要潤濕，并具有特別少的小顆粒和外來顆粒(例如灰塵、纖維、非吸附劑顆粒和未經確認的顆粒)。此外，優選的吸附劑具有少量可提取的殘余單體、交聯劑和其它有機可提取物。
該傳統網絡主要是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，其中二乙烯基苯(DVB)用作交聯劑(即，將線性聚苯乙烯鏈連接在一起的試劑)。這些聚合網絡包括“凝膠型”聚合物。該凝膠型聚合物為通過單體共聚合獲得的均勻、無孔苯乙烯-DVB共聚物。大孔吸附劑代表第二類傳統網絡。它們是通過在沉淀生成的聚苯乙烯鏈的稀釋劑存在下共聚合單體獲得的。通過該步驟形成的聚苯乙烯網絡具有相對大的內表面積(每克聚合物高達幾百平方米)；Amberlite_XAD-4是由該步驟生產的。
與上述的傳統網絡相比，本發明的優選吸附劑(例如Dowex_XUS-43493)為超交聯網絡。這些網絡是通過將線性聚苯乙烯鏈或者以溶液或者以溶脹狀態與雙官能試劑交聯制得的；優選的雙官能試劑產生構象約束的交聯橋，據信這樣防止了當該吸附劑處于基本無水(即“干燥”)狀態時孔塌陷。
超交聯網絡據信具有與傳統網絡相區別的三個主要特性。首先，由于這些橋使聚苯乙烯鏈保持分離，因此聚合物鏈的密度低。結果，吸附劑通常具有相對大的孔表面積和孔徑。其次，這些網絡能夠膨脹，即，當聚合物相接觸有機分子時其體積增加。最后，該超交聯聚合物處于干燥狀態時是“直”的；即，干燥狀態網絡的剛性阻止了鏈與鏈的吸引。但是，當吸附劑被潤濕時這些鏈松弛，這增加了網絡在液體介質中膨脹的能力。Davankov和Tsyurupa，Reactive Polymers1327-42(1990)；Tsyurupa等人Reactive Polymers 2569-78(1995)，本文引入作為參考。
已成功地利用幾種交聯劑生產聚苯乙烯鏈之間的橋，包括二氯代對二甲苯(XDC)、一氯二甲醚(MCDE)、1，4-二-氯甲基聯苯(CMDP)、4，4′-二-(氯甲基)聯苯(CMB)、二甲基甲縮醛(DMF)、p，p′-二-氯甲基-1，4-二苯基丁烷(DPB)和三-(氯甲基)-均三苯(CMM)。通過這些交聯劑之一與苯乙烯苯環通過弗瑞德-克來福特反應來反應在聚苯乙烯鏈之間形成這些橋。因此，所得橋連接在兩個不同聚苯乙烯鏈上出現的苯乙烯苯酚環上。參見例如US3729457，這里引入作為參考。
因為這些橋通常消除了對“潤濕”劑的需要，因此這些橋是特別重要的。即，這些橋防止了當吸附劑處于基本上無水(即“干”)狀態時孔塌陷，因此在吸附劑與血液制品接觸之前不必用潤濕劑再次打開。為了防止孔塌陷，應形成構象約束的橋。一些雙官能試劑如DPB不導致一般限制的構象；例如，DPB含有對構象重排敏感的四個連續亞甲基單元。因此，DPB不是用于本發明的優選雙官能試劑。
上述吸附劑顆粒的一些與結構有關的特性列于表A中。
表A
加工吸附劑顆粒可以進一步對這些吸附劑顆粒加工以除去微細顆粒、鹽、潛在可提取物和內毒素。這些可提取組分的除去典型地是通過用有機溶劑、蒸汽或超臨界流體處理實現的。優選地這些顆粒經過滅菌。
目前幾個公司銷售“凈化”(即加工過的)型的可商購獲得的吸附劑顆粒。除了對這些吸附劑顆粒(例如樹脂)進行加工之外，這些公司試驗這些吸附劑，并且最終吸附劑保證無菌(USP XXI)、無熱原(LAL)并且無可檢測的提取物(DVB和總有機物)。
熱加工(例如蒸汽)是加工吸附劑顆粒的一種有效方法。F.Rodriguez，Principles Of Polymer Systems，(HemispherePublishing Corp.)，pp.449-53(3rd.Ed_1989)。Supelco公司(Bellefonte，PA)使用一種無溶劑、熱專有過程凈化Dowex_XUS-43493和Amberlite吸附劑。使用蒸汽的主要好處在于沒有向吸附劑中添加任何潛在的可提取物。但是，一個大的缺陷是該過程能夠從樹脂珠的孔中奪走水分；一些吸附劑的有效性能需要這些珠在接觸血液制品之前被再次潤濕。
凈化/加工過的吸附劑的一個優點是特別低水平的顆粒的直徑小于30μm。對Supelco加工的吸附劑(Dowex_XUS-43493和Amberlite_XAD-16)的初步試驗是測定顆粒數。這些試驗的結果顯示出沒有外來顆粒(例如灰塵、纖維、非吸附劑顆粒和未經確認的顆粒)并且基本上沒有微細顆粒(＜30μm)。
將潤濕劑和穩定劑與吸附劑樹脂一起使用可以使用一些方法防止顆粒干燥和吸附能力的喪失，例如Amberlite_在某些條件(例如干燥)下喪失一些吸附能力。
在一種方法中，顆粒、材料或設備可以在密閉且不能變干的潤濕狀態下加工。該方法伴隨有幾個重要缺陷。由于超過期限材料中可提取物的水平可能增加，因此這些產品的保存期限可能縮短。由于潤濕聚合物典型地未經過γ-輻照，因此滅菌可能被限制在蒸汽過程。加工要求組件保持濕潤狀態的設備通常比加工干燥設備更困難；例如，如果設備組裝和最終滅菌之間時間拖延太長，可能得考慮生物負荷和內毒素。
防止吸附能力喪失的第二種方法是使用經過干燥沒有副作用的吸附劑。如上所述，具有高度交聯孔結構的大網絡吸附劑(例如，Dowex_XUS-43493和Purolite_MN-200)通常不需要潤濕劑，這是因為該交聯阻止了孔塌陷。不象Amberlite_XAD-16，這些大網絡吸附劑當其被干燥時保留了非常高比例的起始活性。
在第三種方法中，在非揮發性潤濕劑存在下通過使Amberlite_XAD-16和所涉及的吸附劑(例如，Amberlite_XAD-4)成水合物可以防止因干燥的吸附能力的喪失。例如，當使用Amberlite_XAD-16作為吸附劑時，在使用之前在操作、滅菌和貯藏過程中該吸附劑珠可以部分地干燥。當這些吸附劑的水分含量低于臨界水平時，發生吸附能力的快速喪失(可能由于孔“塌陷”)；因此，為了達到最佳效果，在使用前這些孔不得不用潤濕劑“再打開”。
當某些吸附劑樹脂暴露在干燥條件下時，穩定劑對保持吸附能力在其最大值附近是有效的。據信使用穩定劑防止了吸附劑孔塌陷。
可接受的穩定劑應是可溶于水和乙醇，相對乙醇和水不揮發，且以少量轉輸安全。甘油和低分子量聚乙二醇(例如PEG-200和PEG-400)是具有這些特性的穩定劑的例子。甘油具有正的血相容性歷史。在紅血球制品的冷凍貯藏中經常將其添加到血液中作為防凍劑。參見例如Chaplin等人Transfusion 26341-45(1986)；Valeri等人Am.J.Vet.Res.42(9)1590-94(1981)。將含高達1％甘油的溶液按常規轉輸，甘油溶液可以商購獲得(例如Glyerolite 57 Solution，FenwalLaboratories，Deerfield，IL)。象Amberlite_XAD-16的吸附劑珠可以在乙醇和甘油中經過穩定。
通常被用作藥物基料的低分子量聚乙二醇也可被用作穩定劑。PEG為化學通式H(OCH2CH2)nOH的液態和固態聚合物，其中n大于或等于4。PEG制品通常接著相應其平均分子量的數量；例如，PEG-200的分子量為200，分子量范圍為190-210。PEG可以許多制品(例如Carbowax、Poly-G和Solbase)商購獲得。
用于顆粒固定的惰性基質通過惰性基質固定吸附劑顆粒。該惰性基質可以由合成或天然聚合物制備。例如，該惰性基質可以是合成或天然聚合物纖維，例如纖維網絡。該惰性基質可以為燒結聚合物。該惰性基質與該設備的其它組件優選為可生物相容的，并且基本上不會因接觸對物料的生物活性有副作用。
最優選地，這些合成纖維為聚酯纖維(Air QualityFiltration(AQF)，Hoechst Celanese處(Charlotte，N.C.))。合成纖維的其它優選例子是聚乙烯或聚酰胺纖維。其它例證合成纖維包括聚烯烴、聚乙烯醇和聚砜纖維。
在一個優選實施方式中，該合成聚合物纖維包括被具有低熔解溫度的鞘包圍的具有高熔點的第一個聚合物核心。該聚合物核心可以是聚酯(聚對苯二甲酸乙二酯)。該鞘可以是尼龍或改性聚酯。纖維可從Unitika(Osaka，Japan)和Hoechst Trevira GmbH & Co.(Augsberg，Germany)商購獲得。
例證的天然聚合物纖維包括得自不同來源的纖維素纖維，這些來源例如有黃麻、kozu、牛皮紙和馬尼拉麻。已將合成或天然聚合物纖維的網絡用于制備US4559145和5639376中所述的過濾器，本文引入作為參考。
適宜構造燒結顆粒的合成聚合物為高密度聚乙烯、超高分子量聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚四氟乙烯、尼龍6。更優選地該燒結顆粒為聚烯烴，如聚乙烯。
如上所述的聚合纖維可以是沒有粘附吸附劑顆粒的吸附劑樹脂。可以將這些纖維形成纖維網絡或可以將其固定在更少吸附劑纖維的纖維網絡上。本發明包含這些纖維；這些纖維優選含有大、多孔、吸附性的表面積或易于降低低分子量化合物濃度的其它吸附性工具。
顆粒的固定在一個實施方式中，吸附劑顆粒被惰性基質固定，從而制得用于降低物料中小有機化合物濃度的吸附介質。該惰性基質可以是含合成或天然纖維網絡和固定其中的吸附劑顆粒的三維網絡。
優選地，該吸附介質含有具有高度多孔結構和非常大的內表面積的小孔吸附劑顆粒，如上所述，被該惰性基質所固定。優選地，當將生物材料與吸附介質接觸時，吸附介質對材料的生物活性或其它性能基本上沒有副作用。
將吸附劑珠固定在纖維網絡上構成空氣過濾器的技術已在US5486410和US5605746中有描述，引入本文作為參考。如圖1所述，纖維網絡的聚合物纖維600由具有相對低熔解溫度的聚合物鞘604(例如，尼龍)包圍的具有較高熔點的聚合物核心602(例如，聚對苯二甲酸乙二酯(PET))組成。參見Heagle等人的US5190657，本文引入作為參考。纖維化樹脂是通過在纖維網絡中首先均勻分布吸附劑珠制成的。接下來，將該網絡快速加熱(例如，180℃×1min.)使纖維600的聚合物鞘熔融并粘附在吸附劑珠606和其它纖維上，從而形成交聯的纖維網絡，如圖2所示。如圖3和圖4所述(不按比例)，一般來說，該纖維網絡含有三層兩個用纖維600稠密地包裹著的外層607和一個含吸附劑珠606和較少纖維600的不太稠密的內層609。在一優選實施方式中，纖維化樹脂的邊緣可以用聚氨酯或其它聚合物密封。或者，如圖3和圖4所述，可以在所得纖維化樹脂中以預定間隔制備熱封件608；例如，可以在纖維化樹脂中以正方形圖案制備熱封件。之后，可以通過這些熱封件將該纖維化樹脂切割，從而形成含所需吸附劑珠質量(例如，優選小于5.0g并且更優選小于3.0g)并且大小適宜放置在血液制品容器內的樹脂樣品。這些熱封件用于防止切割的纖維化樹脂被磨損并且有利于固定吸附劑珠。但是，為了實踐本發明不需要使用這些熱封件。在一選擇性實施方式中，如圖4所述，沒有將吸附劑珠固定在這些纖維本身上，但是仍然固定在纖維的較稠密外層607之間并帶有熱封件608；該實施方式也可以通過這些熱封件切割之后使纖維化介質樣品含一定量的吸附劑。
本發明也嘗試使用粘附劑(例如，粘合劑)將吸附劑樹脂固定在纖維上。而且，盡管優選將吸附劑珠化學地粘著到纖維網絡上，但是也可以將這些珠物理地限制在纖維網絡中；這可以通過例如用足夠的纖維包圍這些珠以便使這些珠處于適當位置來實現。
也嘗試了可以將這些吸附劑顆粒固定在纖維網絡中的其它方法。可以使用干鋪法固定這些顆粒，如US5605746和5486410(AQF專利)中所述，本文將其引入作為參考。可以使用濕鋪法固定這些顆粒，如US4559145和4309247中所述，本文將其引入作為參考。可以使用熔融吹制法固定這些顆粒，如US5616254中所述，本文將其引入作為參考。在使用濕鋪法由天然聚合物纖維構建基質時，該惰性基質優選包括結合劑以將吸附劑珠結合到纖維上。結合劑的非限制性例子包括蜜胺、聚胺和聚酰胺。該基質典型地含1％或更少的這些結合劑。
在用吸附劑顆粒經燒結的合成聚合物顆粒構建惰性基質時，吸附劑顆粒比基質具有較高的熔解溫度是很重要的。
在一優選實施方式中，將吸附劑顆粒固定在通過生物組分纖維網絡的熱粘合形成的纖維基質中。另一實施方式涉及將吸附劑顆粒固定在非生物組分纖維中并使用強度樹脂系統、粘附劑或其它可熔纖維，從而在纖維和吸附劑顆粒之間形成粘合。有用的纖維的非限制性例子包括聚酯、尼龍和聚烯烴。(用于無紡工業的纖維的供應商已列于“AGuide to Fibers for Nonwovens，”Nonwovens Industry，June 1998，66-87.)濕強度樹脂系統的例子包括蜜胺/甲醛、表氯醇基樹脂、聚胺和聚酰胺。使用可熱熔纖維將顆粒固定在纖維基質中已經公開。參見例如US4160059。
優選地，所得吸附介質單位面積含已知量的吸附劑。單位面積的吸附劑為約100g/m2-約500g/m2，優選地從約250g/m2-約350g/m2。這樣，可以通過切割纖維化樹脂的預定面積簡單地測定試圖用于特定目的的適當量的吸附劑(即，不用稱纖維化樹脂)。
該吸附介質優選生物相容(即，不產生有毒、有害或免疫反應)；對例如血液制品(例如，血小板和凝血因子)的材料的性能具有最小影響；并且不伴有有毒可提取物。吸附介質所固定的吸附劑顆粒優選具有高的機械穩定性(即，沒有微細顆粒產生)。用于批量設備的吸附介質含約25-85wt％的吸附劑，優選以載荷約100-500g/m2含約50-80％的吸附劑，更優選以載荷約250-350g/m2含約50-80％的吸附劑。
包被吸附劑顆粒顆粒、基質或吸附介質的表面血相容性可以通過使用親水聚合物包被其表面得到改善。例證的親水聚合物包括聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(pHEMA)，它可以從例如Scientific Polymer Products，Inc.(Ontario，NY)獲得，以及纖維素基聚合物，例如乙基纖維素，它可以從Dow Chemical(Midland，MI)獲得。參見例如Andrade等人，Trans.Amer.Soc.Artif.Int.Organs XVII222-28(1971)。包被的其它例子包括聚乙二醇和聚氧化乙烯，也可從Scientific Polymer Products，Inc.獲得。該聚合物包被可以增加血相容性并減少由于機械故障產生小顆粒的危險。
該吸附劑表面也可以用固定的肝素調節。此外，可以經過肝素吸附調節強陰離子交換聚苯乙烯二乙烯基苯吸附劑。肝素，一種聚陰離子，將非常牢固地吸附在具有強陰離子交換特性的吸附劑的表面上。可商購獲得各種季銨調節的聚苯乙烯二乙烯基苯吸附劑。
可以使用大量不同的方法進行包被，包括如US5455040中所述的射頻輝光放電聚合，本文引入作為參考和Wurster包被法(由International Processing Corp.(Winchester，KY)完成)。
在一個實施方式中，可以通過將吸附劑顆粒(通常經過氣壓)懸浮在一個室中以便例如pHEMA的親水聚合物可以均勻噴射在吸附劑顆粒的整個表面上來實施該Wurster包被法。如實施例3所述，用pHEMA均勻噴射的Dowex_XUS-43493顯示出血小板收率增加以及用增加量的包被對血小板形狀改變產生了預料不到的效果。已發現該Wurster包被法選擇性地包被吸附劑表面的外表面，對內部孔表面幾乎沒有影響。
在一優選實施方式中，可以將固定吸附介質浸在親水聚合物中進行包被(參見實施例3)。該方法比用親水聚合物噴射吸附劑顆粒更簡單且成本更低。
該方法并不限制在任何特定時間內包被該吸附介質的方法。例如，在一個實施方式中，在制得吸附介質之后但在熱封該吸附介質之前進行pHEMA包被。在另一實施方式中，將該吸附介質首先熱封，然后進行該pHEMA包被。除了包被該吸附介質之外，將與pHEMA應用相伴的燒結過程用于除去松散顆粒和纖維。
隨著包被量增加，一些小有機化合物通過包被到達顆粒表面將變得更困難，這使得吸附動力降低。因此，隨著包被量增加，通常必需使用增加量的吸附劑達到與所包被的吸附劑相同的除去動力。在一個實施方式中，pHEMA包被的最佳水平是能觀察到對血小板收率和體外血小板功能的保護作用的最少的包被(0.1-0.5％)。
這些包被可能對滅菌敏感。例如，γ滅菌可能導致包被交聯和/或裂開。因此，滅菌的類型(E-射線束與γ輻照)和劑量可能影響所包被的吸附劑的性能。通常，優選E-射線束。
設備提供設備用于減少含細胞的生物組合物中的化合物。該設備為批量設備。批量設備的例子示于圖16。批量設備已在文獻中已知并描述在例如PCT申請WO96/40857，引入本文作為參考。
本發明的批量設備可以包括一種例如血袋的容器，包括含固定顆粒的吸附劑介質。在一個實施方式中，將血液制品添加到含吸附劑介質的血袋中并將該袋攪拌一定時間。
例如，在一個實施方式中，將例如固定Dowex_XUS-43493的吸附介質放置在血液制品容器(例如，PL 146塑料容器(BaxterHealthcareCorp.(Deerfield，IL))中，將該容器在血小板搖動器(HelmerLaboratories(Novesvill，IN))或者旋轉裝置(HelmerLaboratories(Novesvill，IN))上在室溫下保持約24小時并在不同溫度條件下貯藏。血液制品容器的大小可以為約600-約1200mL。貯藏溫度可以為約4℃-約22℃。
可以使用方法減少可能從吸附劑介質中變松散的吸附劑顆粒的出現。
本發明涉及一種批量設備，含有保留在例如網袋/囊的容器中的固定吸附劑介質。該網/囊可以由織制、無紡或膜密封件構成。在一個實施方式中，該編織網袋可以由藥用聚酯或尼龍構成。優選的實施方式是聚酯。可商購獲得的膜包括，但不限于，Supor_200、800、1200親水聚磺酸乙二酯(PES)膜(Gelman Sciences(Ann Arbor，MI))；Durapore_親水改性的聚偏二氟乙烯(PVDF)(Mantee AmericaCorp.(San Diego，CA))和具有整體疏水出口的親水改性的聚砜膜，例如Gemini膜(Millipore(Marborough，MA))；和具有聚偏二鹵乙烯包被的含聚碳酸酯的膜(Poretics(Livermore，CA))。這些容器可以在添加吸附基質之后進行滅菌。
用于含細胞的生物組合物的優選實施方式本發明提供了降低含細胞的生物組合物中低分子量化合物的濃度的設備。這些設備包括由惰性基質固定的顆粒組成的吸附介質。
已顯示如脫眉毒素C3a和末端膜攻擊復合物SC5b-9的生物反應調節物是通過對全血和其組分處理(例如流血過濾白細胞、單采、回收等)和貯藏生產的。在手術和輸血的不利情況中已牽涉這些生物反應調節物。
在一些實施方式中，本發明的設備降低或控制含細胞的生物組合物中活化補體的濃度。與沒有用該設備處理的組合物相比，當用該設備處理該組合物時，其中活化補體的濃度被降低或控制。在一個實施方式中，該吸附設備包括例如通過AQF生產的纖維化Ambersorb IAD。在該實施方式中，將含細胞的生物組合物暴露到該設備中與對照相比使得C3a補體片段和SC5b-9末端組分復合物減少。在一個實施方式中，暴露到該設備中持續5天與對照相比使得C3a補體片段至少減少了約10％。在另一實施方式中，暴露到該設備中持續5天與對照相比使得C3a補體片段至少減少了約30％。在另一實施方式中，暴露到該設備中持續5天與對照相比使得C3a補體片段至少減少了約50％。
在一個實施方式中，本發明提供了一種用于降低含血小板的生物組合物中化合物的濃度的設備。在用該設備處理之后血小板的生物活性基本上得到保留。該實施方式的吸附介質包括被惰性基質固定的吸附劑顆粒。優選的顆粒為很多孔且具有大于約750m2/g的表面積。
用于本實施方式的特別優選的顆粒是含有超交聯聚苯乙烯網絡的聚芳香族吸附劑，例如Dowex_XUS-43493或Purolite MN-200。優選惰性基質包括合成或天然聚合物纖維。在優選實施方式中該惰性基質包括合成聚合物纖維，它包括被具有較低熔解溫度的鞘包圍的具有高熔點的第一個聚合物核心。該聚合物核心可以是聚對苯二甲酸乙二酯核心。該鞘可以是尼龍鞘或改性聚酯鞘。人造纖維可從Unitika(Osaka，Japan)和Hoechst Trevira商購獲得。
通過本實施方式的這些設備、材料和方法降低或控制的例證化合物是補骨脂素、補骨脂素衍生物、異補骨脂素、補骨脂素光化產物、吖啶、吖啶衍生物、亞甲藍、塑性可提取物、生物反應調節物、猝滅劑和聚胺衍生物。
典型地將含血小板的生物組合物用于3天內捐贈，但可以在室溫下貯藏高達7天，因此，將這些血小板組合物在整個貯藏過程中保持與吸附介質接觸應是有利的。優選地，該過程應獲得可接受的血小板收率(例如，損失低于10％)。本發明嘗試的一種方法通過改善吸附劑表面的血相容性使得貯藏延長。
使用含由惰性基質固定的吸附劑顆粒的吸附介質允許在血小板數基本上沒有損失的情況下使低分子量化合物的濃度降低。短語“基本上沒有損失”是指適宜用于其想要目的例如，適宜輸入人體的血小板制品，并且可以是例如在整個過程中，更優選至少5天血小板數或功能損失低于約10％，優選低于約5％。而且，在血小板數基本上沒有損失的情況下，血小板可以與吸附介質接觸的時間大于血小板可以單獨與吸附劑顆粒接觸的時間。顆粒的固定出乎意料地使接觸時間延長以及血小板損失數降低。在血小板數沒有大的損失例如損失約20％的情況下，典型地血小板不能與未經固定的吸附劑顆粒接觸超過約20小時。相反，在血小板數基本上沒有損失的情況下，可以將血小板與含被惰性基質固定的吸附劑顆粒的吸附介質接觸超過20小時，例如約1-7天。
此外，與沒有吸附介質超時貯藏血小板相比，存在吸附介質的情況下貯藏的血小板的體外血小板功能(例如形狀改變、GMP-140、pH)得到改善。存在吸附介質的情況下貯藏的血小板可以具有大于約6-小于約7.5的pH。
在另一實施方式中，本發明提供了一種用于降低含紅血球的室溫組合物中低分子量化合物(例如小有機化合物)的濃度同時基本上保留了紅血球生物活性的設備。典型地，通過該設備除去的化合物具有約100g/mol-約30000g/mol的分子量。該吸附介質含有被惰性基質固定的吸附劑顆粒。用于本實施方式的優選顆粒有很多孔且具有大于約750m2/g的表面積。
優選地，用于紅血球組合物的設備是在降低低分子量化合物的濃度之后基本上保留了紅血球生物活性的設備。在一個實施方式中，該紅血球設備基本上沒有因接觸而對液體的生物活性有負面影響。該設備實施方式包括含被惰性基質固定的顆粒的吸附介質和選擇性地顆粒保留設備。
在一個實施方式中，用于紅血球組合物的設備中的顆粒為活性炭。優選該活性炭得自合成源。活性炭的非限制性例子包括可從PicaU.S.A.(Columbus，Ohio)獲得的Picactif Medicinal；可從NoritAmericas Inc.(Atlanta，GA)獲得的Norit ROX 0.8；和可從PicaU.S.A.(Columbus，OH)獲得的G-277。
在一個實施方式中，該吸附劑優選為得自合成源的活性炭，如Ambersorb 572。這些Ambersorb是Rohm & Haas(Philadelphia，PA)生產的合成活化含碳(即，富含碳)吸附劑。Ambersorb通常為比典型活性炭更耐久的大的球形(300-900μm)顆粒。這些Ambersorb是通過用專用高溫活化方法處理高度磺酸酯化的多孔聚苯乙烯珠合成生產的。這些吸附劑不需要預膨脹達到最佳吸附活性。
在另一實施方式中，用于含紅血球組合物的設備(“紅血球設備”)中的顆粒可以是疏水樹脂。疏水樹脂的非限制性例子包括以下聚芳香族吸附劑Amberlite_吸附劑(例如，Amberlite_XAD-2，XAD-4和XAD-16)，可從Rohm & Haas(Philadelphia，PA)獲得；可從Toso Haas(TosoHass，Montgomeryville，PA)獲得的Amberchrom_吸附劑；和Diaion_//Sepabeads_吸附劑(例如Diaion_HP20)，可從MitsubishiChemical America，Inc.(White Plains，NY)獲得。在一個特別優選的實施方式中，這些顆粒為可從Purolite(Bala Cynwyd，PA)獲得的Hypersol-Macronet_吸附劑樹脂(例如Hypersol-Macronet_吸附劑樹脂MN-200，MN-150和MN-400)或可從Dow Chemical Company(Midland，MI)獲得的Dowex_吸附劑(例如XUS-43493和XUS-40285)。
紅血球的優選惰性基質包括合成或天然聚合物纖維。在一優選實施方式中，該惰性基質包括合成聚合物纖維，它包括被具有較低熔解溫度的鞘包圍的具有高熔點的第一個聚合物核心。該聚合物核心可以是聚對苯二甲酸乙二酯或聚酯核心。該鞘可以是尼龍鞘或改性聚酯鞘。纖維可從Unitika(Osaka，Japan)和Hoechst Trevira(Augsberg，Germany)商購獲得。
在一些實施方式中，紅血球設備的吸附介質處于密封件中。在一個實施方式中，該設備包括吸附介質和容器。在另一實施方式中，包括吸附介質和容器的該設備也可以包括顆粒滯留介質。在一個實施方式中，該容器包括體積為約600ml-約1L的血袋。在另一實施方式中，該容器包括體積為約800ml-約1L的血袋。該顆粒保留介質可以包括聚酯織制、聚酯無紡或合成膜的密封件。
優選該設備在約4℃或約22℃(室溫)并在攪拌下與紅血球組合物接觸1-35天。在一個實施方式中，該紅血球組合物在約22℃下與該設備接觸不超過約36小時。在另一實施方式中，該紅血球組合物在約22℃下與該設備接觸不超過約24小時。在另一實施方式中，該紅血球組合物在約22℃下與該設備接觸不超過約12小時。在另一實施方式中，該紅血球組合物在約22℃下與該設備接觸不超過6小時。
在一些實施方式中，在紅血球組合物與該設備接觸之后改變溫度。在一個實施方式中，該設備在約22℃下與該紅血球組合物接觸約0.5-約24小時，然后貯藏在約4℃下高達約5周。在另一實施方式中，該設備在約22℃下與該紅血球組合物接觸約0.5-約12小時，然后貯藏在約4℃下高達約5周。在另一實施方式中，該設備在約22℃下與該紅血球組合物接觸約0.5-約6小時，然后貯藏在約4℃下高達約5周。
使用含被惰性基質固定的吸附劑顆粒的吸附介質在紅血球功能基本上沒有損失的情況下處理該紅血球組合物。短語“基本上沒有損失“是指應適宜輸血或其想要目的的產品，并且在某些情況下可以是指溶血低于約1％；優選溶血低于約0.8％，紅血球回收大于約80％；優選紅血球回收大于90％，ATP濃度的變化與無設備對照紅血球的差異低于約10％，并且細胞外鉀濃度的變化與無設備對照紅血球的差異不到約15％。在35天內，與未經固定的顆粒相比，對于IAD溶血的變化至少低10％，優選地，低20％更優選50％。最優選地，與未經固定的顆粒相比，對于IAD溶血的變化至少低90％。
可以使用標準藥盒評價紅血球功能。具體地，可以通過測定紅血球在Drabkin試劑((Sigma Chemical Company)，St.Louis，MO)中的上層清液在540nm下的吸光度來測定溶血。使用Na+/K+分析儀(Ciba-Corning Diagnostics，Medfield，MA)可以評價鉀漏出。使用標準藥盒(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)可以進行總紅血球樣品中ATP的定量酶測定并以水背景對照測定340nm下的吸光度。
在待處理的生物組合物為含紅血球的組合物的地方，該設備可以降低紅血球樣品中低分子量化合物的濃度。優選該設備可以降低紅血球樣品中吖啶衍生物和硫醇的濃度。更優選該設備可以降低紅血球樣品中5-[(β-乙酯基乙基)氨基]-吖啶和谷胱甘肽的濃度。可以使用HPLC試驗測定與該設備接觸的紅血球中的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和谷胱甘肽的濃度。試驗流動相為HPLC水中的10mM H3PO4和乙腈中的10mMH3PO4。Zorbax SB-CN和YMC ODSAM-303柱可從MacMod Analytical，Inc.(Chadds Ford，PA)和YMC，Inc.(Wilmingtion，N.C.)獲得。
在有攪拌下設備與含細胞的生物組合物接觸的地方，可以連續或間歇該攪拌。通過保留細胞功能度的任意適宜裝置提供該攪拌，包括以下類型的機械攪拌器往復、軌道、三維旋轉裝置和旋轉裝置型攪拌器。在一個實施方式中，通過軌道攪拌器提供該攪拌并且是連續的。在另一實施方式中，通過軌道攪拌器提供該攪拌并且是間歇的。在另一實施方式中，通過往復攪拌器提供該攪拌。
應用本發明嘗試降低含細胞的生物組合物中低分子量化合物的濃度。這些化合物包括，例如，如光活化產物的補骨脂素失活試劑、氨基吖啶、有機染料和吩噻嗪。例證的補骨脂素失活試劑包括呋香豆素，例如補骨脂素和吖啶。接著如US5459030和5559250(引入本文作為參考)所述用補骨脂素失活化合物處理血液制品，可以通過將處理過的血液制品與本發明的設備接觸降低血液制品中補骨脂素失活化合物的濃度。
在一個實施方式中，本發明嘗試一種失活溶液中補骨脂素的方法，其中該方法包括a)依次提供ⅰ)環化合物，ⅱ)用所述補骨脂素污染的懸浮液，和ⅲ)纖維化樹脂；b)用所述環化合物處理所述溶液，以便產生其中所述補骨脂素失活的處理過的溶液產物；和c)將所述處理過的溶液產物與所述纖維化樹脂接觸，并進一步包括用于降低血液制品中小有機化合物的濃度同時基本上保留了血液制品的所需生物活性的設備，該設備包括很多孔的吸附劑顆粒，其中這些吸附劑顆粒被惰性基質固定。
除了補骨脂素失活化合物之外，例如在輸血之前可以從例如血液制品的材料中減少其反應降解產物。
可以將本文所公開的材料和設備用于分離性輸血方法中。可以將全血分成兩種或多種特定組分(例如，紅血球、血漿和血小板)。術語“分離性輸血”廣義上是指將血液從供體中取出并分成不同組分，收集并保留感興趣的組分并將其它組分返回給供體的過程。在再輸血過程中該供體接受替換液體以幫助彌補由于組分移去造成的體積和壓力損失。分離性輸血系統在PCT公開WO96/40857中有描述，本文引入作為參考。
低分子量化合物本發明的設備降低含細胞的組合物中低分子量化合物的濃度。術語“低分子量化合物”是指分子量在約100g/mol-約30000g/mol的有機或生物分子。低分子量化合物包括，但不限于，以下化合物小有機化合物如補骨脂素、吖啶或染料；如谷胱甘肽的猝滅劑；如增塑劑的塑性可提取物；如活化補體的生物調節物，它具有約100g/mol-約30000g/mol的分子量；和聚胺衍生物。
小有機化合物不同組的小有機化合物可以被本發明的設備所吸附。這些分子可以是環狀或非環族。在一個實施方式中，這些化合物優選為例如補骨脂素、吖啶或染料的環狀化合物。在另一實施方式中，這些化合物為硫醇。
環狀化合物的非限制性例子包括放線菌素、蒽環酮、絲裂霉素、安曲霉素和有機染料和光反應化合物如苯并二吡喃酮、芴、芴酮、呋香豆素、卟啉、原卟啉、紅紫素、酞菁染料、金絲桃素、Monostral FastBlue、Norphillin A、菲啶、phenazathionium salt、吩嗪、吩噻嗪、疊氮基苯、喹啉和噻噸酮。優選這些化合物為呋香豆素。
呋香豆素的非限制性例子包括補骨脂素和補骨脂素衍生物。特別注意的是4′-氨甲基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、8-甲氧基補骨脂素、鹵代補骨脂素、異補骨脂素與季銨、糖或其它核酸結合基團相連的補骨脂素。還注意到以下補骨脂素5′-溴甲基-4，4′，8-三甲基補骨脂素、4′-溴甲基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(4-氨基-2-氮雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(2-氨乙基)-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(5-氨基-2-氧雜)戊基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(5-氨基-2-氮雜)戊基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(6-氨基-2-氮雜)己基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(7-氨基-2，5-氧雜)庚基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(12-氨基-8-氮雜-2，5-二氧雜)十二烷基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(13-氨基-2-氮雜-6，11-二氧雜)十三烷基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(7-氨基-2-氮雜)庚基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(7-氨基-2-氮雜-5-氧雜)庚基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(9-氨基-2，6-二氮雜)壬基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(8-氨基-5-氮雜-2-氧雜)辛基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(9-氨基-5-氮雜-2-氧雜)壬基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、4′-(14-氨基-2，6，11-三氮雜)十四烷基-4，5′，8-三甲基補骨脂素、5′-(4-氨基-2-氮雜)丁基-4，4′，8-三甲基補骨脂素、5′-(6-氨基-2-氮雜)己基-4，4′，8-三甲基補骨脂素和5′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，4′，8-三甲基補骨脂素。優選該補骨脂素為4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素。
吖啶吖啶的非限制性例子包括吖啶橙、吖啶黃、奎納克林、N1，N1-二(2-羥乙基)-N4-(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)-1，4-戊二胺、9-(3-羥丙基)氨基吖啶、N-(9-吖啶基)甘氨酸、S-(9-吖啶基)-谷胱甘肽。在一個優選實施方式中該吖啶為N-(9-吖啶基)-β-丙氨酸，或者稱為5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶。
染料染料的非限制性例子包括例如亞甲藍、中性紅、甲苯胺藍、結晶紫和天藍A的吩噻嗪；如亞甲紫Bernthsen的吩噻嗪酮；如1，8，15，22-四苯氧基-29H，31H-酞菁氯化鋁和硅石類似物的酞菁染料；以及金絲桃素。優選該染料為亞甲藍或甲苯胺藍。更優選該染料為亞甲藍。
術語“噻嗪染料”包括在一個或多個環中含有硫原子的染料。最常見的噻嗪染料是亞甲藍[氯化3，7-二(二甲基氨基)-吩噻嗪-5-鎓]。其它噻嗪染料包括，但不限于，天藍A、天藍C和勞思氏紫，如Schinazi的US5571666所述。
術語“呫噸染料”是指為化合物呫噸衍生物的染料。可以將這些呫噸染料分入三個主要分類之一ⅰ)芴或氨基呫噸、ⅱ)對甲氨基酚或氨基羥基呫噸和ⅲ)芴酮羥基呫噸。嘗試用于本發明的呫噸染料的例子包括玫瑰紅和曙紅Y；如Schinazi的US5571666所述，這些染料可以從許多源(例如，Sigma Chemical Co_St.Louis，MI)商購獲得，本文引入作為參考。
猝滅劑可以降低各種化合物的濃度。其它例證化合物包括猝滅化合物。猝滅方法不希望包括含有或能夠形成的官能團、親電子基團的補骨脂素失活化合物的副反應，如1998年1月6日申請的摘要號28217300600的共有美國專利申請“Methods for Quenching Pathogen Inactivatorsin Biological Systems”，將其公開的內容引入本文。在本方法中，用補骨脂素失活化合物和猝滅劑處理如血液制品的材料，其中該猝滅劑包括能夠共價地與親電子基團反應的親核官能團。在一個實施方式中，該補骨脂素失活化合物包括連接配體和例如芥子基團的官能團的核酸，它能夠就地反應形成親電子基團。猝滅劑的例子包括，但不限于，含親核基團的化合物。例證的親核基團包括硫醇、硫羰酸、二硫碳酸、硫代氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯、胺、磷酸酯和硫代磷酸酯基團。該猝滅劑可以是或含，例如吡啶的氮雜環。該猝滅劑可以是含例如葡萄糖-6-磷酸酯的化合物的磷酸酯。該猝滅劑也可以是含以下化合物(但不限于)的硫醇谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、氫硫基乙醇、二巰基丙醇、硫醇、氫硫基乙基磺酸和其鹽，例如，MESNA、高半胱氨酸、氨乙基硫醇、二甲氨基乙基硫醇、二硫蘇糖醇和其它含硫醇的化合物。例證的芳香族硫醇化合物包括2-巰基苯并咪唑磺酸、2-巰基煙酸、萘烯硫醇、喹啉硫醇、4-硝基-苯硫酚和苯硫酚。其它猝滅劑包括硝基芐基吡啶和無機親核試劑如硒化物鹽或有機硒化物、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫化物、硫代磷酸鹽、焦磷酸鹽、氫硫化物和二硫代亞硝酸鹽。該猝滅劑可以是含親核基團的肽化合物。例如，該猝滅劑可以是含半胱氨酸的化合物，例如，如GlyCys的二肽或如谷胱甘肽的三肽。
可以通過本發明的設備除去的化合物可以包括硫醇如氫硫基醋酸甲酯、硫乳酸、苯硫酚、2-巰基吡啶、3-巰基-2-丁醇、2-巰基苯并噻唑、硫代水楊酸和硫辛酸。
塑性可提取物來自用于裝生物組合物的塑料貯藏容器和管中的可提取物的一組低分子量化合物的濃度也可以使用本發明的設備從生物組合物中降低。可提取物的例子包括，但不限于，增塑劑、殘余單體、低分子量低聚物、抗氧化劑和潤滑劑。參見例如R.Carmen，TransfusionMedicine Reviews 7(1)1-10(1993)。塑性組分通過蒸汽、γ射線或電子束的滅菌可以產生氧化反應和/或聚合物裂開，導致形成其它類型的可提取物。
增塑劑常被用于提高塑料的性能如可加工性和透氣性。在血液貯藏容器中發現的最常見增塑劑是用于PVC制品中的鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯。DEHP已被確定為潛在致癌物。已開發出其它增塑劑，包括，但不限于，以下化合物1，2，4-苯三酸三(2-乙基己)酯(TEHTM)、乙酰檸檬酸三正己酯(ATHC)、丁酰檸檬酸三正己酯(BTHC)和鄰苯二甲酸二正癸酯。
可以將本發明的設備用于降低或控制各種環境中的生物組合物中的塑性可提取物的濃度。這些環境包括，但不限于，以下血液處理；血液貯藏；以及例如血液透析和體外膜氧化的體外應用。
生物反應調節物(BRMs)一組廣義上稱之為生物反應調節物(BRMs)的低分子量化合物的濃度也可以使用本發明的設備從生物組合物中降低和控制。BRMs是指“改變免疫反應的光譜分子”。Illustrated Dictionary of Immunology，J.M.Cruse and R.E.Lewis。一般的BRMs組包括，但不限于例如組胺和血清素的小分子；例如凝血噁烷、前列腺素、白三烯和花生四烯酸的脂類；例如緩激肽的小肽；含其它基團的更大多肽，包括活化補體片段(C3a，C5a)；例如IL-1、IL-6和IL-8的細胞因子；以及例如RANTES和MIP的趨化因子。
在貯藏過程中血液制品中BRMs的集聚可能對生物組合物的所需生物活性有副作用。例如已證實在標準血庫條件下貯藏血小板的過程中發生補體活化。補體活化伴隨著稱之為“血小板貯藏損害”血小板功能和活力的的喪失。參見例如V.D.Mietic and O.Popovic，Transfusion 32(2)150-154(1993)。在所貯藏的血液制品中BRMs的集聚也可能對例如接受該血液制品的患者有副作用在貯藏過程中在血小板濃縮物中BRMs的集聚在接受血小板的患者中伴隨有非溶血性發熱輸血反應。參見例如N.M.Heddle，Current Opinions inHematology 2(6)478-483(1995)。
聚胺衍生物一組已知為聚胺衍生物的低分子量化合物的濃度例如也可以使用本發明的設備從生物組合物中降低。聚胺衍生物為在碳主鏈中含多個氮原子的化合物。
聚乙二醇其它例證化合物包括活化聚乙二醇(aPEG)，可以將其用于改變細胞或材料的表面以便分別提供免疫掩蔽性能或穩定蛋白結合。可以將該設備用于降低過量的活化聚乙二醇或PEG的未反應衍生物，從而使活化PEG與水或例如磷酸鹽、磷酸酯或如谷胱甘肽的硫醇的小親核試劑反應。可以被除去的其它化合物包括活化PEG制品中的雜質，它可以影響血液制品的功能或使它們不適宜輸血(例如有毒化合物)。最后，也可以將例如aPEG與細胞表面親核試劑反應過程中釋放的N-羥基琥珀酰亞胺的小分子降低。
可以通過本發明的設備除去的化合物的例子包括粘附在活性分子上的線性或支鏈聚乙二醇，這些活性分子包括氰尿酰氯、琥珀酰亞氨基酯、氧化碳酰咪唑衍生物、碳酸硝基苯酯衍生物、縮水甘油醚衍生物和醛。
應理解為本發明并不局限在所示和所述的這些精確的詳細操作或精確化合物、組合物、方法或步驟中，各種改變和等價物對本領域技術人員應是顯而易見的。由上述內容可知，應清楚地指出這些方法和設備可以與分離性輸血系統和目前用于加工輸血用血液制品的其它設備和步驟混合。
實施例下面的實施例用于說明本發明的某些優選實施方式和特征，但不構成對其范圍的限制。
在以下的實驗說明中，使用以下縮寫eq(等價物)；M(容積克分子)；μM(容積微克分子)；N(當量)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；Kg(千克)；L(升)；mL(毫升)；μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；min.(分鐘)；s和sec.(秒)；J(焦耳，或瓦特.秒)；℃(攝氏度)；TLC(薄層色譜)；HPLC(高壓液相色譜)；pHEMA和p(HEMA)(聚[甲基丙烯酸2-羥乙酯])；PC(s)(血小板濃縮物)；PT(凝血酶原時間)；aPTT(活化部分凝血酶原時間)；TT(凝血酶時間)；HSR(低滲休克反應)；FDA(美國食品和藥品管理局)；GMP(良好生產實踐)；DMF(藥物主文件)；SPE(固相提取)；Aldrich(Milwaukee,WI)；Asahi(Asahi Medical Co_Ltd_Tokyo,Japan)；Baker(J.T.Baker,Inc_Phillipsburg,NJ)；Barnstead(Barnstead/Thermolyne Corp_Dubuque,IA)；BectonDickinson(Becton Dickinson Microbiology Systems；Cockeysville,MD)；Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules，CA)；Cerus(CerusCorporation；Concord,CA)；Chrono-log(Chrono-Log Corp.；Havertown，PA)；Ciba-Corning(Ciba-Corning Diagnostics Corp.；Oberlin，OH)；Consolidated Plastics(Consolidated Plastics Co_Twinsburg,OH)；Dow(Dow Chemical Co.；Midland,MI)；Eppendorf(Eppendorf North America Inc_Madison,WI)；Gelman(GelmanSciences,Ann Arbor,MI)；Grace Davison(W.R.Grace & Co_Baltimore,MD)；Helmer(Helmer Labs,Noblesville,IN)；HoechstCelanese(Hoechst Celanese Corp_Charlotte,NC)；InternationalProcesslng Corp.(Winchester,KY)；Millipore(Milford,MA)；NIS(Nicolet,a Thermo Spectra Co_San Diego,CA)；Poretics(Livermore,CA)；Purolite(Bala Cynwyd,PA)；Rohm and Haas(Chauny,France)；Quidel(San Diego,CA)；Saati(Stamford,CT)；Scientific Polymer Products(Ontario,NY)；Sigma(Sigma ChemicalCompany,St.Louis,MO)；Spectrum(Spectrum Chemical Mfg.Corp_Gardenia,CA)；Sterigenics(Corona,CA)；Tetko,Inc.(Depew,NY)；TosoHaas(TosoHass,Montgomeryville,PA)；Wallac(Wallac Inc_Gaithersburg,MD)；West Vaco(Luke,W.Va)；YMC(YMC Inc_Wilmington,NC)；DVB(二乙烯基苯)；LAL(Limulus AmoebocyteLystate)；USP(美國藥典)；EAA(乙酰乙酸乙酯)；EtOH(乙醇)；HOAc(乙酸)；W(瓦特)；mW(毫瓦)；NMR(核磁共振；在室溫下在Varian Gemini200 MHz Fourier Transform Spectrometer上獲得的光譜)；ft3/min(每分鐘立方英寸)；m.p.(熔點)；g/min和gpm(每分鐘加侖)；UV(紫外線)；THF(四氫呋喃)；DMEM(Dulbecco′s改良的Eagles培養基)；FBS(胎牛血清)；LB(Luria Broth)；EDTA(乙二胺四乙酸)；Phorbol MyristateAcetate(PMA)；磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)；AAMI(藥學儀器改進協會)；ISO(國際標準組織)；EU(內毒素單元)；LVI(可大量注射物)；GC(氣相色譜)；M(兆)；kGy(1000格雷=0.1兆拉德)；MΩ(兆歐姆)；PASⅢ(血小板補充溶液Ⅲ)；dH2O(蒸餾水)；IAD(固定吸附設備)；SCD(無菌連接設備)。
以下實施例之一提到HEPES緩沖液。該緩沖液含8.0g的137mMNaCl、0.2g的2.7mM KCl、0.203g的1mM MgCl2(6H2O)、1.0g的5.6mM葡萄糖、1.0g的1mg/ml牛血清白蛋白(可從Sigma，St.Louis，MO獲得)和4.8g的20mM HEPES(可從Sigma，St.Louis，MO獲得)。
實施例1具有Amberlite_XAD-16的纖維化樹脂該實施例是利用纖維化樹脂和含未經固定的吸附劑珠的設備比較從血小板中除去氨基補骨脂素的動力學和血小板功能和形態。更具體地說，將含固定化Amberlite_XAD-16的纖維化樹脂與含自由(即未經固定的)Amberlite_XAD-16 HP和Dowex_XUS-43493的設備相比較。
制備纖維化樹脂和吸附劑珠由AQF獲得干凈且水合狀態的含Amberlite_XAD-16的固定化吸附劑介質(Rohm and Haas)。這些Hoechst Celanese纖維網絡的纖維是由聚對苯二甲酸乙二酯核心和尼龍鞘組成的，該鞘的熔解溫度比該核心的低。該纖維化樹脂的制備如下首先將這些吸附劑珠均勻分布在纖維網絡中。接下來，將該纖維網絡快速加熱使纖維的聚合物鞘熔融并粘附到吸附劑珠和其它纖維上，從而形成交聯的纖維網絡。所形成的纖維化樹脂含載荷為130g/m2(即，每平方米纖維含130g吸附劑珠)的Amberlite_XAD-16。
將該纖維化樹脂切成正方形(14cm×14cm)，所得片段含約2.5g的干Amberlite_XAD-16。然后通過將該纖維化樹脂浸泡在30％乙醇中約10分鐘將該Amberlite_XAD-16珠預潤濕。潤濕Amberlite_XAD-16的其它方法和其它吸附劑也是有效的并且被本發明所包含。應說明的是含其它類型珠的纖維化樹脂(例如，經橋接或超交聯的樹脂如Dowex_XUS-43493)不需要用于有效除去補骨脂素的潤濕步驟。
也可以直接從Rohm and Haas獲得干凈且水合狀態的Amberlite_XAD-16 HP(高純度)珠。在加入網袋之前對松散(即未經固定的)Amberlite_XAD-16 HP珠不需要預潤溫；但是，校正吸附劑的量以計算出珠的水分含量(2.5g干劑=6.8g帶有62.8％的水分)。從Dow獲得Dowex_XUS-43493珠，該干燥珠不需潤濕并且不需要用水校正該珠的質量。然后將聚酯網袋(7cm×7cm正方形；30μm開口)用2.5g(干重)的松散Amberlite_XAD-16 HP或Dowex_XUS-43493珠填充。
含纖維化樹脂和吸附劑的袋通過高壓滅菌法在121℃下“濕”循環45分鐘滅菌。之后，將含纖維化樹脂和吸附劑的袋插入單獨滅菌、1-升PL 2410塑料容器(Baxter)中。插入之后，在層流通風櫥中使用無菌剪刀、止血鉗子和脈沖封閉器將PL 2410塑料容器熱封。
纖維化樹脂和吸附劑珠與含補骨脂素的血小板濃縮物(PC)接觸將2-3個單元的單供體單采血小板混合在35％自體血漿/65％血小板補充溶液(即合成介質)中制成血小板濃縮物庫。向該溶液中添加氨基補骨脂素4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素(S-59)，其量實現150μM4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的最終濃度。將所得PC溶液分成300mL單元，然后將這些單元放在PL 2410塑料容器(Baxter)中并用3J/cm2的UVA照射。照射之后，將經過處理的PCs轉移到含帶Amberlite_XAD-16、松散Amberlite_XAD-16 HP或松散Dowex_XUS-43493的纖維化樹脂的固定化PL 2410塑料容器中，或者轉移到空PL 2410塑料容器中作對照。然后將該PL 2410塑料容器(Baxter)放在22℃下的Helmer血小板恒溫箱中并以約70轉/分鐘攪拌。
在首先的8個小時的貯藏中每隔1小時移出每一PC樣品，通過HPLC分析殘余4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素。用含三甲基補骨脂素(TMP)的樣品稀釋劑(最終濃度=35％甲醇，25mMKH2PO4，pH=3.5)作為內標準將每種樣品稀釋5倍。通過在4℃下將這些樣品培養30分鐘，蛋白質和其它大分子沉淀。然后將這些樣品離心分離且將上層清液過濾(0.2微米)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM 4.6mm×250mm)上通過在20分鐘內流出從65％溶劑A(25mM KH2PO4，pH=3.5)，35％B(甲醇)到80％B的線性梯度進行分析。
通過在Baker System 9118 CP(Baker Instrument Co.；Allentown，PA)計數血小板每天監測用纖維化樹脂或一種松散珠的5-天貯藏期間的血小板收率。使用Ciba-Corning 238 pH/Blood Gas Analyzer評價血內氣體和pH。使用用于形態、形狀變化、低滲休克反應、聚集和GMP-140(p-選擇蛋白)表達的試驗評價與纖維化樹脂或含自由吸附劑的設備接觸5天后的體外血小板功能。形狀變化、聚集和低滲休克反應是使用Lumi-Aggregometer(Chrono-Log)評價的，同時GMP-140是使用Becton-Dickinson FACScan Fluorescence Analyzer(BectonDickinson)通過流式細胞術測定的。
補骨脂素的除去和血小板收率和功能圖5比較了用XUS-43493、XAD-16 HP和含XAD-16的纖維化樹脂從于35％血漿/65％合成介質(PASⅢ)的血小板中除去4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的吸附動力學。具體地，實線連接的圓圈所示的數據代表含未經固定的吸附劑XUS-43493(2.5g珠；＜5％水分)的設備；虛線連接的三角形所示的數據代表含未經固定的XAD-16HP(6.8g珠；62.8％水分)的設備；并且虛線連接的正方形所示的數據代表纖維化樹脂(帶有在30％乙醇中的XAD-16濕珠的Hoechst纖維；14cm×14cm)。如圖5中數據所示，含未經固定的吸附劑的設備和含纖維化樹脂的設備的4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的吸附動力學都是可比的。因此，纖維化處理對除去動力學沒有明顯的大的影響。
此外，研究了與松散珠相比較的纖維化樹脂的血小板收率和功能。具體地說，該研究的試驗使用了ⅰ)6.8g XAD-16 HP(62.8％水分)；ⅱ)在30％乙醇中的14cm×14cm溫的纖維化XAD-16(130g樹脂/cm2)；和ⅲ)2.5g XUS-43493(＜5％水分)。XAD-16 HP和纖維化樹脂樣品制備了雙份血小板單元，但XUS-43493僅制得單份血小板單元。結果列于表1中。
如表1所示，與5天對照相比，含未經固定的珠(XAD-16 HP和XUS-43493)的樣品的5天的pH和pO2值稍微上升。用纖維化樹脂的試驗具有相對對照更可比的pH和pO2。血小板數顯示用纖維化介質和含未經固定的吸附劑的設備的對照接觸5天之后血小板損失9-22％。如表1所列的，纖維化樹脂具有更好的收率(5天損失9％)，并且與含未經固定的XAD-16的設備或XUS-43493吸附劑顆粒相比時所有體外評價呈現更好。
表1
盡管為了實現本發明不需要明白用含未經固定的XUS-43493和XAD-16 HP的設備觀察到的pH和pO2更高的機理，但是較高值據信是由含未經固定的吸附劑存在下血小板代謝稍微降低所至。比較起來，相對對照，纖維化介質一致地比XUS-43493或XAD-16珠具有更可比的5天pH和pO2值。
相對于XUS-43493或XAD-16 HP吸附劑珠，纖維化介質也有較好的5天血小板收率。在幾種情況下觀察到XUS-43493介質觀察的損失為22-28％。但是，應注意到用含具有XUS-43493的未經固定的吸附劑的設備的目前優選實施方式涉及8小時暴露之后從該設備轉移這些血小板；該過程導致＜5％的血小板損失。
表1中所示的數據說明了纖維化介質相對含未經固定的吸附劑的設備具有更高的血小板收率。令人吃驚的是，該纖維化介質還獲得通過pH/pO2、形狀變化、聚集、形態和GMP-140所示的更好的5天的血小板功能。盡管為了實現本發明不需要理解該纖維化介質的增強性能的原理，但是可以提出幾種假設。首先，粘附在吸附劑珠表面上的這些纖維可以阻止血小板和珠表面之間的相互作用。其次，將這些珠固定可以防止相互作用并消除對血小板有害的機械影響。第三，將這些珠固定可以增強流體在珠表面的剪切，因此減少了血小板和珠表面之間的相互作用；比較起來，未經固定的珠與流體自由流動使得流體相對珠的表面的流動降低。
血小板損失當復查上述數據時，看出一次研究與下一次研究之間的血小板損失存在一些可變性。但是，在最初血小板數較高的研究中以5天對照計數的百分率表示的血小板損失較小。進行研究是為了證實血小板損失的數量對給定的血小板粘著可利用的材料面積是否是恒定的。關于該研究，將兩個血小板單元合并并將該合并物分成兩個樣品。一個樣品用35％自體血漿/65％合成介質(PAS)稀釋一倍，以便該血小板數為另一單元的一半。將這些血小板混合物用4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素+UVA處理并在前面討論的標準血小板貯藏條件下與含未經固定的吸附劑(2.5g XUS-43493)的設備接觸5天。
盡管按百分率計算的損失的差異很大，但是兩個單元中損失的血小板總數事實上是相同的。因此，這些結果說明了在一段時間后總的血小板損失基本上是恒定的；即，盡管血小板損失的百分率隨最初血小板數而變化，但是當達到平衡時血小板損失的總數幾乎是恒定的。基于該實施例中提出的結果，纖維化樹脂對體外血小板功能沒有副作用。
實施例2具有活性炭的纖維化樹脂該實施例是對含Amberlite_XAD-16的纖維化樹脂和含經過固定的活性炭的纖維化樹脂比較從血小板中除去4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的動力學和血小板功能和形態。
制備纖維化樹脂Hoechst Celanese制備含Amberlite_XAD-16 HP(Rohm and Haas)的纖維化樹脂。含Amberlite_XAD-16的該纖維化樹脂是如前面實施例中所述制備的，包括30％乙醇潤濕步驟。Hoechst Celanese還制備了以載荷375g/m2(AQF-375-B)和500g/m2(AQF-500-B)含經過固定的活性炭(WestVaco)的纖維化樹脂。#在一優選實施方式中，該吸附劑顆粒為合成活性炭，包括例如，Ambersorb和A-Supra。由于合成活性炭能夠除去大量從經過固定的吸附介質上脫落的微粒物，因此它們為優選。該纖維化樹脂是以與用于含Amberlite_XAD-16的纖維化樹脂相似的方法制備的。每種纖維化樹脂的纖維組成相同。
將該纖維化樹脂切成正方形(14cm×14cm)，所得片段含約2.5g的干Amberlite_XAD-16。接下來，將該纖維化樹脂通過高壓滅菌法在121℃下“濕”循環45分鐘滅菌。之后，將該纖維化樹脂插入單獨滅菌、1-升PL 2410塑料容器(Baxter)中，并在層流通風櫥中使用無菌剪刀、止血鉗子和脈沖封閉器將該容器熱封。
纖維化樹脂與含補骨脂素的PC接觸將2-3個單元的單供體單采血小板混合在35％自體血漿/65％合成介質(PASⅢ)中制成血小板濃縮物庫。添加4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素，其量實現150μM 4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的最終濃度。將所得PC溶液分成300mL單元，并將這些單元放在PL 2410塑料容器(Baxter)中并用3J/cm2的UVA照射。照射之后，將經過處理的PCs轉移到含帶XAD-16、AQF-375-B、AQF-500-B的纖維化樹脂的PL 2410塑料容器中，或者轉移到空PL 2410塑料容器中作對照。然后將該PL 2410塑料容器放在22℃下的Helmer血小板恒溫箱中并以約70轉/分鐘攪拌。
按照前面實施例中的進行，在首先的8個小時的貯藏中每隔1小時移出每一PC樣品，通過HPLC分析殘余4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素。用含三甲基補骨脂素(TMP)的樣品稀釋劑(最終濃度=35％甲醇，25mM KH2PO4，pH=3.5)作為內標準將每種PC樣品稀釋5倍。通過在4℃下將這些樣品培養30分鐘，蛋白質和其它大分子沉淀。然后將這些樣品離心分離且將上層清液過濾(0.2微米)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM 4.6mm×250mm)上通過在20分鐘內流出從65％溶劑A(25mM KH2PO4，pH=3.5)，35％B(甲醇)到80％B的線性梯度進行分析。
通過在Baker System 9118 CP上計數血小板每天監測用纖維化樹脂或含未經固定的吸附劑的設備的5-天貯藏期間的血小板收率。使用Ciba-Corning 238 pH/Blood Gas Analyzer評價血內氣體和pH。使用用于形態、形狀變化、低滲休克反應、聚集和GMP-140(p-選擇蛋白)表達的試驗評價與纖維化樹脂或含未經固定的吸附劑的設備接觸5天后的體外血小板功能。形狀變化、聚集和低滲休克反應是使用Chrono-Log Lumi-Aggregometer評價的，同時GMP-140是使用Becton-Dickinson FACScan Fluorescence Analyzer通過流式細胞術測定的。
補骨脂素的除去和血小板收率和功能圖6比較了用含XAD-16的纖維化樹脂和具有兩種不同活性炭載荷的纖維化樹脂從于35％血漿/65％合成介質(PASⅢ)的血小板中除去4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的吸附動力學。具體地，圓圈所示的數據代表使用纖維化XAD-16珠的4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的除去；正方形所示的數據代表使用纖維化AQF-500-B的除去；并且三角形所示的數據代表使用纖維化AQF-375-B的除去。如圖6中數據所示，不同纖維化樹脂的4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的吸附動力學都是可比的，并且該纖維化樹脂都顯示出非常好的除去動力學(4小時之后≤0.5μM的殘余4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素)。
還評價了每種纖維化樹脂的血小板收率和體外血小板數據列于表2中。
表2 參照表2，炭基纖維化樹脂提供了損失小于10％的良好血小板收率；正如前面實施例的研究，含XAD-16的纖維化樹脂具有稍高的血小板損失(約17％)。至于pO2，炭纖維化樹脂的5天值與對照可比較。盡管為了實現本發明不需要明白炭纖維化樹脂為什么具有稍高的pH值，但是它可能是從生物曝氣法中由殘余可提取物(例如磷酸鹽)人為造成的；帶有炭基纖維化樹脂的PC貯藏8小時之后觀察到pH(pH=7.3-7.4)快速上升支持了該觀點。使用伴隨有非常少可提取物的USP炭可以消除觀察到的pH最初升高。
碳基纖維化樹脂在形狀變化和聚集試驗上都提供了良好結果。盡管AQF-500-B纖維化樹脂所至的形狀變化好于對照的，但是與AQF-500-B相伴的血小板呈現出稍差的聚集試驗。
實施例3pHEMA包被對吸附劑血相容性的影響該實施例是對用pHEMA包被的Dowex_XUS-43493和含Amberlite_XAD-16的纖維化樹脂比較從血小板中除去4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的動力學和血小板功能和形態。
制備pHEMA包被的吸附劑珠和纖維化樹脂含約50wt％水的Dowex_XUS-43493(商業上稱之為Optipore_L493)是從Dow獲得的，并且具有300kD的粘度平均分子量的聚合HEMA是從Scientific Polymer Products獲得的。在包被之前，將這些吸附劑珠干燥到水分含量＜5％。通過將該聚合物溶解在95％變性醇/5％水中以使pHEMA濃度達到50mg/ml，從而制備pHEMA的儲備溶液。
由International Processing Corp.在具有載荷為約4kg(干)吸附劑的9-英寸Wurster流化床包被器中進行該包被過程。該包被過程涉及60-70g/min的pHEMA流速、50℃的入口溫度和約200ft3/min的空氣流速。在包被過程中移出50g的包被吸附劑樣品，以便獲得3-18％(w/w)pHEMA的包被水平；將用3.7％、7.3％和10.9％pHEMA(w/w)包被的吸附劑珠用于下述研究中。
含未經固定的干(未經過包被的)Dowex_XUS-43493(2.5g)和用pHEMA包被的Dowex_XUS-43493(3.0g或5.0g)的設備是通過將所需質量的吸附劑放入正方形30μm聚酯網袋(7cm×7cm)中制成的。將填充吸附劑的袋插入單獨滅菌的1-升PL 2410塑料容器(Baxter)中，并用脈沖封閉器熱封。之后，含有填充吸附劑的袋的PL-2410塑料容器通過電子束或γ射線(SteriGenics)到2.5MRad滅菌；如上所述，通常優選電子束滅菌。
根據實施例1中所述的方法，Hoechst Celanese制備含Amberlite_XAD-16的纖維化樹脂。將該纖維化樹脂切成正方形(14cm×14cm)，所得片段含約2.5g的干Amberlite_XAD-16。將該纖維化樹脂的Amberlite_XAD-16通過浸泡在含50mg/mL pHEMA的95％乙醇/5％蒸餾水的溶液中同時潤溫和包被。在10分鐘內在生理鹽水中沖洗兩次除去殘余乙醇。該過程獲得約6％(w/w)pHEMA的包被。然后將該纖維化樹脂通過高壓滅菌法在121℃下“濕”循環45分鐘滅菌。之后，將該纖維化樹脂插入單獨滅菌、1-升PL 2410塑料容器(Baxter)中，并在層流通風櫥中使用無菌剪刀、止血鉗子和脈沖封閉器熱封。
pHEMA包被的吸附劑珠和纖維化樹脂與含補骨脂素的PC接觸將單供體單采血小板單元混合在35％自體血漿/65％合成介質(PASⅢ)中制成血小板濃縮物庫。添加4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素，其量實現150μM 4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的最終濃度。然后將所得PC溶液分成300mL單元，并將這些單元放在PL 2410塑料容器(Baxter)中并用3J/cm2的UVA照射。照射之后，將經過處理的PCs轉移到含以下所得片段所示的設備的PL2410塑料容器中。也制備沒有吸附設備的對照樣品。然后將這些PL2410塑料容器放在22℃下的Helmer血小板恒溫箱中并以約70轉/分鐘攪拌。
在首先的8個小時的貯藏中每隔1小時移出每一PC樣品，通過HPLC分析殘余4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素。用含三甲基補骨脂素(TMP)的樣品稀釋劑(最終濃度=35％甲醇，25mMKH2PO4，pH=3.5)作為內標準將每種PC樣品稀釋5倍。通過在4℃下將這些樣品培養30分鐘，蛋白質和其它大分子沉淀。然后將這些樣品離心分離且將上層清液過濾(0.2微米)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM4.6mm×250mm)上通過在20分鐘內流出從65％溶劑A(25mMKH2PO4，pH=3.5)，35％B(甲醇)到80％B的線性梯度進行分析。
通過在Baker System 9118 CP上計數血小板測定用纖維化樹脂或含未經固定的吸附劑的設備的5-天貯藏期間之后的血小板收率。使用Ciba-Corning 238 pH/Blood Gas Analyzer評價血內氣體和pH。使用用于形態、形狀變化、低滲休克反應、聚集和GMP-140(p-選擇蛋白)表達的試驗評價與纖維化樹脂或含未經固定的吸附劑的對照設備接觸5天之后的體外血小板功能。形狀變化、聚集和低滲休克反應是使用Chrono-Log Lumi-Aggregometer評價的，同時GMP-140是使用Becton-Dickinson FACScan Fluorescence Analyzer通過流式細胞術測定的。
pHEMA包被對補骨脂素的除去的影響圖7比較了用經pHEMA包被的和未經包被的Dowex_XUS-43493珠從于35％血漿/65％合成介質(PASⅢ)的血小板中除去4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的吸附動力學。具體地，用3.0g用3.7％(w/w)pHEMA包被的Dowex_XUS-43493除去4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素是用圓圈表示的，用7.3％(w/w)pHEMA包被的是用三角形表示的，并且用10.9％(w/w)pHEMA包被的是用菱形表示的；正方形代表用2.5g(干)未經包被的Dowex_XUS-43493除去4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素。如圖7中數據所示，4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素吸附的動力學隨pHEMA包被水平的增加而降低。盡管為了實現本發明不需要明白該機理，但是該降低據信是由于4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素擴散到吸附劑顆粒內的抗性增加。
同樣用3.7％、7.3％和10.9％(w/w)pHEMA包被的Dowex_XUS-43493測定4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素除去的吸附動力學。結果(未顯示)說明包被有10.9％pHEMA的珠的除去動力學是可與未經包被的(對照)珠相比較的。
pHEMA包被對血小板收率的影響在兩個研究中在每種中使用不同量吸附劑(3.0g和5.0g)但相同水平的pHEMA包被(3.7％、7.3％和10.9％[w/w])測定pHEMA包被對血小板收率的影響。相對未與含未經固定的吸附劑的設備接觸的經過處理的PC的5天的血小板數計算血小板收率。如表3中結果所示，當試驗3.0g的XUS-43493時，隨著pHEMA包被水平的增加在5天的血小板上存在稍許的劑量反應；因此這些結果建議低水平的pHEMA包被可能是最有效的，這是因為低水平的pHEMA包被對4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的除去動力學的影響更小同時其仍然抑制血小板粘附到吸附劑表面上。與用3.0g的XUS-43493看到的稍許影響相反，當試驗5.0g時觀察到劑量反應-pHEMA包被水平的增加增加了5天血小板收率。但是，收率仍然比使用3.0g吸附劑珠時觀察的低。
表3

表3中所示的結果建議使用較低量的吸附劑(例如，2.5-3.0g)和低水平pHEMA包被(例如，≤3.0％w/w)將提供最好的血小板收率。如上所述，pHEMA包被的最佳水平是觀察到對血小板收率和體外血小板功能的保護效果的最小包被。
pHEMA包被和滅菌對血小板功能的影響前面說明了由于pHEMA包被可以通過輻照交聯或裂開，因此滅菌方法可以對吸附劑功能有很大影響。為了評價該影響，用經pHEMA包被(3.7％w/w)和未經包被的未經固定的XUS-43493的設備經2.5 MRad電子束或2.5MRadγ射線滅菌進行試驗。將含2.5g(干)的未經固定的包被或未經包被的XUS-43493的每一設備裝入正方形30μm聚酯網袋(7cm×7cm)中；含經過處理的PC的對照單獨貯藏在PL 2410塑料容器中。結果列于表4中。
表4
參照表4，與對照相比5天的pH值顯示是非常穩定的。用含未經固定的未包被的吸附劑的設備測定的pO2值稍微升高，這暗示代謝稍稍降低；用pHEMA包被顯示出降低該影響，含未經固定的吸附劑的電子束滅菌的設備的結果比γ射線滅菌的設備的更接近對照。
經pHEMA包被的樣品都具有非常好的血小板收率，電子束滅菌的樣品呈現稍稍更好些。形狀變化和聚集呈現出與收率相似的模式，含未經固定的未包被吸附劑的設備提供最低值并且經pHEMATF/電子束滅菌的樣品提供與對照相似的較高值。用含未經固定的吸附劑的設備處理的樣品在低滲休克反應(HSR)試驗方面與對照相同或比對照好。用含未經固定的吸附劑的設備處理的樣品比對照具有更低的形態得分，但GMP-140試驗顯示出更低水平的活化。
進行另一血相容性研究以比較含未經固定的未經包被的XUS-43493的設備(2.5g珠；30μm聚酯網袋；7cm×7cm)、含Amberlite_XAD-16的未經包被的纖維化樹脂(14cm×14cm)和含經pHEMA包被的Amberlite_XAD-16的纖維化樹脂。表5中所示的結果顯示了pHEMA在纖維化樹脂上的良好效果。
表5
由表5中關于體外血小板功能和血小板收率的數據說明，用pHEMA包被給纖維化樹脂帶來的pO2值更接近對照所觀察到的。經pHEMA包被的纖維化樹脂也比未經包被的纖維化樹脂呈現出更高的血小板收率。結果顯示出經pHEMA包被的纖維化樹脂在所有體外血小板功能試驗中比未經包被的XUS-43493珠表現得好。而且，未經包被的纖維化樹脂在大多數體外血小板功能試驗中比未經包被的XUS-43493珠表現得好。
實施例4甘油和聚乙二醇對吸附劑能力的影響該實施例試驗甘油和聚乙二醇作為穩定劑對從血漿中除去氨基補骨脂素的吸附劑能力和動力學的影響。在該實施例的試驗中使用自由(即未經纖維化)Amberlite_XAD-16和Dowex_XUS-43493吸附劑珠。
方法在80℃的烘箱中將Amberlite_XAD-16 HP(Rohm and Haas(Philadelphia，PA))和Dowex_XUS-43493(Supelco，Bellefonte，PA)干燥到水分＜5％。將已知量的吸附劑浸泡在含0-50％甘油、50％PEG-200或50％PEG-400(甘油、PEG-200和PEG-400來自Sigma)的乙醇溶液中。接著在室溫下培養15分鐘，除去過量溶劑并將這些樣品在80℃下干燥一整夜；避免在＞120℃的溫度下干燥該吸附劑，這是因為在更高溫度下優先觀察到吸附劑性能(例如，孔熔融)改變。干燥之后，稱重吸附劑樣品以確定單位質量吸附劑中穩定劑的量。
進行幾個單獨的研究。在如下所述的研究中包括“未經潤濕”吸附劑的對照樣品和“經最佳潤濕”的吸附劑。未經潤濕的吸附劑樣品是未經受任何預處理的干燥吸附劑，而且經最佳潤濕的吸附劑樣品是通過用30％乙醇/70％dH2O潤濕吸附劑制成的。將經最佳潤溫的吸附劑用dH2O沖洗以除去殘余乙醇。為了確保不發生干燥，在吸附研究之前制備該吸附劑。
使用含150μM摻加有3H-4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的100％人體血漿進行每種吸附研究。將血漿(6.0mL)添加到含有用不同穩定劑處理過的吸附劑的小瓶中。校正吸附劑的量以便甘油或PEG內容物提供0.2g吸附劑。將這些小瓶放在旋轉裝置中并在室溫下攪拌。在不同時間移出血漿樣品并測定殘余3H-4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的水平。將樣品(200mL)稀釋在5.0mL的OptiphaseHiSafe Liquid Scintillation Cocktail(Wallac)中并在Wallac 1409Liquid Scintillation Counter(Wallac)中計數。
用甘油處理過的Amberlite_XAD-16和Dowex_XUS-43493的吸附能力圖8比較了用含不同水平甘油的乙醇溶液對Amberlie_XAD-16和Dowex_XUS-43493的預處理對100％血漿中相關4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素吸附能力的影響。在80℃下干燥48小時之前將吸附劑樣品在乙醇/甘油溶液中潤濕15分鐘。在4小時的接觸之后進行吸附能力的單個測定。參照圖8，在X-軸上所示的甘油含量為甘油在乙醇中的重量/體積百分率。在Y-軸上所示的吸附能力是相對經最佳潤濕的吸附劑樣品的吸附能力的百分率。XUS-43493的吸附能力用正方形表示，XAD-16的用圓圈表示。
如圖8中數據所示，XAD-16的能力從干燥樣品中的約30％增加到在205甘油溶液中潤濕的樣品中的90％以上。這些結果說明了干燥之后為了保持高吸附能力需要非常低水平的甘油。在干燥之前在50％乙醇/50％dH2O(無甘油)中潤濕的對照樣品顯示出與經過干燥的未經處理的樣品相同的吸附能力。相反，這些XUS-43493樣品未顯示出甘油對吸附能力的任何影響；在所有水平的甘油下吸附能力接近100％。盡管對本發明的試驗沒有決定性作用，但是該發現支持甘油起到干燥過程中防止吸附劑孔塌陷的假說；因為XUS-43493具有高度交聯結構，進行干燥時它不遭受孔塌陷。
用甘油處理的樣品顯示出對干燥非常穩定。樣品在層流通風櫥中貯藏7天觀察不到吸附能力的變化(數據未顯示)。
在本發明的一個優選實施方式中，將2.5g干燥吸附劑用于從每個單元的血小板中除去補骨脂素和補骨脂素光合產物。在30％甘油/70％乙醇中浸泡該吸附劑，接著干燥，使吸附劑含約50％甘油。因此一個5.0g的樣品應含2.5g干吸附劑和2.5g甘油。這樣，典型的300mL單元的血小板應含0.8％的甘油，一個被認為可接受用于輸血的水平。
用甘油或PEG處理過的Amberlite_XAD-16和Dowex_XUS-43493的吸附能力用低分子量聚乙二醇PEG-200和PEG-400、非揮發性且能溶于乙醇和水中的低毒性試劑進行另外的研究。在乙醇中的50％的PEG-400、PEG-200或甘油溶液中將吸附劑樣品處理15分鐘。圖9比較了穩定劑對干燥吸附劑Amberlite_XAD-16(下面)和Dowex_XUS-43493(上面)在100％血漿中的4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素吸附能力的影響；未經潤濕的樣品標為“No Tx”。吸附能力是以相對經最佳潤濕的吸附劑的能力的百分率來報道的。
正如圖9中數據所示并以其“大網絡”結構為基礎預測，Dowex_XUS-43493的能力不受干燥(“No Tx”樣品)影響。相反地，干燥后Amberlite_XAD-16約為最大能力的35％。用甘油、PEG-200和PEG-400處理XAD-16都提高了干燥吸附劑的能力；每個吸附劑能力都大于90％，其中甘油＞PEG-200＞PEG-400。盡管為了實現本發明不需要明白其準確作用機理，但是甘油和兩種PEG溶液之間的能力的差異可能是穩定劑的滲透隨分子量的增加而降低造成的。也就是說，在15分鐘的應用過程中，甘油(MW=92.1)可能比由于其尺寸大因此擴散更慢的PEG-200(MW=190-210)或PEG-400(MW=380-420)能夠更完全地滲透到吸附劑孔中。
用甘油或PEG處理過的Amberlite_XAD-16的吸附動力學同樣進行研究以確定用甘油或PEG填充吸附劑的孔是否導致相反動力學降低。圖10比較了使用幾種不同溶液中的Amberlite_XAD-16從100％血漿中經過3小時的4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的吸附。具體地說，圖10中的數據代表XAD-16 ⅰ)干燥前用50％甘油溶液潤濕過(實線連接的空心正方形)，ⅱ)干燥之前用50％的PEG-400溶液潤濕過(虛線連接的黑圓圈)，ⅲ)預潤濕過，即在開始研究之前用50％乙醇/50％dH2O潤濕過(虛線連接的黑三角形)，和ⅳ)未經過任何處理的(實線連接的黑正方形；“No Tx”)。圖10中的數據證實了在50％甘油/50％乙醇或50％PEG-400/50％乙醇溶液中潤濕的Amberlite_XAD-16樣品的吸附動力學與在乙醇中經最佳潤溫的樣品(即用乙醇預處理的樣品)的吸附動力學非常接近。經干燥但未經處理的XAD-16樣品(No Tx)通過3小時僅僅實現約30％的除去。
本實施例中所示的數據說明了用含50％乙醇和50％甘油、PEG-200或PEG-400的溶液形式的穩定劑處理Amberlite_XAD-16可以防止與干燥相伴的吸附能力的喪失。用這些穩定劑獲得的結果暗示低分子量潤濕劑代表用于增強吸附劑功能的可使用的方法。
實施例5從FFP中除去亞甲藍本實施例涉及各種不同聚合吸附劑材料從鮮凍血漿中除去亞甲藍的能力。
本實施例的試驗評價“自由”吸附劑樹脂(即，未加入含未經固定的吸附劑的設備)和纖維化樹脂。所試驗的這些自由吸附劑樹脂是Amberlite_XAD-16 HP(Rohm and Haas)、MN-200(Purolite)和Dowex_XUS-43493(Dow Chemical Co.)。該XAD-16 HP以水合狀態進來以便不需要預處理(即，不潤濕)，并且該MN-200也以完全水合的狀態提供；該XUS-43493為干的。
含XAD-16的纖維化樹脂通常是以實施例1中所述制備的。簡單地說，將含130g/m2XAD-16的2cm×7cm(即14cm2)的纖維化樹脂條首先在70％乙醇中潤濕，然后用蒸餾水徹底沖洗。
亞甲藍(10mM)儲備溶液是通過將U.S.P.亞甲藍(Spectrum)溶于蒸餾水中制成的。將該亞甲藍儲備溶液添加到100％血漿樣品中得到10μM的最終濃度。將“自由”吸附劑樹脂樣品(即，XAD-16 HP、MN-200和XUS-43493)稱入50mL聚丙烯管中用于吸附研究。通過干燥測定質量丟失確定每種吸附劑的水分含量。用水分含量校正每種吸附劑的質量以便每種相當于使用0.25g干吸附劑。
向每一小瓶中添加30mL含10μM亞甲藍的100％血漿樣品。在室溫下將這些小瓶放在旋轉裝置上。以間隔15分鐘從每一小瓶中除去樣品(200mL)并通過HPLC鑒定剩余亞甲藍。用樣品稀釋劑(最終濃度=35％甲醇，25mM KH2PO4，pH=3.5)將每種血漿樣品稀釋5倍。通過在4℃下將這些樣品培養30分鐘使蛋白質和其它大分子沉淀。將樣品離心分離并將上層清液過濾(0.2μm)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM，4.6mm×250mm)上通過在20分鐘內流出從65％溶劑A(25mM KH2PO4，pH=3.5)、35％B(甲醇)到80％B的線性梯度經過分析。HPLC試驗的檢出極限為約0.5μM亞甲藍。
圖11比較了在2小時內從100％血漿中吸附亞甲藍的動力學。參照圖11，XAD-16 HP數據由虛線連接的空心菱形所示，MN-200數據由實線連接的黑三角形所示，XUS-43493數據由虛線連接的空心圓圈所示，并且含XAD-16的纖維化樹脂由實線連接的黑正方形所示。正如這些數據所示，該XAD-16 HP和MN-200提供了最快的吸附動力學，接著是XUS-43493。正如XUS-43493以其干燥狀態時使用的，其動力學稍慢些可能是由于其潤濕較慢所至。最后，含XAD-16的纖維化樹脂具有最慢的吸附動力學。這可能是在批次培養過程中，由于14cm2的纖維化樹脂條的一部分在整個吸附研究中未完全浸泡在血漿中，因此降低了吸附劑和血漿之間的有效接觸面積，致使纖維化樹脂和血漿之間接觸較差。
這些數據說明了可以使用在本發明中嘗試使用的樹脂和纖維化樹脂從血液制品中除去如酚噻嗪染料的非補骨脂素的補骨脂素失活化合物。
實施例6從經過包裝的紅血球中除去吖啶化合物本實施例涉及各種不同樹脂材料將吖啶化合物從經過包裝的紅血球(PRBC)中除去的能力。更具體地說，本實施例的試驗評價從PRBC中除去該吖啶化合物，5[(β-羧乙基)氨基]吖啶。
幾種吖啶的化學結構列于圖12中。如圖12所示，9-氨基吖啶和5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶為氨基吖啶。
樹脂選擇性用幾種類型的樹脂研究化合物5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的平衡吸附。所評價的聚合吸附劑樹脂是Amberlite_XAD-2、XAD-4、XAD-7和XAD-16 HP(Rohm and Haas)；Purolite_MN-150、MN-170、MN-200、MN-300、MN-400、MN-500和MN-600；和Dowex_XUS-43493和XUS-40285(Dow Chemical Co.)。此外，試驗幾種Amberlite_陰離子交換樹脂(IRA-958、IRA-900、IRA-35、IRA-410和IRA-120；Rohm andhaas)和Amberlite_弱陽離子交換樹脂(DP-1；Rohm and haas)。而且，評價幾種炭，包括Hemosorba_AC(Asahi)、PICA G277和Norit ASupra(都可從American Norit商購獲得)。最后，還試驗Porapak_RDx(Waters)，一種具有硝基芳香族化合物親和力的苯乙烯乙烯基吡咯烷酮共聚物。
最初，用每種樹脂樣品評價5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和腺嘌呤(6-氨基嘌呤)的能力來進行平衡吸附研究。稱重約0.1g樹脂并轉入6mL聚丙烯管中。將在蒸餾水中的含100μM5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的25％血漿/75％Adsol_(Baxter)的5.0mL等分試樣添加到每一管中。典型地將例如紅血球的細胞制品貯藏在含低百分率的血漿(10-35％)和剩余合成介質的介質中；Adsol_一種由在鹽溶液中的腺嘌呤、葡萄糖和甘露糖醇組成的合成介質的例子。當然，本發明嘗試使用在血漿和其它合成介質的混合物中的吖啶濃縮物而不是100μM。接下來，將這些管放在滾筒攪拌器上并在室溫下培養3小時。培養之后，移出每種樣品的等分試樣通過HPLC分析殘余5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和腺嘌呤。
就HPLC過程而言，用樣品稀釋劑(50％甲醇，25mM KH2PO4，pH=3.5)將每種樣品稀釋2倍，通過在4℃下將這些樣品培養30分鐘使蛋白質和其它大分子沉淀。然后將這些樣品離心分離并將上層清液過濾(0.2μm)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM，4.6mm×250mm)上通過在20分鐘內流出從75％溶劑A(25mM KH2PO4，pH=3.5)、25％B(甲醇)到80％B的線性梯度進行分析。就5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶除去而言，在Cf=1μM下的估計能力(μmole/g)是由具有C0=100μM的單個吸附測定確定的；該結果列于表6第2列(ND=不能測出)。就腺嘌呤而言，在Cf=1mM下的估計能力(mmole/g)是由具有C0=1.5mM的單個吸附測定確定的；該結果列于表6第3列(ND=不能測出)。
表6
當嘗試使用任何能夠吸附吖啶化合物的樹脂時，優選的樹脂選擇性地越過腺嘌呤吸附5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶并呈現出較低溶血。圖13為不同樹脂的腺嘌呤能力(Y-軸)和5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶能力(X-軸)數據的曲線。如表6和圖13中的數據所示，Dowex_XUS-43493和Purolite_MN-200樹脂具有最高的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶能力；而且，當同時考慮高5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶能力和低腺嘌呤能力時，Amberlite_XAD-16 HP比較理想。
本實施例中所述的體外試驗的結果暗示Dowex_XUS-43493和所述樹脂Purolite_MN-200為從PRBC中除去吖啶化合物的優選樹脂。
實施例7用苯乙烯-二乙烯基苯吸附劑從包裝的紅血球中除去吖啶化合物本實施例涉及各種不同苯乙烯-二乙烯基苯(苯乙烯-DVB)吸附劑從血液制品中除去氨基吖啶化合物的能力。更具體地說，本實施例的試驗評價從血漿/Adsol_溶液中除去吖啶橙和9-氨基吖啶(如圖12所述)。
A.試驗步驟就本實施例的試驗而言，在蒸餾水中制備5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶(Cerus)和吖啶橙(Aldrich)的儲備溶液(10mM)，并在乙醇中制備9-氨基吖啶(Aldrich)的儲備溶液(10mM)。將該5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶添加到含25％血漿/75％生理鹽水的溶液中以達到最終濃度100μM，同時將該吖啶橙和9-氨基吖啶化合物添加到含25％血漿/75％Adsol_(Baxter)防腐溶液中以達到最終吖啶濃度100μM。
所用吸附劑為Amberlite_XAD-16 HP(Rohm and Haas)；Purolite_MN-200和Dowex_XUS-43493(Supelco)。通過測定干燥后質量丟失來測定每種吸附劑的水分含量；校正水分含量以便使用0.25g干的每種吸附劑的等價物。將吸附劑準確稱取到50mL Falcon管中。向含吸附劑的每一管中添加30mL含100μM吖啶的25％血漿/75％Adsol_溶液。然后在室溫下將這些管放在旋轉裝置上，并貯藏以后分析用。
通過HPLC分析樣品中殘余吖啶水平。用樣品稀釋劑(50％甲醇，25mMKH2PO4，pH=3.5)將每種樣品稀釋2倍，通過在4℃下將這些樣品培養30分鐘使蛋白質和其它大分子沉淀。然后將樣品離心分離并將上層清液過濾(0.2μm)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM，4.6mm×250mm)上通過在20分鐘內流出從75％溶劑A(25mMKH2PO4，pH=3.5)、25％B(甲醇)到80％B的線性梯度進行分析。使用一二極管數組檢測器通過可見吸光度在400nm下檢測9-氨基吖啶、在490nm下檢測吖啶橙并在410nm下檢測5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶。
B.吸附動力學從25％血漿/75％生理鹽水中經過3小時對5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的吸附比較Dowex_XUS-43493、Purolite_MN-200和Amberlite_XAD-16 HP的吸附動力學。圖14A和圖14B都顯示了殘余5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶與時間的函數，圖14B顯示對數刻度的數據。在圖14A和圖14B中，XAD-16 HP數據由虛線連接的黑圓圈所示，MN-200數據由虛線連接的黑正方形所示，XUS-43493數據由實線連接的黑三角形所示。由這些數據說明，XUS-43493和MN-200具有最快的吸附動力學并且幾乎等價。XAD-16 HP顯示具有較低的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶能力。
圖15比較了用Dowex_XUS-43493從25％血漿/75％Adsol_中除去9-氨基吖啶和吖啶橙的吸附動力學。參照圖15，虛線連接的黑正方形代表9-氨基吖啶，實線連接的黑圓圈代表吖啶橙。由這些數據說明，超過3小時檢測不到9-氨基吖啶水平。比較起來，Dowex_XUS-43493對吖啶橙的能力較低，這可能是由于在吖啶橙上有兩個季氨基。
實施例8制備用-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物和谷胱甘肽處理過的PRBC。用新鮮的ABO-匹配的全血制備PRBC庫。使用Beckman Sorvall RC3B離心分離機在3800rpm下將這些全血單元離心分離5分鐘。使用一壓榨器將血漿在另一干凈袋中壓榨。如果需要一個以上單元時，將這些PRBC單元合并在3.0L大小的Clintec Viaflex袋中。向每一單元的PRBC添加94mL的Erythrosol。通過將血液制品填充到毛細管中并將其旋轉5分鐘來測定血細胞比容(HCT)百分率。測定血細胞比容以確保其不低于55％。向每種100mL的PRBC中添加3.3mL的12％葡萄糖。測定最終血細胞比容百分率。將PRBC(300mL)再填充到塑料容器PL146(Baxter Healthcare)中。向血袋中添加6.0mL的150mM谷胱甘肽以達到3.0mM最終濃度以及添加3.0mL的30mM 5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物以達到300μM最終濃度。使用腕作用搖動器(廠商)將該PRBC混合物攪拌1分鐘。將經5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物和谷胱甘肽處理過的PRBC在室溫下整夜培養以使該5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物分解成5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶。
實施例9在PRBC和PRBC上層清液中的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的HPLC試驗。將該樣品(100μL)用100μL生理鹽水稀釋并將所得混合物渦旋。向該溶液中添加300μL在CH3CN中的20mM H3PO4，將該混合物渦旋15秒鐘。在13200rpm下將該樣品離心分離5分鐘。將該上層清液(200μL)稀釋進800μL的冷0.1M HCL中并經渦旋。通過使用0.2μm GelmanAcrodisc過濾器將該樣品填充到自動采樣器中。HPLC條件如下(柱和常規柱的廠商和部件號)柱=Zorbax SB-CN，4.6mm×150mm，3.5μm顆粒；保護柱=(4.6mm×12.5mm，5μm顆粒(Mac Mod Analytical，Inc.(Chadds Ford，PA))；移動相A為在HPLC水中的10mM H3PO4；移動相C為在乙腈中的10mM H3PO4；溫度為20℃；樣品體積為100μL；梯度條件如下

DAD設置如下

實施例10在PRBC和PRBC上層清液中的谷胱甘肽的HPLC試驗。該樣品是按照如上所述HPLC試驗制備的。HPLC條件如下分析柱=YMC ODS-AM-303，250mm×4.6mm，5μm顆粒；保護柱=Brownlee，15×3.2mm，7μm顆粒；移動相A為在HPLC水中的10mMH3PO4；移動相C為在乙腈中的10mMH3PO4；溫度為15℃；樣品體積為75μL；梯度條件如下

DAD設置如下

實施例11篩選吸附劑的方法。使用含25％血漿和75％Erythrosol的試驗溶液代表PRBC中的上層清液。將Erythrosol制備作為兩個經單獨殺菌的分開的儲備溶液部分(溶液C和溶液D)。將等體積的溶液C和溶液D混合制得最終溶液。

將血漿-Erythrosol溶液摻加5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶至300μM的最終濃度。向該混合物中添加谷胱甘肽(還原形式，Sigma Chemical Co.)以獲得3mM的最終濃度。將吸附劑樣品(0.2-0.8g)準確稱取(±0.001g)在進確定空瓶重的7mL帶螺旋塞蓋的小瓶中。將需要預潤濕的吸附劑樣品懸浮在70％乙醇中，將該吸附劑靜置并除去上層清液。通過將吸附劑再懸浮在蒸餾水中、使該吸附劑靜置并傾析該上層清液以除去殘余乙醇。當計算吸附劑能力時根據水分含量校正吸附劑質量。向每一管中添加5.0mL血漿/Erythrosol等分試樣。將這些管放在旋轉裝置上并在室溫下翻轉24小時。從旋轉裝置中移去這些小瓶并將吸附劑靜置。從每一管中除去上層清液樣品。離心分離樣品以除去殘余吸附劑。通過HPLC分析樣品以測定5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶殘余水平。使用如上所述的反相試驗檢測谷胱甘肽的殘余水平。吸附劑篩選的結果示于表7和8中。
表7吸附劑篩選-從25％血漿/75％Erythrosol中除去5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶(“LOD”為檢測極限) 表8吸附劑篩選-從25％血漿/75％Erythrosol中除去谷胱甘肽 實施例12吸附劑的吸附能力。進行吸附等溫線試驗以測定各種類型的吸附劑的吸附能力(μmole5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶/g吸附劑)。圖17顯示了與Purolite MN-200的吸附等溫線相比由幾種Ambersorb獲得的吸附等溫線。在含0.2-3mM 5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和0.6-10mM GSH的25％血漿/75％Erythrosol溶液中進行吸附研究。在室溫下將樣品攪拌24小時。使用表7(22μmole/g)中吸附能力計算測定應需要約4gPurolite MN-200將300mL的PRBC單元中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的水平從300μM減少到最終水平1μM。需要低于1g的Ambersorb572(130μmole/g)以實現可比較的除去。簡單的計算評價應需要低于1g的Ambersorb 572將300mL的PRBC單元中GSH的水平從150mL上層清液(50％HCT)中的6mM減少到最終水平500μM。
實施例13分解產物的長期除去。
本試驗檢驗PRBC在暴露24小時之后除去纖維化PICA G-277活性炭設備(AQF，7.3g.500m2/g)后其中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和GSH的水平。在PRBC具有連續設備暴露的地方平行地進行該研究。圖18顯示了在1-4周的貯藏中在沒有設備的情況下上層清液樣品中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和GSH的濃度高得多。
在有除去設備(MN-200)的情況下在貯藏35天之后在最初搖動的PRBC中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的濃度減少到5μM。這說明在4℃下在靜止貯藏條件中的確發生了5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶除去。
實施例14封閉材料(膜、編織、無紡)對IAD的影響經調查使用封閉材料包圍吸附劑介質用于顆粒留住的最初目的。該最初目的是留住顆粒。但是，通過防止RBCs和膜之間接觸膜可以改善設備的血相容性。可以容易地使用親水聚合物(PEO、PEG、HPL)調節膜以改善血相容性但不改變功能。通過熱封膜、編織聚酯或無紡聚酯材料包圍約10g的纖維化Pica G277活性炭介質(AQF 500g/m2)。將PRBC單元(300mL)用300μM可降解的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物和3mMGSH配料，在室溫下在血小板震動器中保持20小時，然后輸入IAD。在24小時內監測5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的濃度。圖19顯示了300mL暴露到由纖維化Pica G277活性炭(500g/m2)組成的IAD并用膜、編織或無紡材料封住的PRBC單元的上層清液中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的水平。將PRBC(Erythrosol、葡萄糖、62％HCT)用300μM的可降解的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物和3mM GSH配料，在輸入IAD之前在室溫下在血小板震動器中攪拌。在室溫下將含PRBC的IAD攪拌24小時。
這些研究說明Tetko封閉物顯示出24小時內5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的最快的除去動力學。在2周后所有封閉材料達到的最終濃度是相似的，1天后5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶濃度降低到約2μM，但8天左右升回到10μM。
實施例15化合物吸附設備對紅血球功能的影響。紅血球功能指示器監測不同設備構型的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和GSH除去試驗的整個過程。測定的參數包括溶解百分率、ATP和K+濃度。表9顯示出ATP濃度一般不受化合物除去設備的存在影響使用MN-200或Pica G277設備的ATP濃度的降低與對照(沒有IAD)的大致相同。發現PRBC中K+的水平隨時間推移而增加。發生除去時的溫度不影響在化合物除去設備中暴露20天的PRBC單元中的K+水平。但是，當暴露時間延長到35天時，PRBC中K+增加的速度隨吸附劑類型而變化，MN-200和PICA G-277設備分別到達40和45mmol/L的最終水平，而沒有設備的對照到達39mmol/L。在經設備暴露過的和沒有設備的對照PRBC單元中溶解的紅血球的百分率通常已發現在24小時之后為0.1-1％之間。如表10和表11所示和圖20和21的圖示，溶解百分率隨所用吸附劑類型有很大的變化。表10顯示了PRBC暴露到兩類固定吸附設備中35天后的溶解值。表11顯示了PRBC暴露在封閉在編織聚酯網中的松散吸附劑顆粒中42天后獲得的溶解值。在1分鐘內使用手腕作用震動器配制所有PRBC單元，之后將該PRBC在室溫下靜置4小時。將這些設備在血小板震動器上在室溫下保持24小時，之后在研究期間將它們在4℃下靜置。固定MN-200比固定PICA G-277顯示出較低的溶血水平，同時松散顆粒吸附劑相比Ambersorb合成含炭吸附劑顯示出最低的溶血水平。MN-200IAD顯示出比相同但未經固定的吸附劑低的溶血。與未經固定的吸附劑相比對其它IAD觀察到相似的觀測。
表9.整個過程中PRBC中ATP的濃度(μmol/dL) 表10.在整個時間內暴露在不同IAD中的PRBC(56％HCT)溶解百分率 表11.暴露于封閉在織制網中的不同松散顆粒吸附劑中的PRBC(55％HCT)溶解百分率
舉例說明了吸附劑顆粒在保持紅血球功能方面的決定性性能。列出了五個不同吸附劑對紅血球溶血的影響的比較性研究。Ambersorb 572在24小時暴露之后僅在PRBC(55％)中產生0.16％的溶血，而且Darco AC(Norit Americas，Inc.(Atlanta，GA))產生0.13％的溶血。這些吸附劑在使紅血球溶血方面比Purolite MN-200、Hemosorba CH-350和Pica G277吸附劑好得多。
表12顯示了含谷胱甘肽和5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的紅血球樣品的上層清液與大量不同吸附劑接觸的比較性研究。活性炭是基本上既能降低5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶濃度又能降低谷胱甘肽濃度的僅有類型的吸附劑。天然活性炭(Norit和PICA)和合成活性炭(Ambersorb)在化合物降低方面都證明是有效的。
表12.幾種不同吸附劑的性能 @PS-DVB=聚苯乙烯-二乙烯基苯，AC=活性炭＾所列為“＞”的值是在試驗LOD之下對殘余水平的單個測定*由25％血漿、75％Erythrosol中單點吸附研究得到的評價
+由25％血漿、75％Erythrosol中多點吸附研究得到的評價實施例16由粘附在無紡聚酯纖維基質(Hoechst-L493)上的Dowex OptiporeL-493組成的纖維化介質已由Hoechst Celanese的AQF部(Charlotte，NC)生產。在用于血小板的批量除去設備中進行該吸附劑介質的性能的評價。
血小板制備在300mL的35％自體血漿、65％PASⅢ中含3.5-4.5×1011血小板的單供體分離性輸血血小板單元是從Sacramento Blood Bank Center獲得的。將4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素(BaxterHealthcare)添加到每一血小板單元中以達到150μM的最終濃度。將血小板單元(4-5個)合并在單個PC-2410塑料容器中并充分混合。將該血小板混合液均勻分入4-5個1L PL2410塑料容器中，每個容器約含300mL血小板混合物。將這些單元用3.0J/cm2UVA處理并移入適當除去設備中進行研究。所有試驗都包括經光化學處理(150μM補骨脂素，3.0J/cm2UV-A)但不與除去設備接觸的對照血小板單元。
設備制備含2.5g Dowex XUS 43493的標準除去設備是由Baxter HealthcareCorporation(Lot FX1032 D96F20042R)制備的。試驗的IAD是用供應作為軋輥原料的Hoechst-L493介質(Hoechst Celanese Corp.)制備的。將介質測定并切割成具有每個IAD的適宜吸附劑量(5.0g和7.5g)。將所切割的介質方在由脈沖焊30μm聚酯網(Tetko)構成的袋中。含這些介質的網袋經高壓滅菌(121℃，20min)并放入無菌PL 2410塑料容器中。或者，將網袋放入PL 2410容器中，將這些容器密封并將該整個裝置通過至2.5MRad的γ射線(SteriGenics)滅菌。在經過光化學處理的血小板轉移之前使用注射器將設備中剩余空氣手工抽空。
吸附動力學在用4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素+UVA的光化學處理之后，將這些血小板混合物送入帶有除去設備的PL2410塑料容器中。將這些設備放在標準血小板培養箱(Helmer)中并在22℃下以70轉/分鐘攪拌。每隔1小時取出血小板混合物樣品用于首先的8小時貯藏。這些樣品在4℃下貯藏并且隨后通過HPLC分析分析殘余4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素。該試驗涉及溶解血小板并溶解4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素且無光合產物的最初樣品制品。樣品制品的上層清液是用在KH2PO4緩沖液中梯度增加的乙醇在C-18反相柱上分析的。
體外血小板功能將血小板混合物與除去設備攪拌接觸7天。在一個研究中，血小板混合物與IAD接觸24小時并使用無菌管焊機(Terumo SCD 312)轉移到無菌1L PL2410塑料容器中。將血小板放回到血小板培養箱中并貯藏7天貯藏期間的剩余時間。
貯藏5或7天之后，測定每個血小板單元中的血小板數和pH。使用CIBA-Corning model 238 Blood Gas Analyzer測定pH和pO2/pCO2。使用Baker 9118+Hematology analyzer測定每個樣品中的血小板數。。進行幾個試驗以評價體外血小板功能。使用Chrono-Log model 500 VSwhole blood aggregometer監測血小板樣品的形狀變化。形狀變化是以添加ADP之后光傳輸的最大變化與添加EDTA之后光傳輸的變化之比來定量的。
血小板對低滲壓的反應是通過低滲休克反應(HSR)試驗來評價的。添加低滲溶液之后光傳輸的變化是使用Chrono-Log model 500 VSwhole blood aggregometer測定的。數據是以吸光度達到其最小值之后2分鐘由低滲壓回收的百分率來報道的。
血小板對ADP/膠原激動劑反應而集聚的能力是通過Chrono-Logmodel 500 VS whole blood aggregometer測定的光傳輸的變化來說明的。
血小板的狀態是通過對血小板打分來評價的。樣品被蒙蔽并且將100個血小板的形態學得分合計為每個樣品的得分。最高可能得分為400(圓盤狀=4，中間體=3，球狀=2，樹狀=1，氣球狀=0)。
血小板活性是通過測定p-選擇蛋白(Granular Membrane Protein，GMP-140)的表達來說明的。將CD62抗體用作試驗樣品，將老鼠對照IgG1用作負對照，將帶有乙酸肉豆蔻氟波醇(PMA)的CD62抗體用于正對照。在FACScan(Becton Dickinson)上分析樣品。報道的活性百分率是與正對照相比的并且是試驗值和負對照值的差。
吸附動力學調查吸附劑珠加入纖維基質中的影響。含有于300mL的35％血漿、65％PASⅢ中4.0×1011個血小板的血小板單元經150μM 4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素+3.0J/cm2UVA處理。IAD是由具有450g/m2的吸附劑載荷的Hoechst-L493制備的。這些IAD經過γ射線滅菌。用補骨脂素+UVA處理之后，將這些血小板轉移到除去設備中。每隔1小時移出樣品并通過HPLC分析殘余4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素。圖22比較了含5.0g和7.5gHoechst-L493介質的IAD和含2.5g松散珠的標準除去設備的IAD的4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的除去動力學。IAD或者含5.0gHoechst-L493(三角形)、7.5g Hoechst-L493介質(正方形)或者含2.5g松散Dowex L493吸附劑珠(圓圈)。Hoechst-L493介質含載荷為450g/m2的吸附劑珠。
當與相同量松散吸附劑珠比較時Hoechst介質的4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的吸附動力學較慢。含2.5g松散珠的除去設備在短時間(1小時)內使殘余4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的水平達到最低。但是，在較長時間時，7.5g和5.0g的Hoechst-L493介質的IAD表現的較好。在該研究中，在低于4小時的接觸中所有三個除去設備的吸附動力學都相對快地達到＜0.5μM殘余4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素的目標。
注意到在長時間(6-8小時)內含較高量吸附劑的Hoechst-L493獲得較低水平的殘余4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素。該觀察暗示Hoechst-L493 IAD的較慢的吸附動力學使得材料輸送受到限制(液體流速和擴散)并不使由于纖維吸附的功能性吸附面積損失。其它研究說明具有較低水平吸附劑載荷(200-300g/m2)的Hoechst-L493介質使得流體更容易地滲透到介質中，這使得吸附動力學更快。前面對含載荷為160g/m2的Amberlite XAD-16吸附劑的Hoechst介質的研究顯示吸附動力學沒有受到以低水平載荷加入纖維基質的影響。
血小板收率和體外血小板功能在這節中呈現兩個獨立研究的數據。每個研究中的血小板單元是由單個庫得到的，以便能夠清楚地評價IAD介質式樣、吸附劑量和接觸時間的影響。
第一個研究評價纖維化(Hoechst介質)對延長接觸(5和7天)后血小板的收率和功能的影響。將從一個庫中得到的總共四個血小板單元用于該研究。無IAD的對照經補骨脂素+UVA處理。將兩個血小板單元與5.0g Hoechst-L493接觸。一個單元在轉移到一空的PL2410貯藏容器之前與IAD接觸24小時。剩余的另一單元在研究過程中一直與IAD接觸。將這些Hoechst-L493 IAD用蒸汽殺菌(120℃，20分鐘)。從Baxter獲得的標準除去設備(2.5g松散Dowex XUS-43493)經過γ射線滅菌。注意到在試驗中典型地與利用松散吸附劑顆粒的設備接觸8-16小時之后血小板沒被從標準除去設備中移走。將貯藏5和7天后的血小板數和體外功能的結果分別匯集在表13A和表13B中。
表13A.(5天)Hoechst-L493纖維化介質與標準除去設備的比較貯藏5天后血小板收率和體外功能


表13B.(7天)Hoechst-L493纖維化介質與標準除去設備的比較貯藏7天后血小板收率和體外功能


Hoechst-L493 IAD(5.0g)的血小板收率明顯好于標準除去設備(2.5g)的收率。在連續與Hoechst-L493 IAD(5.0g)接觸7天的貯藏實現了損失＜10％。用Hoechst-L493 IAD處理的血小板單元都在形狀變化、集聚和GMP-140方面比無IAD的對照呈現出較好的性能。保持與Hoechst-L493 IAD)(5.0g)接觸整整5天的血小板比接觸24小時之后轉移的血小板顯示出可比較的體外功能。有趣的是，保持與Hoechst-L493IAD接觸的血小板在GMP-140試驗中表現得較好。7天后兩者中間性能的差異很大。這種觀察暗示與IAD的接觸降低了貯藏過程中通過血小板的p-分離蛋白表達的速度。
第二個研究是在含5.0g和7.5g的Hoechst-L493介質的IAD中尋找確定用更高量的介質是否在血小板收率或體外功能上有更大的降低。在該研究中，Hoechst-L493 IAD通過γ射線滅菌。標準除去設備(2.5g Dowex XUS-43493)包括在該研究中。在該研究的整個過程中血小板保持與除去設備接觸。將貯藏5和7天后的血小板數和體外功能的結果分別匯集在表14A和表14B中。
表14A.(5天)γ射線滅菌的Hoechst-L493纖維化介質的評價貯藏5天后血小板收率和體外功能(不轉移)


表14B.(7天)γ射線滅菌的Hoechst-L493纖維化介質的評價貯藏7天后血小板收率和體外功能(不轉移)


在表14A和14B中匯集的結果與在第一個研究中觀察到的結果相似。與Hoechst-L493 IAD接觸的血小板的收率比與標準除去設備接觸的血小板的收率高得多。7.5g Hoechst-L493 IAD的血小板收率略低于5.0g IAD的血小板收率。在所有體外試驗中用Hoechst-L493 IAD處理過的血小板呈現出可與對照血小板相比。在第7天在集聚試驗中與無IAD的對照相比與Hoechst-L493 IAD接觸的血小板顯示出改善了的性能。在第7天沒有進行GMP-140試驗。
當與血小板接觸貯藏5天的標準除去設備(2.5g松散XUS-43493)相比，用Hoechst-L493介質(5.0，7.0g)制備的IAD使得體外功能優良。而且，經150μM 4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素+3.0J/cm2UVA處理的血小板當與Hoechst-L493 IAD(5.0g)接觸5和7天時顯示出通過形狀變化、集聚和GMP-140所指示的改善的體外功能。比較帶或不帶IAD(5.0g Hoechst-L493)的血小板的5-7天貯藏的另一研究證明帶IAD的貯藏可以提高血小板性能，如體外功能試驗所示。
實施例17AQF纖維化珠與自由珠在PRBC中的比較。該研究比較使用Ambersorb 572的AQF纖維化珠和自由珠從PRBC中除去S-300(N-(9-吖啶基)-β-丙氨酸)和谷胱甘肽。
通過在2100rpm下將全血離心分離5分鐘并擠掉血漿，然后每單元添加84mL Erythrosol制得PRBC。將6個經ABO匹配過的單元合并在一個3.0L的Clintec Viaflex袋中。將約300mL返回到每個最初的PL 146袋中并用6.0mL的150mM谷胱甘肽定量至3.0mM的最終濃度和用3.0mL的30mM S-300衍生物定量至300μM的最終濃度。將其手工混合并使其在室溫下培養4小時。
將這些PRBC轉移到含于AQF纖維化介質中的4.8g Ambersorb珠(400g/m2)或4.8g松散Ambersorb珠的兩個吸附設備之一的1L PL1813袋中。將這些纖維化介質或松散珠封閉在一個Tekto織制網袋中。對每個吸附設備重復二次并將在沒有吸附設備的PL 1813袋中的單元作為對照。將它們在室溫下在血小板震動器上貯藏24小時，然后轉移到靜止條件下在4℃下貯藏。在與S-300衍生物和谷胱甘肽配料之前、在處理之后但在轉移到吸附設備之前、以及在2、4、6、8、20和24小時和轉移到吸附設備之后的1、2和5周對這些單元抽樣。制備這些樣品用于S-300和谷胱甘肽的HPLC分析，結果示于表15中。也對這些樣品進行溶血百分率、ATP濃度、K+濃度和pH分析(參見表16)。
該試驗的結果暗示纖維化樹脂優于自由珠。與自由珠相比，該纖維化樹脂顯示出等價除去S-300和谷胱甘肽具有改善紅血球功能的好處。表15顯示了兩種化合物的吸附設備的S-300除去是相似的。在24小時之后纖維化珠的谷胱甘肽的除去動力學顯示出稍好但兩個設備都在可接受的水平。表16顯示了就紅細胞功能試驗而言纖維化樹脂處理過的樣品可與對照單元相比。兩個設備比較起來，ATP和pH基本上相同。24小時之后溶血百分率和K+水平自由珠高得多，這說明紅血球功能基本上損失了。
表15.使用在纖維化介質中的Ambersorb 572珠和自由珠從PRBC中除去S-300和谷胱甘肽。處理之后PRBC(S-300)或上層清液(谷胱甘肽)中化合物的殘余濃度。 表16.用在纖維化介質中的Ambersorb 572珠和Ambersorb 572自由珠處理的PRBC的溶血百分率、K+、ATP和pH比較。

實施例18攪拌方式對使用纖維化Ambersorb 572的S-300和谷胱甘肽的除去的影響以及對紅血球功能的影響。該研究著眼于在IAD處理過程中所用的攪拌方法對除去S-300(N-(9-吖啶基)-β-丙氨酸)的影響以及對血細胞比容百分率、溶血百分率、ATP濃度、K+濃度和pH的影響。
制備PRBC作為一個庫并如實施例17中處理。在室溫下處理4小時之后，將6個單元轉移到由封閉于一個Tekto織制網袋中的4.8g的Ambersorb 572(AQF生產，400g/m2)組成的IAD中。將這些IAD包含在1L PL1813袋中。將對照單元轉移到沒有IAD的PL1813袋中。然后將它們經過如下處理

與實施例17中相似地對單元抽樣。結果顯示優選某一攪拌方法用于除去S-300和谷胱甘肽。盡管軌道震動器顯示出比其它方法更低水平的溶血，但是所有方式獲得相同的除去。表17顯示了S-300和谷胱甘肽水平。表18顯示了紅細胞功能。
表17用不同攪拌方式處理且具有AQF纖維化Ambersorb 572的單元中的S-300和谷胱甘肽水平。 PS=血小板震動器，OS=軌道震動器，PR=血小板旋轉裝置，N=Nutator。表18使用纖維化AQF Ambersorb 572并使用不同攪拌方式獲得的溶血百分率、K+、ATP和pH結果。

實施例19由纖維化Ambersorb 572處理過的PRBC活化的補體的除去。本研究著眼于用S-300衍生物和谷胱甘肽處理接著用AQF纖維化介質除去之后在PRBC中形成補體片段C3a和SC5b-9。
制備PRBC作為一個庫并按實施例17中每一個進行處理。在室溫下處理4小時之后，將這些單元轉移到含以下的1L PL 1813袋中。

醋酸纖維素酯膜已知是使補體活化并被用作正對照。除單元2之外所有單元在4℃下靜止貯藏之前都在室溫下處理24小時。單元2在4℃下連續貯藏。
在IAD處理之前、處理過程中4、8、和24小時、和5天之后，從每個試驗物品中取出三個1.5mL樣品，將每個樣品在2000xg下離心分離15分鐘并將450μL的每一上層清液與50μL冷200mM EDTA混合并經渦旋。將它們在干冰上快速冷凍并在-70℃下貯藏。
將酶免疫試驗(Quidel)用于檢測補體片段C3a和SC5b-9的形成。這些片段的存在是補體相同活化的象征。該試驗涉及由與辣根過氧化物酶(HRP)結合的老鼠抗體粘結該靶子片段并使用該HRP的顯色物檢測。測定樣品吸光度并根據標準曲線計算樣品中的片段濃度。與實施例17中相似地也對這些樣品評價S-300、谷胱甘肽和溶血。
結果顯示與對照比較，在用AQF介質中的Ambersorb 572珠處理過的樣品中補體活性降低。表19顯示出就對照而言，補體活性比在4℃下連續貯藏的樣品中的低。用IAD處理過的樣品顯示出比在5天的對照的C3a和SC5b-9的水平低，在24小時后C3a接近檢測極限。表20顯示出S-300和谷胱甘肽的除去按用AQF介質所希望的進行。
表19經過不同處理的補體片段C3a和SC5b-9水平。 表20經過不同處理的S-300濃度(PRBC)、谷胱甘肽濃度(上層清液)和溶血百分率。 實施例20通過惰性顆粒基質改善吸附劑的血相容性。本實施例證明將吸附劑顆粒固定在惰性顆粒基質中提高了吸附劑的血相容性并且對低分子量化合物的除去基本上沒有影響。此外，本實施例支持將吸附劑顆粒固定在惰性基質(纖維或顆粒)中是提高吸附劑血相容性的常規方法的論點。由固定在纖維基質和顆粒基質中的吸附劑顆粒組成的IAD的結果示于下。
在本實施例中所研究的介質包括固定在超高分子量聚乙烯(UHMWPE)微粒基質中的Purolite MN-200吸附劑顆粒(200-1200μm)。代表性的介質是由Porex(Fairburn，GA)生產的。通過將約50％(w/w)PuroliteMN-200(200-1200μm)與50％(w/w)具有相同粒徑的UHMWPE混合形成固定吸附劑介質的盤。將該混合物放入圓柱形腔中在壓力下受熱，其條件足以使UHMWPE顆粒熔融并包圍吸附劑顆粒。所得盤的直徑為3.50英寸并且厚約為0.250英寸。這些盤重約24g，相應于每個盤中約有12g MN-200。將介質盤放入塑料貯藏容器(PL2410，Baxter HealthcareCorp.)并通過具有25-40kGy的γ射線(Sterigenics，Hayward，CA)輻射將整個裝置滅菌，從而制得IAD。
該纖維基質IAD包括以300g吸附劑/m2的載荷固定在無紡聚酯基質中的Purolite MN-200。將約2.5g(吸附劑量)的固定Purolite MN-200放入由30μm編織聚酯材料(Tetko，DePew，NY)構成的袋中。將該袋裝置放入塑料貯藏容器(PL2410，Baxter Healthcare Corp.)并通過具有25-40kGy的γ射線(Sterigenics，Hayward，CA)輻射將整個裝置滅菌。
包括懸浮在約300mL的35％自體血漿、65％血小板添加溶液中的血小板(3-5×1011細胞)的經ABO匹配的血小板濃縮物單元是從SacramentoBlood Band(Sacramento，CA)獲得的。在向每個單元給以3mL的15mM氨化補骨脂素(4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補骨脂素)之前將這些血小板單元匯集并分開。通過在UVA照射設備(BaxterHealthcare Corp.)中用3.0J/cm2的UVA照射將每個單元經受光化學處理。將兩個經過光化學處理的血小板單元轉移到具有兩個試驗SRD的PL2410塑料貯藏容器中。一個經過處理的單元作為對照并且不與IAD接觸。在試驗過程中將所有單元放在室溫(22℃)下的血小板震動器(Helmer，Noblesville，IN)中。
測定每個IAD實施方式的補骨脂素的吸附動力學。在首先的8小時貯藏中間隔2小時移出每個血小板單元樣品(約1mL)。然后通過高壓液相色譜法分析這些樣品中的殘余補骨脂素水平。接著在室溫下貯藏5天，測定每個單元中的血小板數、pH和溶解氣體。也通過進行體外試驗評價血小板功能，包括形狀變化、集聚、低滲休克反應、GMP-140(p-分離蛋白表達)和形態得分。
圖23顯示了補骨脂素吸附動力學。在8小時培養過程中兩個IAD將補骨脂素除去至HPLC試驗定量的極限。相對于纖維IAD(2.5g)，由于顆粒IAD的更高量的吸附劑(約12g)因此具有更快的吸附動力學。
將血小板數、pH測定和體外血小板功能試驗結果匯集在表21中。纖維和顆粒基質IAD都具有90％以上的血小板回收率。考慮到顆粒IAD含約12g MN-200，這一觀察對該顆粒IAD有特別的影響。注意到含2.5g未經固定的吸附劑顆粒的除去設備典型地使得血小板5天損失25-35％。含12g未經固定的顆粒的設備因此如期除去＞50％的血小板。顯而易見，將吸附劑固定在顆粒基質中大大降低了血小板損失同時補骨脂素除去動力學仍然非常快。
將體外血小板功能研究的結果匯集在表21下半個中。同樣，兩種IAD均顯示出滿意的結果。由于單個高測量值顯示出大的標準偏差，因此低滲休克反應稍高于對照。與所有其它試驗顯示的性能基本相同，這些IAD在集聚試驗中的確表現的很好。
表21.纖維基質和顆粒基質IAD的5天的血小板收率和體外血小板功能的比較


可以由本構型通過使液體更充分地滲透到介質中以改變盤的幾何學，從而進一步將該顆粒基質IAD優化。較薄的盤將可以使用更少量的吸附劑獲得相當的除去動力學。
除優化盤的幾何學之外，潤濕設備并且因此通過增加介質的潤濕可以進一步提高該吸附動力學。在除去的最初階段，UHMWPE基質的內在疏水性能使該設備潤濕比較慢。能夠用于提高潤濕的策略包括使用潤濕劑(例如，甘油、聚環氧乙烯、聚乙二醇、親水聚合物)或經氣體等離子體輝光放電處理。與潤濕劑不同，經輝光放電處理可以直接用于改變UHMWPE粘合劑基質的表面化學。
權利要求
1．一種降低含細胞的生物組合物中生物反應調節物的濃度的方法，其中該方法基本上保留了生物組合物的所需生物活性，包括用一種設備處理該生物組合物，其中該設備包括含高吸附劑顆粒的惰性基質，并且其中吸附劑顆粒的直徑范圍在約100μm-約1500μm，并且其中將該設備用于批量過程。
2．根據權利要求1的方法，其中該生物反應調節物為活化補體。
3．根據權利要求1的方法，其中該設備的吸附劑顆粒為具有優良可濕性的聚芳香族吸附劑顆粒。
4．根據權利要求1的方法，其中該設備的吸附劑顆粒為由合成源得到的活性炭。
5．根據權利要求1的方法，其中該設備的惰性基質為合成聚合物纖維，并且其中該合成聚合物纖維包括被具有較低熔解溫度的鞘包圍的具有高熔解溫度的聚合物核心。
6．根據權利要求1的方法，其中該設備的惰性基質為顆粒網絡，并且其中該顆粒網絡包括聚乙烯顆粒。
7．根據權利要求1的方法，其中該生物組合物包括血小板。
8．根據權利要求1的方法，其中該生物組合物包括紅血球。
9．根據權利要求1的方法，其中該方法還降低生物組合物中補骨脂素衍生物或吖啶衍生物的濃度。
10．根據權利要求1的方法，其中該方法還降低生物組合物中染料或猝滅劑的濃度。
全文摘要
本發明提供了降低含細胞的生物組合物中低分子量化合物的濃度同時基本上保留了該生物組合物中所需的生物活性的方法和設備。該設備包括大量多孔吸附劑顆粒,并且這些吸附劑顆粒被惰性基質固定。
文檔編號C07D219/10GK1284897SQ98813840
公開日2001年2月21日 申請日期1998年7月8日 優先權日1998年1月6日
發明者D·J·赫, T·A·番 申請人:塞魯斯公司