專利名稱：：β－促脂解素及其用途的制作方法交叉引用本申請要求下列專利的優先權美國臨時專利申請號60/068659，申請日為1997年12月23日；60/079857，申請日為1998年3月30日；60/086321，申請日為1998年5月21日；60/091385，申請日為1998年7月1日；60/095405，申請日為1998年8月5日；60/103976，申請日為1998年10月13日。本發明背景本發明涉及藥理學和醫學領域。具體地講，本發明涉及β-促脂解素，其片段和類似物，藥用制劑，以及用上述制劑治療哺乳動物糖尿病和其他相關的癥狀的方法。阿黑皮素原(POMC)是被轉運到神經內分泌細胞中的分泌途徑的神經肽前體分子。POMC在特殊內肽酶的作用下被裂解成諸如促腎上腺皮質素(ACTH)、β-促脂解素(BLT)、β-內啡肽、和促黑素(MSH)的肽。將POMC加工成一種或幾種特殊肽的過程是以組織和細胞特異性方式進行的(一般參見M.Castro和E.Morrison，神經生物學臨床綜述，11，35-57，1997，Roberts,J.L.和Herbert,E.Proc.Nat.Acad.Sci,74，4826(1997)；Roberts,J.L.和Herbert,E.Proc.Nat.Acad.Sci,74，5300(1997)；Mains等,Proc.Nat.Acad.Sci,74，3014(1997))。POMC主要是在腦垂體和下丘腦中產生的。POMC在垂體前葉中的翻譯后加工產生ACTH和BLT。另一方面，垂體中葉的主要產物是α-MSH、CLIP、γ-促脂解素、β-內啡肽、和β-MSH，而在下丘腦中POMC主要被加工成γ-MSH和β-內啡肽。由POMC衍生的肽在代謝和生理學調節中起著多種重要作用。例如，ACTH是一種有39個氨基酸的肽，能刺激腎上腺皮質分泌糖皮質素。另一方面，MSH’s能通過表皮中的黑素細胞促進黑素合成，并且還表現出與脂肪代謝相關。β-內啡肽源于BLT的羧基末端(即人類序列的59-89號殘基)，并具有止痛活性，該活性受納絡酮的拮抗，納絡酮是一種已知的嗎啡的拮抗劑。因此，由POMC產生的肽激素在生理學和代謝調節中具有多種作用。適當的葡萄糖和燃料代謝取決于非POMC相關的肽---胰島素。具體地講，胰島素能促進糖原、脂肪酸、和蛋白合成，并且還能促進糖酵解。胰島素在促進葡萄糖進入肌肉和脂肪細胞方面是很關鍵的。有缺陷的胰島素代謝會導致糖尿病。1型糖尿病需要服用外源胰島素以便適當控制燃料和葡萄糖代謝。另一方面，2型糖尿病通常不需要外源胰島素，直到這種病的晚期。適當控制葡萄糖和燃料代謝對于糖尿病的有效控制來說是必要的。否則的話有可能產生嚴重的、甚至是致命的后果，包括酮酸病、昏迷、視網膜病、糖尿病性微血管病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞形成、中風、壞疽、血甘油三酯過多、血膽甾醇過多、心肌病、皮膚病、糖尿病性腳綜合癥、腎病、尿路感染、乳頭狀壞死、白內障、糖尿病性胃腸病、便秘、外周血管病，甚至死亡。在很多場合下，必須在服用太多胰島素和太少胰島素之間的尋求微妙的平衡。因此，對糖尿病的理想的療法應當是能夠通過改善對胰島素的敏感性控制血液葡萄糖含量的療法。本文介紹了用于治療或預防1型和2型糖尿病及相關并發癥的方法和有效的藥用組合物，包括服用藥理學上有效量的β-促脂解素和/或其片段和/或類似物。本文披露了通過服用藥理學上有效量的BLT、其類似物、或其功能性片段用于治療包括人在內的哺乳動物的糖尿病及其并發癥的方法。本發明還涉及治療1型和2型糖尿病、視網膜病、糖尿病性微血管病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞形成、中風、壞疽、血甘油三酯過多、血膽甾醇過多、心肌病、皮膚病、糖尿病性腳綜合癥、腎病、尿路感染、乳頭狀壞死、白內障、糖尿病性胃腸病、便秘、和外周血管病的方法。本文披露了在大腸桿菌和酵母中生產BLT的方法。在大腸桿菌中，BLT是以融合蛋白形式產生的，可以在存在高鹽的條件下通過常規純化方法從細胞裂解物中回收。BLT融合蛋白含有用于將融合配偶體從BLT上分離的特定蛋白酶的識別位點。在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中，當所述融合蛋白從細胞中分離時被裂解，因此，可以從培養基中回收完整的天然BLT。本發明的一種實施方案涉及一種具有序列2、序列5、或序列7的氨基酸序列的大體上純的蛋白。本發明的另一種實施方案涉及一種編碼含有β-促脂解素的融合蛋白或重組蛋白或肽的分離的核酸化合物。本發明的另一種實施方案涉及編碼本發明的蛋白或肽的至少一種分離的核酸化合物。本發明的又一種實施方案涉及包括本發明的分離的核酸化合物的載體。本發明的又一種實施方案涉及包括本發明的分離的核酸的載體，其中，所述分離的核酸化合物可操作地連接于一種啟動子序列上。本發明的另一種實施方案涉及含有本發明載體的宿主細胞。本發明的另一種實施方案涉及構建具有表達β-促脂解素的潛力重組宿主細胞的方法，該方法包括通過合適的方法將本發明的載體導入所述宿主細胞中。本發明的另一種實施方案涉及在重組宿主細胞中表達β-促脂解素的方法，所述方法包括在適于基因表達的條件下培養所述宿主細胞。本發明的另一種實施方案涉及一種藥用制劑，它含有β-促脂解素、其類似物或功能性片段作為活性成分，以及相關的一種或幾種藥理學上可接受的載體、賦形劑、或稀釋劑。本發明的另一種實施方案涉及藥用制劑，其中，所述β-促脂解素、其類似物或功能性片段是人類β-促脂解素。本發明的另一種實施方案涉及用于治療糖尿病或其并發癥的β-促脂解素、其類似物或功能性片段。本發明的另一種實施方案涉及具有促胰島素活性的BLT片段。本發明的另一種實施方案涉及具有促胰島素活性的選自序列9-序列13的肽。本發明的另一種實施方案涉及具有促胰島素活性的選自序列14-序列25的肽。本發明的另一種實施方案涉及本文所披露的β-促脂解素肽的功能性類似物。本發明的另一種實施方案涉及治療糖尿病的方法，包括服用治療上有效量的選自序列9-25的至少一種肽。本發明的另一種實施方案涉及治療糖尿病的方法，包括服用治療上有效量的選自序列9-序列13的肽。本發明的另一種實施方案涉及一種藥用制劑，它含有至少一種具有促胰島素活性的選自序列9-25的肽作為活性成分。本發明的另一種實施方案涉及治療包括人類在內的哺乳動物糖尿病的方法，包括服用治療有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段。本發明的另一種實施方案涉及通過服用有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段降低哺乳動物血液葡萄糖含量的方法。本發明的另一種實施方案涉及通過服用有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段治療需要治療的哺乳動物的高血糖的方法。本發明的另一種實施方案涉及通過服用有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段治療哺乳動物胰島素過多的方法。本發明的另一種實施方案涉及通過服用有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段增強哺乳動物對胰島素的敏感性的方法。本發明的另一種實施方案涉及合成β-促脂解素、其類似物或功能性片段的固相合成方法。本發明的另一種實施方案涉及制備β-促脂解素的方法，包括a．用一種表達載體轉化合適的宿主，其中，所述載體編碼β-促脂解素、其類似物或功能性片段；b．在所述β-促脂解素能夠表達的條件下培養所述轉化宿主；c．通過任何合適方法純化所述β-促脂解素。本發明的另一種實施方案涉及對β-促脂解素活性的測定，包括下面步驟a)給表現出胰島素不敏感性和較高血液葡萄糖水平的哺乳動物服用一種試驗蛋白；和b)在步驟a)之后檢測血液葡萄糖和胰島素含量。本發明還涉及通過服用藥理上有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段治療哺乳動物1型或2型糖尿病及其相關的并發癥的方法。發明詳述定義術語“類似物”或“功能性類似物”是指BLT的修飾形式，其中，至少進行了一個氨基酸的取代，使得所述類似物在體內和/或體外保持與未修飾的BLT大體上相同的生物學活性。術語“bid”或“b.i.d.”是指每天2次服用的BLT或其他化合物的劑量。“BLT”是指β-促脂解素。人類BLT包括89個氨基酸殘基(序列8)。業已在多種生物中鑒定了BLT蛋白，并且在多種生物中測定了其氨基酸序列，包括人類、小鼠、綿羊、和豬(Li&Chung，自然，260，622-24(1976)、和大象(Li等Int.J.Pept.Prop.Res.32，573-78(1978)以及其他哺乳動物，以上所有文獻被收作本文參考文獻。術語“β-促脂解素融合蛋白”或“BLT融合蛋白”是指包括BLT的一類雜合重組蛋白分子，這種蛋白分子是在大腸桿菌或其他類型細胞中產生的，通過特殊的蛋白酶解或化學裂解可以用這種分子制備BLT或BLT片段。典型的BLT融合蛋白包括如序列2、序列5和序列7所示的蛋白。本文所說的術語“互補”或“互補性”是指嘌呤和嘧啶核苷酸通過氫鍵結合形成雙鏈核酸分子的能力。下面的堿基對與互補性相關鳥嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；腺嘌呤和尿嘧啶。在本文中，“互補”是指應用在包括兩個單鏈核酸分子的整個長度上的大體上所有堿基對的上述關系。“部分互補”是指在這樣一種分子上的上述關系，其中，兩個單鏈核酸分子中的一個的長度比另一個的長度短，因此，所述分子之一的一部分保持為單鏈。本文所說的“并發癥”或“其并發癥”是指癥狀、綜合癥、附屬性疾病、疾病、或與一種或幾種疾病或綜合癥相關的癥狀，或與有缺陷的胰島素代謝相關的癥狀、或有缺陷的糖代謝、例如有缺陷的葡萄糖代謝，包括，但不限于1型和2型糖尿病。并發癥的例子包括酮酸病、昏迷、視網膜病、糖尿病性微血管病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞形成、中風、壞疽、血甘油三酯過多、血膽甾醇過多、心肌病、皮膚病、糖尿病性腳綜合癥、腎病、尿路感染、乳頭狀壞死、白內障、糖尿病性胃腸病、便秘、和外周血管病。“保守性取代”或“保守性氨基酸取代”是指如表1所示的蛋白或肽上的一個或多個氨基酸殘基的取代。“其片段”是指一種肽、或核酸的片段、碎片、或小的部分，因此所述片段包括2個或更多個連續的氨基酸，或者包括大約5-14個氨基酸或更多，或10個或更多個在親代肽或核苷酸分子上連續的核苷酸。其片段可以保留或者不保留生物學活性。例如，本文所披露的一種肽的片段可以被用作抗原產生抗該片段的親代肽的特異性抗體。在表示核酸分子時，“其片段”是指10或更多個源于其親代核酸的連續的核苷酸，而且由于其遺傳密碼，是指其互補序列。例如，如果所述片段的序列為5’-AGCTAG-3’，則“其片段”還包括互補序列3’-TCGATC-5’。術語“融合蛋白”表示自然界不存在的雜合蛋白分子，包括翻譯融合或酶促融合，其中，兩種或兩種以上不同蛋白或其片段共價連接在一個多肽鏈上。“融合配偶體”是指BLT融合蛋白上的一種氨基酸序列，所述序列不是由BLT產生，例如，在本文中被確定為序列6的序列。本文所說的“功能性片段”或“功能上等同的片段”是指完整長度BLT的保留了生物學活性的一個部分或片段，即具有在體內和/或體外增強胰島素作用的能力；和/或在體內促進降低血液葡萄糖的能力，或在體外增強葡萄糖被攝入細胞或組織的能力。功能性片段還可以在體內和/或體外產生完整長度LBT所具有的生物學活性，即促進葡萄糖攝取和/或增強胰島素作用和/或增強胰島素敏感性的能力。功能性片段可以通過克隆技術或通過化學合成方法或通過化學或酶促裂解產生。“宿主細胞”是指適于繁殖和/或表達包含在一種載體上的克隆基因的任何真核或原核細胞，所述載體通過諸如轉化或轉染之類的方法導入所述宿主細胞。術語“同系物”或“同源的”表示不同核酸分子或氨基酸序列之間的關系，其中，所述序列或分子通過在所述分子的一個或幾個片段或部分上的相同性或部分相同性和/或相似性聯系在一起。本文所使用的術語“雜交”是指單鏈核酸分子通過核苷酸堿基配對與互補鏈結合的過程。“選擇性雜交”是指在高嚴格條件下的雜交。雜交程度取決于諸如同源性程度、雜交的嚴格性、和雜交鏈的長度等。術語“促胰島素”是指胰島素增強活性，例如，通過逆轉或減輕胰島素不敏感性的作用。“分離的核酸化合物”是指任何RNA或DNA序列，不管它是構建的還是合成的，它在位置上離開其天然位置例如細胞中。本文所說的“核酸探針”或“探針”是一種能與另一種核酸化合物雜交的標記過的核酸化合物。“核酸探針”是指單鏈核酸序列，它能與互補的或部分互補的單鏈靶核酸序列結合，形成雙鏈分子。核酸探針可以是寡核苷酸或核苷酸聚合物。探針通常含有一個可檢測的部分，該部分可以連接在探針的末端或在探針序列內部。術語“質粒”是指染色體外遺傳因子。本文所披露的質粒是通過商業渠道獲得的，可以不受限制的公開獲得，或者用容易得到的質粒按照公開的方法構建。“引物”是一種核酸片段，它被作為酶促或合成延伸例如核酸分子的起始物質。術語“啟動子”是指指導轉錄的核酸序列，例如指導DNA向RNA的轉錄。誘導型啟動子是能通過諸如碳源、熱、或金屬離子的環境信號調節的啟動子。組成型啟動子通常以穩定的水平起作用，并且是不可調節的。術語“蛋白”和“肽”在本文中可以交換使用，它們是指通過肽鍵共價連接的兩個或兩個以上氨基酸殘基。在某些場合下，這些術語描述了包括通過肽鍵連接的大于10和高達大約500個氨基酸殘基的氨基酸生物聚合物。本文所說的“重組DNA克隆載體”是指任何自主性復制劑，包括，但不限于質粒和噬菌體，它含有業已整合了一個或幾個額外DNA片段的DNA分子。本文所使用的術語“重組DNA表達載體”或“表達載體”是指任何重組DNA克隆載體，例如質粒或噬菌體，其中，存在啟動子和其他調控因子，因此，使得可能編碼一種蛋白的插入DNA能夠轉錄。術語“嚴格性”是指雜交條件。高嚴格條件不利于非同源堿基配對。低嚴格條件具有相反的作用。嚴格性可以改變，例如通過溫度和鹽的濃度加以改變。“低嚴格性”條件包括諸如大約37℃或更低的溫度，低于大約50％的甲酰胺濃度，和中等至低鹽(SSC)濃度；或大約50℃或更低的溫度，和中等至高鹽(SSPE)濃度，例如1M氯化鈉。“高嚴格性”條件包括諸如大約42℃或更低的溫度，低于大約20％的甲酰胺濃度，和低鹽(SSC)濃度；或大約65℃或更低的溫度，和低鹽(SSPE)濃度。例如高嚴格性條件包括在0.5M磷酸氫鈉、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mMEDTA中，在65℃下雜交，Ausubel,F.M.等，現代分子生物學方法，Ⅰ卷，1989；Green公司，紐約，2.10.3)。“SSC”包括雜交和洗滌溶液。20×SSC溶液的母液含有3M氯化鈉、0.3M檸檬酸鈉、pH7.0。“SSPE”包括雜交和洗滌溶液。1×SSPE溶液含有180mM氯化鈉、9mM磷酸氫二鈉、0.9mM磷酸二氫鈉和1mMEDTA、pH7.4。“大體上純的”在指一種蛋白時，表示所述蛋白是與包括其他蛋白分子在內的其他細胞和非細胞成分分離的。大體上的純的制劑至少為85％的純度；優選至少大約95％的純度。“大體上純的”的蛋白可以通過多種合適方法中的任一種制備，例如，所述方法包括IMAC蛋白純化方法(美國專利No4569794)，收作本文參考文獻。本文所說的“治療”表示為了消除疾病、癥狀或失調而對患者進行的控制和護理，包括服用本發明的蛋白以便預防癥狀或并發癥的發作，減輕癥狀或并發癥，或消除疾病、癥狀或失調。在本說明書中所引用的所有文獻均被收作本文參考文獻。β-促脂解素是于1964年從綿羊腦垂體中分離的，其一級結構于次年報導(Li等，自然，208，1093，1960)。從那時起，業已報導了綿羊(sheep)、牛、綿羊(ovine)、小鼠、豬、豚鼠、大鼠、大象、和人BLTs的一級序列。(例如，參見Lohmar和Li，生物化學生物物理學公報，147，381，1967；Li和Chung，自然，260，622，1976；Drouin和Gooman，自然，288，419，1980；Li等，Int,J.Pept.Prot.Res.32，573-78，1988；Blake和Li,Proc.Natl.Acad.Sci,80，1556-1559，1983；Takahashi等，Febs通訊135，97-102，1981；以上所有文獻被收作本文參考文獻)。其序列資料表明，BLT的羧基末端在不同物種之間是高度保守的。另一方面，在不同物種的BLT分子的氨基酸末端之間存在相當大的序列差別。本發明還涉及BLT融合蛋白，包括人BLT(序列8)，或源于其他物種的BLT，或其功能性片段。本文所披露的典型的BLT融合蛋白為序列2、序列5、和序列7。BLT的功能性片段可以以具有生物學活性的BLT的片段形式方便地鑒定，例如，在給需要治療的哺乳動物服用時具有減輕糖尿病癥狀的能力，或降低血清胰島素含量和/或增強胰島素敏感性和/或降低血液葡萄糖含量和/或促進脂肪或肌肉組織對葡萄糖的攝取，在體內或體外起作用，或在體外對脂肪細胞起作用。BLT的功能性片段包括保留了生物學活性并且包括在某些場合下在BLT蛋白中是連續的至少2個或更多個氨基酸殘基的任何片段。優選的片段包括BLT的部分或完全位于人BLT(序列8)的殘基59-89部分以外的連續片段，或非人BLT的等同片段(即編碼β-內啡肽的片段)。本文所披露的人BLT的代表性功能性片段為序列9-序列25。優選片段在本文中被指定為序列9-序列13，最優選的片段在本文中被指定為序列10、序列12、和序列13。在某些情況下，功能性片段可以包括親代BLT的一個內部缺失，例如，在序列13中缺少了人BLT的氨基酸殘基7-23。功能性片段可以通過本領域技術人員熟知的固相化學合成和/或通過重組DNA技術生產。例如，參見K.Struhl，反向生物化學；“體外合成酵母蛋白的方法和應用”，酶學方法194，520-535。例如，在一種方法中，將一組缺失突變導入編碼BLT的核酸，以便缺失不同數量的肽編碼區，或者從該分子的氨基末端缺失；或者從該分子的羧基末端缺失。該方法還可用于制備完整蛋白的內部片段，其中，去掉了羧基末端和氨基末端。用于產生所述缺失的合適的核酸酶包括諸如Bal31，或在單鏈核酸分子的情況下為綠豆核酸酶。為簡便起見，優選將BLT編碼核酸克隆到諸如噬菌體M13或等同物的單鏈克隆載體上。如果需要，可將所述得到的缺失片段亞克隆到任何合適的載體上，以便在任何合適的宿主細胞中繁殖和表達。BLT的功能性片段可以用任何合適的方法鑒定并測定其生物學活性，例如，一種肽片段在體內或體外促進或增強胰島素敏感性和/或細胞攝取葡萄糖的能力。BLT的功能性類似物可以通過在所述BLT或本文所披露的任一種肽上一個或幾個氨基酸殘基的缺失、插入、倒位、和/或取代而制備。所述取代類似物通常可以通過固相或重組技術制備，其中，可以諸如按照表1所示產生單一或多個保守性氨基酸取代。一般，對于多重取代來說，優選在任何特定分子中改變10個以下的殘基，最優選在任何特定分子中改變1-5個殘基，以便有大約90-99％的殘基與序列8的序列相同；或者使得大約95-99％的殘基與序列8或源于其他物種的其他合適的BLT相同。例如，人BLT(序列8)的類似物包括在1-89號氨基酸殘基之間的片段上的單個或多個氨基酸取代，包括下列取代，其中1號位置上的殘基可以是Glu、Ala、Asp或Gln；2號位置上的殘基可以是Leu、Ile、Val或Met；3號位置上的殘基可以是Thr、Ala、Glu、Ser、Pro或Gly；4號位置上的殘基可以是Gly、Arg、Ala、Leu、Pro或Ser；5號位置上的殘基可以是Glu、Gln、Asp、Asn或Ala；6號位置上的殘基可以是Arg、Glu、Leu、Lys、Gln或Ala；7號位置上的殘基可以是Leu、Pro、Asp、Val、Ile或Met；8號位置上的殘基可以是Arg、Glu、Ala、Tyr、Leu、Lys、Pro、Gln或Trp；9號位置上的殘基可以是Glu、Ala、Pro、Asp、Asn或Gln；10號位置上的殘基可以是Gly、Ala、Ser或Asp；11號位置上的殘基可以是Asp、Arg、Pro、Asn、Gln、Ala或Glu；12號位置上的殘基可以是Gly、Ala、Ser、或Met；13號位置上的殘基可以是Pro、Glu、Gly或Val；14號位置上的殘基可以是Asp、Glu、Asn、Gln或Gly；15號位置上的殘基可以是Gly、Ala、Ser或Glu；16號位置上的殘基可以是Pro、Gln、Leu、Gly或Glu；17號位置上的殘基可以是Ala、Asp、Ser或Gly；18號位置上的殘基可以是Asp、Glu、Gln或Asn；19號位置上的殘基可以是Asp、Glu、Asn、或Gln；20號位置上的殘基可以是Gly、Ser、或Ala；21號位置上的殘基可以是Ala、Gly、Ser、或Phe；22號位置上的殘基可以是Gly、Ala、Ser、或Lys；23號位置上的殘基可以是Ala、Phe、Thr、Gly、Ser、或Leu；24號位置上的殘基可以是Gln、Arg、Asp、Asn、Leu、或Val；25號位置上的殘基可以是Ala、Leu、Asp、Ile、Gly、Ser、或Thr；26號位置上的殘基可以是Asp、Glu、Gly、Asn、Gln、或Lys；27號位置上的殘基可以是Leu、Ala、Ile、Met、或Val；28號位置上的殘基可以是Glu、Gln、Asn、或Asp；29號位置上的殘基可以是His、Asn、Tyr、Ala、Gln、或Glu；30號位置上的殘基可以是Ser、Gly、Glu、Ala、Leu、或Asp；31號位置上的殘基可以是Leu、Ala、Val、Met、或Ile；32號位置上的殘基可以是Leu、Ala、Val、Ile、Met或Pro；33號位置上的殘基可以是Val、Ala、Glu、Leu、Ile、Met、或Arg；34號位置上的殘基可以是Ala、Ser、Pro、Glu、或Gly；35號位置上的殘基可以是Ala、Asp、Gly、Ser、或Leu；36號位置上的殘基可以是Glu、Ala、Thr、Leu、Asp、Asn、或Gln；37號位置上的殘基可以是Lys、Glu、Thr、Arg、Gln、或Asp；38號位置上的殘基可以是Lys、Arg、Gln、或Glu；39號位置上的殘基可以是Asp、Ala、Asn、Glu、Gln、或Lys；40號位置上的殘基可以是Glu、Ser、Asp、Asn、Gln、或Gly；41號位置上的殘基可以是Gly、Ala、或Ser；42號位置上的殘基可以是Pro、Gly、Ser、或Asn；43號位置上的殘基可以是Tyr、Phe、或Trp；44號位置上的殘基可以是Arg、Lys、Gln、或Glu；45號位置上的殘基可以是Met、Ile、Ser、或Val；46號位置上的殘基可以是Glu、Gln、Asp、Asn、His、Arg、或Gly；48號位置上的殘基可以是Tyr或Trp；49號位置上的殘基可以是Arg或Lys；50號位置上的殘基可以是Trp、Tyr、或Phe；51號位置上的殘基可以是Gly、Ala、Ser、或gln；52號位置上的殘基可以是Ser、Thr、Asn、或Ala；53號位置上的殘基可以是Pro或Gly；54號位置上的殘基可以是Pro、Ala、Gly、Arg、Leu、或Thr；55號位置上的殘基可以是Lys、Arg、Gln、或Ala；56號位置上的殘基可以是Asp、Asn、Glu、Gln、Ala、Gly、或Ile；57號位置上的殘基可以是Lys、Gln、或Arg；58號位置上的殘基可以是Arg、Gln、或Lys；59號位置上的殘基可以是Tyr、Phe、或Trp；60號位置上的殘基可以是Gly、Ala、或Ser；61號位置上的殘基可以是Gly、Ala、或Ser；62號位置上的殘基可以是Phe、Tyr、或Trp；63號位置上的殘基可以是Met、Leu、Ile、或Val；64號位置上的殘基可以是Thr、Ala、Ser、或Lys；65號位置上的殘基可以是Ser、Ala、Thr、或Pro；66號位置上的殘基可以是Glu、Asp、Asn、Lys、或Gln；67號位置上的殘基可以是Lys、Arg、或Gln；68號位置上的殘基可以是Ser、Ala、Thr、或Gly；69號位置上的殘基可以是Gln、Glu、Asp、Asn、Arg、或His；70號位置上的殘基可以是Thr、Ser、Ala、或Lys；71號位置上的殘基可以是Pro、或Gly；72號位置上的殘基可以是Leu、Ile、Met、或Val；73號位置上的殘基可以是Val、Leu、Ile、或Met；74號位置上的殘基可以是Thr、Ala、或Ser；75號位置上的殘基可以是Leu、Ile、Met、或Val；76號位置上的殘基可以是Phe、Tyr、Trp、或Leu；77號位置上的殘基可以是Lys、Gln、或Arg；78號位置上的殘基可以是Asn、Asp、Glu、Gln、或His；79號位置上的殘基可以是Ala、Gly、Ser、Ile、或Val；80號位置上的殘基可以是Ile、Leu、Met、Val、或Thr；81號位置上的殘基可以是Ile、Met、Val、Thr、或Leu；82號位置上的殘基可以是Lys、Gln、或Arg；83號位置上的殘基可以是Asn、Asp、Glu、Gln、或Ser；84號位置上的殘基可以是Ala、Val、Ser、Gly、或Glu；85號位置上的殘基可以是Tyr、Phe、Trp、或His；86號位置上的殘基可以是Lys、Gln、或Arg；87號位置上的殘基可以是Lys、Gln、或Arg；88號位置上的殘基可以是Gly、Ala、或Ser；89號位置上的殘基可以是Glu、Gln、Asp、Asn、或His；人BLT(序列8)上的其他特定取代包括在序列8上的單個或多個取代，其中3號位置上的殘基是Glu；4號位置上的殘基是Arg；6號位置上的殘基是Gln；7號位置上的殘基是Pro；8號位置上的殘基是Glu、Ala或Pro；9號位置上的殘基是Pro或Ala；11號位置上的殘基是Arg或Pro；16號位置上的殘基是Leu或Gln；21號位置上的殘基是Phe；23號位置上的殘基是Thr、Leu、或Pro；24號位置上的殘基是Arg或Val；27號位置上的殘基是Ala；29號位置上的殘基是Asn、Tyr、或Ala；30號位置上的殘基是Glu；31號位置上的殘基是Ala；32號位置上的殘基是Ala；33號位置上的殘基是Ala或Glu；34號位置上的殘基是Pro或Ser；35號位置上的殘基是Asp；36號位置上的殘基是Thr或Ala；37號位置上的殘基是Glu；40號位置上的殘基是Ser；42號位置上的殘基是Ser；44號位置上的殘基是Glu；45號位置上的殘基是Val；52號位置上的殘基是Asn；54號位置上的殘基是Ala或Arg；56號位置上的殘基是Gly；84號位置上的殘基是Val；85號位置上的殘基是His；和89號位置上的殘基是His；表1代表性氨基酸可取代性<tablesid="table1"num="001"><table>原始殘基代表性取代ALAARGASNASPCYSGLNGLUGLYHISILELEULYSMETPHESERTHRTRPTYRVALPROSER,GLYLYSGLN,HIS,ASP,GLUGLU,GLN,ASNSERASN,GLU,ASPASP,GLN,ASNPRO,SER,ALAASN,GLNLEU,VAL,METILE,VAL,METARG,GLN,GLULEU,ILE,VALMET,LEU,TYR,TRPTHR,ALASER,ALATYR,PHETRP,PHEILE,LEU,METGLY</table></tables>表2序列表標志序列號說明1編碼Met-Arg-BLT的核酸2Met-Arg-BLT的氨基酸序列3用于形成序列5的融合配偶體的氨基酸序列4用于構建BLT融合體的寡核苷酸接頭5BLT融合體的氨基酸序列6谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合配偶體7GST/BLT融合蛋白8人BLT的氨基酸序列9人BLT(1-49)10人BLT(50-89)11人BLT(38-67)12人BLT(38-89)13人BLT(Δ7-23)14人BLT(1-14)15人BLT(8-21)16人BLT(15-28)17人BLT(22-35)18人BLT(29-42)19人BLT(36-49)20人BLT(43-56)21人BLT(50-63)22人BLT(57-70)23人BLT(64-77)24人BLT(71-84)25人BLT(78-89)26BLT類似物(1Glu-Ala)27BLT類似物(3Thr-Ser)28BLT類似物(5Gln-Glu)29BLT類似物(7Leu-Asp)30BLT類似物(10Gly-Ala)31BLT類似物(15Gly-Glu)32BLT類似物(17Ala-Gly)33BLT類似物(23Ala-Phe)34BLT類似物(30Ser-Glu)35BLT類似物(42Pro-Ser)基因分離方法本領域技術人員可以理解，可以通過多種重組DNA技術獲得編碼BLT或BLT融合體的核酸，例如，包括聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，或從頭DNA合成(例如，參見T.Maniatis等分子克隆；實驗室手冊，第2版，第14章(1989))。例如，可將針對序列1的3’和5’末端的寡核苷酸引物用于Met-Arg-BLT的PCR擴增。例如，參見PCR方法方法和應用指南，M.Innis等著，學術出版社(1990)。PCR擴增包括模板DNA、合適的酶、引物、和緩沖液，并且通常是在DNA熱循環儀(PerkinElmerCetus,Norwalk,CT)上進行的。通過在瓊脂糖凝膠電泳之后檢測合適大小的DNA片段(即273個堿基對)確定陽性結果。蛋白生產方法本發明的一種實施方案涉及用BLT蛋白作為藥用化合物。技術人員可以理解的是，本發明的所述蛋白及片段、或其功能性片段可以通過多種不同方法合成，如本領域眾所周知的化學方法，包括固相肽合成，或重組方法。以上兩種方法披露于被收作本文參考文獻的美國專利4617149中。蛋白固相化學合成的原理在本領域中是眾所周知的，并可以參見本領域的普通教科書。例如，參見H.Dugas和C.Penney，生物有機化學(1981)；Spriger-Verlag，紐約54-92。例如，肽可以通過固相方法使用應用生物系統430A肽合成儀(應用生物系統，Foster市，CA)合成，并且使用由應用生物系統提供的合成循環。對起始對甲基二苯甲基胺樹脂進行使用雙偶合方法的順序叔丁氧基羰基化學，以便產生C-末端羰酰胺。為了產生C-末端酸，使用相應的吡啶-2-乙醛肟甲碘化物樹脂。用預先形成的羥基苯并噻唑酯將天冬酰胺、谷氨酰胺、和精氨酸連接在一起。在所述合成結束之后，可以對所述肽進行脫保護，并用含有10％間甲酚的無水氟化氫將其從所述樹脂上切除。側鏈保護基團的切除和所述肽從樹脂上的切除是在0℃或更低溫度下進行的，優選在-20℃下進行30分鐘，然后再在0℃下進行30分鐘。一般，肽的合成包括下面的一系列步驟。首先激活其α-氨基(如果必要的話還有側鏈官能團)受到保護的氨基酸，以便形成活性酯。將所述活化的氨基酸通過所述活化的酯基連接到惰性固體支持物上，并對結合的氨基酸進行充分洗滌。在該步驟之后，在一個獨立的反應中將第二種受保護的氨基酸激活成酯。將所述第一種氨基酸的α-氨基脫保護，得到一種活性胺，并讓第二種激活的氨基酸與它起反應，以便在所述固體支持物上形成一種二-肽。順序重復上述步驟，得到長度逐漸加長的肽。在所述合成結束之后，將所述肽從固體支持物上切除，并通過用強酸處理所述肽對側鏈官能團脫保護。然后通過過濾將所述肽從固體支持物中分離，用有機溶劑沉淀，并通過本領域公知的多種技術純化。在本發明中，α-氨基保護基團是9-芴甲氧羰基(Fmoc)基團。側鏈保護基團是Boc(用于Lys和Trp殘基)、Trt(用于Asn、His、Gln)、tBu(用于Ser、Thr、Tyr)，OtBu(用于Asp、Glu)和Pmc(用于Arg)。活性酯是與2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)形成的。通過用哌啶處理所述固相除去α-氨基Fmoc保護基團。在上述條件下，Fmoc基團很容易除去，而固相連接和側鏈保護基團不受影響。有待于添加到新生肽鏈上的受保護的氨基酸用HBTU活化。人BLT的合成出現了若干特殊挑戰。首先，所述肽的序列包括ser-pro-pro三肽片段。在所述合成中，標準連接化學會導致一系列缺失錯誤。通過pro殘基的雙重連接可以降低所述缺失。在優選實施方案中，所述合成是通過pro和ser殘基的雙重連接完成的。另外，在所述連接步驟結束之后，用乙酸酐封閉所述剩余的未反應的脫保護肽，以防缺失肽的鏈伸長。其次，所述人的肽含有三個asp-gly二肽序列。這些序列即使在asp側鏈受保護的情況下也容易形成環亞胺。所述環亞胺然后在脫保護步驟中與哌啶起反應，產生哌啶修飾的肽。通過對asp殘基前面的每一個甘氨酸殘基進行N-a-Hmb保護可以消除所述環化作用。例如，參見Qubbell等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.2343，1994，被收作本文參考文獻。在兩個asp-gly二肽前面有一個pro。由于所述序列的這一特征，并且由于hmb保護的氨基酸的較弱的活性，對所述二肽中的每一個進行多重連接，然后用乙酸酐封端。在一種優選實施方案中，是雙重連接的。在一種優選方法中，所述肽是用Fmoc化學法用一個輪次合成的。由于在BLT分子的N-末端部分存在若干asp-gly二肽序列，使得BLT的合成復雜化。業已觀察到asp-gly二肽序列上的天冬酰胺側鏈發生堿催化環化作用，并且隨后在FMOC合成中添加哌啶。通過在合成中在每一個asp-gly序列上使用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-甘氨酸可以消除上述反應。通過用Hmb基團保護甘氨酰胺，可以抑制天冬酰胺側鏈的環化作用。在裂解、脫保護、和反相HPLC純化后，可以電噴射質譜術分析所述肽。所述BLT合成中出現的主要類型是具有預期質量的完整長度肽。使用該方法可以用一個輪次，以0.1mM的規模生產數量超過100毫克的純化蛋白。本發明的蛋白還可以通過重組DNA技術生產。編碼BLT、或BLT融合體(例如序列1)的克隆核酸的表達可以在本領域技術人員熟知的多種合適的宿主中進行。為此，通過本領域技術人員熟知的任何合適的方法將BLT編碼核酸導入宿主細胞。盡管本發明的范圍包括染色體整合，不過優選將所述序列克隆到合適的染色體外存在的表達載體中，以便BLT基因的編碼區可操作地連接于組成型或誘導型啟動子上。重組生產BLT蛋白的基本步驟包括a)構建編碼BLT或其融合蛋白的天然的、合成的或半合成的DNA；b)以適于表達所述蛋白的方式將所述DNA整合到一種表達載體上；c)將所述載體轉化或導入一種合適的真核或原核宿主細胞中，產生重組宿主細胞；d)以能表達所述蛋白的方式培養所述重組宿主細胞；和e)通過任何合適的方法回收并大體上純化所述蛋白。在原核和真核宿主細胞中表達重組BLT融合蛋白人β-促脂解素(BLT)是一種有89個氨基酸的激素，它是由腦垂體以前體蛋白的形式產生的，所述前體蛋白進行翻譯后加工產生包括BLT在內的若干具有生物活性的激素。由于BLT較小，并且包含蛋白酶解敏感位點，我們最初通過化學合成生產這種蛋白。不過，這種方法不適用于大量制備。在本發明中，我們披露了一種方法，通過該方法可以在細菌或真菌表達宿主中以融合蛋白形式生產BLT。所述融合蛋白受到保護，不會發生蛋白酶解降解，并且可以通過下文所述的方法回收完整的BLT。在大腸桿菌中，BLT是以融合蛋白形式產生的，這種融合蛋白可以在有高鹽的條件下通過常規純化方法從細胞裂解物中回收。所述融合蛋白含有被用于從BLT上分離融合配偶體的特殊蛋白酶的識別位點。在巴斯德畢赤酵母中，所述融合蛋白是在從細胞中分離時裂解的，以便可以檢測到天然BLT，并從培養基中回收到完整的BLT。該方法提供了BLT的生產工藝。與化學合成不同，本文所披露的方法可以放大，以便生產大量的BLT。可將原核生物用于生產重組BLT蛋白。例如，大腸桿菌K12菌株294(ATCCNo.31446)特別適用于在原核細胞中表達外源蛋白。還可將大腸桿菌的其他菌株、諸如枯草芽孢桿菌的芽孢桿菌、諸如鼠傷寒桿菌或粘質沙雷氏菌的腸桿菌、各種假單胞菌和其他細菌如鏈霉菌屬用作宿主細胞，克隆并表達本發明的重組蛋白。適于在原核生物中驅動基因表達的啟動子序列包括b-內酰胺酶[例如載體pGX2907，ATCC39344，含有一個復制子和b-內酰胺酶基因]，乳糖系統[Chang等，自然(倫敦)275615(1978)；Goeddel等，自然(倫敦)281544(1979)]、堿性磷酸酶、和色氨酸(trp)啟動子系統[載體pATH1(ATCC37695)]，它被設計成能在trp啟動子的控制下表達諸如trpE融合蛋白的開放讀框。諸如tac啟動子(從質粒pDR540，ATCC-37282中分離)和T7啟動子的雜合啟動子也可以使用。還可將其核苷酸序列已知的其他細菌啟動子連接到編碼本發明的蛋白的DNA上，使用接頭提供任何需要的限制位點。用于細菌系統中的啟動子還要含有一個可操作地連接在編碼所需要的多肽的DNA上的SD序列。上述例子是說明性的而不是限定性的。本發明的蛋白可以通過直接表達合成或以融合蛋白形式合成，通過酶促或化學裂解從融合蛋白上除去融合配偶體。原則上講，本發明可應用能夠在細菌或真菌宿主中表達的任何融合系統。在合適的融合系統的一種實施方案中，在BLT和融合配偶體間設置一個識別位點，其中，例如，將所述融合配偶體設置在BLT的氨基末端。合適的位點可以是蛋白酶的識別序列，或者是易受化學裂解的位點。合適的細菌融合配偶體的例子包括谷胱甘肽-S-轉移酶、麥芽糖結合蛋白、羧肽酶原、鈣調蛋白結合蛋白或任何能啟動融合蛋白高水平表達的位于氨基末端的序列。合適的蛋白酶的例子包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。用于化學裂解的制劑包括溴化氰、酸等。適用于真菌系統的融合配偶體的例子包括α交配因子、前肽、人血清白蛋白和任何能啟動所述融合蛋白表達和分泌的其他序列，并且隨后裂解(在分泌期間)將天然BLT釋放到培養基中。在一種方法中，BLT融合蛋白包括與二肽(即met-arg)融合的天然BLT序列，所述二肽融合在天然BLT分子的氨基末端(例如序列2)。該融合分子的二肽配偶體可以通過用組織蛋白酶C處理除去，并通過諸如HPLC的本領域公知的方法純化天然BLT分子。在生產重組BLT融合蛋白的另一種方法中，將谷胱甘肽S-轉移酶(GST)用作融合配偶體。生產在本文中被稱為序列7的蛋白，大體上如Smith和Johnson(基因67，31，1988)所述，該文獻被收作本文參考文獻。在重組系統中生產某些肽時經常觀察到，以融合蛋白形式表達能延長其壽命，提高所需要的肽的產量，或提供純化所述蛋白的方便的方法。在原核宿主中表達哺乳動物蛋白時這一點特別重要。已知有多種肽酶(例如腸激酶和凝血酶)能在特定位點上裂解多肽或者從氨基或羧基末端消化所述肽(例如，二氨基肽酶)。另外，特定的化合物(例如溴化氰)可以在特定位點上裂解多肽。技術人員可以理解的是，必須對氨基酸序列(如果采用重組方法的話還有合成的或半合成的編碼序列)進行修飾，以便插入位點專一性內部裂解位點。例如，參見P.Carter，“融合蛋白的位點專一性蛋白酶解”，第13章，見蛋白純化從分子機制到大規模加工，美國化學協會，華盛頓特區，(1990)。除了原核生物之外，可以使用諸如蛙卵母細胞的兩棲表達系統，和哺乳動物細胞系統。具體宿主細胞的選擇在一定程度上取決于所使用的具體表達載體。適用于本發明的代表性哺乳動物宿主細胞包括，例如，HepG-2(ATCCHB8065),CV-1(ATCCCCL70),LC-MK2(ATCCCCL7.1),3T3(ATCCCCL92),CHO-K1(ATCCCCL61),HeLa(ATCCCCL2),RPMI8226(ATCCCCL155),H4IIEC3(ATCCCCL1600),C127I(ATCCCCL1616),HS-Sultan(ATCCCCL1484),和BHK-21(ATCCCCL10)。有多種載體適用于轉化哺乳動物宿主細胞。例如，包括轉錄和聚腺苷酸化所需要的猴病毒40(SV40)基因組的片段的pSV2-型載體。業已構建了大量的質粒pSV2-型載體，如pSV2-gpt,pSV2-neo,pSV2-dhfr,pSV2-hyg,pSV2-b-珠蛋白，其中，SV40啟動子啟動插入基因的轉錄。所述載體可以從諸如美國典型培養物保藏中心(ATCC)12301ParklawnDrive,Rockville，馬里蘭，20852，或農業研究機構保藏中心(NRRL)1815N.大學大街，Peoria，伊利諾依，61604的來源廣泛獲得。適用于在哺乳動物細胞中表達的啟動子包括SV40晚期啟動子，源于真核基因的啟動子，如雌激素誘導雞卵清蛋白基因，干擾素基因，糖皮質素誘導酪氨酸氨基轉移酶基因，胸苷激酶基因啟動子，以及主要早期和晚期腺病毒基因的啟動子。用載體轉染哺乳動物細胞可以用多種眾所周知的方法進行，包括，但不限于原生質體融合、磷酸鈣共沉淀、和電穿孔等。例如，參見Maniatis等，同上。某些病毒也構成合適的載體。其例子包括腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒、皰疹病毒、桿狀病毒、和肉瘤病毒，如美國專利4775624中所披露的，該專利被收作本文參考文獻。諸如酵母和其他真菌的真核微生物也適于作為宿主細胞。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德畢赤酵母是優選的真核微生物。諸如乳酸克魯維酵母的其他酵母也可以使用。為了在酵母屬中表達，可以使用諸如Yrp7(ATCC-40053)的質粒。例如，參見L.Stiachcom等，自然，282，39(1979)；J.Kingsman等，基因7，141(1979)；S.Tschemper等，基因10，157(1980)。質粒Yrp7含有TRP1基因，它提供了用于trp1營養缺陷突變型的選擇標記。本發明的其他實施方案包括編碼BLT或其片段的分離的核酸序列。正如技術人員可以理解的，本發明的氨基酸化合物可以由多種不同的核酸序列編碼。由于這些不同的核酸序列可以編碼相同的氨基酸序列，本發明還包括這些不同的核酸序列。本發明的BLT編碼核酸還可以通過化學合成法生產。核酸的合成在本領域中是眾所周知的。例如，參見E.L.Brown,R.Belagaje,M.J.Ryan，和H.G.Kheorana，酶學方法68，109-151(1979)。相當于BLT的DNA序列的片段可以用常規DNA合成裝置制備，如用應用生物系統380A或380B型DNA合成儀(應用生物系統公司，850LincolnCenterDrive,Foster市，CA94404)用亞磷酰胺化學法合成，然后連接所述片段，以便重建完整的基因。另外，可以用磷酸三酯化學法合成本發明的核酸。(例如參見M.J.Gait著，寡核苷酸合成，實踐方法，(1984))。載體本發明的另一方面涉及包含本發明核酸的重組DNA克隆載體和表達載體。優選的核酸載體是包括DNA的載體。最優選的重組DNA載體包括分離的DNA序列序列1。技術人員可以理解，最合適的克隆載體和表達載體的選擇取決于多種因素，包括限制性酶切位點的可利用性，待轉染或轉化所述載體的宿主細胞的類型，轉染或轉化的目的(例如，作為染色體外因子穩定轉化，或者整合到宿主染色體上)，容易檢測的標記或選擇標記的有或無(例如，一種類型和另一種類型的抗生素抗性和代謝標記)，以及目標基因在宿主細胞中的拷貝數量。適于攜帶本發明核酸的載體包括RNA病毒、DNA病毒、裂解性噬菌體、溶源性噬菌體、穩定性噬菌體、質粒、和類病毒等。最優選的載體是質粒。本領域技術人員可以理解，在制備表達載體時有多種可變因素需要考慮，例如，是使用組成型還是誘導型啟動子。技術人員還可以理解的是，待生產的核酸或蛋白的量在一定程度上決定表達系統的選擇。就啟動子序列而言，優選誘導型啟動子，因為它們能夠高水平的、可調節地表達可操作地連接的基因。技術人員可以理解，多種合適的啟動子對多種誘導劑有反應，例如，碳源、金屬離子和熱。與表達載體相關的其他因素包括是否包括指導重組蛋白定位的序列。例如，位于編碼區前面編碼信號肽的序列可用于指導所產生的多肽的細胞外輸出。本發明還提供了一種構建能表達BLT蛋白重組宿主細胞的方法，該方法包括將含有編碼BLT的分離的DNA序列的重組DNA載體轉入或導入宿主細胞。優選的宿主細胞是適于外源導入的基因或蛋白高水平表達的任何細胞。可以在本領域技術人員熟知的條件下培養轉化的宿主細胞，以便表達重組BLT。本發明還提供了用于治療受與胰島素代謝或糖代謝缺陷相關的疾病或癥狀困擾的人和其他哺乳動物的方法，所述疾病如包括糖過多病、胰島素過多病、1型和2型糖尿病、以及與其相關的并發癥。所述方法包括給需要治療的生物服用有效量的BLT蛋白或肽，或含有BLT的融合蛋白或其功能性片段，或其類似物，劑量為大約1-1000微克/公斤體重。在實施該方法時，BLT可以1日1次的劑量，1日多次的劑量服用，或者通過植入身體或用其他方式連接在身體上的機械泵送裝置連續或不連續服用。待服用的BLT或相關蛋白或肽的量由醫生確定，并取決于諸如被治療的癥狀，或疾病的性質和嚴重程度，以及患者的年齡和一般健康狀況的因素。本發明還提供一種含有BLT蛋白或其功能性片段或其類似物，如以序列8為代表，或其藥理學上可以接受的無毒的鹽作為活性劑的藥用組合物，所述活性劑與藥理學上可以接受的固體或液體載體混合。所述蛋白優選為藥理學上可以接受的鹽的形式，可將其制備成適于腸胃外服用，用于治療和預防性治療糖尿病或其并發癥。例如，序列8的化合物或其他BLT，或其片段可以與常規藥用載體和賦形劑混合。含有BLT蛋白的所述組合物含有重量百分比大約0.1-90％的蛋白，優選為可溶形式，并且一般為大約10-30％。另外，本發明蛋白可以單獨服用，或者與其他抗糖尿病制劑或用于治療糖尿病的制劑組合服用。為了靜脈內(Ⅳ)使用，BLT、片段或類似物以常用的靜脈內流體形式服用并且通過輸液服用。所述流體如可以使用生理鹽水、Ringer’s溶液或5％葡萄糖溶液。對于肌內制劑來說，可以溶解一種無菌制劑，優選合適的可溶鹽形式的BLT蛋白，例如序列8，如氫氯酸鹽，并在諸如無熱原的水(蒸餾水)、生理鹽水或5％葡萄糖溶液的藥用稀釋劑中服用。可以制備合適的不可溶形式的化合物，并且作為在水基或藥理學上可接受的油基，例如長鏈脂肪酸的酯，如油酸乙酯中的懸浮液形式服用。下面的實施例更全面地說明了本發明，以及將BLT用于治療糖尿病的用途。本領域技術人員可以理解，所披露的特定試劑、設備和方法僅僅是說明性的，并不希望以任何形式限定本發明。例1人BLT蛋白的固相合成和純化用Fmoc化學法用一個輪次合成人BLT肽(序列8)。由于在BLT分子的N-末端部分存在若干asp-gly二肽序列，使得BLT的合成復雜化。業已觀察到asp-gly二肽序列上的天冬酰胺側鏈發生堿催化環化作用，并且隨后在FMOC合成中添加哌啶。通過在合成中在每一個asp-gly序列上使用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-甘氨酸可以消除上述反應。通過用Hmb基團保護甘氨酰胺，可以抑制天冬酰胺側鏈的環化作用。在裂解、脫保護、和反相HPLC純化后，可以電噴射質譜術分析所述肽。所述BLT合成中出現的主要類型是具有預期質量的完整長度肽。使用該方法可以用一個輪次，以0.1mM的規模生產數量超過100毫克的純化蛋白。材料預加樣Fmoc-Glu(OtBu)Wang(用對苯氧基芐醇功能化的1％交聯的聚苯乙烯)樹脂，大約為0.6M氨基酸/克樹脂。N-甲基吡咯烷酮(NMP)、哌啶、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-甲基脲六氟磷酸(HBTU)，2MN，N，二異丙基乙基胺(DIEA)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，二氯甲烷(DCM)，二甲基甲酰胺(DMF)。對用Fmoc-保護的C-末端氨基酸(0.1或0.25mM氨基酸)預加樣的樹脂進行稱重，并放入反應室中。通過用DCM洗滌使所述樹脂預膨脹。然后用NMP洗滌所述樹脂。通過在溶解在NMP中的12-22％哌啶溶液中溫育所述樹脂除去N-末端Fmoc基團。在脫保護之后用NMP充分洗滌所述樹脂。將待添加到所述肽上的1mmol的另一個Fmoc保護的氨基酸溶解在2.1克NMP、2.0克DMF中的0.45MHBTU/HOBt制劑中。在溶解之后，通過添加3ml溶解在NMP中的2MDIEA開始氨基酸的活化。然后將活化的氨基酸添加到脫保護的樹脂上，并進行連接。在交聯結束之后，用NMP徹底洗滌所述樹脂，然后對每一個后續的氨基酸重復完整輪次的脫保護和連接。在所述合成中的特定輪次中的步驟如下輪次AA步驟1Glu(OtBu)完全洗滌2Gly單連接3Lys(Boc)單連接4Lys(Boc)單連接5Tyr(tBu)單連接6Ala單連接7Asn(Trt)單連接8Lys(Boc)單連接9Ile單連接10Ile單連接11Ala單連接12Asn(Trt)單連接13Lys(Boc)單連接14Phe單連接15Leu單連接16Thr(tBu)單連接17Val單連接18Leu單連接19Pro雙連接/Ac20封端20Thr(tBu)單連接21Gln(Trt)單連接22Set(tBu)單連接23Lys(Boc)單連接24Glu(OtBu)單連接25Bet(tBu)單連接26Thr(tBu)單連接27Met單連接28Phe單連接29Gly單連接30G1y單連接31Tyr(tBu)單連接32Arg(Pmc)單連接33Lys(Boc)單連接34Asp(OtBu)單連接35Lys(Boc)單連接36Pro雙連接/Ac20封端37Pro雙連接/Ac20封端38Ser(tBu)單連接39Gly單連接40Trp(Boc)單連接41Arg(Pmc)單連接42Phe單連接43His(Trt)單連接44Glu(OtBu)單連接45Met單連接46Arg(Pmc)單連接47Tyr(tBu)單連接48Pro雙連接/Ac20封端49Gly單連接50Glu(OtBU)單連接51Asp(OtBu)單連接52Lys(Boc)單連接53Lys(Boc)單連接54Glu(OtBU)單連接55Ala單連接56Ala單連接57Val單連接58Leu單連接59Leu單連接60Ser(tBu)單連接61His(Trt)單連接62Glu(OtBu)單連接63Leu單連接64Asp(OtBu)單連接65Ala單連接66Gln(Trt)單連接67Ala單連接68Gly單連接69Ala單連接70Gly(Fmoc-hmb)雙連接/Ac20封端71Asp(OtBu)單連接72Asp(OtBu)單連接73Ala單連接74Pro雙連接/Ac20封端75Gly(Fmoc-hmb)雙連接/Ac20封端76Asp(OtBu)單連接77Pro雙連接/Ac20封端78Gly(Fmoc-hmb)雙連接/Ac20封端79Asp(OtBu)單連接80Gly單連接81Glu(OtBu)單連接82Arg(Pmc)單連接83Leu單連接84Arg(Pmc)單連接85Gln(Trt)單連接86Gly單連接87Thr(tBu)單連接88Leu單連接89Glu(OtBu)單連接90最終脫保護對于反應緩慢或低效率的氨基酸來說，進行2個獨立的連接反應。通過用乙酸酐處理封閉所有剩余的未反應的肽，對于所述氨基酸之一的步驟的順序是脫保護、連接反應1、洗滌、連接反應2、洗滌、Ac20封端、洗滌、脫保護。縮略語OtBu叔丁基酯，tBu叔丁基，Boc叔丁氧基羰基，Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基，Hmb2-羥基-4-甲氧基芐基，Fmoc9-芴甲氧基羰基。例2構建編碼BLT的合成基因用標準克隆方法構建質粒，如Maniatis等所披露的，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，紐約(1982)，酶和其他試劑是從Gibco-BRL，Gaithersgurg，MD或新英格蘭實驗室，BeverlyMAO1915獲得。用于消化、鑒定、回收和純化本發明所使用的各種寡核苷酸和DNA片段的方法是本領域技術人員所熟知的，而且用于將所述序列連接到載體上，轉化宿主微生物，以及在能夠產生質粒DNA和重組蛋白產物的條件下培養所述宿主微生物的方法也是已知的。編碼人BLT的DNA序列(序列8)是用8個化學合成的大小為52-86個堿基的寡核苷酸組裝而成的。所述寡核苷酸是用諸如應用生物系統380A或380B型的常規DNA合成裝置制備的(可以從應用生物系統公司購買，850，LincolnCenterDrive，Foster市，CA94404)。設計所述寡核苷酸的序列，以便由4個所述寡核苷酸形成合成基因的一條鏈，而由其余的4個寡核苷酸形成該合成基因的互補鏈。在組裝之前，在有ATP的條件下用多核苷酸激酶處理所述寡核苷酸，以便將每一個寡核苷酸上的游離羥基磷酸化。將所述8種寡核苷酸以等摩爾濃度(3皮摩爾/微升)混合在100微升體積中，加熱到95℃，并用數小時時間逐漸冷卻到室溫。這樣能使得單個的寡核苷酸進行正確的堿基配對。加入T4DNA連接酶，連接所述寡核苷酸，產生大約285堿基對的雙鏈DNA，在2％瓊脂糖凝膠上對該DNA進行分析和純化。將具有“粘性”末端的該片段連接到用NdeⅠ和BamHⅠ消化過的pUC18載體上。將所述連接混合物轉入感受態DH10B細胞中，將所述細胞鋪平板到含有100微克/毫升氨芐青霉素的胰胨-酵母瓊脂平板上。對生長過夜的菌落進行分析，證實是否存在含有所述化學合成基因的質粒。所述分析是這樣進行的從所述菌落中純化質粒DNA，用NdeⅠ和BamHⅠ消化所述質粒DNA，并證實大約285堿基對片段的存在。然后通過DNA序列分析證實正確的序列。該質粒被命名為pOJ838。例3構建表達BLT融合蛋白的質粒由于BLT是一種小的蛋白，優選通過產生融合蛋白以增加其大小。為此，使用兩種不同的融合配偶體。一種是具有因子Xa裂解位點的谷胱甘肽S-轉移酶(GST)，其氨基酸序列在本文中被稱為序列6，它是由載體pGEX-2T(Pharmacia生物技術，Piscataway,NJ08855)編碼的；另一個是短肽序列MIIGLMVGGVSGSGSGSGDDDDP(序列3)。為了獲得天然β-促脂解素，通過化學或酶促消化處理融合蛋白，以便將β-促脂解素從其融合配偶體上解離。這一目的通過在所述融合配偶體和β-促脂解素之間插入酶促或化學裂解位點而實現。對于GST融合體來說，選擇腸激酶或因子Xa的識別位點；對于小的合成肽融合體(序列3)來說，插入一個脯氨酸，以便在酸處理之后能夠進行化學裂解。編碼具有因子Xa識別序列(IEGR)的GST融合體的質粒是按如下方法構建的。用AdeⅠ和NruⅠ消化質粒pOJ838(含有合成β-促脂解素的pUC18；參見例4)，并對最大的載體片段進行凝膠純化。以等摩爾量混合序列為5’TATGAGATCTATCGAAGGTCGTGAGCTCACCGGTCAGCGTGTTCG-3’(序列4)的合成接頭及其補體，加熱到95℃，并通過逐漸將溫度降低到大約25℃進行退火。將退火的接頭連接到所述載體片段上，并將連接混合物轉入感受態DH10B細胞。將轉化細胞鋪平板到含有100微克/毫升氨芐青霉素的胰胨-瓊脂平板上。對生長過夜的菌落進行分析，證實含有所述接頭序列的質粒的存在。這一目的是這樣實現的從所述菌落中純化質粒DNA，證實通過所述接頭導入的新的BglⅡ位點的存在。然后通過DNA序列分析證實正確的接頭序列。所得到的質粒被命名為pOJ839。用BglⅡ和EcoRⅠ消化質粒pOJ839，并對含有β-促脂解素基因的小的片段(現在連接在因子Xa識別序列上)進行凝膠純化，并連接到用BamHⅠ和EcoRⅠ消化過的pGEX2-T上。將連接混合物轉入感受態DH10B細胞，將所述細胞鋪平板到含有100微克/毫升氨芐青霉素的胰胨-酵母瓊脂平板上，對生長過夜的菌落進行分析，在用SacⅠ消化之后證實含有新的大約300bp片段的質粒的存在。這種新的質粒被命名為pOJ840。例4編碼羧肽酶原-BLT融合蛋白的重組載體pHMM260-ProCpB(10)/LVPR/β-促脂解素(R49)一種含有ProCpB(10)/LVPR/β-促脂解素(R49)表達框的重組DNA表達載體pHMM260編碼羧肽酶原-BLT融合蛋白。該載體是用標準克隆技術生產的。對pHMM260表達框的注釋如圖16所示。該表達框的旁側在5’末端是NdeⅠ位點，而在3’末端是BamHⅠ位點。豬羧肽酶原B蛋白的前肽部分存在于所述表達框的5’末端，始于Mgt殘基，并止于Ser殘基。凝血酶蛋白酶識別序列LVPR存在于羧肽酶原的3’末端。該序列始于Glu殘基，位于凝血酶裂解位點的3’末端，編碼野生型人β-促脂解素。構建若干衍生的表達框，以便BLT序列的49號位置從野生型序列Arg(R49)改變成Ala(A49)pHMM261，或Glu(E49)pHMM262，或Gln(Q49)pHMM263。制備上述衍生物是為了降低在所述融合蛋白的合成和純化期間受到蛋白酶解作用的影響。上述所有載體編碼可溶性融合蛋白。例5編碼絲氨酸羥基甲基轉移酶(SHMT)-BLT融合蛋白的重組載體pHMM268用標準克隆技術構建含有源于絲氨酸羥基甲基化酶轉移酶(SHMT)的氨基末端序列的融合蛋白。質粒pHMM268在大腸桿菌中以高水平表達。由pHMM268產生的融合蛋白是不溶性的，并可以以顆粒組分形式回收。這一特征的優點是，可以防止蛋白酶解降解作用。例6給雄性AVY/A小鼠服用小鼠BLT7天AVY/A小鼠是研究肥胖和糖尿病的模型。這種近交品系在中年時期會產生血糖過多病、胰島素過多病和胰島素不敏感性，因此構成了研究肥胖和糖尿病的有用模型。雄性AVY/A小鼠是從Harlan公司(Indianapolis,IN)購買的，大約為6月齡。將所述動物圈養在籠子中，每籠6只，并隨意采食5008食物和水。在規定的間隔時間測定血液葡萄糖含量；當清晨葡萄糖含量達到至少300毫克/dL時，讓所述動物接受實驗方案。將5只隨機挑選的動物圈養在一起作為對照；將5只隨機挑選的動物圈養在一起接受小鼠BLT(小鼠BLT序列容易獲得；例如，參見M.Notake等FEBS通訊156，67-71，1983，收作本文參考文獻)處理，所述小鼠BLT是通過固相技術合成的。接受處理的小鼠每天2次皮下注射(SC)BLT(每一個劑量共200微升體積)；對照動物每天2次注射200微升媒介物(鹽水溶液)。所述動物每天注射2次，在上午和下午注射，共注射6天；在第7天只在上午進行注射。在第0天上述測定血液葡萄糖含量、體重、和食物消耗量。第1-6天早上測定體重和食物消耗量。在第6天上午測定血漿甘油三酯。從第6天下午到第7天上午對小鼠禁食一夜。第7天進行口服葡萄糖耐受性試驗。在上午注射鹽水或BLT2小時之后測定0時間血液葡萄糖含量。為了進行該試驗，給動物口服25％葡萄糖溶液(100微升/10克體重)，然后在30、60、和120分鐘之后放血。將所述血樣用于測定葡萄糖和胰島素含量。在口服葡萄糖耐受性試驗之后，讓所述動物自由進食。在最后1次SC注射鹽水或BLT之后第1、3、和14天，對動物放血，以便測定血液葡萄糖值。結果體內服用BLT可降低血液葡萄糖和胰島素含量上述實驗結果歸納在圖1-8中。在為期7天的處理時間內，對照組和實驗組的動物大約消耗4.5-6克食物(圖1)。在兩組中的體重保持相同，大約為50克(圖2)。在處理6天之后，在處理過的小鼠體內BLT處理可降低血漿甘油三酯(參見圖3)。對照動物表現出3.05nmol/l(s.d.0.58)的平均值，而處理動物測得的平均值為2.05nmol/l(s.d.0.43)。這表明了血清甘油三酯下降了大約30％-35％。BLT還能在處理過的動物中導致血液葡萄糖含量的顯著降低(圖4)。在服用BLT7天之后，處理組表現出的血液葡萄糖含量為135mg/dL(s.d.16)；形成鮮明對照的是，對照組的測定值為171mg/dL(s.d.16)。處理動物體內血液葡萄糖含量的降低在第7天最后一次服用BLT之后能持續至少3天(圖5)。對照動物表現出的葡萄糖含量為331mg/dL(s.d.79)。另一方面，處理動物保持明顯較低的血液葡萄糖含量，為205mg/dL(s.d.76)。在最后一次服用BLT之后第14天沒有觀察到BLT在降低血液葡萄糖含量方面的作用(圖6)。為了證實BLT處理對胰島素含量的影響，在為期7天的處理和禁食一夜之后進行口服葡萄糖耐受試驗(圖7和圖8)。在開始試驗之后30分鐘，對照和處理動物表現出最初的血液葡萄糖含量升高，從大約80mg/dL升高到200mg/dL或更高；隨后兩個組表現出水平相當的葡萄糖值的降低，一直到2小時的時間點(圖7)。另人吃驚的是，處理過的動物表現出的血漿胰島素值明顯低于對照動物的(圖8)。例如，在30分鐘的時間點上，對照動物的胰島素含量為11.5mg/dL(s.d.1.9)，而處理動物的胰島素含量為6.0mg/dL(s.d.3.0)。例7給雄性AVY/A小鼠服用小鼠BLT14天對雄性AVY/A小鼠進行圈養，每籠6只，自由采食5008食物和水。在規定的間隔時間測定血液葡萄糖含量；當清晨葡萄糖含量達到至少300毫克/dL時，讓所述動物接受實驗方案。將5只隨機挑選的動物圈養在一起作為對照；將5只隨機挑選的動物圈養并用小鼠BLT處理，所述小鼠BLT是通過固相技術合成的。接受處理的小鼠每天2次SC注射600微克BLT(每一個劑量共200微升體積)；對照動物接受200微升媒介物(鹽水溶液)。每天2次注射所述動物，在上午和下午注射，共注射13天；在第14天只在上午進行注射。在第0天上午測定血液葡萄糖含量、體重、和食物消耗量。第1-13天早上測定體重和食物消耗量。從第13天下午到第14天上午對小鼠禁食一夜。在第14天，進行口服葡萄糖耐受性試驗。在上午注射鹽水或BLT2小時之后測定0時間血液葡萄糖含量。為了進行該試驗，給動物口服25％葡萄糖溶液(100微升/10克體重)，然后在30、60、和120分鐘之后放血。將所述血樣用于測定葡萄糖和胰島素含量。在口服葡萄糖耐受性試驗之后，讓所述動物自由進食。在最后1次SC注射鹽水或BLT之后第1、3、和14天，對動物放血，以便測定血液葡萄糖值。結果服用BLT14天可降低血液葡萄糖和胰島素含量有關結果歸納在圖9-10中。在為期14天的處理時間內，對照組和實驗組的動物大約消耗4.5-6克食物，而兩組動物的體重保持相同，大約為50克(數據未顯示)。為了證實用BLT處理2周對胰島素含量的影響，在14天時間進行口服葡萄糖耐受性試驗(圖9和圖10)。在30分鐘的時間點上，對照和處理動物表現出最初的血液葡萄糖含量升高，從大約80mg/dL升高到300mg/dL或更高；隨后兩個組表現出水平相當的葡萄糖含量值的降低，一直到2小時該試驗的結束點(圖9)。例如，處理過的動物在30分鐘的時間點上表現出平均血液葡萄糖含量為289mg/dL(s.d.24)，而對照組的含量為348mg/dL(s.d.18)。還在60分鐘和120分鐘的時間點上觀察到較低的含量。例如，在120分鐘時，處理動物的平均血液葡萄糖含量為114mg/dL(s.d.4)，而對照組的含量為188mg/dL(s.d.23)。處理動物還表現出血漿胰島素值明顯低于對照動物的(圖10)。例如，在30分鐘的時間點上，對照動物的胰島素含量為7.4ng/ml(s.d.2.1)，而處理動物的胰島素含量為4.8ng/ml(s.d.0.6)。例8在3T3脂肪細胞中BLT刺激葡萄糖攝取將小鼠3T3-L1細胞鋪平板在每孔大約100微升生長培養基的96孔平板上，以便每孔分配大約25，000細胞。生長培養基DMEM，高葡萄糖，w/outL-谷氨酰胺10％牛血清2mML-谷氨酰胺1％PenStrep1.25微克/毫升兩性霉素在鋪平板之后3天通過用不同的培養基更換生長培養基誘導細胞分化成脂肪細胞。分化培養基DMEM，高葡萄糖，w/outL-谷氨酰胺10％FBS2mML-谷氨酰胺1％PenStrep1.25微克/毫升兩性霉素10mMHeps0.25μM地塞米松(1微升/毫升0.25mM母液)0.5mMIBMX(10微升/毫升50mM母液)5微克/毫升胰島素(1微升/毫升5毫克/毫升母液)用通過一個流量控制器連接在箱式真空源上的8路歧管將培養基從細胞中吸出。用一個8路Matrix電子移液管將新鮮培養基分配到孔中，將其設定為最低速度，以便減少對細胞的破壞。在第1天，將100微升分化培養基加入每一個孔中，以便開始將3T3細胞分化成脂肪細胞。在開始分化之后第3天，將所述培養基更換成含有胰島素的分化培養基，但不含IBMX或地塞米松(胰島素培養基)。在第6天將所述培養基再次更換成不含胰島素、IBMX、或地塞米松的培養基(FBS)培養基。將細胞維持在FBS培養基中，每隔一天進行飼養，直到在開始分化之后15-21天能夠進行葡萄糖轉運試驗。例9在存在BLT的條件下在被誘導分化成脂肪細胞的3T3細胞中進行葡萄糖轉運試驗按例8所述方法誘導小鼠3T3-L1細胞分化成脂肪細胞。在進行葡萄糖轉運試驗之前15-24小時，按如下方法處理細胞1．在37℃下用100毫升磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)洗滌孔兩次，在兩次洗滌之間進行抽吸。2．然后，向每一個孔中添加100毫升DMEM，高葡萄糖，1％抗生素/抗真菌素溶液，2mM谷氨酰胺，0.1％BSA(加熱到37℃)，0-1000nM小鼠BLT(通過固相技術合成)，和0-100nM胰島素。這一時期是血清饑餓階段。3．然后，在37℃下培養細胞過夜。在試驗當天，按如下方法處理細胞1．除去培養基，在紙巾上吸印平板，并用100毫升KRBH緩沖液(含有Hepes的Krebs-Ringer緩沖液，pH7.4)洗滌細胞兩次。2．在去掉最終的洗滌液之后，在37℃下在100微升KRBH、含有100M葡萄糖的0.1％BSA、10微升/毫升(0.1μCi/孔)放射性標記過的2-脫氧葡萄糖(C14)和適當濃度的胰島素中培養所述細胞1小時。3．在用放射性標記過的葡萄糖培養之后，加入10微升10×細胞松弛素B(200μM)，終止細胞對葡萄糖的進一步攝取。4．通過在Microbeta平板讀數器上讀平板的數測定放射性標記的葡萄糖攝取。結果該實驗的結果歸納在圖11中。當在攝取實驗之前用BLT對脂肪細胞進行預處理時，被攝入誘導分化成脂肪細胞的3T3細胞的葡萄糖從大約3倍增加到大約6倍。例10在有BLT的功能性片段的條件下在誘導分化成脂肪細胞的3T3細胞中進行葡萄糖轉運實驗按例8方法將小鼠3T3-L1細胞誘導分化成脂肪細胞。在進行葡萄糖轉運試驗之前大約14-24小時，按如下方法處理細胞1．在37℃下用100毫升磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)洗滌孔兩次，在兩次洗滌之間進行抽吸。2．然后，向每一個孔中添加100毫升DMEM、高葡萄糖、1％抗生素/抗真菌素溶液、2mM谷氨酰胺、0.1％BSA(加熱到37℃)、0-1000nM小鼠或人BLT(通過固相技術合成)和0-100nM胰島素。這一時期是血清饑餓階段。例如，在一種實驗中使用在本文中被稱為序列10的人BLT片段；在另一個實驗中，使用在本文中被稱為序列12的人BLT片段。3．然后，在37℃下培養細胞過夜。在實驗的當天，按如下方法處理細胞1．除去培養基，在紙巾上吸印平板，并用100毫升KRBH緩沖液(含有Hepes的Krebs-Ringer緩沖液，pH7.4)洗滌細胞兩次。2．在去掉最終的洗滌液之后，在37℃下在100微升KRBH、含有100M葡萄糖的0.1％BSA、10微升/毫升(0.1μCi/孔)放射性標記過的2-脫氧葡萄糖(C14)和適當濃度的胰島素中培養所述細胞1小時。3．在用放射性標記過的葡萄糖培養之后，加入10微升10×細胞松弛素B(200μM)，終止細胞對葡萄糖的進一步攝取。4．通過在Microbeta平板讀數器上讀平板的數測定放射性標記的葡萄糖攝取。結果當在所述攝取實驗之前用BLT的功能性片段對脂肪細胞進行預處理時，被誘導分化成脂肪細胞的3T3細胞對葡萄糖的攝取相對對照而言有所加強。例11BLT的功能性類似物按例10所述方法將小鼠3T3-L1細胞誘導分化成脂肪細胞。然后按例8所述方法用人BLT類似物，例如序列26-序列35處理脂肪細胞，并監測葡萄糖轉運。功能性類似物表現出與天然BLT大體上相同的結果。例12給雄性AVY/A小鼠服用人BLT14天按例7所述方案的劑量給雄性AVY/A小鼠服用固相合成的人BLT。結果服用人BLT能顯著降低雄性AVY/A小鼠的血清胰島素含量(參見圖12和13)。有關結果歸納在圖12-13中。在為期14天的處理中，對照組和實驗組的動物大約消耗4.5-6克食物，而在兩組中的體重保持相同，大約為50克(數據未顯示)。為了證實用人BLT進行2周處理對血漿葡萄糖和其胰島素含量的影響，在14天的時間之后進行口服葡萄糖耐受試驗。在30分鐘的時間點上，對照動物和處理動物表現出最初的血液葡萄糖含量升高，從大約80mg/dL升高到300mg/dL或更高；隨后兩個組表現出水平相當的葡萄糖值的降低，一直到2小時的時間點(圖12)。例如，處理過的動物在30分鐘的時間點上表現出平均血液葡萄糖含量為大約400mg/dL(s.d.12)，而對照的含量330mg/dL(s.d.19)。在60分鐘和120分鐘的時間點上也觀察到較低的含量。例如，在120分鐘時，處理動物的平均血液葡萄糖含量為178mg/dL(s.d.16)，而對照組的含量為202mg/dL(s.d.13)。處理動物表現出血漿胰島素值明顯低于對照動物的(圖13)。例如，在30分鐘的時間點上，對照動物的胰島素含量為14.0ng/ml(s.d.1.5)，而處理動物的胰島素含量為10.2ng/ml(s.d.0.4)。在120分鐘時間點上，對照動物的胰島素含量為9.3ng/ml(s.d.2.3)，而處理動物的胰島素含量為5.4ng/ml(s.d.0.9)。例13給雄性Lepob/Lepob小鼠服用小鼠β-促脂解素將從Jackson實驗室(BarHarbor,ME)購買的雄性Lepob/Lepob小鼠單獨圈養，并自由采食5008食物和水。從尾部對小鼠放血，測定最初的葡萄糖、胰島素、和甘油三酯值。選擇小鼠用作對照，或每天兩次注射小鼠β-促脂解素60微克或120微克處理。處理小鼠每天兩次皮下注射60微克或120微克(每個劑量為200微升的總體積)；對照小鼠接受200微升媒介物(鹽水)。在每天注射2次，在上午7點和下午3點對小鼠進行注射，共注射16天，而在第17天只在上午7點進行注射。在第0-17天清晨測定體重和食物消耗量。在第7天清晨將小鼠尾部放血，進行葡萄糖、胰島素和甘油三酯值的測定。從第13天下午到第14天上午將所述動物禁食一夜。第14天進行口服葡萄糖耐受性試驗。在上午注射之后2小時測定0時間血液葡萄糖和胰島素。給小鼠口服25％葡萄糖溶液(100微升/10克體重)，然后在30、60、和120分鐘之后放血。將所述血樣用于測定葡萄糖和胰島素。在口服葡萄糖耐受性試驗之后，讓小鼠自由進食。在第16天，取尾部血樣，以便測定血液葡萄糖值、胰島素、甘油三酯、和皮質酮值。在第17天，宰殺小鼠。該實驗的結果如圖14所示。在為期16天的處理期間內，處理動物的血漿胰島素值顯著降低。例如，在處理的第7天，對照動物的胰島素值大約為300ng/ml，而處理動物的測定值為大約215ng/ml，至少降低了30％。另外，在處理的第16天，處理動物的血漿胰島素值較低(圖14)。例14給雄性Lepob/Lepob小鼠通過AlzetTM泵服用人BLT將從Jackson實驗室(BarHarbor,ME)購買的1月齡雄性Lepob/Lepob小鼠單獨圈養，并自由采食5008食物和水。給予12小時的光照周期(從下午6點到上午6點關閉光源)。從尾部對小鼠放血，測定最初的葡萄糖、胰島素、和甘油三酯值。處理動物接受0.24mg/天或0.48mg/天連續服用的人β-促脂解素(ER4-VBH43)，通過皮下植入AlzetTM泵(Alza公司)服用，使得所有三個組中的平均葡萄糖和甘油三酯值相等。對照動物接受鹽水溶液。對對照組來說，用鹽水填充所述泵，對低劑量組來說用20毫克/毫升人β-促脂解素填充，而對高劑量組來說用40毫克/毫升人β-促脂解素填充。在植入所述泵之前用異氟烷麻醉小鼠。在第0-7天清晨測定體重和食物消耗量。在第4天上午將小鼠尾部放血，進行葡萄糖、胰島素和甘油三酯值的測定。從第6天下午到第7天上午將小鼠禁食一夜。第7天進行口服葡萄糖耐受性試驗。將小鼠尾部放血，進行0時間胰島素和葡萄糖測定，然后口服25％葡萄糖溶液(100微升/10克體重)，然后在30、60、和120分鐘之后放血。將血樣用于測定葡萄糖和胰島素。在口服葡萄糖耐受性試驗之后，讓小鼠自由進食。相應于血漿胰島素含量的葡萄糖耐受性實驗的結果如圖15所示。0.24mgBLT/天的值比對照大約低25％，而0.48mgBLT/天的值比對照大約低40％(參見圖15中插入曲線下面的部分)。例15人BLT蛋白類似物的固相合成和純化用Fmoc化學法用一個輪次合成人BLT肽的類似物(即序列26所示的類似物)，其中，用Ala取代序列8中的Glu。由于在BLT分子的N-末端部分存在若干asp-gly二肽序列，使得BLT的合成復雜化。業已觀察到asp-gly二肽序列上的天冬酰胺側鏈發生堿催化環化作用，并且隨后在FMOC合成中添加哌啶。通過在合成中在每一個asp-gly序列上使用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-甘氨酸可以消除上述反應。通過用Hmb基團保護甘氨酰胺，可以抑制天冬酰胺側鏈的環化作用。在裂解、脫保護、和反相HPLC純化后，可以電噴射質譜術分析所述肽。所述BLT合成中出現的主要類型是具有預期質量的完整長度肽。使用該方法可以用一個輪次，以0.1mM的規模生產數量超過100毫克的純化蛋白。材料預加樣Fmoc-Glu(OtBu)Wang(用對苯氧基芐醇功能化的1％交聯的聚苯乙烯)樹脂，大約為0.6M氨基酸克樹脂。N-甲基吡咯烷酮(NMP)、哌啶、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-甲基脲六氟磷酸(HBTU)，2MN，N，二異丙基乙基胺(DIEA)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，二氯甲烷(DCM)，二甲基甲酰胺(DMF)。對用Fmoc-保護的C-末端氨基酸(0.1或0.25mM氨基酸)預加樣的樹脂進行稱重，并放入反應室中。通過用DCM洗滌使所述樹脂預膨脹，然后用NMP洗滌所述樹脂，通過在溶解在NMP中的12-22％哌啶溶液中溫育所述樹脂除去N-末端Fmoc基團。在脫保護之后用NMP充分洗滌所述樹脂。將待添加到所述肽上的1mmo1的另一個Fmoc保護的氨基酸溶解在2.1克NMP、2.0克溶解在DMF中的O.45MHBTU／HOBt制劑中。在溶解之后，通過添加3ml溶解在NMP中的2MDIEA開始氨基酸的活化。然后將活化的氨基酸添加到脫保護的樹脂上，并進行連接。在交聯結束之后，用NMP徹底洗滌所述樹脂。然后對每一個后續的氨基酸重復完整輪次的脫保護和連接。在所述合成中的特定輪次中的步驟如下輪次AA步驟1Ala完全洗滌2Gly單連接3Lys(Boc)單連接4Lys(Boc)單連接5Tyr(tBu)單連接6Ala單連接7Asn(Trt)單連接8Lys(Boc)單連接9Ile單連接10Ile單連接11Ala單連接12Asn(Trt)單連接13Lys(Boc)單連接14Phe單連接15Leu單連接16Thr(tBu)單連接17Val單連接18Leu單連接19Pro雙連接/Ac20封端20Thr(tBu)單連接21Gln(Trt)單連接22Set(tBu)單連接23Lys(Boc)單連接24Glu(OtBu)單連接25Set(tBu)單連接26Thr(tBu)單連接27Met單連接28Phe單連接29Gly單連接30Gly單連接31Tyr(tBu)單連接32Arg(Pmc)單連接33Lys(Boc)單連接34Asp(OtBu)單連接35Lys(Boc)單連接36Pro雙連接/Ac20封端37Pro雙連接/Ac20封端38Ser(tBu)單連接39Gly單連接40Trp(Boc)單連接41Arg(Pmc)單連接42Phe單連接43His(Trt)單連接44Glu(OtBu)單連接45Met單連接46Arg(Pmc)單連接47Tyr(tBu)單連接48Pro雙連接/Ac20封端49Gly單連接50Glu(OtBu)單連接51Asp(OtBu)單連接52Lys(Boc)單連接53Lys(Boc)單連接54Glu(OtBu)單連接55Ala單連接56Ala單連接57Val單連接58Leu單連接59Leu單連接60Ser(tBu)單連接61His(Trt)單連接62Glu(OtBu)單連接63Leu單連接64Asp(OtBu)單連接65Ala單連接66Gln(Trt)單連接67Ala單連接68Gly單連接69Ala單連接70Gly(Fmoc-hmb)雙連接/Ac20封端71Asp(otBu)單連接72Asp(OtBu)單連接73Ala單連接74Pro雙連接/Ac20封端75Gly(Fmoc-nmb)雙連接/Ac20封端76Asp(OtBu)單連接77Pro雙連接/Ac20封端78G1y(Fmoc-hmb)雙連接/Ac20封端79Asp(OtBu)單連接80Gly單連接81Glu(OtBu)單連接82Arg(Pmc)單連接83Leu單連接84Arg(Pmc)單連接85Gln(Trt)單連接86Gly單連接87Thr(tBu)單連接88Leu單連接89Glu(OtBu)單連接90最終脫保護對于反應緩慢或低效率的氨基酸來說，進行2個獨立的連接反應，通過用乙酸酐處理封閉所有剩余的未反應的肽，對于所述氨基酸之一的步驟的順序是脫保護、連接反應1、洗滌、連接反應2、洗滌、Ac20封端、洗滌、脫保護。縮略語OtBu叔丁基酯，tBu叔丁基，Boc叔丁氧基羰基，Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基，Hmb2-羥基-4-甲氧基芐基，Fmoc9-芴甲氧基羰基。例16給雄性ZDF大鼠A1zet泵服用人BLT將從遺傳學模型公司(Indianapolis，IN)購買的雄性Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠單獨圈養，并自由采食5008食物和水。在5周齡時將所述大鼠禁食一夜，進行最初的口服葡萄糖耐受性實驗。從尾部抽血測定0時間點上的胰島素和葡萄糖含量，然后給所述動物口服50％的葡萄糖溶液(2．5克／公斤體重)，并在服用之后30、60、和120分鐘抽血，在口服葡萄糖耐受性試驗之后，讓所述大鼠自由進食。在6周齡時，將所述動物分組，每組4只動物，服用人BLT。在實驗的第0天，再次從尾部抽血，測定葡萄糖、胰島素、皮質酮和甘油三酯的值。隨機挑選所述大鼠為對照，通過皮下植入Alzet泵連續服用人β-促脂解素(ER4-VTA-2)0.5毫克/天或1.0毫克/天。對對照來說，用鹽水填充所述泵，對低劑量組來說用20.835mg/ml人β-促脂解素填充，而對高劑量組來說用41.67mg/ml人β-促脂解素填充。在皮下植入之前37℃下在鹽水中溫育所述泵過夜。在第0-8天測定體重和食物消耗量。在第3天上午取樣，測定葡萄糖、胰島素、皮質酮和甘油三酯值。從第5天下午到第6天上午將大鼠禁食一夜。在第6天，進行口服葡萄糖耐受性試驗，。在口服葡萄糖耐受性試驗之后，讓大鼠自由進食。用于該研究的Zucker動物是2型糖尿病的良好模型。在6-7周齡時，血液葡萄糖值和甘油三酯含量升高，而胰島素分泌降低。這些動物是抗皮質酮過多和胰島素的。表3．用人BLT處理的ZDF大鼠表3和圖16中的結果表明每天服用劑量為1毫克的人BLT可以對ZDF大鼠產生明顯影響。在開始OGTT30分鐘之后，對照的血漿葡萄糖含量平均為191±16毫克/dL，而BLT處理動物為172±5毫克/dL(參見圖16)。在開始之后60分鐘，對照動物表現出的葡萄糖含量為157±6毫克/dL，而BLT處理動物為154±8毫克/dL。表3表明，在BLT處理動物中血液葡萄糖值保持低于對照動物，特別是在較高劑量下。在開始服用BLT第0、2、和7天，對照動物所具有的葡萄糖值為大約150毫克/dL。另一方面，用1毫克/天人BLT處理的動物在第7天平均為140毫克/dL，低于對照動物大約7％。處理動物還表現出比對照動物低大約11％的血清甘油三酯含量(表3)，這證實了BLT處理的促胰島素作用。例17在ZDF大鼠骨骼肌中人BLT能促進葡萄糖轉運進行一種研究，以便確定β-促脂解素在骨骼肌中對葡萄糖轉運的影響。Zucker糖尿病肥胖(ZDF/GmiTM-fa/fa)雄性大鼠是從遺傳學模型公司獲得(Indianapolis,IN)。用PurinaFormulab5008大鼠飼料(PurinaMills公司，圣路易絲，MO)維持所述大鼠，并圈養在光照受控制的空間內，給予12小時的光照和黑暗的交周期。單獨圈養大鼠，并自由采食食物和水。為了測定肌肉組織中葡萄糖的轉運，通過腹膜內注射戊巴比妥鈉鹽(6.5毫克/100毫克體重)麻醉來自例16的動物，分離足底肌并分成兩半。將每一半組織樣品放在鹽水中洗滌2分鐘，然后在充氣的(95％氧氣-5％二氧化碳)含有1％BSA、8mM葡萄糖和32mM甘露糖醇的KHB中洗滌。按如下方法進行葡萄糖轉運實驗。預培養將肌組織樣品轉移到裝有1.8毫升充氣的含有1％BSA、8mM葡萄糖和32mM甘露糖醇的KHB的20毫升試管中，含或不含500nM小鼠β-促脂解素。將樣品放置在搖動水浴中在室溫下保持20小時，進行兩次間隔的緩沖液更換。在預培養之后，在29℃下在恒定的95％氧氣-5％二氧化碳氣流中洗滌肌組織樣品15分鐘。在含有1.8毫升添加了40mM甘露糖醇的試管中洗滌所述樣品，在有(2000μU/ml)或沒有胰島素，有或沒有β-促脂解素(100nM)的條件下進行。然后在恒定的95％氧氣-5％二氧化碳氣流中將肌樣品轉移到新的試管中。所述溫育培養基包括8mM3-O-甲基-葡萄糖(OMG)、2mCi/ml3H-3-OMG、30mM甘露糖醇、0.3mCi/ml14C甘露糖醇、2mM丙酮酸、胰島素(2000μU/ml)、和小鼠β-促脂解素。對照缺少胰島素和/或β-促脂解素。在29℃下保持10分鐘之后，冷凍控制樣品，并冷凍保存直到可以進行葡萄糖轉運實驗。葡萄糖轉運將肌肉削減到大約20-25毫克，在70℃下在0.5毫升1M氫氧化鉀中消化30分鐘。在消化之后，將樣品放在冰上，并取出100微升樣品進行糖原分析。向其余的0.4毫升樣品中添加0.4毫升1N鹽酸，并對試管進行渦旋攪拌。然后將300毫升鹽酸處理的樣品添加到6.4毫升閃爍液中，并在閃爍計數器上測定樣品的放射性。用14C甘露糖醇做細胞外標記，根據細胞內3H-3-OMG累積量計算葡萄糖轉運。糖原含量向100微升上述樣品中添加17微升冰醋酸和500微升0.3M乙酸鈉緩沖液(Ph4.8+5毫克/毫升淀粉葡糖苷酶)。然后在37℃下溫育所述試管過夜。在第2天，將50微升樣品放入96孔平板上，并添加200微升Trinder試劑(Sigma315-100；用水稀釋到20微升)。在37℃下溫育所述平板10分鐘，并在505nm波長下測定吸收讀數。表4．用人BLT處理過的ZDF大鼠肌肉組織中的葡萄糖轉運處理3OMG轉運(μmol/克/10分鐘)對照.085±.01胰島素.080±BLT+胰島素.113±.018序列表&#60110&#62Butler,JonP.Hale,JohnE.HeathJrWilliamF.Schoner,BrigitteE.Heiman,MarkL.Becker,GeraldW.Varshavsky,AlexanderD.&#60120&#62β-促脂解素及其用途&#60130&#62X-12139&#60140&#62&#60141&#62&#60160&#6235&#60170&#62PatentInVer.2.0&#60210&#621&#60211&#62273&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述Met-Arg人BLT&#60400&#621atgcgtgagctcaccggtcagcgtcttcgcgaaggtgacggtccggacggtccggctgac60gacggtgctggtgctcaggcagatctcgagcactccctgctggttgctgcagaaaaaaaa120gacgaaggtccgtaccgtatggaacacttccgttggggttccccgccgaaagacaaacgt180tacggtggtttcatgacctccgaaaaatcccagaccccgctggttaccctgttcaaaaac240gctatcatcaaaaatgcatacaaaaaaggtgaa273&#60210&#622&#60211&#6291&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述Met-Arg人BLT&#60400&#622MetArgGluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAsp151015GlyProAlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSer202530LeuLeuValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGlu354045HisPheArgTrpGlySerProProLysAspLysArgTyrGlyGlyPhe505560MetThrSerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsn65707580AlaIleIleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu8590&#60210&#623&#60211&#6223&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述融合蛋白配偶體&#60400&#623MetIleIleGlyLeuMetValGlyGlyValSerGlySerGlySerGly151015SerGlyAspAspAspAspPro20&#60210&#624&#60211&#6245&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述寡核苷酸接頭&#60400&#624tatgagatctatcgaaggtcgtgagctcaccggtcagcgtgttcg45&#60210&#625&#60211&#62114&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述BTL融合蛋白&#60400&#625MetIleIleGlyLeuMetValGlyGlyValSerGlySerGlySerGly151015SerGlyAspAspAspAspProMetArgGluLeuThrGlyGlnArgLeu202530ArgGluGlyAspGlyProAspGlyProAlaAspAspGlyAlaGlyAla354045GlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeuValAlaAlaGluLysLysAsp505560GluGlyProTyrArgMetGluHisPheArgTrpGlySerProProLys65707580AspLysArgTyrGlyGlyPheMetThrSerGluLysSerGlnThrPro859095LeuValThrLeuPheLysAsnAlaIleIleLysAsnAlaTyrLysLys100105110GlyGlu&#60210&#626&#60211&#62331&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述GST融合配偶體&#60400&#626MetSerProIleLeuGlyTyrTrpLysIleLysGlyLeuValGlnPro151015ThrArgLeuLeuLeuGluTyrLeuGluGluLysTyrGluGluHisLeu202530TyrGluArgAspGluGlyAspLysTrpArgAsnLysLysPheGluLeu354045GlyLeuGluPheProAsnLeuProTyrTyrIleAspGlyAspValLys505560LeuThrGlnSerMetAlaIleIleArgTyrIleAlaAspLysHisAsn65707580MetLeuGlyGlyCysProLysGluArgAlaGluIleSerMetLeuGlu859095GlyAlaValLeuAspIleArgTyrGlyValSerArgIleAlaTyrSer100105110LysAspPheGluThrLeuLysValAspPheLeuSerLysLeuProGlu115120125MetLeuLysMetPheGluAspArgLeuCysHisLysThrTyrLeuAsn130135140GlyAspHisValThrHisProAspPheMetLeuTyrAspAlaLeuAsp145150155160ValValLeuTyrMetAspProMetCysLeuAspAlaPheProLysLeu165170175ValCysPheLysLysArgIleGluAlaIleProGlnIleAspLysTyr180185190LeuLysSerSerLysTyrIleAlaTrpProLeuGlnGlyTrpGlnAla195200205ThrPheGlyGlyGlyAspHisProProLysSerAspLeuValProArg210215220GlySerProGlyIleHisArgAspLeuValProArgGlySerIleGlu225230235240GlyArgGluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAsp245250255GlyProAlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSer260265270LeuLeuValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGlu275280285HisPheArgTrpGlySerProProLysAspLysArgTyrGlyGlyPhe290295300MetThrSerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsn305310315320AlaIleIleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu325330&#60210&#627&#60211&#62422&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述GST/BLT融合蛋白&#60400&#627MetSerProIleLeuGlyTyrTrpLysIleLysGlyLeuValGlnPro151015ThrArgLeuLeuLeuGluTyrLeuGluGluLysTyrGluGluHisLeu202530TyrGluArgAspGluGlyAspLysTrpArgAsnLysLysPheGluLeu354045GlyLeuGluPheProAsnLeuProTyrTyrIleAspGlyAspValLys505560LeuThrGlnSerMetAlaIleIleArgTyrIleAlaAspLysHisAsn65707580MetLeuGlyGlyCysProLysGluArgAlaGluIleSerMetLeuGlu859095GlyAlaValLeuAspIleArgTyrGlyValSerArgIleAlaTyrSer100105110LysAspPheGluThrLeuLysValAspPheLeuSerLysLeuProGlu115120125MetLeuLysMetPheGluAspArgLeuCysHisLysThrTyrLeuAsn130135140GlyAspHisValThrHisProAspPheMetLeuTyrAspAlaLeuAsp145150155160ValValLeuTyrMetAspProMetCysLeuAspAlaPheProLysLeu165170175ValCysPheLysLysArgIleGluAlaIleProGlnIleAspLysTyr180185190LeuLysSerSerLysTyrIleAlaTrpProLeuGlnGlyTrpGlnAla195200205ThrPheGlyGlyGlyAspHisProProLysSerAspLeuValProArg210215220GlySerProGlyIleHisArgAspLeuValProArgGlySerIleGlu225230235240GlyArgGluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAsp245250255GlyProAlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSer260265270LeuLeuValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGlu275280285HisPheArgTrpGlySerProProLysAspLysArgTyrGlyGlyPhe290295300MetThrSerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsn305310315320AlaIleIleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGluMetArgGluLeuThr325330335GlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyProAlaAspAsp340345350GlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeuValAlaAla355360365GluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGluHisPheArgTrpGly370375380SerProProLysAspLysArgTyrGlyGlyPheMetThrSerGluLys385390395400SerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIleIleLysAsn405410415AlaTyrLysLysGlyGlu420&#60210&#628&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#628GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGluHisPhe354045ArgTrpGlySerProProLysAspLysArgTyrGlyGlyPheMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu85&#60210&#629&#60211&#6249&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#629GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGluHisPhe354045Arg&#60210&#6210&#60211&#6240&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6210TrpGlySerProProLysAspLysArgTyrGlyGlyPheMetThrSer151015GluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIleIle202530LysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu3540&#60210&#6211&#60211&#6230&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6211LysAspGluGlyProTyrArgMetGluHisPheArgTrpGlySerPro151015ProLysAspLysArgTyrGlyGlyPheMetThrSerGluLys202530&#60210&#6212&#60211&#6252&#60212&#62PRT&#60213&#62Homosapiens&#60400&#6212LysAspGluGlyProTyrArgMetGluHisPheArgTrpGlySerPro151015ProLysAspLysArgTyrGlyGlyPheMetThrSerGluLysSerGln202530ThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIleIleLysAsnAlaTyr354045LysLysGlyGlu50&#60210&#6213&#60211&#6272&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6213GluLeuThrGlyGlnArgGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeuVal151015AlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGluHisPheArg202530TrpGlySerProProLysAspLysArgTyrGlyGlyPheMetThrSer354045GluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIleIle505560LysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu6570&#60210&#6214&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6214GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAsp1510&#60210&#6215&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6215ArgGluGlyAspGlyProAspGlyProAlaAspAspGlyAla1510&#60210&#6216&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6216GlyProAlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGlu1510&#60210&#6217&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6217GlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeuValAlaAla1510&#60210&#6218&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6218HisSerLeuLeuValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyPro1510&#60210&#6219&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6219GluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGluHisPheArg1510&#60210&#6220&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6220TyrArgMetGluHisPheArgTrpGlySerProProLysAsp1510&#60210&#6221&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6221TrpGlySerProProLysAspLysArgTyrGlyGlyPheMet1510&#60210&#6222&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6222LysArgTyrGlyGlyPheMetThrSerGluLysSerGlnThr1510&#60210&#6223&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6223ThrSerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLys1510&#60210&#6224&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6224ProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIleIleLysAsnAla1510&#60210&#6225&#60211&#6212&#60212&#62PRT&#60213&#62人&#60400&#6225AsnAlaIleIleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu1510&#60210&#6226&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述人類似物&#60400&#6226GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetAspLysTyr354045ArgTyrAlaThrProProHisGluHisArgTyrAlaAlaPheMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu85&#60210&#6227&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述人類似物&#60400&#6227GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGluLysPhe354045ArgTyrGlySerProProArgGluLysHisTrpGlyAlaTrpMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuVaLThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu85&#60210&#6228&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述人類似物&#60400&#6228GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetAspHisPhe354045HisPheAlaSerProProArgGluLysHisTyrGlyAlaTyrMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu85&#60210&#6229&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述人類似物&#60400&#6229GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetAspHisPhe354045ArgTrpAlaSerProProLysGluArgHisPheAlaAlaTyrMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu85&#60210&#6230&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述人類似物GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetAspLysTyr354045ArgPheGlyThrProProArgGluLysArgPheAlaGlyTyrMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu85&#60210&#6231&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述人類似物&#60400&#6231GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetAspArgTrp354045ArgTrpAlaSerProProArgGluLysHisTyrGlyAlaTrpMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu85&#60210&#6232&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62序列描述人類似物&#60400&#6232GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGluArgTrp354045LysPheAlaThrProProHisAspHisLysTrpGlyGlyPheMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu85&#60210&#6233&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述人類似物&#60400&#6233GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetAspLysTrp354045ArgTrpAlaSerProProLysGluHisArgTrpGlyGlyTyrMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu85&#60210&#6234&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述人類似物&#60400&#6234GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetAspHisPhe354045LysTyrAlaSerProProHisGluArgHisPheGlyAlaTrpMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu85&#60210&#6235&#60211&#6289&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述人類似物&#60400&#6235GluLeuThrGlyGlnArgLeuArgGluGlyAspGlyProAspGlyPro151015AlaAspAspGlyAlaGlyAlaGlnAlaAspLeuGluHisSerLeuLeu202530ValAlaAlaGluLysLysAspGluGlyProTyrArgMetGluLysPhe354045LysTrpAlaThrProProHisGluArgArgTyrGlyAlaTyrMetThr505560SerGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlaIle65707580IleLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu8權利要求1．一種大體上純的蛋白，具有選自下列一組的氨基酸序列序列2、序列5、和序列7。2．一種編碼權利要求1的蛋白的分離的核酸化合物。3．一種含有權利要求2的分離的核酸化合物的載體。4．如權利要求3的載體，其中，所述分離的核酸化合物可操作地連接在一個啟動子序列上。5．一種含有權利要求4的載體的宿主細胞。6．一種用于構建具有表達β-促脂解素的潛力的重組宿主細胞的方法，該方法包括通過任何合適的方法將權利要求5的載體導入所述宿主細胞。7．一種在權利要求6的重組宿主細胞中表達β-促脂解素的方法，所述方法包括在適于基因表達的條件下培養所述重組宿主細胞。8．一種藥用制劑，含有β-促脂解素、其類似物或功能性片段作為活性成分，并與一種或幾種藥理學上可以接受的載體、賦形劑、或稀釋劑組合。9．如權利要求8的藥用制劑，其中，所述β-促脂解素是人β-促脂解素。10．β-促脂解素、其類似物或功能性片段用于治療糖尿病或其并發癥。11．一種用于治療哺乳動物糖尿病的方法，包括服用治療有效量的β-促脂解素或其類似物。12．一種用于治療哺乳動物糖尿病的方法，包括服用治療有效量的β-促脂解素的功能性片段。13．如權利要求11的方法，其中，所述β-促脂解素是具有本文中序列8所示序列的人β-促脂解素。14．如權利要求11的方法，其中，所述β-促脂解素是重組人β-促脂解素。15．如權利要求11的方法，其中，所述糖尿病是1型或2型糖尿病。16．如權利要求11的方法，其中，所述哺乳動物是人。17．一種用于治療需要治療的患者的糖尿病并發癥的方法，包括服用治療有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段。18．一種通過服用有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段降低哺乳動物血液葡萄糖水平的方法。19．一種通過服用有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段治療需要治療的哺乳動物的血糖過多病的方法。20．一種通過服用有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段治療哺乳動物胰島素過多病的方法。21．一種通過服用有效量的β-促脂解素、其類似物或功能性片段增強哺乳動物胰島素敏感性的方法。22．一種用于通過一個輪次合成β-促脂解素、其類似物或片段的固相合成方法，包括以下步驟a)活化α-氨基或者側鏈官能團被保護的氨基酸以形成活性酯；b)將所述活化氨基酸連接到惰性固體支持物上；c)將第二種受保護的氨基酸活化成一種酯，其中，所述第一種氨基酸的α氨基被脫保護，產生活性胺，而所述第二種活化氨基酸與所述第一種氨基酸起反應，在所述固體支持物上形成二肽；d)重復步驟(a)-(c)；e)從所述固體支持物上分離所述肽，并對側鏈官能團脫保護；f)從所述固體支持物上分離所述肽；和g)通過任何合適的方法純化所述肽；其中，h)當BLT序列含有ser-pro-pro三肽片段時，進行pro殘基的多重連接；i)在所述連接步驟結束之后，封閉所有未反應的、脫保護的肽，以防缺失肽的鏈延伸；和j)當BLT序列含有asp-gly二肽序列時，在asp殘基前面的每一個甘氨酸殘基上用N-α保護基團保護。23．一種用于制備權利要求1的β-促脂解素的方法，包括a．用一種表達載體轉化合適的宿主，其中，所述載體編碼一種β-促脂解素；b．在能表達所述β-促脂解素的條件下培養所述轉化宿主；c．通過任何合適的方法純化所述β-促脂解素。24．一種測定β-促脂解素活性的方法，包括以下步驟a)給表現出胰島素不敏感性和較高血液葡萄糖水平的哺乳動物服用一種試驗蛋白；和b)在步驟(a)之后通過任何合適的方法測定血液葡萄糖和胰島素水平。25．如權利要求11的方法，其中，所述β-促脂解素選自下列一組序列2、序列5、序列7、和序列8。26．一種具有促胰島素活性的肽，選自下列一組序列9、序列10、序列11、序列12、和序列13。27．一種具有促胰島素活性的肽，選自下列一組序列14、序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、和序列25。28．一種具有促胰島素活性的肽，選自下列一組序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、和序列25。29．一種用于治療糖尿病的方法，包括服用治療有效量的選自下列一組的至少一種肽序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、和序列25。30．一種用于治療糖尿病的方法，包括服用治療有效量的選自下列一組的至少一種肽序列9、序列10、序列11、序列12、和序列13。31．一種藥用制劑，含有選自下列一組的具有促胰島素活性的肽作為活性成分序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、和序列25。32．一種β-促脂解素的功能性類似物。33．一種在體外或體內具有促胰島素活性的β-促脂解素的片段。34．一種與序列8具有大約90-95％相同性的β-促脂解素的功能性類似物，其中，氨基酸取代選自下列一組1號位置上的殘基可以是Glu、Ala、Asp或Gln；2號位置上的殘基可以是Leu、Ile、Val或Met；3號位置上的殘基可以是Thr、Ala、Glu、Ser、Pro或Gly；4號位置上的殘基可以是Gly、Arg、Ala、Leu、Pro或Ser；5號位置上的殘基可以是Glu、Gln、Asp、Asn或Ala；6號位置上的殘基可以是Arg、Glu、Leu、Lys、Gln或Ala；7號位置上的殘基可以是Leu、Pro、Asp、Val、Ile或Met；8號位置上的殘基可以是Arg、Glu、Ala、Tyr、Leu、Lys、Pro、Gln或Trp；9號位置上的殘基可以是Glu、Ala、Pro、Asp、Asn或Gln；10號位置上的殘基可以是Gly、Ala、Ser或Asp；11號位置上的殘基可以是Asp、Arg、Pro、Asn、Gln、Ala；Glu；12號位置上的殘基可以是Gly、Ala、Ser、或Met；13號位置上的殘基可以是Pro、Glu、Gly或Val；14號位置上的殘基可以是Asp、Glu、Asn、Gln或Gly；15號位置上的殘基可以是Gly、Ala、Ser或Glu；16號位置上的殘基可以是Pro、Gln、Leu、Gly或Glu；17號位置上的殘基可以是Ala、Asp、Ser或Gly；18號位置上的殘基可以是Asp、Glu、Gln或Asn；19號位置上的殘基可以是Asp、Glu、Asn、或Gln；20號位置上的殘基可以是Gly、Ser、或Ala；21號位置上的殘基可以是Ala、Gly、Ser、或Phe；22號位置上的殘基可以是Gly、Ala、Ser、或Lys；23號位置上的殘基可以是Ala、Phe、Thr、Gly、Ser、或Leu；24號位置上的殘基可以是Gln、Arg、Asp、Asn、Leu、或Val；25號位置上的殘基可以是Ala、Leu、Asp、Ile、Gly、Ser、或Thr；26號位置上的殘基可以是Asp、Glu、Gly、Asn、Gln、或Lys；27號位置上的殘基可以是Leu、Ala、Ile、Met、或Val；28號位置上的殘基可以是Glu、Gln、Asn、或Asp；29號位置上的殘基可以是His、Asn、Tyr、Ala、Gln、或Glu；30號位置上的殘基可以是Ser、Gly、Glu、Ala、Leu、或Asp；31號位置上的殘基可以是Leu、Ala、Val、Met、或Ile；32號位置上的殘基可以是Leu、Ala、Val、Ile、Met或Pro；33號位置上的殘基可以是Val、Ala、Glu、Leu、Ile、Met、或Arg；34號位置上的殘基可以是Ala、Ser、Pro、Glu、或Gly；35號位置上的殘基可以是Ala、Asp、Gly、Ser、或Leu；36號位置上的殘基可以是Glu、Ala、Thr、Leu、Asp、Asn、或Gln；37號位置上的殘基可以是Lys、Glu、Thr、Arg、Gln、或Asp；38號位置上的殘基可以是Lys、Arg、Gln、或Glu；39號位置上的殘基可以是Asp、Ala、Asn、Glu、Gln、或Lys；40號位置上的殘基可以是Glu、Ser、Asp、Asn、Gln、或Gly；41號位置上的殘基可以是Gly、Ala、或Ser；42號位置上的殘基可以是Pro、Gly、Ser、或Asn；43號位置上的殘基可以是Tyr、Phe、或Trp；44號位置上的殘基可以是Arg、Lys、Gln、或Glu；45號位置上的殘基可以是Met、Ile、Ser、或Val；46號位置上的殘基可以是Glu、Gln、Asp、Asn、His、Arg、或Gly；48號位置上的殘基可以是Tyr或Trp；49號位置上的殘基可以是Arg或Lys；50號位置上的殘基可以是Trp、Tyr、或Phe；51號位置上的殘基可以是Gly、Ala、Ser、或Gln；52號位置上的殘基可以是Ser、Thr、Asn、或Ala；53號位置上的殘基可以是Pro或Gly；54號位置上的殘基可以是Pro、Ala、Gly、Arg、Leu、或Thr；55號位置上的殘基可以是Lys、Arg、Gln、或Ala；56號位置上的殘基可以是Asp、Asn、Glu、Gln、Ala、Gly、或Ile；57號位置上的殘基可以是Lys、Gln、或Arg；58號位置上的殘基可以是Arg、Gln、或Lys；59號位置上的殘基可以是Tyr、Phe、或Trp；60號位置上的殘基可以是Gly、Ala、或Ser；61號位置上的殘基可以是Gly、Ala、或Ser；62號位置上的殘基可以是Phe、Tyr、或Trp；63號位置上的殘基可以是Met、Leu、Ile、或Val；64號位置上的殘基可以是Thr、Ala、Ser、或Lys；65號位置上的殘基可以是Ser、Ala、Thr、或Pro；66號位置上的殘基可以是Glu、Asp、Asn、Lys、或Gln；67號位置上的殘基可以是Lys、Arg、或Gln；68號位置上的殘基可以是Ser、Ala、Thr、或Gly；69號位置上的殘基可以是Gln、Glu、Asp、Asn、Arg、或His；70號位置上的殘基可以是Thr、Ser、Ala、或Lys；71號位置上的殘基可以是Pro、或Gly；72號位置上的殘基可以是Leu、Ile、Met、或Val；73號位置上的殘基可以是Val、Leu、Ile、或Met；74號位置上的殘基可以是Thr、Ala、或Ser；75號位置上的殘基可以是Leu、Ile、Met、或Val；76號位置上的殘基可以是Phe、Tyr、Trp、或Leu；77號位置上的殘基可以是Lys、Gln、或Arg；78號位置上的殘基可以是Asn、Asp、Glu、Gln、或His；79號位置上的殘基可以是Ala、Gly、Ser、Ile、或Val；80號位置上的殘基可以是Ile、Leu、Met、Val、或Thr；81號位置上的殘基可以是Ile、Met、Val、Thr、或Leu；82號位置上的殘基可以是Lys、Gln、或Arg；83號位置上的殘基可以是Asn、Asp、Glu、Gln、或Ser；84號位置上的殘基可以是Ala、Val、Ser、Gly、或Glu；85號位置上的殘基可以是Tyr、Phe、Trp、或His；86號位置上的殘基可以是Lys、Gln、或Arg；87號位置上的殘基可以是Lys、Gln、或Arg；88號位置上的殘基可以是Gly、Ala、或Ser；89號位置上的殘基可以是Glu、Gln、Asp、Asn、或His。35．如權利要求34的β-促脂解素的功能性類似物，其中，所述類似物與序列8的相同性大約為95％-99％。36．一種具有促胰島素活性的肽，選自下列一組序列14、序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20、序列21、和序列22。37．如權利要求22的方法，其中，在步驟h)當BLT序列含有ser-pro-pro三肽片段時，進行pro和ser殘基的雙重連接；i)在完成所述連接步驟之后，用一種酸酐封閉所有未反應的、脫保護的肽，以防缺失肽的鏈延伸。38．如權利要求37的方法，其中，在步驟j)所述N-α保護包括N-α-Hmb或甲基苯甲酸酯。39．一種與序列8至少有90％的相同性的β-促脂解素的功能性類似物。全文摘要本發明提供了與β－促脂解素相關的分離的核酸、載體、轉化的宿主細胞、類似物、功能性片段和融合蛋白。還提供了含有β－促脂解素或其片段和/或類似物的藥用組合物,以及用于通過服用有效量的β－促脂解素治療糖尿病和與其相關的并發癥的方法。文檔編號C07K1/06GK1284882SQ98813767公開日2001年2月21日申請日期1998年12月21日優先權日1997年12月23日發明者G·W·貝克爾,J·P·布特勒,J·E·哈勒,小W·F·赫斯,M·L·海曼,B·E·肖納,A·D·瓦沙夫斯基申請人:伊萊利利公司