神經保護劑的制作方法

專利名稱：神經保護劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及神經保護劑。
在與低血糖可能有關或無關的事件如長時間的低氧和局部缺血中，出現不同程度的神經元損傷。
局部缺血通常發生于心臟病發作期間，但是在這期間引起的損傷基本上局限于心臟組織，并且已經研制了一些治療方法。關于本發明，我們關注更長時間的局部缺血對腦的影響，如發生于中風病人或頭部損傷引起的局部缺血。局部缺血的嚴重程度取決于中風或損傷的性質，但是肯定有腦損傷，而這就是本發明要闡明的。
在本領域中，已知有各種緩解腦損傷的神經保護劑，但是目前已知的所有神經保護劑往往伴隨有不良的副作用。例如，MK801(dizocilpine maleate)分子相當簡單，并已知它對局部缺血性病人提供一定水平的神經保護作用。然而，MK801也伴隨有“使人驚恐的親精神作用”(馬丁德爾氏藥典)以及不良的運動作用。神經保護作用詳述于Brain Research 755(1977)36-46(Pringle,A.K.等)，該文獻通過引用結合到本文中。相同的作者也在早期的論文中描述了芋螺毒素的神經保護作用，但是盡管該化合物具有神經保護作用，體內仍觀察到不良的副作用。
近來，已對一系列亞精胺相關的多胺化合物進行了研究，而這些化合物公開于WO 93/12777，特別參考其作為陽離子通道調節劑的用途。公開了這些化合物調節跨過具有陽離子通道的細胞膜的陽離子轉運的方法，所述化合物為具有偶聯至直鏈多胺的賴氨酸或精氨酸基部分(或胍部分)的多胺化合物。此外，提及了它們對NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受體的作用。不能預測這些化合物對陽離子通道的作用，因為多種化合物對P型鈣通道有作用，而其它化合物對鉀通道和鈉通道有作用。盡管這些化合物隨后用于研究其對鈣通道的作用，但是該研究已有效完成并公開發表于Proc.Natl.Acad.Sci.USA[86,1689-1693(1989),Llinàs,R等]，所述研究公開了得自漏斗蛛毒素、稱為FTX的物質在極小劑量下對小鼠具有毒性。
本發明人并不知道Llinàs和其同事的研究，并尋求相似的化合物，因為已知這些化合物具有一定的鈣通道阻滯活性。實際上，所發現的是，不僅所述鈣通道阻滯活性不是非常明顯，而且對NMDA受體也僅有極小作用或沒有作用。此外，還確立了這些化合物是無毒的(盡管在早期的研究中認為這些化合物是有毒的)并且它們還有顯著的神經保護作用。
據認為，早期研究結果和本發明結果矛盾的原因在于化合物的制備上的不同。具體來說，漏斗蛛毒素的FTX成分特別以現有技術從所述毒素分離，而不是另外制備。目前認為該化合物具有下式(1)的結構 已經采用本文所述方法合成生產相關化合物，使得終末產品中的雜質很少或者沒有。因此，各種測定的結果極其令人驚奇的是，已經證實所述化合物無毒以及對鈣通道作用微小。實際上，如果對P型鈣通道有明顯的作用和/或該化合物有毒性，則它們在臨床領域沒有用處。相反，我們發現純化型的所述化合物可用作神經保護劑。
所以，本發明首先是提供具有以下通式(Ⅰ)的基本純化合物以及其藥學上可接受的鹽 其中Q代表脒基、氰基或式XYN-基團，其中X和Y相同或不同，每一個可以代表氫原子、低級烷基、或含有單一雜原子的基團或與其連接的氮原子一起形成含氮的雜環基團；Ra代表具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈的亞烷基或亞鏈烯基，每一個任選被每個具有1-3個碳原子的1-4個烷基取代；Rb和Rc每個代表在直鏈中具有3-4個碳原子的亞烷基或亞鏈烯基，每個任選地被每個具有1-3個碳原子的1或2個烷基取代，在Rb和Rc的所述直鏈中的碳原子總數為7；R2和R3彼此相同或不同，每個代表氫原子或式R、RCO-、ROCO-或RNHCO-基團，其中R代表低級烷基或芳基；所述烷基或芳基任選地被以下定義的一個或多個α取代基取代；星號表示的手性碳原子為L構型；Z為芳香族氨基酸殘基；n為0或1；R1代表氫原子或低級烷基或芳基，所述烷基或芳基任選地被以下定義的一個或多個α取代基取代；和W代表氫原子、烷基或芳基。
一類優選的本發明化合物是式(Ⅰa)的化合物和其藥學上可接受的鹽 (其中Q、Ra、Rb、Rc、R2、R3、Z、n和R1同以上的定義)。
一類更優選的本發明化合物是式(Ⅰb)的化合物和其藥學上可接受的鹽 其中X、Y、Z、n和R1與以上定義相同；x是1-5之間的一個整數；y是3或4；R4、R5、R6和R7可以相同或不同，而且每個代表氫原子或低級烷基；和星號表示的手性碳原子是L構型。
α取代基選選自鹵原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氰基、羥基、烷基(當所述取代基是烷基時除外)、芳基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基和羧基及其酯。
本發明還提供以上定義的式(Ⅰ)、(Ⅰa)或(Ⅰb)的無毒化合物。還提供包含以上定義的化合物的神經保護組合物以及采用以上定義的化合物生產藥物，所述藥物用于阻止在局部缺血事件前、后或期間的神經元損傷。本發明還提供治療哺乳動物(可以是人類)的方法，以通過在局部缺血事件前、后或期間給予所述哺乳動物有效量的以上定義的式(Ⅰ)、(Ⅰa)或(Ⅰb)無毒化合物達到保護所述哺乳動物免遭局部缺血事件引起的神經元損傷。
基本純是指在HPLC(高效液相層析)條件下顯示沒有籍此可檢測的任何或任何顯著量的雜質。痕量雜質在某些情況下是可以接受的，而所述情況可以由當時的技術人員確定。一般來說，雜質水平應該低于1，而優選明顯低于1％，例如低于0.1％、盡可能低至0.001％。
另一方面，最好所述化合物是無毒的，是指所述化合物在其使用劑量水平應該沒有任何不可接受水平的毒性。最好是它們不表現出任何毒性。
不管以前如何，以上定義的化合物類可用于低氧或局部缺血條件下的神經保護，而且我們在如下將要敘述的海馬上進行的實驗已經證實這一點。這些化合物具有活性的濃度水平大致上低于現有技術化合物的活性濃度水平。
本發明化合物可以用于懷疑有缺血事件尤其是中風或頭部損傷危險的病人。這種預防性使用極其有用。然而，已經證實本發明化合物即使在缺血事件后使用也具有有用的活性，但是應該認識到的是，最好是盡可能早地給予所述化合物，以盡可能減少神經元變性。在某些情況下，理想的是重復劑量給予，尤其是當所述病人仍處于局部缺血事件危險中時。
一般來說，合適的給藥方法是注射，以便盡早達到需要的結果。因此，特別優選靜脈內注射，但是在某些情況下，可能最好是將所述化合物直接給入到腦脊液中。
本發明化合物的劑量將隨許多因素而變化，包括年齡、體重和病人的一般狀況以及給藥模式、頻次和途徑。然而，一般優選劑量為0.01-50mg/kg體重，更優選的劑量為0.05-20mg/kg體重。可以單次劑量或分次劑量給予。
在本發明化合物中，一般最好是所述化合物的總長度在以下所示的化合物A的長度范圍內。可以認為化合物A是18單位長，因此我們優選本發明化合物小于25單位長而大于14單位長。這是一般的優選，但是一般應該注意的是活性隨長度的明顯改變而迅速下降，甚至一單位也產生一般不需要的效應。所以，更優選所述化合物為17-22單位長。“單位”是指最長鏈中除氫外的原子和與其連接的非鏈原子。因此，例如式(Ⅰa)中的-NH2基團被認為是一個單位，基團CR2R4、CO、CR4R6等同樣如此。
Q可以代表氰基、脒基或式XYN-基團。
其中X或Y代表低級烷基，該基團優選具有1-6個碳原子并可以是具有1-6個、優選為1-4個碳原子的直鏈或支鏈基團。實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、2-甲基丁基、1-乙基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、己基和異己基。其中，我們優選具有1-4個碳原子的烷基，優選的是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基和異丁基，而最優選甲基。
其中X或Y代表含雜原子的單一基團，這可以是無環或環狀基團。無環基團的實例包括脒基(與X和Y連接的氮原子一起形成胍基)、烷氧基羰基(以形成烷氧基羰基氨基基團)、氨基甲酰基或硫代氨基甲酰基(以形成脲基或硫脲基基團)。可以用X和Y表示的雜環基團的實例包括具有5-10環碳原子(在一個或兩個環中)的這些基團，其中1-4個為氮和/或氧和/或硫雜原子，其余為碳原子。在有4個雜原子的情況下，我們優選所有4個均為氮原子。在有3個雜原子的情況下，我們優選所有3個、2個或1個為氮原子。在有2個雜原子的情況下，我們優選2個或1個為氮原子。這類基團的實例包括吡咯基、四唑基、吲哚基、噻唑基、呋喃基、吡喃基、苯并吡喃基、咪唑基、吡唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、異吲哚基、喹啉基、異喹啉基、卡唑基、苯并二氫吡喃基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、二氫吲哚基和嗎啉基基團。
另一方面，X和Y與其連接的氮原子一起可以形成含氮雜環基團。這類雜環基團的實例包括具有5-10環原子(在一個或兩個環中)的基團，其中1-4為氮和/或氧和/或硫雜原子，其余為碳原子。在有4個雜原子的情況下，我們優選所有4個均為氮原子。在有3個雜原子的情況下，我們優選所有3個、2個或1個為氮原子。在有2個雜原子的情況下，我們優選2個或1個為氮原子。這類基團的實例包括1-吡咯基、1-或2-四唑基、1-吲哚基、3-噻唑基、1-咪唑基、1-吡唑基、2-異噻唑基、3-噁唑基、2-異噁唑基、1-吡啶基、1-吡嗪基、1-異吲哚基、1-喹啉基、2-異喹啉基、9-卡唑基、1-吡咯烷基、1-吡咯啉基、1-咪唑烷基、哌啶子基、1-哌嗪基、1-二氫吲哚基和嗎啉代基團。
在Q為烷氧基羰基氨基基團的情況下，所述烷氧基部分最好具有1-6碳原子并可以是直鏈或支鏈基團。這類基團的實例包括甲氧基羰基氨基、乙氧基羰基氨基、丙氧基羰基氨基、異丙氧基羰基氨基、丁氧基羰基氨基、戊氧基羰基氨基和己氧基羰基氨基，其中我們優選具有1-4個碳原子的基團，而最優選乙氧基羰基氨基。
最好是X和Y中至少一個為氫原子。我們特別優選X和Y中的一個或兩個是氫原子。特別優選的化合物是其中X和Y均為氫原子的式(Ⅰ)化合物，或其中X和Y中的一個為氫原子而另外一個為脒基基團或氨基甲酰基的式(Ⅰ)化合物。最優選的化合物是其中X和Y均為氫原子的式(Ⅰ)、(Ⅰa)和(Ⅰb)的化合物或者其中X和Y中的一個為氫原子而另一個為脒基基團的式(Ⅰ)、(Ⅰa)和(Ⅰb)的化合物。
除了優選觀察到的所述化合物的優選的總長度外，Ra和Rb代表的基團長度即在式(Ⅰa)中的x加上y的長度不是特別重要。雖然Ra代表任何具體的亞烷基或亞鏈烯基基團可以高至6個碳原子長，但是最好限制每個亞烷基鏈不超過5個、優選3或4個碳原子，而且一般優選三亞甲基和四亞甲基基團的總組合。這類亞烷基和亞鏈烯基的實例包括亞甲基、亞乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、1,2-亞乙烯基、亞丙烯基、亞丁-1-烯、亞丁-2-烯、亞戊-1-烯、亞戊-2-烯、亞戊-3-烯、亞己-1-烯、亞己-2-烯、亞己-3-烯和亞己-4-烯基團。因此，x最好是3或4，而y最好是3或4。同樣，Rc代表的亞烷基或亞鏈烯基基團最好是三亞甲基或四亞甲基。當Rb為三亞甲基時，Rc為四亞甲基，反之亦然。最優選的是Rb為三亞甲基基團而Rc為四亞甲基。
不同的基團R1、R4、R5、R6和R7可以是未取代的或被至少一個以上定義的α取代基取代的低級烷基或芳基基團。所述低級烷基基團最好具有1-6個碳原子，實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基和異己基基團，其中優選甲基和乙基基團，最優選甲基基團。所述芳基基團是最好具有6-10個環碳原子而更優選具有6個或10個環碳原子的碳環芳香族基團，例如苯基、1-萘基和2-萘基基團，其中優選苯基基團，另一方面，這些基團中的任何一個可以被一個或多個α取代基取代。
α取代基的實例包括鹵原子例如氯、氟或溴原子；氨基基團；其中烷基部分最好是具有1-6個碳原子的烷基氨基基團，例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、丁基氨基、叔丁基氨基、戊基氨基和己基氨基基團；其中烷基部分最好是具有1-6個碳原子的二烷基氨基基團，例如二甲基氨基、二乙基氨基、甲基乙基氨基、二丙基氨基、二丁基氨基、二戊基氨基和二己基氨基基團；氰基基團；羥基基團；烷基基團(當所述取代基為烷基時除外)，例如上述關于R1等的實例；芳基基團，例如上述關于R1等的實例；氨基甲酰基基團；其中烷基部分最好是具有1-6個碳原子的烷基氨基甲酰基，例如甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、丙基氨基甲酰基、丁基氨基甲酰基、叔丁基氨基甲酰基、戊基氨基甲酰基和己基氨基甲酰基基團；和其中烷基部分最好具有1-6個碳原子的二烷基氨基甲酰基，例如二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基、甲基乙基氨基甲酰基、二丙基氨基甲酰基、二丁基氨基甲酰基、二戊基氨基甲酰基和二己基氨基甲酰基基團。
該類取代的基團的實例包括鹵素取代的甲基基團、優選具有三個鹵原子，例如三氯甲基和三氟甲基基團；鹵素取代的苯基基團，例如鄰-、間-和對-氯代苯基，鄰-、間-和對-氟代苯基，鄰-、間-和對-溴代苯基，2,3-二氯代苯基，2,3-二氟代苯基，3,4-二氯代苯基，3,4-二氟代苯基，2,4,6-三氯代苯基和2,4,6-三氟代苯基；氨基取代的烷基基團，例如氨基甲基、2-氨基乙基、3-氨基丙基和4-氨基丁基基團；烷基氨基取代的烷基基團(其中烷基氨基基團的烷基部分最好是具有1-4個碳原子)，例如甲基氨基甲基、2-甲基氨基乙基、3-甲基氨基丙基、4-甲基氨基丁基、乙基氨基甲基、2-乙基氨基乙基、3-乙基氨基丙基、4-乙基氨基丁基、丙基氨基甲基、2-丙基氨基乙基、3-丙基氨基丙基、4-丙基氨基丁基、丁基氨基甲基、2-丁基氨基乙基、3-丁基氨基丙基和4-丁基氨基丁基基團；二烷基氨基取代的烷基基團(其中二烷基氨基基團的每個烷基部分最好是具有1-4個碳原子)，例如N,N-二甲基氨基甲基、2-N,N-二甲基氨基乙基、3-N,N-二甲基氨基丙基、4-N,N-二甲基氨基丁基、N,N-二乙基氨基甲基、2-N,N-二乙基氨基乙基、3-N,N-二乙基氨基丙基、4-N,N-乙基氨基丁基、N,N-丙基氨基甲基、2-N,N-丙基氨基乙基、3-N,N-丙基氨基丙基、4-N,N-丙基氨基丁基、N,N-丁基氨基甲基、2-N,N-丁基氨基乙基、3-N,N-丁基氨基丙基和4-N,N-丁基氨基丁基基團；芳基-(尤其是苯基或萘基)取代的烷基基團，例如芐基、苯乙基、3-苯丙基或4-苯丁基；氨基甲酰基取代的烷基基團，例如氨基甲酰基甲基、2-氨基甲酰基乙基、3-氨基甲酰基丙基和4-氨基甲酰基丁基基團；烷基氨基甲酰基取代的烷基基團(其中烷基氨基甲酰基的烷基部分最好是具有1-4個碳原子)，例如甲基氨基甲酰基甲基、2-甲基氨基甲酰基乙基、3-甲基氨基甲酰基丙基、4-甲基氨基甲酰基丁基、乙基氨基甲酰基甲基、2-乙基氨基甲酰基乙基、3-乙基氨基甲酰基丙基、4-乙基氨基甲酰基丁基、丙基氨基甲酰基甲基、2-丙基氨基甲酰基乙基、3-丙基氨基甲酰基丙基、4-丙基氨基甲酰基丁基、丁基氨基甲酰基甲基、2-丁基氨基甲酰基乙基、3-丁基氨基甲酰基丙基和4-丁基氨基甲酰基丁基基團；二烷基氨基甲酰基取代的烷基(其中二烷基氨基甲酰基的每個烷基部分最好具有1-4個碳原子)，例如N,N-二甲基氨基甲酰基甲基、2-N,N-二己基氨基甲酰基乙基、3-N,N-二己基氨基甲酰基丙基、4-N,N-二甲基氨基甲酰基丁基、N,N-二乙基氨基甲酰基甲基、2-N,N-二乙基氨基甲酰基乙基、3-N,N-二乙基氨基甲酰基丙基、4-N,N-乙基氨基甲酰基丁基、N,N-丙基氨基甲酰基甲基、2-N,N-丙基氨基甲酰基乙基、3-N,N-丙基氨基甲酰基丙基、4-N,N-丙基氨基甲酰基丁基、N,N-丁基氨基甲酰基甲基、2-N,N-丁基氨基甲酰基乙基、3-N,N-丁基氨基甲酰基丙基和4-N,N-丁基氨基甲酰基丁基基團；羧基取代的烷基基團，例如羧甲基、2-羧乙基、3-羧丙基和4-羧丁基基團及其酯；以及鄰-、間-和對-氨基苯基、甲基氨基苯基、乙基氨基苯基、丙基氨基苯基、丁基氨基苯基、N,N-二甲基氨基苯基、N,N-二乙基氨基苯基、N,N-二丙基氨基苯基、N,N-二丁基氨基苯基、聯苯基、氨基甲酰基苯基、甲基氨基甲酰基苯基、乙基氨基甲酰基苯基、丙基氨基甲酰基苯基、丁基氨基甲酰基苯基、N,N-二甲基氨基甲酰基苯基、N,N-二乙基氨基甲酰基苯基、N,N-二丙基氨基甲酰基苯基、N,N-二丁基氨基甲酰基苯基和羧基苯基基團以及羧基苯基酯。
酯基的實例包括具有1-20個碳原子更優選1-6個碳原子的烷基，例如以上所例舉的烷基和本領域熟知的高級烷基基團如庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十三烷基、十五烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基，但是最優選甲基、乙基和叔丁基；具有3-7個碳原子的環烷基，例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基和環庚基；其中烷基部分具有1-3個碳原子而芳基部分是具有6-14個碳原子的碳環芳族基團的芳烷基，所述芳烷基可以是取代的或者未取代的，盡管優選未取代的基團，但是如果是被取代，它具有至少一個以上所定義和例舉的α取代基；這類芳烷基的實例包括芐基、苯乙基、1-苯乙基、3-苯丙基、2-苯丙基、1-萘基甲基、2-萘基甲基、2-(1-萘基)乙基、2-(2-萘基)乙基、二苯甲基、三苯甲基、雙(鄰-硝基苯基)-甲基、9-蒽基甲基、2,4,6-三甲基芐基、4-溴芐基、2-硝基芐基、4-硝基芐基、3-硝基芐基、4-甲氧基芐基和胡椒基基團；具有2-6個碳原子的鏈烯基基團，例如乙烯基、烯丙基、2-甲基烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基和5-己烯基基團，其中優選乙烯基、烯丙基、2-甲基烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基和丁烯基基團，最優選烯丙基和2-甲基烯丙基基團。
具有1-6個優選1-4個碳原子的鹵代烷基，其中的烷基部分與在上述關于烷基中定義和例舉的烷基相同，而鹵原子是氯、氟、溴或碘，例如2,2,2-三氯乙基、2-鹵代乙基(例如2-氯乙基、2-氟乙基、2-溴乙基或2-碘乙基)、2,2-二溴乙基和2,2,2-三溴乙基基團；取代的甲硅烷基烷基基團，其中的烷基部分與以上定義和例舉的相同而甲硅烷基具有高至3個取代基，該取代基選自具有1-6個碳原子的烷基和未取代的或具有至少一個選自以上定義和例舉的α取代基的苯基，例如2-三甲基甲硅烷基乙基基團；其中苯基未被取代或取代、最好具有至少一個具有1-4個碳原子或酰胺基的苯基，例如苯基、甲苯基和苯甲酰氨基苯基基團；苯甲酰甲基，它可以是未取代的或具有至少一個以上定義和例舉的α取代基，例如苯甲酰甲基本身或對-溴苯甲酰甲基基團；環狀和無環萜品基，例如香葉基、橙花基、里哪基、植基、_基(尤其是間-和對-_基)、苧基、蒈烷基、蒎基、冰片基、notcaryl、降蒎烷基(norpinanyl)、降冰片基、_烯基、莰烯基和降冰片烯基團；烷氧基甲基基團，其中烷氧基部分具有1-6優選1-4個碳原子并且其本身可以被單一未取代的烷氧基取代，例如甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、異丙氧基甲基、丁氧基甲基和甲氧基乙氧基甲基基團；脂族酰氧基烷基基團，其中酰基優選鏈烷酰基而更優選具有2-6個碳原子的鏈烷酰基以及烷基部分具有1-6優選1-4個碳原子，例如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、異丁酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基、1-新戊酰氧基乙基、1-乙酰氧基乙基、1-異丁酰氧基乙基、1-新戊酰氧基丙基、2-甲基-1-新戊酰氧基丙基、2-新戊酰氧丙基、1-異丁酰氧基乙基、1-異丁酰氧基丙基、1-乙酰氧基丙基、1-乙酰氧基-2-甲基丙基、1-丙酰氧基乙基、1-丙酰氧基丙基、2-乙酰氧基丙基和1-丁酰氧基乙基基團；環烷基取代的脂族酰氧基烷基，其中酰基優選為鏈烷酰基而更優選2-6個碳原子的鏈烷酰基，環烷基取代基具有3-7個碳原子和烷基部分具有1-6優選1-4個碳原子，例如(環己基乙酰氧基)甲基、1-(環己基乙酰氧基)乙基、1-(環己基乙酰氧基)丙基、2-甲基-1-(環己基乙酰氧基)丙基、(環戊基乙酰氧基)甲基、1-(環戊基乙酰氧基)乙基、1-(環戊基乙酰氧基)丙基和2-甲基-1-(環戊基乙酰氧基)丙基基團；烷氧基羰基氧基烷基基團，尤其是1-(烷氧基羰基氧基)乙基基團，其中所述烷氧基部分具有1-10、優選1-6而更優選1-4個碳原子，以及所述烷基部分具有1-6、優選1-4個碳原子，例如1-甲氧基羰基氧基乙基、1-乙氧基羰基氧基乙基、1-丙氧基羰基氧基乙基、1-異丙氧基羰基氧基乙基、1-丁氧基羰基氧基乙基、1-異丁氧基羰基氧基乙基、1-仲丁氧基羰基氧基乙基、1-叔丁氧基羰基氧基乙基、1-(1-乙基丙氧基羰基氧基)乙基和1-(1,1-二丙基丁氧基羰基氧基)乙基基團；和其它烷氧基羰基烷基基團，其中所述烷氧基和烷基均具有1-6、優選1-4個碳原子，例如2-甲基-1-(異丙氧基羰基氧基)丙基、2-(異丙氧基羰基氧基)丙基、異丙氧基羰基氧基甲基、叔丁氧基羰基氧基甲基、甲氧基羰基氧基甲基和乙氧基羰基氧基甲基基團；環烷基羰基氧基烷基和環烷基氧基羰基氧基烷基基團，其中所述環烷基基團具有3-10、優選3-7個碳原子的單環或多環烷基并可任選地被至少一個(并優選只1個)1-4個碳原子的烷基(例如選自以上例舉的烷基)取代，而所述烷基部分具有1-6、更優選1-4個碳原子(例如選自以上例舉的烷基)并最優選甲基、乙基或丙基，例如1-甲基環己基羰基氧基甲基、1-甲基環己氧基羰基氧基甲基、環戊氧基羰基氧基甲基、環戊基羰基氧基甲基、1-環己氧基羰基氧基乙基、1-環己基羰基氧基乙基、1-環戊氧基羰基氧基乙基、1-環戊基羰基氧基乙基、1-環庚氧基羰基氧基乙基、1-環庚基羰基氧基乙基、1-甲基環戊基羰基氧基甲基、1-甲基環戊氧基羰基氧基甲基、2-甲基-1-(甲基環己基羰基氧基)丙基、1-(1-甲基環己基羰基氧基)丙基、2-(1-甲基環已基羰基氧基)丙基、1-(環己基羰基氧基)丙基、2-(環己基羰基氧基)-丙基、2-甲基-1-(1-甲基環戊基羰基氧基)丙基、1-(1-甲基環戊基羰基氧基)丙基、2-(1-甲基環戊基羰基氧基)丙基、1-(環戊基羰基氧基)丙基、2-(環戊基羰基氧基)丙基、1-(1-甲基-環戊基羰基氧基)乙基、1-(1-甲基環戊基羰基氧基)丙基、金剛烷氧基羰基氧基甲基、金剛烷基羰基氧基甲基、1-金剛烷氧基羰基氧基乙基和1-金剛烷基羰基氧基乙基基團；環烷基烷氧基羰基氧基烷基基團，其中所述烷氧基具有單一環烷基取代基，該環烷基取代基是具有3-10、優選3-7個碳原子的單環或多環烷基，例如環丙基甲氧基羰基氧基甲基、環丁基甲氧基羰基氧基甲基、環戊基甲氧基羰基氧基甲基、環己基甲氧基羰基氧基甲基、1-(環丙基甲氧基羰基氧基)乙基、1-(環丁基甲氧基羰基氧基)乙基、1-(環戊基甲氧基羰基氧基)乙基和1-(環已基甲氧基羰基氧基)乙基基團；萜烯基羰基氧基烷基和萜烯氧基羰基氧基烷基，其中所述萜烯基為以上例舉的萜烯基并優選環狀萜烯基，例如1-(甲氧基羰基氧基)乙基、1-(甲基羰基氧基)乙基、甲氧基羰基氧基甲基、甲基羰基氧基甲基、1-(3-蒎烷氧基羰基氧基)乙基、1-(3-蒎烷基羰基氧基)乙基、3-蒎烷氧基羰基氧基甲基和3-蒎烷基羰基氧基甲基基團；5-烷基或5-苯基[它可以被至少一個以上定義和例舉的α取代基取代](2-氧代-1,3-二氧戊烯-4-基)烷基基團，其中每個烷基基團(它們可以相同或者不同)具有1-6、優選1-4個碳原子，例如(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧戊烯-4-基)甲基、(5-苯基-2-氧代-1,3-二氧戊烯-4-基)甲基、(5-異丙基-2-氧代-1,3-二氧戊烯-4-基)-甲基、(5-叔丁基-2-氧代-1,3-二氧戊烯-4-基)甲基和1-(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧戊烯-4-基)乙基基團；和其它基團尤其是體內容易去除的基團，例如2-苯并[c]呋喃酮基、2,3-二氫化茚基和2-氧代-4,5,6,7-四氫-1,3-苯并二氧戊烯-4-基基團。
以上基團中，我們特別優選體內容易去除的基團而最優選脂族酰氧基烷基、烷氧基羰基氧基烷基、環烷基羰基氧基烷基、2-苯并[c]呋喃酮基和(5-取代的2-氧代-1,3-二氧戊烯-4-基)甲基基團。
然而，我們優選R1、R4、R5、R6和R7均為氫。
一般我們優選基團Z不存在即n為0，但是當它存在時，則優選它為芳香族氨基酸殘基并優選疏水芳香族氨基酸、更優選α-氨基酸，例如組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或苯基甘氨酸，其中最優選苯丙氨酸或酪氨酸。
Rc為任選地被1或2個烷基、優選甲基取代的低級亞烷基。這種低級亞烷基在直鏈中具有3或4個碳原子并任選地被1或2個烷基、優選甲基取代。這類基團的實例包括亞甲基、亞乙基、甲基亞乙基、1-、2-或3-甲基-三亞甲基、三亞甲基、亞丙基、四亞甲基、戊亞甲基和己亞甲基基團，其中通常優選三亞甲基和四亞甲基基團。
本發明優選的化合物為下式A-D的化合物式A的化合物； 式B的化合物 式C的化合物 式D的化合物 式E的化合物 式F的化合物 式G的化合物 式H的化合物 式I的化合物 其中特別優選式A、D、E、F、G、H和I的化合物，更優選式A和D的化合物，而最優選式A的化合物。
本發明的化合物可以通過各種其本身在本領域公知的方法制備。或者，可以通過以下方法制備Wang樹脂(0.03mmol)在無水四氫呋喃(1.0ml)中溶脹，并分批加入羰基二咪唑(4當量，0.12mmol)。將生成的混合物在環境溫度下攪拌16小時，然后過濾，之后用四氫呋喃、乙醇和二氯甲烷洗滌。然后將樹脂真空干燥。
將所述樹脂在無水二氯甲烷(1.0ml)中再溶脹，并分批加入1,3-二氨基丙烷(10當量，0.3mmol)。將生成的混合物攪拌2小時，然后過濾，洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇和二氯甲烷)后再進行真空干燥。
將所述樹脂再次在無水二氯甲烷(1.0ml)中再溶脹并加入2,6-二甲基吡啶(5當量，0.15mmol)，接著小心加入2,4-二硝基苯磺酰氯(4當量，0.12mmol)。將該混合物在惰性氣體下攪拌2小時后，洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)并真空干燥。
然后將生成的樹脂在無水四氫呋喃(1.0ml)溶脹，并在攪拌下加入并溶解三苯基膦(4當量，0.12mmol)、Dde保護的氨基醇(4當量，0.12mmol)。滴加二乙基偶氮二羧酸酯(4當量，0.12mmol)并將該混合物攪拌12小時，然后過濾并洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)，再后進行真空干燥。
再后，將所述樹脂在二氯甲烷(1.0ml)中溶脹并加入丙胺(5當量，0.15mmol)，攪拌該混合物1小時后過濾并洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)，然后真空干燥。
再將所述樹脂在無水二氯甲烷(1.0ml)中溶脹并加入二碳酸二叔丁酯(10當量，0.3mmol)和N,N-二甲基氨基吡啶(5mol％，0.0015mmol)。然后將該混合物攪拌16小時。再將所述樹脂過濾并洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)，然后真空干燥。
然后，將所述樹脂在2％水合肼/二甲基甲酰胺(1.0ml)中攪拌1小時后洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)并真空干燥。
將Fmoc AA(4當量，0.12mmol)、TBTU(4當量，0.12mmol)和二異丙基乙胺(8當量，0.48mmol)溶解于無水二甲基甲酰胺(1.0ml)中并將該混合物加至所述樹脂中。然后將全部反應物攪拌12小時后，過濾、洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)并真空干燥。
向所述樹脂中加入20％哌啶/二甲基甲酰胺(1.0ml)并將該混合物攪拌0.5小時后，過濾、洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)，再后進行真空干燥。
將Boc AA(4當量，0.12mmol)、TBTU(4當量，0.12mmol)和二異丙基乙胺(8當量，0.48mmol)溶解于二甲基甲酰胺(1.0ml)中并將該混合物加至所述樹脂中。然后將全部反應物攪拌12小時后，過濾、洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)并真空干燥。
將50％TFA/45％二氯甲烷/2.5％H2O/2.5％三異丙基硅烷(1.0ml)加入到所述樹脂中并將該混合物攪拌1小時。將所述樹脂過濾并用二氯甲烷(1.0ml)洗滌，真空濃縮濾液。將所得的粘性黃色油用無水乙醚(3x2ml)研制得到所需要的化合物。
在附后的非限制的實施例中闡明本發明化合物的制備以及神經保護活性。在這些實施例中使用以下縮寫Arg 精氨酸；Boc 叔丁氧基羰基；DIC 二異丙基碳化二亞胺；EDT 乙烷-1,2-二醇Fmoc N-芴基甲氧基羰基；HOBt 羥基苯并三唑Lys 賴氨酸；ODS 十八烷基硅烷；Orn 鳥氨酸；Phe 苯丙氨酸；Pmc NG-2,2,5,7,8-戊甲基苯并二氫吡喃-6-基磺酰基；RP-HPLP 反相高效液相層析；TFA 三氟乙酸；化合物合成實施例1N’-L-精氨酰亞精胺[式A的化合物]將0.152gN1-芴基甲氧基羰基-N4-(4'-苯甲酰氧基羰基-(1'-苯氧基)乙醇胺樹脂)-N8-叔丁氧基羰基亞精胺用5ml哌啶在二甲基甲酰胺中的20％(v/v)溶液處理。過濾所述樹脂后再用5ml哌啶在二甲基甲酰胺中的20％(v/v)溶液處理30分鐘。此后，過濾樹脂并依次用10ml二甲基甲酰胺、5ml甲醇、最后兩次每次用10ml二氯甲烷洗滌。將Fmoc-Arg(Pmc)OH(0.1027g，0.154mmol)溶解于二氯甲烷(9ml)后加入HOBt(0.021g，0.155mmol)。在室溫下放置10分鐘后，加入N4-(4'-苯甲酰氧基羰基(1'-苯氧基)乙醇胺樹脂)-N8-叔丁氧基羰基亞精胺(0.1032g，0.031mmol)，接著加入DIC(24ml，0.155mmol)。于室溫下輕輕攪拌該混合物20小時。在水合茚三酮試驗為陰性后，將所述樹脂過濾并在用二氯甲烷(1x10ml)、甲醇(1x5ml)、二氯甲烷(2x10ml)洗滌后真空干燥。如上去除Fmoc。用TFA-苯酚-水-三異丙基硅烷-乙烷-1,2-二硫醇(EDT)(81.5∶5∶5∶1∶2.5(體積)；2.5ml)在室溫下對N1-Arg-(Pmc)-N4-(4'-苯甲酰氧基羰基-(1'-苯氧基)乙醇胺樹脂)-N8-叔丁氧基羰基亞精胺去保護/裂解5小時。所述樹脂通過帶有致密玻璃棉塞的Pasteur吸移管過濾去除并用二氯甲烷(4x4ml)洗滌。真空去除溶劑，將殘留物溶解于CH3CN(1ml)中并傾入冷乙醚(25ml)中以通過離心分離得到白色沉淀物。輕輕傾去上清液而將固體重懸浮于乙醚(2.5ml)中。所述固體再通過離心分離并重復該步驟兩次。將該產物溶解于水后進行冷凍干燥。分析該產物并經RP-HPLC(ODS，用水/0.1％TFA等度洗脫)純化。
實施例2這些化合物分別采用Fmoc-L-Lys(叔丁氧基羰基)、Fmoc-L-Orn(叔丁氧基羰基)、Fmoc-D-Arg(Pmc)、Fmoc-D-Lys(叔丁氧基羰基)和Fmoc-D-Orn(叔丁氧基羰基)以相似的方式制備。
化合物分析N-L-精氨酰亞精胺[式A的化合物]δH(300MHz,D2O)3.86(1H,t,J-6.6,Argα-CH),3.82-3.02(4H,m),2.95-2.78(6H,m),1.98-1.70(4H,m),1.68-1.40(6H,m)δC(75MHz,D2O)173.1(COOH),159.6(NH=C(NH-2)NH),55.6(CH),49.6(CH2),47.8(CH2),42.9(CH2),41.4(CH2),39.1(CH2),30.8(CH2),281(CH2),26.5(CH2),26.3(CH2),25.4(CH2)M/Z(ES+)302.3(M+H)+,416.3(M+H+TFA)+。N1-D-精氨酰亞精胺(化合物Z1)δH(360MHz,D2O)3.78(1H,t,J-6.5,Argα-CH),3.32-3.04(4H,m),3.03-2.83(6H,m),1.87-1.69(4H,m),1.68-1.55(4H,m),1.54-1.42(2H,m)δC(95MHz,D2O)53.8(CH),47.7(CH2),45.9(CH2),41.1(CH2),39.5(CH2),37.2(CH2),29.0(CH2),26.2(CH2),24.6(CH2),24.4(CH2),23.5(CH2)M/Z(ES+)302.3(M+H)+,416.3(M+H+TFA)+。N1-L-賴氨酰亞精胺(式B的化合物)δH(360MHz,D2O)3.84(1H,t,J-6.6,Lysα-CH),3.2(2H,aft,J7.5),3.09-2.80(8H,m),1.89-1.73(4H,m),1.72-1.49(6H,m),1.44-1.26(2H,m)；M/Z(ES+)274.3(M+H)+,410.3(M+Na+TFA)+。N1-D-賴氨酰亞精胺(化合物Z2)δH(360MHz,D2O)3.84(1H,t,J-6.5,Lysα-CH),3.23(2H,aft,J7.5),3.09-2.84(8H,m),1.90-1.74(4H,m),1.73-1.50(6H,m),1.40-1.27(2H,m)M/Z(ES+)274.3(M+H)+,388.4(M+H+TFA)+。N1-L-鳥氨酰亞精胺(式C的化合物)δH(360MHz,D2O)3.94(1H,t,J-6.6,Ornα-CH),3.31(2H,aft,J7.5),3.18-2.89(8H,m),2.08-1.80(4H,m),1.78-1.52(6H,m)M/Z(ES+)260.3(M+H)+,374.3(M+H+TFA)+。N1-D-鳥氨酰亞精胺(化合物Z3)δH(360MHz,D2O)3.88(1H,t,J-6.6,Ornα-CH),3.23(2H,aft,J7.5),3.10-2.80(8H,m),1.98-1.78(4H,m),1.75-1.50(6H,m)M/Z(ES+)260.3(M+H)+,374.3(M+H+TFA)+。HPLC分析通過HPLC分析本發明化合物。結果表明用本發明優選的方法制備的化合物基本上不合原始反應物。
實施例3精氨酸-L-苯丙氨酸-亞精胺式G的化合物Wang樹脂(0.03mmol，50mg)在無水四氫呋喃(1.0ml)中溶脹，并分批加入羰基二咪唑(4當量，0.12mmol，19mg)加入。此后將生成的混合物在環境溫度下攪拌16小時，然后過濾并用四氫呋喃、乙醇和二氯甲烷洗滌。再后將樹脂真空干燥。
將所述樹脂在無水二氯甲烷(1.0ml)中再溶脹，加入1,4-二氨基丁烷(10當量，0.3mmol，25mg)。將生成的混合物攪拌2小時，然后過濾，洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇和二氯甲烷)后再進行真空干燥。
將所述樹脂再次在無水二氯甲烷(1.0ml)中再溶脹并加入2,6-二甲基吡啶(5當量，0.15mmol，16mg)，接著小心加入2,4-二硝基苯磺酰氯(4當量，0.12mmol，32mg)。將該混合物在惰性氣體下攪拌2小時后，洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)并真空干燥。
然后將生成的樹脂在無水四氫呋喃(1.0ml)和三苯基膦(4當量，0.12mmol，32mg)中溶脹。攪拌下加入并溶解Dde保護的氨基醇(4當量，0.12mmol，29mg)。滴加二乙基偶氮二羧酸酯(4當量，0.12mmol，21mg)并將該混合物攪拌12小時，然后過濾并洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)。再后進行真空干燥。
再后，將所述樹脂在二氯甲烷(1.0ml)中溶脹并加入丙胺(5當量，0.15mmol，13mg)。攪拌該混合物1小時后過濾并洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)，然后真空干燥。
再次將所述樹脂在二氯甲烷(1.0ml)中溶脹并加入二碳酸二丁酯(10當量，0.3mmol，33mg)和N,N-二甲基氨基吡啶(5mol％，0.0015mmol，0.2mg)，然后將該混合物攪拌16小時。再將所述樹脂過濾并洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)，然后真空干燥。
然后，將所述樹脂在2％水合肼/二甲基甲酰胺(1.0ml)中攪拌1小時后洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)，之后真空干燥。
將Fmoc-Phe-OH(4當量，0.12mmol，46mg)、TBTU(4當量，0.12mmol，39mg)和二異丙基乙胺(8％0.48mmol，62mg)溶解于無水二甲基甲酰胺(1.0ml)中并將該混合物加至所述樹脂中。然后將全部反應物攪拌12小時后，過濾、洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)并真空干燥。
向所述樹脂中加入20％哌啶/二甲基甲酰胺(1.0ml)并將該混合物攪拌0.5小時。然后過濾并洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)，再后進行真空干燥。
將Boc-Arg(Phe-OH(4當量，0.12mmol，63mg)、TBTU(4當量，0.12mmol，39mg)和二異丙基乙胺(8當量，0.48mmol，62mg)溶解于二甲基甲酰胺(1.0ml)中并將該混合物加至所述樹脂中。然后將全部反應物攪拌12小時后，過濾并洗滌(二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷)。再后真空干燥。
將50％TFA/45％二氯甲烷/2.5％H2O/2.5％三異丙基硅烷(1.0ml)加入到所述樹脂中并將該混合物攪拌1小時。將所述樹脂過濾并用二氯甲烷(1.0ml)洗滌，真空濃縮濾液。將所得的粘性黃色油用無水乙醚(3x2ml)研制得到為其四TFA鹽的標題化合物(19mg，700/0)。分析LCMS90％(ELS檢測)。M/z449(ES+)。NMR發現1H NMR與上述結構一致。Dde保護的氨基醇Dde=N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基)乙基Dde保護的氨基醇的制備向3-氨基-1-丙醇(1.5g，20mmol)的乙醇溶液中加入2-乙酰雙甲酮(1.1當量，22mmol，4.0g)并將該混合物加熱至50℃1小時。將生成的溶液真空濃縮得到的紅色結晶固體，用己烷研制獲得灰白色固體(4.74g，95％)。
實施例4式D的化合物將N1-芴基甲氧基羰基-N4-(4'-苯甲酰氧基羰基(1'-苯氧基)乙醇氨基樹脂)-N8-Boc亞精胺(≈31mg，0.263mmol/g)裝于2ml PTFE注射器并用20％哌啶的二甲基甲酰胺(2ml)在30分鐘內處理三次，接著用二甲基甲酰胺(2x2ml)和CH2Cl2(4x2ml)洗滌。
用5當量(0.041mmol)Fmoc-氨基甲酰基的酸和在CH2Cl2/二甲基甲酰胺中的DIC/HOBt(1ml/滴)活化，將生成的伯胺偶聯至Fmoc-Phe)。不時攪拌4小時后，茚三酮試驗指示所述偶聯已完成。在用20％哌啶的二甲基甲酰胺(2ml，2x30mn)處理并用二甲基甲酰胺(2x2ml)和CH2Cl2(4x2ml)洗滌后，將Di(Boc)保護的胍基羧酸偶聯至所述樣品。用3當量(O.025mmol)羧酸和DIC/HOBt在CH2Cl2/二甲基甲酰胺(1ml/滴)的活化作用完成偶聯。不時攪拌5小時后，茚三酮試驗顯示所述偶聯已完成。
用二甲基甲酰胺(2x2ml)/CH2Cl2(4x2ml)洗滌后，所述化合物在用TFA-H2O(95∶5,0.4ml)處理1.5小時前從所述固體支持物即在CH2Cl2(1ml)中再溶脹的所述樹脂去保護性裂解。
用TFA-CH2Cl2(1∶1,2ml)洗滌所述樹脂樣品，然后將所述洗滌物過濾入管制瓶中。真空減少所述溶劑并將殘留物溶解于水，冷凍并凍干。所述化合物用ES MS分析得到為主峰的所需要的分子離子。M/Z(ES+)448.4實施例5采用器官型海馬切片培養物[Pringle A.K.等，(1996 Stroke 272124-2130)]研究低氧性神經元損傷。
按照Stoppini等(1991 J.Neurosci.Meth.37 173-182)的方法從8-10日齡Wistar幼鼠(Bioresources Unit,University of Southampton)制備培養物。將培養物體外維持14天(37℃，5％CO2)，在此期間每3天換一次培養基(50％極限必需培養基(MEM)、25％Hank平衡鹽溶液(HBSS)、25％熱滅活的馬血清，添加以1mM谷胺酰胺、5mg/ml葡萄糖和1.5％兩性霉素)。通過用95％N2/5％CO2飽和(因此無氧)的無血清(SF)培養基(75％MEM、25％HBSS、1mM谷胺酰胺、5mg/ml葡萄糖、1.5％兩性霉素)取代培養基并將培養物置于其中的大氣也用N2/CO2飽和的密閉室中誘導低氧。在180分鐘低氧后，將培養物重新平板接種于正常含氧量的SF培養基并再置于培養箱中24小時。將化合物加入到低氧前、低氧中和低氧后(此后縮寫為“pdp”)或正處于低氧后恢復期(“post”)的培養物中[Johnson,T.D.(1996 TrendsPharmacol.Sci.22-27)]。采用通常不能進入健康細胞、但是進入漿膜受損的細胞內并當與DNA結合時變成強熒光的熒光排斥染料碘化丙錠(PI,5μg/ml)來評價細胞損傷。用“NIH Image 1.55”軟件(由在美國衛生國立研究所的Wayne Rasband編寫并得自國際互聯網zippy.nimh.nih.gov的匿名的機能試驗程序(ftp))定量神經細胞損傷。簡而言之，根據透射圖像測量CA1、CA3和齒狀回(DG)細胞層的面積。在低氧開始后24小時，用裝備有若丹明濾光裝置的標準Leica倒置熒光顯微鏡捕獲熒光圖像。用密度切片的功能圖像測定高于神經細胞層的背景的PI熒光面積。細胞損傷表示為其中可檢測PI熒光的胞體層的百分面積。成像后將培養物在4％低聚甲醛中固定過夜并用硫堇染色。
數據表示為均數±sem。分析前匯集非藥物組的數據。用單側方差分析(ANOVA)后繼之以因果推理的非配對的Student's檢驗確定統計學顯著性。因為只有在CA1區的細胞對誘導的低氧損傷敏感，所以只計算該區的所有藥理數據。
制備器官型海馬切片培養物并如上維持。將NMDA制備為在蒸餾水中的50mM貯存液并以SF培養基按需要稀釋。通過將培養物置于含有10μM或30μM NMDA的SF培養基中180分鐘誘導神經毒性。此后，將培養物再平板接種于SF培養基中并在培養箱中保持24小時。將300μM L-ArgSp或媒介物(SF培養基)加入到NMDA暴露前、暴露期間和暴露后的培養基中。整個試驗期間，在所述培養基中包含有5μg/ml PI。24小時后，通過PI熒光成像檢測神經元損傷并如上定量。血流研究開始用4％鹵烷麻醉成年雄性Wistar大鼠(250-300g)，隨后用在氧中混合在7％N2O中的1.5％鹵烷維持麻醉。進行股動脈插管以連續記錄血壓。此外，進行股靜脈插管以注射所述化合物。使動物穩定15-30分鐘后注射0.25-0.3ml的1mg/ml L-ArgSp溶液。注射所述化合物后，持續監測大鼠60分鐘。然后，終止麻醉并使大鼠蘇醒。在這些研究中，測量記錄為1mg/kg L-ArgSp靜脈注射入麻醉雄性Wistar大鼠的股靜脈后誘導的平均動脈血壓(MABP)。計算注射L-ArgSp前(注射前)和注射后30秒和10分鐘的MABP。數據表示為四次觀察的均數±sem。全前腦局部缺血如上所述麻醉動物，并將熱敏電阻插入左側顳肌以記錄體溫。切開頸部背中線皮膚，用顯微手術鑒定椎動脈并用單極電極在Cl水平閉合該動脈。縫合所述切口，使動物從麻醉中恢復并送回其飼養籠內24小時。然后再麻醉動物并暴露頸總動脈(CCAs)。動物分為2組。1組接受0.25-0.3ml的1mg/ml L-ArgSp溶液(終劑量為1mg/kg)，而2組接受0.25-0.3ml的無菌蒸餾水。獨立制備樣品并在注射前隨機化。在用微血管彈簧小夾夾閉CCAs15分鐘前，對動物進行15分鐘的注射。然后，縫合皮膚，使動物蘇醒。24小時后，最后一次麻醉動物并經心臟灌注1％低聚甲醛，去腦并進行處理以用于組織學研究。觀察人員在雙盲情況下，根據蘇木精和依紅染色的冠狀切片確定在錐體細胞層的CA1、CA3區和齒狀回顆粒細胞層中的活神經元和死神經元數。結果(ⅰ)對照方法體外14天后，器官型海馬切片培養物保持了大多數的體內海馬的結構和形態。準確地說，在硫堇染色的切片中可觀察到清晰可辨的錐體(CA1和CA3/4)和齒狀回顆粒細胞層。神經元似乎健康正常，具有強染色的細胞質包圍的淺染色的細胞核(

圖1)。
3小時低氧后的24小時，在錐狀細胞層的CA1區(35.6±1.43％損傷，n=108)中可檢測到PI熒光，在CA3錐狀細胞(7.1±1.3％)或齒狀顆粒細胞(3.9±2.9％)檢測到少量(但是沒有統計學意義)的PI標記。在維持于無血清培養基24小時的未處理對照組觀察到少量PI熒光。硫堇染色后，對照培養物與未處理的切片難以區分開，具有大而健康正常外觀的神經元。相反，在暴露于180分鐘低氧的培養物中，CA3錐體細胞和齒狀顆粒細胞外觀正常，但是在CA1中的細胞具有小、染色深的固縮核和少量可見的細胞質，表明神經元死亡，如圖1所示。圖1顯示未處理對照培養物(A)或3小時低氧后的24小時培養物(B)的PI熒光圖像。在未處理的培養物中未檢測到PI熒光，但是在低氧處理培養物中的CA1椎狀細胞層中存在強染色。(C+D)對應顯示于A+B的培養物的CA1區的硫堇染色切片。(C)神經元含有深染色細胞質包圍的淺染色核(白色箭頭所示)。(D)相反，在低氧處理的培養物中的神經元表現為小、深染色的固縮核(黑色箭頭所示)。在該圖中，刻度條為A、B1mm；C、D100μm。
與300μM L-ArgSp孵育24小時后，未觀察到高于基線的PI熒光增加。低氧前、低氧發生期間和24小時恢復期中加入300μM L-ArgSp30分鐘完全是神經保護性的。在0.2±0.02％的CAI中可檢測到PI熒光(n=12，與低氧對照相比p＜0.001)。在硫堇染色的切片中，所述神經元與未處理或對照培養物的神經元不能區別。
當延遲到低氧后立即加入L-ArgSp，仍然觀察到顯著的神經保護作用。這是濃度依賴性的(0.3-300μM)，EC50為3-30μM。在這些培養物的CA1亞區中觀察到損傷減輕(參見圖1、以下所示的表1)，證實延遲加入所述化合物不會明顯降低神經保護效力。
表1
表1表示其中在低氧3小時后24小時可檢測到PI熒光的CA1錐體細胞層的定量百分面積(％損傷CA1)。匯集僅暴露于低氧的所有培養物的數據(低氧對照)。按(((％低氧對照的損傷-％藥物處理的損傷)／％低氧對照的損傷)·100)計算神經保護的百分率。數據表示為均數±sem，n=培養物數，與低氧對照相比*p＜O.05，**p＜0．01，***p＜O.001。
為了確定L-ArgSp的亞精胺和精氨酸組分是否是產生所述神經保護作用所必需的，我們還評價了低氧后加入300μM亞精胺和300μML-精氨酸的作用。
亞精胺或L-精氨酸單獨均不能使損傷減輕(參見表1)。這些數據表明必需具有以上定義結構的化合物才具有神經保護效力，例如使L-精氨酸與亞精胺綴合制備的化合物。該結果與其中要求保護亞精胺直接阻滯鈣傳導的wO 91／00853的發現相反。關于我們的現有工作，我們已經表明純化的亞精胺在我們的檢測中沒有神經保護作用。在現階段我們認為所述不同基于的事實是在WO 91/00853中沒有對亞精胺進行純化，因此人們僅能夠推測所用的亞精胺是不純的。
當用相關的氨基甲酰基酸賴氨酸或鳥氨酸取代精氨酸殘基時，所得化合物的神經保護效力小于L-ArgSp。盡管如此仍然觀察到神經保護效力。低氧后立即加入300μM L-賴氨酰亞精胺(L-LysSp)導致小量但是明顯的CA1區PI熒光的降低(參見表1)。低氧后加入300μM L-鳥氨酰亞精胺(L-OrnSp)導致較少但是明顯的損傷減輕。
與L-對映體相比，用其相應的D-對映體取代L-氨基甲酰基酸導致所述化合物的神經保護效力顯著降低，因為低氧后加入300μM D-ArgSp、D-LysSp或D-OrnSp并不會導致任何可觀察到的PI熒光降低(參見上述的表1)。另外，CA1亞區的細胞出現皺縮、深染、固縮核，表明神經元死亡。這些結果清楚地說明，我們已經發現了L旋光活性對神經保護效力是重要的。所以，本發明高度優選的化合物具有L旋光活性。此外，與WO 91/00853內容直接相反的是，我們發現賴氨酸取代精氨酸(化合物A和B)降低神經保護作用但是不會逆轉神經保護作用。ⅴ)直方2為證實當低氧后立即加入L-ArgSp(0.3-300μM)的濃度依賴性神經保護效應的直方圖。神經元損傷表示為其中低氧3小時后24小時檢測PI熒光的CA1區的百分率(％損傷CAT)。(與低氧對照(對照)相比***p＜0.001,**p＜0.01,*p＜0.5,n=108對照,n=14 0.3μM,n=7 3μM,n=14 30μM,n=16 300μM)。
暴露于10μM NMDA180分鐘后24小時在錐體細胞層的CA1亞區而不是該培養物的其它區中可檢測到PI熒光。NMDA濃度增加至30μM導致更嚴重的損傷，在錐體細胞層的CA1和CA3區中均發生顯著的神經元損傷，但是不損傷齒狀回的顆粒細胞。整個試驗中加入300μM L-ArgSp至所述培養基中不會減輕由10μM或30μMNMDA引起的損傷。圖3顯示說明當NMDA加入后L-ArgSp對NMDA介導的神經毒性缺乏神經保護效力。神經元損傷表示為其中暴露于NMDA 180分鐘后24小時檢測PI熒光的CA1(實心條)或CA3(影線條)的百分面積。(均數±sem，每一組的n=8)。ⅶ)血流研究這些研究的結果提供于以下表2中。表2
注射后60分鐘即剛好在蘇醒前記錄的血壓與給藥后10分鐘測得的血壓相同。L-ArgSP引起的MABP小量降低不具有統計學意義。給予L-ArgSP后在這些動物中沒有發生對體溫或心率的影響。蘇醒后沒有觀察到所述化合物對動物的不良作用。對另外5只大鼠在給予1mg/kg L-ArgSp后讓其恢復3天，在這些動物中未觀察到長期的行為缺陷。
15分鐘全前腦局部缺血是特別嚴重的損傷，導致整個海馬結構的神經元損傷。當局部缺血后24小時進行評價時，僅接受載體的動物顯示CA1、CA3和齒狀回的神經元損傷，并且損傷的程度是區域相關性的(CA1＞CA3＞DG)。在誘導局部缺血前15分鐘用1mg/kgL-ArgSp處理的動物中，所述神經元損傷顯著緩解、尤其是極其脆弱的CA1區。該數據描述于圖4，該圖為說明在載體處理動物(實心條)和L-ArgSp處理動物(影線條)的CA1、CA3和齒狀回(DG)中的活神經元百分率(按組織學測得的)(％活神經元)。(與載體處理的對照相比**P＜0.01,*P＜0.05；數據為均數±sem,n=5對照，n=7L-ArgSp)。實施例討論我們采用固相化學技術已經合成了其中的精氨酰亞精胺。我們已經證明該化合物尤其是L-對映體具有顯著的神經保護效力，即使延遲到低氧發生后加入該化合物也是如此。
所述數據證明本發明化合物必須包含通過酰胺鍵連接至上述第二組分的上述第一組分，例如綴合亞精胺和L-Arg以使得具有神經保護效力。關于這一點，獨自用亞精胺和L-Arg未檢測到保護效力。因此可以得出的一個結論是本發明化合物尤其是L-ArgSp的作用通過需要在同一分子中存在第一和第二組分的受體位點介導的。
用L-賴氨酸(L-LysSp)或鳥氨酸(L-OrnSp)取代L-精氨酸仍然得到活性化合物。然而，這些化合物的活性不如L-ArgSp活性大。這提示胍鎓(guanidinium)官能度是最適活性所需要的，但是其它正電荷基團可以較好地取代它。
因此，現在認為對活性的高度優選的特性是末端正電荷對胍鎓或銨離子和α-氨基甲酰基基團的相對空間位置。這得自于所述側鏈的相對長度和總長度從Arg到Lys再到Orn的減小，并提示該化合物能夠呈現雙功能結合能力。
此外，在本發明高度優選的實施方案中，似乎可認為所述結合位點是空間特異性的，需要所述氨基甲酰基酸為L構型以具有最適化活性。D-ArgSp和D-LysSp相對于其相應的L-對映體均是無活性的。
所述血流數據表明，本發明化合物尤其是式A的化合物對血流較FTX具有較少的不良作用。
實施例6重復實施例5的方法，但是采用不同劑量的新的一批化合物A(pdp)。結果示于以下的表3。
表3
p＜0.05，**p＜0.01實施例7重復實施例5的方法，但是采用在α-氨基進行取代的衍生自化合物A的各種化合物。結果示于以下的表4中。
表4
p＜0．05，**P＜0．01CBZ=芐氧基羰基實施例8重復實施例5的方法，但是采用其中吡啶基丙氨酸取代化合物A的精氨酸的化合物(PyrAla3,4)。結果示于以下的表5中。
表5
從該表可以看出該化合物具有陰性保護效應。
實施例9重復實施例5的方法，但是采用化合物I(其中瓜氨酸取代化合物A的精氨酸)或其中谷氨酰胺取代化合物A的精氨酸的化合物(Gln3，4)。結果示于以下的表6中。
表6
*p＜O．05，從該表可以看出化合物I產生明顯的保護效應，GIn3，4則沒有該效應。
實施例lO重復實施例5的方法，但是采用化合物A或對應于化合物A的化合物、但是其中Rc為四亞甲基即Rb和Rc的碳原子總數為8(Arg4，4)。結果示于以下的表7中。
表7
**P＜O．01從該表可以看出化合物A產生明顯的保護效應，Arg4，4則沒有該效應。實施例總結總而言之，用新型固相方法合成了許多亞精胺(多胺)基化合物，并評估了其對在海馬切片培養物中低氧所誘導的神經元損傷的保護效應。300μML-精氨酰亞精胺的神經保護作用顯著，當低氧前加入時觀察到完全保護作用。當在低氧后加入時觀察到濃度依賴性方式的保護，在300μM處的保護作用顯著(＞70％)，EC50為3-30μM。L-賴氨酰亞精胺和L-鳥氨酰亞精胺也是保護性的，盡管其保護程度較精氨酸亞精胺低。重要的是，所有三種化合物的D-對映體在提供神經保護活性方面的活性(如果有任何活性的話)顯著低于L-對映體。
固相/組合化學和神經元損傷(例如局部缺血相關性損傷)的體外模型的汞齊法(amalgamation)為合成和研究許多潛在的神經保護化合物提供了良好的手段。該方法提供了產生可以顯著影響嚴重神經元損傷如發生于中風后的損傷治療的化合物的可能性。
權利要求
1．具有通式(Ⅰ)的基本純化合物及其藥學上可接受的鹽。 其中Q代表脒基、氰基或式XYN-基團，其中X和Y相同或不同，每一個可以代表氫原子、低級烷基、或含有單一雜原子的基團或與其連接的氮原子一起形成含氮的雜環基團；Ra代表具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈的亞烷基或亞鏈烯基和每一個任選地被每個具有1-3個碳原子的1-4個烷基取代；Rb和Rc每個代表在直鏈中具有3-4個碳原子的亞烷基或亞鏈烯基，每個任選地被每個具有1-3個碳原子的1或2個烷基取代，在Rb和Rc的所述直鏈中的碳原子總數為7；R2和R3彼此相同或不同，每個代表氫原子或式R、RCO-、ROCO-或RNHCO-基團，其中R代表低級烷基或芳基；所述烷基或芳基任選地被以下定義的一個或多個α取代基取代；星號表示的手性碳原子為L構型；Z為芳香族氨基酸殘基；n為0或1；R1代表氫原子或低級烷基或芳基，所述烷基或芳基任選地被以下定義的一個或多個α取代基取代；和W代表氫原子、烷基或芳基；α取代基選選自鹵原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氰基、羥基、烷基(當所述取代基是烷基時除外)、芳基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基和羧基及其酯。
2．按照權利要求1的化合物，它具有式(Ⅰa) 其中Q、Ra、Rb、Rc、R2、R3、Z、n和R1與權利要求1相同。
3．按照權利要求1的化合物，它具有結構式(Ⅰb) 其中X、Y、Z、n和R1定義與權利要求1相同；x是1-5之間的一個整數；y是3或4；R4、R5、R6和R7可以相同或不同，每個代表氫原子或低級烷基；和星號表示的手性碳原子是L構型。
4．按照前述權利要求中任一項的化合物，其中Z代表L構型的芳香族氨基酸殘基。
5．按權利要求1定義的無毒的式(Ⅰ)化合物。
6．按權利要求2定義的無毒的式(Ⅰa)化合物。
7．按權利要求3定義的無毒的式(Ⅰb)化合物。
8．按照權利要求1的化合物，它是
9．按照權利要求1的化合物，它是
10．按照權利要求1的化合物，它是
11．按照權利要求1的化合物，它是
12．按照權利要求1的化合物，它是
13．按照權利要求1的化合物，它是
14．按照權利要求1的化合物，它是
15．按照權利要求1的化合物，它是
16．按照權利要求1的化合物，它是
17．按照前述權利要求中任一項的化合物在生產用于治療哺乳動物以保護所述哺乳動物免遭局部缺血事件引起的神經元損傷的藥物中的用途。
18．一種治療哺乳動物以保護所述哺乳動物免遭局部缺血事件引起的神經元損傷的方法，該方法通過將有效量的權利要求1-16中任一項要求保護的無毒化合物在局部缺血事件前、后或事件發生期間給予所述哺乳動物。
全文摘要
式(Ⅰ)的化合物及其藥學上可接受的鹽對可能由局部缺血事件引起的神經元損傷具有保護能力,其中:Q代表脒基、氰基或式XYN－基團(其中X和Y為氫或不同基團);R
文檔編號C07C275/16GK1284058SQ98813520
公開日2001年2月14日 申請日期1998年12月16日 優先權日1997年12月16日
發明者A·K·普林格勒, M·布拉德里, L·E·森德斯特龍, F·伊安諾蒂 申請人:南安普敦大學