內皮蛋白酶解活性和/或血管生成活性的刺激、調節和/或抑制的制作方法

專利名稱：內皮蛋白酶解活性和/或血管生成活性的刺激、調節和/或抑制的制作方法
背景技術：
血管生成是通過以預存在的血管的萌發過程而形成新的毛細血管的過程，并發生在發育過程中及大量生理及病理狀態中。因此血管生成為組織生長，傷口愈合及女性生殖功能所必需，且也是一些病理進程如腫瘤生長，血管瘤形成及眼新生血管化的一部分(見Folkman，New Engl.J.Med.3331757-1763(1995)；Pepper，Arberioscler.Thromb.Vasc.Biol.17605-619(1997))。一相似的但未深入研究的進程也發生于淋巴系統，并有時指作淋巴管生成。
血管生成起于母血管基膜的局部破損處，隨后內皮細胞遷移并派出入胞外基質周圍，導致毛細萌芽形成。隨后形成腔，構成功能血管萌芽形成中的一基本要素。在基膜重構后完成血管萌芽成熟。在此系列事件期間，至少發生三種內皮細胞功能改變1)與胞外基質相互作用的調節，其要求改變細胞-基質接觸及降解基質的蛋白酶解酶(纖溶酶原激活物(PAs)及基質金屬蛋白酶)的產生；2)移動(遷移)開始增高隨之降低，這使細胞轉位于血管生成刺激物附近，且一旦達到目的地則停止轉位；3)增殖增加，此為血管生長及延長提供新細胞，且一旦血管形成則隨之恢復為靜止狀態。總之，這些細胞功能在毛細管形態發生，即三維未閉合或開放的類管結構的形成中起作用。許多新形成的毛細管隨后經歷血管壁成熟的過程(即平滑肌細胞富集基質及外膜形成)，其它的則經歷退化(即缺乏血流時)[見Pepper et al.，Enzyme Protein，49138-162(1996)；Risau，Nature 386671-674(1997)]。
通常闡述的是除應答組織損傷或女性生殖器官發生的血管生成之外，在健康成年機體內內皮細胞轉化非常低。推想內皮保持靜止是由于內源性負調節物的存在，因為正調節物通常在成熟組織中被檢出，其中明顯沒有血管生成，此認識的反面也是正確的，即正及負調節物經常共存于組織中，其中內皮細胞轉化提高。由此引出“血管生成開關”的見解，其中內皮激活狀態通過正及負調節物間的平衡而決定。在激活的(血管生成)內皮中，正調節物占優勢，而通過負調節物的優勢控制得以實現并保持內皮靜止[Hanahan et al.，Cell.86353-364(1996)]。“開關”最初用于腫瘤漸進的描述以描述從血管前期至血管期，“開關”這一見解還可用于發育，生理及病理性血管生成。盡管其仍需在體內最后證實，現行研究假設“開關”包含正調節物的誘導和/或負調節物的缺失。
許多多肽生長因子或細胞因子已證實是體內血管生成的[見Klagsbrun et al.，Ann.Rev.Physiol.，53217-39(1991)；Leek et al.，J.Leukocyte Biol.，56423-435(1994)；Pepper et al.，Curr.Topics Microbiol.Immunol.，213/II31-67(1996)]。這些包括血管內皮生長因子(VEGF)，也稱作血管通透性因子或vasculotropin，及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)。但盡管VEGF在胚胎血管發育及腫瘤血管生成中的作用已明確證實(見Carmeliet et al.，Nature 380435-39(1996)；Ferrara et al.，Nature，380439-442(1996)；Dvorak et al.，Amer.J.Pathol.，1461029-1039(1995)；Ferrara et al.，Endocrine Rev.，184-25(1997))，bFGF在血管生成的內源性調節方面的實際作用仍需證實。然而，有兩項觀察報告指出這兩種細胞因子在血管生成調節中的相互作用的潛在重要性。首先，VEGF及bFGF已證實在體外血管生成誘導中協同作用[Pepper et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.189824-831(1992)；Goto et al.，Lab.Invest.69508-517(1993)]，且此項觀察在兔后肢局部缺血模型中得以體內證實。[Asahara et al.，Circulation 92(Supp.II)II.365-71(1995)]，及在大鼠海綿移植模型體內證實[Hu et al.，A.Br.J.Pharmacol.，114262-268(1995)]。其次，VEGF的體外血管生成作用及其誘導PA活性的能力均依于由內皮細胞產生的內源性bFGF。
由VEGF家族成員誘導的內皮細胞功能的改變，通過包括VEGFR-1(Flt-1)，VEGFR-2(KDR/Flk-1)及VEGFR-3(Flk-4)的轉膜酪氨酸激酶受體介導[見Mustonen et al.，J.Cell Biol.，129895-898(1995)]。VEGFRs在許多成熟組織中表達，盡管組成型血管生成表觀不存在，但在發育及某些血管生成相關的/依賴性的病理情況如腫瘤生長期間，VEGFRs在內皮細胞中明顯正調節[見Dvorak et al.，Amer.J.Pathol.1461029-1039(1995)；Ferrara et al.，Endocrine Rev.，184-25(1997)]。VEGFR-1缺陷的小鼠及VEGFR-2缺陷的小鼠的表型揭示了這些受體在發育期間在血管形成中的基本作用。VEGFR-1缺陷的小鼠在妊娠中期死于子宮內，這是由于內皮細胞不能有效地裝配為血管，導致異常血管腔的形成所致[Fong et al.，Nature，37666-70(1995)]。VEGFR-2缺陷的鼠在性交后8.5～9.5天死于子宮內，與VEGFR-1相反，此現象出現是由于內皮細胞前體的流產性發育所致[Shalaby et al.，Nature 37662-66(1995)]。通過使用顯性失活法也已清晰地證實了VEGFR-2在腫瘤血管生成中的重要性[Millauer etal.，Nature 367576-579(1994)；Millauer et al.，Cancer Res.561615-1620(1996)]。VEGFR-3缺陷的小鼠的表型還未報導。
VEGFR-1的配體包括VEGF及胎盤生長因子(PlGF)；VEGFR-2的配體包括VEGF及VEGF-C；而VEGFR-3只報道有一個配體VEGF-C[見Mustonen et al.，J.Cell Biol.129895-898(1995)；Thomas，J.Biol.Chem.，271603-606(1996)]。VEGF-C是血管生成細胞因子的VEGF家族的最近闡述的一成員，其是與VEGF結構同源的蛋白質，是在探查VEGFR-3的配體期間，從人前列腺腺瘤細胞系PC-3分離的[見Joukov et al.，EMBOJ.，15290-298(1996)]。在另一項VEGFR-3配體的探查中，VEGF相關的蛋白(VRP)分離自人G61神經膠質瘤細胞DNA文庫，此文庫用基于編碼具有與VEGF高度相似性的氨基酸序列的表達序列標記(EST)的探針篩選[Lee et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931988-92(1996)]。VEGF-C和VRP是相同的蛋白，并從此稱作VEGF-C。VEGF-C呈現與VEGF高度相似性，包括參與分子內及分子間二硫鍵的8個半胱氨酸殘基的保守。半胱氨酸豐富的C-末端部分，其增加了與該家族其它配體相關的VEGF-C/VRP多肽的長度，顯示出提示為Balbiani3環蛋白重復的半胱氨酸殘基的間距圖式。此C末端前肽還包括VEGF類似區的短基序，其可促進分泌的VEGF-C與胞外基質間的相互作用。VEGF-C與VEGFR-3的胞外區結合，并誘導VEGFR-3酪氨酸磷酸化。除VEGFR-3之外，VEGF-C還與VEGFR-2結合并誘導其磷酸化。VEGF-C促進人及牛內皮細胞生長，盡管在此分析中其比VEGF活性低。已報道VEGF-C在三維膠原凝膠中可引起內皮細胞遷移[Joukov，et al.，EMBO J.，163898-911(1997)]。VEGF-C轉錄物可在許多成人及胎兒組織中及在一些細胞系中檢測。人VEGF-C已定位于染色體4934[Daavonen et al.，Circulation 931079-82(1996)]。
VEGF-C的顯著特征之一是其mRNA首先翻譯為前體，從中成熟配體通過細胞相關的蛋白酶解加工衍生。在生物合成之后，通過二硫鍵及非共價鍵連接將VEGF-C快速締合成kDa反平行的同源二聚體。隨后在分泌途徑的末端部分及在細胞膜，N-末端及C-末端前肽經蛋白酶解加工，產生一些未完全加工的中間產物，然后，成熟的VEGF-C作為含二個經非共價相互作用連接的VEGF-同源區的21kDa同源二聚體從細胞中釋出。此加工結果是VEGF-C獲得與VEGFR-2結合并激活其的能力，并也提高與VEGFR-3的親和性及激活性。細胞內蛋白酶裂解非VEGF-C分泌所必需。基于這些觀測報告已推斷VEGFR-3作為前體的合成使其信號優先地傳至VEGFR-3[Joukov et al.，EMBO J.，163898-911(1997)]，VEGFR-3在發育早期限于靜脈內皮，并在發育后期及出生后變為限于淋巴內皮內[Kukk et al.，Development，1223829-3827(1996)]。在加工機制被激活的某些情況下，可推斷VEGF-C可獲得額外的信號導向VEGFR-2的能力，從而提供額外的VEGF-C活性調節水平。信號導向VEGFRs要求受體二聚化。蛋白酶解加工通過間接促進VEGFR-2/VEGFR-3異源二聚體的形成可提供進一步調節機制。
Montesano等在Cell 42469-477(1985)中闡述了應用血管生成體外模型分析胞外基質侵襲及管形成，其報道bFGF及VEGF誘導生長于三維膠原或血纖蛋白凝膠上的胎兒微血管、淋巴及動脈內皮細胞侵襲其下基質，在其中它們形成類毛細管結構[見Montesano et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.837297-7301(1986)；Pepper et al.，Exp.CellRes.，210298-305(1994)；Pepper et al.，J.Cell Sci.，10873-78(1985)]。這表明bFGF及VEGF的血管生成誘導性可經直接作用于內皮細胞而介導。但越來越多證據表明特異性細胞因子引起的應答的性質是前后相關的，即取決于應答細胞的周圍環境中其它調節分子的存在與否。就血管生成而言，已先期證實VEGF及bFGF在體外模型中是協同的[Pepper et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，189824-831(1992)]，并在相同模型中，TGF-β1具有雙相作用[Pepper et al.，Exp.Cell Res.，204356-363(1993)]。
盡管在現有技術中已有深入細致的研究，但仍需要影響血管生成的方式。尤其需要增強、調節和/或抑制血管生成的方法，及刺激或抑制蛋白酶如纖溶酶原激活物活性的方法。發明概述本發明一個目的是鑒定在牛內皮細胞系中的VEGF受體的表達。
本發明另一目的是研制出一種協同誘導內皮細胞的血管生成應答的方法。
本發明又一目的是提供一種影響內皮細胞的蛋白酶解性質的方法。
本發明再一目的是提供一種抑制內皮細胞中血管生成的方法。
本發明再一目的是提供一種抑制蛋白酶活性的方法。
本發明再一目的是提供一種抑制纖溶酶原激活物活性的方法。
本發明再一目的是提供一種抑制腫瘤生長的方法。
現已發現，血管內皮生長因子B(VEGF-B)及血管內皮生長因子C(VEGF-C)刺激內皮胞外蛋白酶解活性，尤其刺激纖溶酶原激活物的活性，且也與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)協同誘導內皮細胞的血管生成，通過施用或共施用VEGF-B和/或VEGF-C以及其它生長因子，可調節內皮細胞血管生成活性。
尤其現已發現當與bFGF或VEGF共施用時，VEGF-C誘導體外內皮細胞的血管生成，且VEGF-B及VEGF-C協同地促進內皮細胞的血管生成。
VEGF-B或VEGF-C與bFGF的協同血管生成誘導作用可用于調節生理及病理性血管生成，以及用于抗腫瘤或其它病癥的治療方案。
用于以下實驗的牛細胞示出對人VEGF，VEGF-B及VEGF-C的明顯應答的事實表明牛受體與人受體的同源性足以產生高度的物種間交叉反應性。由此，在表達人受體的人組織中可期望相似地或更多地應答。
VEGF-B及VEGF-C誘導各種蛋白酶如纖溶酶原激活物(PAs)的基因表達，其可破壞周圍組織，并從而促進腫瘤細胞對那些組織的侵襲。同樣，由于VEGF-C可作為內皮細胞的化學引誘物，這可導致淋巴管(其由內皮細胞組成)的侵襲及滲透，并最后支持腫瘤轉移的開始，因而，VEGF-B和VEGF-C拮抗劑可治療性地應用以抑制VEGF-B和/或VEGF-C的功能，從而阻止或預防滲透、內皮細胞侵襲和/或轉移，尤其，如以下實施例14所示，α2-抗纖溶酶可抵抗VEGF-B和/或VEGF-C的血管生成功能，并從而可根據本發明的一方面用作抗轉移劑。
本發明的另一方面包括提供一反義核苷酸序列，其至少互補于可促進內皮細胞增殖的VEGF-B和/或VEGF-C的DNA序列的一部分。本發明因而包括反義寡核苷酸，其選擇性地與編碼VEGF-B和/或VEGF-C蛋白的核酸分子結合，并分別用于降低VEGF-B或VEGF-C基因的轉錄和/或翻譯。這在希望降低VEGF-B和/VEGF-C基因產物的表達的任何疾病中均是合乎需要的，包括降低由于VEGF-B和/或VEGF-C基因的表達所致的腫瘤細胞表型的任何方面。反義分子可以此方式用于阻止或抑制腫瘤細胞的此方面。
本文所用的術語“反義寡核苷酸”或“反義”意為此寡核苷酸是一寡核糖核苷酸，或修飾的寡脫氧核糖核苷酸，其在生理條件下與含有特定基因的DNA或與此基因的mRNA轉錄物雜交，并從而抑制此基因的轉錄和/或此mRNA的翻譯。反義分子被標記以便在與靶基因雜交時干擾靶基因的轉錄或翻譯。本領域技術人員將認識到反義寡核苷酸的實際長度，且其與其靶互補程度將取決于所選擇的特異靶，包括靶的序列及含有此序列的特定堿基。優選反義寡核苷酸的構建及排列是使得在生理條件下選擇性與靶結合，即在生理條件下與靶序列比與靶細胞中其它序列雜交的多。基于公布的VEGF-B及VEGF-C的DNA序列，本領域技術人員根據本發明能容易地選擇及合成任何數目的合適的反義分子以應用。為有足夠的選擇性及有效抑制，該反義寡核苷酸應包括至少7個，優選至少15個互補于靶的連續堿基[見Wagner et al.，Nature Biotechnology，14840-844(1996)]。更優選地，該反義寡核苷酸包括一20～30個堿基的互補序列。盡管可以選擇反義于基因或mRNA轉錄物的任何區域的寡核苷酸，在一優選的實施方案中，反義寡核苷酸相應于N-末端或5’上游位點如翻譯起始、轉錄起始或啟動子位點，另外，3’未翻譯區也可被靶擊。本領域也使用靶擊mRNA剪接位點的反義寡核苷酸，但如果發生可變mRNA剪接則非十分優選。另外，該反義序列優選靶擊于不會出現mRNA二級結構的位點[見Sainio et al.，Cell MolNeurobiol.，14(5)439-457(1994)]，以及預期不結合蛋白質的位點。
由于本領域熟練技術人員可容易地衍生相應于cDNA的基因組DNA或相應于基因組DNA的cDNA，因而本領域技術人員能提供互補于所需基因的cDNA的反義核苷酸，或提供與所需基因的基因組DNA雜交的反義核苷酸。以相似方式，不經過分試驗可容易地獲得等位或同源DNA的反義序列。
本發明所用反義寡核苷酸可包括“天然”脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸或其任何組合，即一天然核苷酸的5’末端與另一天然核苷酸的3’末端可以共價鍵合，如在天然系統中，通過磷酸二酯核苷酸間連鍵連接。這些寡核苷酸可通過本領域公知的方法手工地或經自動合成儀進行制備。還可通過載體重組地產生。但在優選的實施方案中，用于本發明的反義寡核苷酸還可包括“修飾”的寡核苷酸，即此寡核苷酸可以各種方式修飾，這種修飾不阻礙其與其靶雜交，但可增強其穩定性或靶擊能力或另外增強其治療功效。
本文所用術語“修飾的寡核苷酸”闡述了一寡核苷酸，其中(1)其至少2個核苷酸通過合成的核苷酸間連鍵共價鍵合(即在一核苷酸的5’末端及另一核苷酸的3’末端之間除了磷酸二酯鍵之外的鍵合)，和/或(2)與核苷酸非天然相連的一化學基團共價附著于寡核苷酸。優選的合成的核苷酸間連鍵是硫代磷酸酯、烷基膦酸酯，二硫代磷酸酯、磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、亞磷酰胺、氨甲酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺化物、肽及羧甲基酯。術語“修飾的寡核苷酸”也包括具有共價修飾的堿基和/或糖的寡核苷酸。例如修飾的寡核苷酸具有主鏈糖的寡核苷酸，所述的糖在3’位與非羥基的低分子量的有機基團及在5’位與非磷酸酯基團的低分子量的有機基團共價附著。因此修飾的寡核苷酸可包括2’-O-烷基化核糖基團。另外，修飾的寡核苷酸也可包括如以阿拉伯糖代替核糖的糖。修飾的寡核苷酸也可包括堿基類似物，如C-5丙炔修飾的堿基[見Wagner et al.，Nature Biotechnology，14844(1996)]。因而本發明涉及含有互補于編碼VEGF-B和/或VEGF-C蛋白的核酸，并在生理條件下與之雜交的修飾的反義分子，以及藥物學可接受載體的藥物制劑。
反義寡核苷酸可作為藥物組合物一部分而施用，如此藥物組合物可包括與任何本領域已知的標準生理學和/或藥物學可接受載體組合的反義寡核苷酸，該組合物應是無菌的并含有適于施用于患者的單位重量或體積的治療有效量的反義寡核苷酸。術語“藥物學可接受的”意為不干擾活性成分的生物活性的非毒性物質。術語“生理學可接受的”指與生物系統如細胞、細胞培養物、組織或生物體相容的非毒性物質。載體的特征將依于施用途徑。生理學及藥物學可接受的載體包括稀釋劑，充填劑，鹽，緩沖劑、穩定劑、溶解劑及其它本領域熟知的物質。
含有如此反義序列的載體可用于抑制或至少降低相關細胞因子的表達。在細胞因子的表達與疾病相關的情況下，應用抑制一或多種血管生成細胞因子表達的此型載體是有利的，例如腫瘤產生VEGF-B和/或VEGF-C以提供血管生成的疾病。用含反義核苷酸序列的載體轉化如此的腫瘤細胞將抑制或阻止內皮細胞增殖活性，并從而能抑制滲透、內皮侵襲和/或轉移，且因此抑制或阻止腫瘤生長。附圖的簡要描述

圖1a-圖1f是示出由VEGF，VEGF-C，bFGF及VEGF或VEGF-C與bFGF組合物誘導的膠原凝膠的血管生成細胞索狀侵襲的顯微照片。
圖2a及2b示出由VEGF-C單獨或VEGF-C與bFGF組合誘導的牛微血管內皮(BME)細胞的體外血管生成曲線。
圖3a及3b示出由VEGF-B單獨或VEGF-B與bFGF組合誘導的BME細胞的體外血管生成曲線。
圖4a-4c示出由VEGF-C單獨或VEGF-C與各種濃度bFGF組合誘導的牛動脈內皮(BAE)細胞的體外血管生成曲線。
圖5a及5b示出由VEGF-B單獨或VEGF-B與bFGF組合誘導的BAE細胞的體外血管生成曲線。
圖6示出在牛淋巴內皮(BLE)細胞中由VEGF-C誘導的體外血管生成曲線。
圖7示出VEGF單獨、VEGF-C單獨及其組合對BAE細胞膠原侵襲的作用曲線。
圖8a及8b示出VEGF單獨，VEGF-B單獨，VEGF-C單獨及其各種組合對BAE細胞膠原侵襲的作用曲線。
圖9a及9b是組織型纖溶酶原激活物(tPA)活性及尿激酶型纖溶酶激活物(uPA)活性的誘導的酶譜分析，圖9c是經VEGF-C，VEGF及bFGF誘導的纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)的反向酶譜分析。
圖10a是tPA活性及uPA活性的誘導的酶譜分析，圖10b是經VEGF-B，VEGF及bFGF誘導的PAI-1活性的酶譜分析。
圖11示出在BAE細胞中由VEGF-C誘導的tPA，uPA及PAI-1 mRNA穩態水平的提高。
圖12示出在BAE細胞中由VEGF-B誘導的uPA及PAI-1mRNA穩態水平的提高。
圖13是示出在BME細胞中α2-抗纖溶酶對由VEGF-C誘導的膠原凝膠的內皮細胞侵襲的抑制作用曲線。詳細描述如引入本文作參考的Eriksson等，WO96/26736中所述可生產重組人VEGF-B167及VEGF-B186。
使用sf9昆蟲細胞系(National Public Health Institute，Helsinki)，及衍生自轉移質粒pFASTBAC1(如Jeltsch M.，VEGF-B和VEGF-C的功能分析，Helsinki University(1997)所述)的桿狀病毒穿梭載體在桿狀病毒系統中生產重組人VEGF-C。
如Joukov et.al.，EMBO J.，163898-911(1997)所述，應用pIC9表達載體(Invitrogen)在巴斯德畢赤氏酵母(GS115菌株)中生產重組人VEGF-CΔNΔC。
重組人VEGF(165個氨基酸同源二聚體-VEGF165)購自Peprotech。
重組人bFGF(155個氨基酸形式)由Dr.P.Sarmientos(FarmitaliaCarlo Erba，Milan，Italy)提供。
牛uPA，牛uPAR及人tPA cDNA克隆由Dr.W.-D.Schleuning提供。
實施例1微血管內皮細胞的細胞培養牛腎上腺皮質衍生的微血管內皮(BME)細胞(Furie et al.，1984)得自M.B.Furie博士和S.C.Silverstein博士，并生長于補加15％熱滅活性供體小牛血清(DCS)(Flow Laboratories，Baar，Switzerland)，青霉素(500u/ml)及鏈霉素(100wg/ml)的α改良極限必需培養基(Gibco AG，Basel，Switzerland)。所用細胞在16及19代之間。
實施例2動脈內皮細胞的細胞培養將分離自成熟牛胸主動脈刮屑并通過有限稀釋克隆的牛動脈內皮(BAE)細胞(如Pepper et al.，Am.J.Physiol.262C1246-57(1992)所述)，在補加10％DCS及抗生素的低糖Dulbecco’s修改的極限必需培養基(DMEM，Gibco)中培養。所用細胞在10及15代之間。
實施例3淋巴內皮細胞的細胞培養牛淋巴內皮(BLE)細胞分離自腸淋巴管并由S.Wasi博士提供。第3代細胞如Pepper et al.，Exp.Cell Res.，210298-305(1994)中所述通過有限稀釋克隆。將BLE細胞在補加1mM丙酮酸鈉，10％供體小牛血清及抗生素的DMEM中培養，所用細胞在21及26代之間。
實施例4肺動脈內皮細胞的細胞培養小牛肺動脈內皮(CPAE)細胞購自美國典型培養物保藏中心(Rockville，MD)，并在補加20％DCS的199培養基中培養，所用細胞為第23代。
將所有內皮細胞系保存在1.5％明膠覆蓋的組織培養燒瓶(FalconLabware，Becton-Dickinson Company，Lincoln Park，NJ)中，并以1/3或1/4分離比傳代培養，所有4種細胞系的內皮性質已由DiI-Ac-LDL(Paesel and Lorei，Frankfurt Germany)吸收及用抗人von Willebrand因子的兔多克隆抗血清(Norclic Immunology，Tivburg，TheNetherlands)免疫染色預先證實。
實施例5在BME細胞中由單獨VEGF或VEGF-C或與bFGF組合刺激血管生成為測定體外血管生成誘導，如Montesano et al.，Cell 42469-477(1985)所述制備三維膠原凝膠，將8體積來自大鼠尾腱的I型膠原的溶液(大約1.5mg/ml)在冰上與1體積10倍極限必需培養基(Gibco)及1體積碳酸氫鈉(11.76mg/ml)迅速混合，分散于18mm組織培養孔中(Nunclon，A/S Nunc，Roskilde，Denmark)，并在37℃10分鐘使之膠凝。然后將牛微血管內皮(BME)細胞于500μl培養基中以0.5-1.0×105細胞/孔種植在膠原凝膠表面上，細胞生長至鋪滿(3-5天)，在此點將血清減至2％，并單用30ng/ml濃度的VEGF或0，1，3，10，30及100ng/ml濃度的VEGF-C或與10ng/ml牛成纖維細胞生長因子(bFGF)組合處理細胞單層。每2-3天更新一次培養基及處理一次，并在4天后固定培養物及照相。
在每孔中以在表層之下一致水平隨機選擇1.0mm×1.4mm測定區域，應用Nikon Diaphot TMD倒置光學顯微鏡，以105×放大通過相差顯微鏡照相，圖1a是未處理對照組的相差視圖，圖1b是用30ng/mlVEGF處理的樣品，膠原凝膠內形成的細胞索的結構十分清楚，焦點面在凝膠表面之下，圖1c示出用30ng/ml VEGF-C處理的膠原凝膠，圖1d示出只用10ng/ml bFGF處理的樣品，同樣可見清楚的侵襲應答，圖1e示出用30ng/ml VEGF及10ng/ml bFGF組合處理的凝膠，圖1f示出用30ng/ml VEGF-C及10ng/ml bFGF組合處理的凝膠，VEGF和bFGF或VEGF-C和bFGF共用而得的協同作用顯而易見。
如Pepper et al.，Biochem Biophys Res.Commun.，189824-831(1992)所述，通過檢測已顯而易見地以單細胞或細胞索形式穿過表面單層細胞的所有細胞結構的總附加長度定量細胞索狀侵襲。圖2a及2b示出的結果以平均總附加萌芽長度(μm)±s.e.m表示，且至少源自9個照相區域，即每種條件源自至少3個獨立試驗的每個試驗的三個區域，1P＜0.000，2P＜0.000(Student’s不成對t-檢驗)。用Student’s不成對t-檢驗對比平均值，顯著性p值＜0.05。為對比之目的，單獨使用30ng/ml VEGF以及30ng/ml VEGF與10ng/ml bFGF組合應用所得結果在每圖右側以條狀(V-A)顯示。
實施例6在BME細胞中通過VEGF-B與bFGF組合刺激血管生成重復實施例5的步驟，除了BME細胞單層用1，10及100ng/ml濃度的VEGF-B167單獨處理，用1，10，100ng/ml濃度的VEGF-B186單獨處理及與10ng/ml bFGF組合處理。VEGF-B較短的167個氨基酸形式缺失見于較長的186氨基酸形式的疏水區及O-糖基化位點。結果示于圖3，盡管在此實驗中單用VEGF-B不能產生可測的血管生成，但100ng/ml濃度的VEGF-B167及所有濃度的VEGF-B186當與10ng/ml bFGF組合時可產生不止加性的血管生成效應，為對比的目的，單用VEGF及VEGF-C及與10ng/ml bFGF組合應用的效果分別在每圖右側以V-A，V-C條示出。
實施例7在BAE細胞中單用VEGF-C及與bFGF組合刺激血管生成重復實施例5的步驟，除了在每孔凝膠表面種植牛主動脈內皮(BAE)細胞培養物，并單用VEGF-C及與1ng/ml和10ng/ml bFGF組合進行實驗，結果分別圖示于圖4a，圖4b及圖4c，可見不僅單用VEGF-C可在BAE細胞中刺激血管生成，當細胞培養物用VEGF-C和bFGF組合處理可觀測到不止加性的血管生成刺激效應。同樣用VEGF處理的結果在每圖右側以條狀(V-A)示出。
實施例8在BAE細胞中通過VEGF-B與bFGF組合刺激血管生成重復實施例6步驟，除了每孔凝膠表面種植牛主動脈內皮(BAE)細胞培養物，并應用3ng/ml濃度的bFGF，結果示于圖5a及5b。同樣，在此實驗中單用VEGF-B不能產生明顯血管生成效應，但當與bFGF組合時，VEGF-B167和VEGF-B186均產生不止加性(即協同)的血管生成效應，為了對比，單用VEGF(V-A)及VEGF-C(V-A)及與bFGF組合應用所得結果示于每圖的右側。
實施例9在BLE細胞中通過VEGF-C刺激血管生成將如實施例5所述用BLE細胞培養物種植三維凝膠形成的牛淋巴內皮(BLE)細胞單層用VEGF-C和/或VEGF處理，在處理4天后，如上述隨機選擇凝膠區域在單層表面之下一致水平照相。結合前述實施例所述定量內皮細胞侵襲，結果示于圖6，可見VEGF-C產生明確的血管生成活性刺激。
前述實施例5-9表明VEGF-B和VEGF-C的血管生成誘導活性可通過對內皮細胞的直接作用而介導，且在血管生成誘導方面，VEGF-B或VEGF-C和bFGF之間存在強協同效應。
如圖1c及2a所示，當將VEGF-C加至三維膠原凝膠上的BME細胞的鋪滿單層細胞時，由VEGF-C誘導的侵襲應答勉強可測，相反，圖4a和6示出，VEGF-C分別在BAE及BLE細胞中誘導明確的劑量依賴性侵襲應答，其伴隨著分支類管結構的形成，此結構通過相差顯微鏡聚焦于單層細胞表面之下可見。假定VEGF-C的Mr為42,000，當在等摩爾(0.6-0.7nM)濃度對比時，VEGF-C(30ng/ml)比VEGF(30ng/ml)效力稍低，是bFGF(10ng/ml)效力的一半(參見圖4a及4b，6及7)。
當與bFGF共用時，VEGF-C誘導一協同體外血管生成應答，因而，當加入至BME細胞時(其中單用VEGF-C效力很小或沒有)，VEGF-C增強bFGF的效力，如圖1f及2所示30ng/ml VEGF-C可增加效力最大至2.5倍。相似地，在BAE及BLE細胞中單用VEGF-C誘導血管生成活性，共用VEGF-C和bFGF誘導不止加性的應答，如圖4所示。
實施例10共用VEGF及VEGF-C共用VEGF及VEGF-C的效應也被評價，1p＜0.000，2p＜0.000(Student’s不成對t-檢驗)。在BME細胞中，其中只有VEGF誘導侵襲，發生應答(14天之后測定)只由于VEGF。在BLE細胞中，其中VEGF及VEGF-C均誘導侵襲，對共用30ng/ml VEGF及30ng/mlVEGF-C的應答基本上是加性的(見圖6)。在BAE細胞中，VEGF及VEGF-C單獨均誘導侵襲，應答(4天后測定)遠比加性高，見于圖7所示。
單用VEGF，VEGF-B及VEGF-C和組合應用的效應的三種方式對比示于圖8a和8b，圖8a示出三種細胞因子的單用效應，可見單用30ng/ml VEGF-B產生一可忽略的效應，單用VEGF(30ng/ml)產生一顯著的效應，但最大單用效應由30ng/ml VEGF-C產生。從圖8b可見，當VEGF和VEGF-B共用時，結果明顯高于其單獨應用的效應總和，同樣地，共用VEGF-B和VEGF-C明顯增強VEGF-C的膠原凝膠侵襲誘導活性，但最驚人的效應是30ng/ml VEGF與30ng/ml VEGF-C共用產生。
實施例11在BME和BAE細胞中通過VEGF-C刺激PA和PAI-1活性將制備自BME和BAE細胞的細胞提取物和培養物上清液暴露在0，1，3，10，30及100ng/ml濃度的VEGF-C中15小時，進行酶譜及反相酶譜分析。為對照的目的，分別暴露于30ng/ml VEGF及10ng/ml bFGF的BME及BAE細胞的測試培養基也被分析。用無血清培養基沖洗35mm明膠覆蓋的組織培養盤中的鋪滿單層內皮細胞二次，并加入在含Trasylol(200 KIU/ml)的無血清培養基中的各細胞因子。15小時后，制備細胞提取物，并如Vassalli et.al.，J.Exp.Med.1591653-68(1984)及Pepper et.al.，J.Cell Biol.，111743-755(1990)所述通過酶譜及反相酶譜加以分析。
圖9a示出來自BME細胞的細胞提取物的酶譜分析，圖9b示出在37℃溫育較長時期的相同酶譜，圖9c示出BAE細胞的培養物上清液的反相酶譜分析。
實施例12在BME及BAE細胞中通過VEGF-B制激PA和PAI-1活性重復實施例11步驟，除了培養物上清液取自暴露于0，1，3，10，30及100ng/ml濃度的VEGF-B，結果示于圖10a和10b。為對照的目的，暴露于30ng/ml VEGF及10ng/ml bFGF的結果也示出。
示于圖9a-9c的酶譜及反相酶譜結果表明VEGF-C在BME及BAE細胞中誘導uPA，tPA及PAI-1活性。相似地，示出圖10a和10b的酶譜及反相酶譜結果表明VEGF-B在內皮細胞中誘導uPA和PAI-1活性，uPA和PAI-1活性的誘導比約等摩爾濃度的VEGF所見的要小，酶譜結果也證實bFGF對tPA的表達沒有或有輕微作用。也測試了VEGF-C對BME細胞中PAI-1活性，BAE細胞中uPA活性及BLE細胞中tPA和PAI-1活性的作用，并發現比圖9a-9c所示效應低。
實施例13RNA制備，體外轉錄，及Northern印跡雜交將細胞因子加入鋪滿內皮單層細胞中，其中24小時前已加入新鮮完全培養基。根據廠商指導，應用Trizol試劑(Gibco BRL LifeTechnologies，Paisley，Scotland)在所示時間后制備總細胞RNA，將制備于暴露于VEGF-C或VEGF-8B(30ng/ml)0，1，2，9，24，48小時的BME細胞的鋪滿細胞單層的含總細胞RNA(5μ/泳道)的影印濾膜，用32P一標記的cRNA探針雜交。示出0，9，24及48小時的對照。加樣的RNA完整性及均勻性通過在轉移及交聯后用亞甲蘭染色濾膜確定，如圖11及12底部的28S和18S核糖體RNAs所示。如Pepper et.al.，J.Cell Biol.，111743-755(1990)所示進行Northern印跡，UV交聯及濾膜的亞甲蘭染色，體外轉錄，雜交及雜交后沖洗。從牛尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)[Kraetzschmar et.al.，Gene，125177-83(1993)]，牛u-PA受體(u-PAR)[Kraetzschmar et.al.，Gene，125177-83(1993)]，人組織型PA(t-PA)[Fisher et.al.，J.Biol Chem.，26011223-11230(1985)]及牛PA抑制劑-1(PAI-1)[Pepper et al.，J.CellBiol.，111743-755(1990)]cDNA，如Pepper et al.，J.Cell Biol.，111743-755(1990)和Pepper et al.，J.Cell Biol.，122673-684(1993)所述制備[32P]-標記的cDNA探針，可見VEGF-C在BAE細胞中提高uPA，tPA及PAI-1 mRNA的穩態水平。
示于圖11的Northern印跡分析表明，VEGF-C在BAE細胞中提高uPA，uPAR，tPA及PAI-1 mRNAs的穩態水平。PA，uPAR及PAI-1誘導的動力學是迅速(1小時內)且瞬間的(uPA和uPAR基線在3-9小時間達到，PAI-1在9-24小時間達到)。就uPA及uPAR而言，這與有關VEGF及bFGF的更延遲的增加的報道相反[見Pepperet.al.，J.Cell Biol.，111743-755(1990)；Mandriota et al.，J.Biol Chem.，2709709-16(1995)]。就PAI-1而言，結果類似于VEGF及bFGF。使用VEGF-B的試驗的Northem印跡實驗結果示于圖12。
細胞外蛋白酶活性的共誘導(其是以uPA合成的增加而表現)，及蛋白酶抑制作用的共誘導(其是以PAI-1合成的增加而表現)，是體內及體外血管生成的標志之一，并與“蛋白酶解平衡”理論相一致，該理論認為盡管蛋白酶為細胞遷移及形態發生所必需，但蛋白酶抑制劑也通過保護胞外基質免于非適合的破壞而發揮相當重要作用。
實施例16在VEGF-C及bFGF存在下，α2-抗纖溶酶對內皮細胞血管生成的抑制通過bFGF和VEGF-C以及0、1、3、10和30μg/ml的α2-抗纖溶酶共處理BME單層細胞4天，然后隨機選擇處理的凝膠區域在單層細胞表面之下一致水平照相，如實施例5中所述定量內皮細胞的侵襲，圖13示出結果。可見隨α2-抗纖溶酶濃度的提高，血管生成活性明顯降低，因而表明α2-抗纖溶酶通過以劑量依賴形式與VEGF-C和bFGF共處理可抑制血管生成的誘導。
前面所述及實施例已以例證闡述了本發明，但非限制本發明，由于本領域技術人員可以對實施方案包括的本發明的精神及實質方面加性適當修改，本發明應包括權利要求書范圍內的任何事情及其等價物。
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權利要求
1.在內皮細胞中刺激血管生成的方法，包括向所述細胞共同施用至少二種選自VEGF，VEGF-B，VEGF-C及FGF的細胞因子。
2.如權利要求1的方法，其中所述的內皮細胞選自微血管內皮細胞，動脈內皮細胞及淋巴內皮細胞。
3.如權利要求2的方法，其中所述的內皮細胞是牛內皮細胞。
4.如權利要求2的方法，其中所述的內皮細胞是人內皮細胞。
5.如權利要求1的方法，其中所述細胞以體外培養物在培養基中處理，且通過將細胞因子摻入培養基中而施用細胞因子。
6.如權利要求1的方法，其中細胞因子以純化蛋白質形式施用。
7.如權利要求1的方法，其中通過用至少一種載體轉染或轉化內皮細胞而施用細胞因子，所述載體包含與至少一種啟動子序列可操縱連接的編碼所述細胞因子的核苷酸序列。
8.如權利要求1的方法，其中所述的至少兩種細胞因子為VEGF-C及FGF。
9.如權利要求1的方法，其中所述的至少兩種細胞因子為VEGF-B和FGF。
10.如權利要求1的方法，其中所述的至少兩種細胞因子為VEGF及VEGF-C。
11.如權利要求1的方法，其中所述的至少兩種細胞因子為VEGF-B和VEGF-C。
12.如權利要求1的方法，其中所述的至少兩種細胞因子為VEGF及VEGF-B。
13.一種通過釋放協同組合的至少兩種選自VEGF，VEGF-B，VEGF-C及FGF的血管生成細胞因子的細胞調節內皮細胞血管生成的方法，所述方法包括中和所述至少兩種血管生成細胞因子中的一種。
14.如權利要求13的方法，其中所述中和是用血管生成細胞因子的抗體處理細胞而進行。
15.如權利要求14的方法，其中被中和的細胞因子是VEGF-C。
16.如權利要求14的方法，其中被中和的細胞因子是VEGF-B。
17.如權利要求14的方法，其中所述述抗體是單克隆抗體。
18.如權利要求13的方法，其中所述細胞是實體腫瘤細胞。
19.一種在VEGF-C及FGF存在下，通過內皮細胞抑制血管生成的方法，所述方法包括用抗纖溶酶處理所述細胞。
20.如權利要求19的方法，其中所述抗纖溶酶包括α2-抗纖溶酶。
21.如權利要求19的方法，其中所述內皮細胞選自微血管內皮細胞，動脈內皮細胞及淋巴內皮細胞。
22.一種刺激內皮細胞蛋白酶解活性的方法，包括用VEGF-B，VEGF-C或者VEGF-B或VEGF-C與至少一種選自VEGF及FGF的其它細胞因子組合處理細胞的步驟。
23.如權利要求22的方法，其中所述內皮細胞選自微血管內皮細胞，動脈內皮細胞及淋巴內皮細胞。
24.一種抑制患者內皮細胞通透、缺陷和/或轉移的方法，包括給所述患者施用有效抑制內皮細胞增殖量的VEGF-B或VEGF-C拮抗劑。
25.一種調節內皮細胞血管生成活性的方法，包括用含有VEGF-B或VEGF-C的反義核酸的載體轉染或轉化所述細胞。
全文摘要
血管內皮生長因子－B(VEGF－B)和血管內皮生長因子－C(VEGF－C)是血管生成多肽,已顯示特別是與bFGF組合時,VEGF－B和VEGF－C是體外血管生成性的。VEGF－C還在牛內皮細胞系中增加纖溶酶原激活物(PA)活性,這伴有PA抑制劑－1的相伴增加。向用bFGF和VEGF－C共處理的牛內皮細胞中加入α－2－抗纖溶酶能部分抑制膠原凝膠侵襲。
文檔編號C07K16/24GK1275050SQ98810009
公開日2000年11月29日 申請日期1998年8月14日 優先權日1997年8月15日
發明者邁克爾·S·派帕爾, 凱里·阿利塔羅, 烏爾夫·埃里克松 申請人:路德維格癌癥研究所, 赫爾辛基大學許可貿易公司, 日內瓦大學