專利名稱：治療脫發和其它疾病的藥物的制作方法
專利說明治療脫發的藥物 本發明涉及對脫發、婦女多毛癥或皮脂溢有優越治療效果或對前列腺癌引起的骨轉移有優越預防效果的新組合物。產生雄性征的激素，例如二氫睪酮(DHT)的過量刺激會引起雄激素-依賴性脫發(男性的典型脫發等)、普通粉刺、皮脂溢、婦女多毛癥、良性前列腺肥大和前列腺癌。
已發現甾族抗-產生雄性征的激素(如雌性激素雌激素)為能夠治療這些由這種產生雄性征的激素過度刺激引起的癥狀的化合物。然而，由于這些化合物本身具有激素的活性，它們易于產生不良作用。例如女性化。
一方面，也正在開發非甾族抗-產生雄性征的激素。盡管這些化合物沒有激素作用，但它們與天然雄激素競爭受體，因而具有不良作用，例如，子宮內男胎兒或男性的女性化，或啟動反饋機制而過度刺激睪丸。
由于5α還原酶作用于睪酮而形成二氫睪酮(DHT)，假如抑制5α還原酶的活性，則可期望治療因產生雄性征的激素過度刺激所致的癥狀而無所述副作用。
其次，病人(かかゐ人)5α還原酶包括兩種同功酶。已闡明I型5α還原酶存在于面部和皮膚的皮脂腺內，II型5α還原酶分布于前列腺中。
由于I型5α還原酶存在于毛囊中，可以期望強烈抑制該酶將減輕男性的典型脫發。然而，用為雄性型脫發動物模型的猴評價I型5-α-還原酶的選擇性抑制劑MK386的效果。結果，血液中的DHT水平顯示有30-40％的降低，但MK386的效果尚未確定(J.Invest.Dermatol.，104，658(1995))。
給予動物模型劑量1mg/kg為II型5α-還原酶選擇性抑制劑的非那甾胺可降低血液中60-70％的DHT濃度，然而意外地發現該藥對治療脫發有效(J.Clin.Endocrinol.Metabol.，79，991(1994))。
事實上，通過臨床試驗已認識到非那甾胺對人脫發的療效。抑制參與減少毛囊體積的因子產生這種療效，并推測這種作用取決于血液中的DHT水平。此外，由最近的臨床結果發現，降低血液中的DHT水平的強度主要取決于對II型5α還原酶抑制活性的強度，但兼有對I型5α還原酶的抑制活性可能獲得更好的結果(J.Clin.Endocrinol.Metabol.，81，2942-2947(1996))。
同樣，在婦女多毛癥或皮脂溢的治療中，不只對II型5α-還原酶有抑制活性、而且兼有對I型5α-還原酶抑制活性的化合物，被認為是優越的藥物。因此，為發現更有效的用于脫發、婦女多毛癥或皮脂溢的藥物，迫切需要比非那甾胺更有效地抑制II型5α-還原酶且同時強烈抑制I型5α-還原酶的化合物。
此外，II型5α-還原酶分布于前列腺中，所以對II型5α-還原酶具有強烈抑制活性的化合物有效用于前列腺癌的治療，但最近發現，在前列腺癌發展和骨轉移期間，I型5α-還原酶為活性形式[J公開特許平8-277220號公報]。因此，如上所述的對兩種類型酶的抑制性化合物也期望用于預防和治療前列腺疾病。
再者，已公開對前列腺酶具有很強抑制活性的本發明的化合物(1)[公開特許平5-32693號公報]。有理由期望對II型5α還原酶的抑制活性來自對前列腺酶的抑制活性。然而，不可能期待化合物(1)對I型5α-還原酶有抑制活性，因為I型5α-還原酶并不分布于前列腺中。多年來，本發明人對有睪酮5α-還原酶抑制活性的衍生物的合成和所述衍生物的藥理活性進行了多年廣泛的研究。結果發現有些具有特異結構的化合物強烈抑制II型5α-還原酶，而且還強烈抑制I型5α-還原酶，因而它們顯示出很強的降低血中DHT水平的活性，而這種活性在目前已知的II型5α-還原酶選擇性抑制劑中尚未獲得，并且它們可對脫發、婦女多毛癥或皮脂溢有優越治療效果或對由前列腺癌引起的骨轉移有優越預防效果，由此完成了本發明。
本發明的目的提供對脫發、婦女多毛癥或皮脂溢有優越治療效果或對由前列腺癌引起的骨轉移有優越治療效果的新組合物。本發明的另一目的在于提供所述化合物在制備用于治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢或用于預防由前列腺癌引起的骨轉移的組合物中的用途。
此外，本發明的再一目的是提供治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢或預防由前列腺癌引起的骨轉移的方法，該方法包括給予溫血動物有效治療量的所述化合物。
用于治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢或用于預防由前列腺癌引起的骨轉移的本發明的新組合物，包含作為活性成分的、由下述式(I)表示的化合物或其藥學上可接受的鹽或其它衍生物。優選含有N-[1-甲基-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-氧代-4-氮雜-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺作為活性成分。
本發明的新使用方法是使用下述式(I)表示的化合物或其藥學上可接受的鹽或其它衍生物以制備用于治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢或用于預防由前列腺癌引起的骨轉移的組合物，優選使用N-[1-甲基-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-氧代-4-氮雜-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺制備所述組合物。
(其中R1和R2各自可以相同或不同且各自表示氫原子、羥基或低級烷氧基。)在上述式(I)中，術語“低級烷氧基”意指直鏈或支鏈C1-6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、異丙氧基、正-丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正-戊氧基、異戊氧基、2-甲基丁氧基、新戊氧基、正-己氧基、4-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3，3-二甲基丁氧基、2，2-二甲基丁氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，2-二甲基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2，3-二甲基丁氧基，其中優選直鏈和支鏈C1-4烷氧基，且更優選甲氧基。
術語“脫發”意指男性的典型脫發和女性脫頭發。
由于化合物(I)可以形成鹽，術語“藥學上可接受的鹽”意指可以轉化為其鹽的本發明化合物(I)的鹽，這樣的鹽的實例優選包括堿金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽和鋰鹽；堿土金屬鹽，如鈣鹽和鎂鹽，及金屬鹽，如鋁鹽、鐵鹽和鋅鹽。
當本發明的化合物(I)處于大氣中時，它可以從中吸收水分、吸收的水分附著于其上，形成水合物。這樣的物質也包括在本發明中。
本發明的化合物(I)可以通過下面所示的方法制備。
(上式中R1和R2如上所述)。
在方法A中，通過羧酸衍生物與胺衍生物的縮合制備化合物(I)。
在步驟A1中，采用化合物(II)或其反應性的衍生物和化合物(III)制備化合物(I)。以用于肽合成的常規方法，例如，疊氮化物法，活化酯法，混合酸酐法或縮合法，進行該步驟。
在這些方法中，疊氮化物法包括用胺化合物(III)處理疊氮化物。所述疊氮化物通過亞硝酸與氨基酸的酰肼反應而制備，所述酰肼通過化合物(II)或其酯與肼于室溫下，在惰性溶劑(如二甲基甲酰胺)中反應而制備。
可使用的亞硝酸化合物的實例可以包括堿金屬亞硝酸鹽(例如亞硝酸鈉)和亞硝酸烷基酯(如亞硝酸異戊基酯)。
該反應優選在惰性溶劑中進行，可使用的溶劑的實例包括酰胺類，例如二甲基甲酰胺和二甲基乙酰胺；亞砜類，例如二甲基亞砜；以及吡咯烷酮，例如N-甲基吡咯烷酮。此外，該方法的兩步反應通常在一種反應液中進行。該反應的溫度范圍在第一步為-50℃-0℃，而在第二步為-10-10℃。反應所需的時間范圍在第一步為5分鐘-1小時，而在第二步為10小時-5天。
所述活性酯法通過化合物(II)與活性酯化劑的反應形成化合物(II)的活性酯，然后使生成的化合物與胺化合物(III)反應來進行。
兩個反應優選在惰性溶劑中進行，可使用的溶劑的實例可以包括鹵代烴，例如二氯甲烷和氯仿；醚類，例如乙醚和四氫呋喃；酰胺類，如二甲基甲酰胺和二甲基乙酰胺以及腈類，例如乙腈。
可使用的活性酯化劑的實例包括N-羥基化合物，例如N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑、N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰胺和二硫化物，例如，二吡啶基二硫化物。活性酯化反應適合在縮合劑，例如，二環己基碳二亞胺、羰基二咪唑或三苯膦存在下進行。
該酯化反應溫度范圍為-10-100℃，活性酯化合物與胺(III)的反應在大約室溫下進行。所述反應所需的時間范圍對于兩個反應均為30分鐘-80小時。
在活性酯與胺的反應中，也可以加入4-二甲基氨基吡啶等。
所述混合酸酐法通過在制備化合物(II)的混合酸酐后與胺反應來進行。
制備混合酸酐的反應通過在惰性溶劑(例如前述鹵代烴、胺、醚)中使化合物(II)與形成混合酸酐的物質反應而進行。這樣的物質的實例包括低級(C1-C4)烷基碳酸酯，例如氯代碳酸乙酯、氯代碳酸異丁酯；低級鏈烷酰基鹵化物，例如新戊酰氯；(低級烷基)-或二芳基-氰基磷酸，例如，二乙基氰基磷酸、二苯基氰基磷酸；或磺酰鹵，例如，2，4，6-三異丙基苯磺酰氯，對甲苯磺酰氯或甲磺酰氯等。
該反應適合在有機胺如三乙胺或N-甲基嗎啉存在下，于-10℃-50℃進行。該反應所需的時間范圍為30分鐘-20小時。
混合酸酐和胺(III)的反應適合在上面例舉的有機胺存在下，在惰性溶劑(例如上面例舉的鹵代烴、酰胺或醚)中進行。該反應溫度范圍為0℃-80℃，該反應所需的時間范圍為1小時-48小時。
或者，該反應也可以在化合物(II)、化合物(III)和形成相應的混合酸酐(無需分離混合酸酐)的混合物中進行。
所述縮合法通過使化合物(II)與胺(III)在縮合劑(例如，二環己基碳二亞胺、羰基二咪唑、1-甲基-2-氯代-碘化吡啶鎓-三乙胺)存在下直接反應來進行。該反應在類似于上述制備活化酯的反應中所用的條件下進行。
當R1和R2含有保護羥基時，該保護基團可以用常規方法除去。
此外，原料化合物(II)或其活性酯是已知的化合物或通過本領域技術人員熟知的方法制備[例如，J.Med.Chem.，27，1690(1984)；J.Med.Chem.，29，2298(1986)]。
化合物(III)是已知的化合物或通過本領域技術人員制備[例如，Synthesis，593(1976)；J.Org.Chem.，36，305(1971)；Angew.chem.，82(1970)；Synthesis，24(1978)；Synthetic Commun.，18，777(1988)；Synthetic Commun.，18，783(1988)；Organic Reactions，3，337(1946)；Org.Synthesis，51，48(1971)；Tetrahedron，30，2151(1974)；J.Org.Chem.，37，188(1972)；]。例如，式H2N-C(Me)(Me)-Ph(R1)(R2)的化合物為本發明的原料化合物，它可如下面反應流程所示，用Synthesis，第24頁(1978)中所述的方法，通過Grignard反應、羥基的疊氮化物反應以及隨后的還原反應來制備
(其中，R1和R2如上所述，Me表示甲基，Ph表示苯基)。
化合物(I)可以以片劑、膠囊、顆粒、粉末、糖漿等的形式口服給予，以乙醇溶液、清潔泡沫膠、清潔霜、皮膚用凝膠、皮膚洗劑、洗發凝較、洗發膏等局部給予。
口服藥用制劑通過本領域技術人員熟悉的方法，采用下列添加劑制備賦形劑(實例包括有機賦形劑，如糖衍生物，例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇；淀粉衍生物，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、α-淀粉、糊精和羧甲基淀粉；纖維素衍生物，如結晶纖維素、低-取代的羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣和內交聯羧甲基纖維素；阿拉伯膠；葡聚糖；pullulan；無機賦形劑，例如，硅酸鹽衍生物如輕硅酸酐、合成的硅酸鋁和硅酸鋁鎂；磷酸鹽如磷酸鈣；碳酸鹽如碳酸鈣和硫酸鹽如硫酸鈣)、潤滑劑(實例包括硬脂酸，硬脂酸的金屬鹽，如硬脂酸鈣和硬脂酸鎂；滑石；膠態硅膠，蠟如蜂蠟(ビ-ガム)和鯨蠟；硼酸；己二酸；硫酸鹽如硫酸鈉；甘醇；富馬酸；苯甲酸鈉；DL亮氨酸；脂族酸的鈉鹽；十二烷基硫酸鹽，如十二烷基硫酸鈉和十二烷基硫酸鎂；硅酸，如硅酸酐和硅酸水合物；以及上面例舉的淀粉衍生物)、粘合劑(實例包括聚乙烯吡咯烷酮、Macrogol和與上例舉的賦形劑類似的化合物)、崩解劑(實例包括與上例舉的賦形劑同樣的化合物和化學改性淀粉和纖維素如sodiumcross carmellose、羧甲基淀粉鈉和交聯聚乙烯吡咯烷酮)、穩定劑(實例包括對氧基苯甲酸酯，例如對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯；醇如氯代丁醇、芐醇和苯乙醇；氯芐烷銨；酚衍生物如苯酚和甲酚；乙基汞硫代水楊酸鈉；脫氫乙酸和山梨酸)、矯味劑(實例包括普通使用的甜味劑、酸化劑和香料)和/或稀釋劑等。
局部藥用制劑通過將示例性化合物加入本領域技術人員熟知的基質中制備，這些基質有，例如，懸浮劑(實例包括阿拉伯膠，黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、藻酸鈉和膨潤土)、乳化劑(實例包括三乙醇胺、十二烷基硫酸鈉、脫水山梨醇倍半油酸酯、多乙氧基醚80和硬脂酸聚烴氧基酯40)、潤濕劑(實例包括山梨醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇和甘油)、防腐劑(實例包括對氧基苯甲酸甲酯、對氧基苯甲酸乙酯、對氧基苯甲酸丙酯和對氧基苯甲酸丁酯)或溶劑(實例包括水；醇如乙醇、異丙醇、丙二醇、十六烷醇和異硬脂醇；烴如天然油脂、蠟和液體石蠟；脂族酸如硬脂酸、異硬脂酸、油酸和亞油酸；和酯如肉豆蔻酸異丙酯)或其混合物。
口服給予或局部給予化合物(I)的量將根據患者的病情、年齡等變化。最好平均給予0.001mg/kg體重(優選0.01mg/kg體重)為下限和10mg/kg體重(優選0.5mg/kg體重)為上限的一個劑量，根據癥狀，可以平均每日給予1至數個劑量。本發明此后將通過試驗實施例、參考實施例和制備實施例更具體地說明本發明。對人I型和II型5α-還原酶的抑制活性的測定方法(1)重組人I型和II型5α-還原酶的制備a)克隆重組人I型和II型5α-還原酶的2cDNA為了通過聚合酶鏈式反應(PCR)克隆人I型和II型5α-還原酶的整個翻譯區，采用Oligo 1000 DNA合成儀(BECKMAN Co.，Ltd.的產品)，根據發表的報告中所述的人I型和II型5α-還原酶的堿基序列(參見Stefan.A等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，3640-3644(1990)，Stefan.A等，Nature，354，159-161(1991))，合成Sequence ID.No.1、2、3和4所示的引物。I型有義引物5’-CCAGCCCTGGCGATGGCAAC-3’(序列ID 1號)I型反義引物5’-CAGAGCTTGAAATTCTGACCTGTTA-3’(序列ID2號)II型有義引物5’-ACGGCGCGATGCAGGTTCAGTG-3’(序列ID 3號)II型反義引物5’-AGCATTGTGGGAGCTCTGCTCCT-3’(序列ID 4號)作為PCR方法的模板，采用人肝QUICK-CloneTMcDNA和人前列腺QUICK-CloneTMcDNA(CLONTECH Laboratory.Inc.的產品)。
用1μl cDNA、5μl所附的PCR緩沖液、1μl 10mM dNTP混合溶液、濃度為20μM的上述有義引物和反義引物各1μl、1μl 5單位/mlTaKaRa Taq聚合酶和40μl蒸餾水進行PCR，反應體積為50μl。PCR的條件為于94℃為20秒，55℃為1分鐘，并于72℃1分鐘，進行25個循環，最后于4℃貯存。當將一份約5μl PCR反應混合物經0.8％瓊脂糖凝膠電泳時，發現對應于上述文獻中期望的還原酶的條帶(I型1021bp，II型812bp)。因此，將PCR反應混合物的剩余部分經5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化。用TA CloningTMKit(InvitrogenCorporation的產品)對純化的cDNA片段進行亞克隆。通過染料終止子方法對亞克隆的I型和II型cDNA的每一個全堿基序列進行分析，已證實它們與所報道的序列相同。將已證實堿基序列的I型和II型cDNA插入表達載體中，以使其表達，然后提供使用。
b)人I型和II型表達質粒的制備通過TA CloneTMKit所附說明書的方法，用人I型或II型表達質粒pME18sH5R1或pME18sH5R2轉化大腸桿菌株DH5(supE44、hsdR17、recA1、endA1、gyrA96、thi-1、relA1)(購自東洋紡織株式會社)轉化。將轉化子的約10μl原代培養液接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的50ml 2×LB培養基(20g，細菌培養用胰蛋白胨(DIFCOLabs的產品)、10g細菌培養用酵母膏(DIFCO Labs的產品)、10g氯化鈉和2g葡萄糖/1L)中，接著于37℃培養約40小時。離心分離(5000rpm，10分鐘)該培養液，回收細胞。采用QIAGEN Plasmid Maxi試劑盒(Qiagen Inc.的產品)，由所得的細胞制備pME18sH5R1或pME18sH5R2。
c)人I型和II型蛋白的表達和制備通過電穿孔方法(Gene PulserTM；Bio-Rad Laboratories)，960μF，200Ω，300V)將10-20μg pME18sH5R1或pMEpME18sH5R2引入2×106/0.5ml COS-1細胞中。引入后，收集培養約48小的細胞。通過POLYTRON(KINEMATICA GmbH的產品)將細胞在置于冰浴上的緩沖液(20mM磷酸鉀，pH7.4，10％甘油，0.33M蔗糖，50μM還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和0.001％苯甲基磺酰氯(PMSF))中勻漿，然后離心(10000×g，1小時)。將沉淀物再次懸浮于緩沖液中并于-80℃貯存。該懸浮液用作I型或II型5α-還原酶。
(2)蛋白含量的測定通過Bradford方法(Bio-Rad的蛋白測定，Biorad)，采用牛γ-球蛋白(牛cohn組分II，Sigma的產品)作為標準品測量蛋白含量。
(3)5α-還原酶活性的測定用14C睪酮(Amersham)轉化為14C 5α-二氫睪酮的轉化率作為指標測定5α-還原酶活性。將化合物溶解并稀釋于二甲亞砜(DMSO)中。向每個試管中傾入5μl份所得的溶液，同時對照組傾入5μl單純的DMSO。將含有10-25μl重組人I型或II型5α-還原酶的0.5ml酶反應緩沖液(I型，含有1μM14C睪酮、1mM二硫蘇糖醇和0.5mM NADPH的40mM磷酸鈣緩沖液(pH7.5)；II型，含有1μM14C睪酮、1mM二硫蘇糖醇和1mM NADPH的100mM tris-檸檬酸緩沖液(pH5.5))加入各試管中，接著于37℃保溫15分鐘。保溫后，加入2ml乙酸乙酯(含睪酮、5α-二氫睪酮和雄烯二酮，各10μg)并將所得的混合物充分攪拌，由此終止所述酶反應，將甾族化合物提取到乙酸乙酯相中。然后，通過離心(3000rpm 5分鐘)使乙酸乙酯相與水相分開。將乙酸乙酯相轉移到另一試管中，接著在氮氣流下蒸發至干。用0.8ml乙醚洗滌試管壁，由此所述甾族化合物被洗脫至試管底部。再次蒸發至干后，將甾族化合物溶于40μl乙酸乙酯中并將所得溶液在薄層板(LK6DF硅膠板，Whatman的產品)上點樣。將該薄層板用1∶1乙酸乙酯和環己烷的混合物展開兩次，以分離含甾族化合物的各部分。含甾族化合物的各部分的放射性用生物顯象分析儀(Fuji Film Co.，Ltd.)測定。對還原酶的抑制活性用50％抑制濃度(IC50)表示。
所述IC50)值如下進行計算以對照組的轉化率為100％，計算還原酶活性的抑制率(100-(加入測試化合物的轉化率÷對照組的轉化率)×100)(％)。制備化合物的稀釋系列并通過上述方法計算每種濃度的抑制率。采用抑制率降至約20％-約80％范圍內的稀釋濃度，設定測試化合物濃度的log值為X，抑制率為Y，通過最小二乘方方法計算回歸直線。從獲得的回歸直線，計算產生50％抑制率所需的化合物濃度并將該濃度指定為IC50。
I型的IC50值示于表1中，同時型II的IC50值示于表2中。(I型)化合物 IC50化合物I 4.9×10-8M非那甾胺7.0×10-7M[表2](II型)化合物 IC50化合物I 3.2×10-9M非那甾胺1.5×10-8M[試驗實施例2]降低人血中二氫甾酮水平的作用口服給予人體1-10mg/人的化合物I或5mg/人的非那甾胺并測定血中二氫睪酮(DHT)和睪酮(T)的濃度。計算它們在給藥前(pre)和時間推移(10和18小時)后的比率(DHT/T)，從中計算(DHT/T)/(DHT/T)pre。結果列于表3(人數n＝4-6)。10小時后 18小時后化合物I(1mg) 0.5180.525化合物I(5mg) 0.4110.376化合物I(10mg)0.2790.284非那雄酮 0.5530.461用人毛乳頭細胞進行試驗毛乳頭為少量存在于毛囊中的細胞團。目前，推測毛乳頭為形成毛發生長基質的干細胞。發現該細胞含有5α-還原酶活性。因此，通過用這種細胞培養系統有可能進行5α-還原酶抑制劑的試驗。通過Messenger，A.G.(人發毛囊皮膚毛乳頭細胞的培養，Br.J.Dermatol.，110，685-989(1984))和Itami，S等，(“培養的人胡須真皮毛乳頭細胞與網狀真皮成纖維細胞相比的5α-還原酶活性”)J.Invest Dermatol.，94，150-152(1990)的方法，進行毛乳頭細胞的分離和培養。使用胡須毛乳頭細胞和兩個受試者的頭部枕區發根用于試驗。在這些細胞經傳代培養4-6代后，在匯合狀態下進行所有的試驗，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌成為匯合的細胞，經乳膠刮剝離，然后收集到離心管中。將所述細胞于4℃ 1500rpm離心10分鐘。將獲得的沉淀物懸浮于緩沖液(含250mM蔗糖，1mM氯化鎂和2mM氯化鈣的20mM tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)中，用25G針將該懸浮液抽吸注射10次。然后用特氟隆-玻璃勻漿器勻漿該懸浮液得到破碎細胞液。為了確定5α-還原酶在細胞中的定位，將所得的破碎細胞液經800×g離心10分鐘，由此得到粗核部分。將上清液于10,000g離心15分鐘，由此得到線粒體部分。將該上清液進一步以100,000×g離心60分鐘，由此得到微粒體部分和細胞溶膠部分。將每一部分的沉淀物洗滌兩次，接著再懸浮。
在常規的保溫條件下，將50μl破碎細胞液加入到含有50nM[3H]-睪酮和1mM NADPH的100mM檸檬酸鈉(pH5.5)或100mM tris-鹽酸(pH7.5)中得到100ml溶液。根據蛋白含量，將50-100mg量的該破裂細胞溶液加入各管中。該反應在37℃進行30分鐘。在保溫期間，該反應隨時間的推移而進行。為找到適合于該反應的最適pH值，使用pH4.5-6.5的檸檬酸緩沖液，使用pH7.0-9.0的tris-鹽酸緩沖液，通過Lowry等(“用福林酚試劑的蛋白質測定”，J.Biol.Chem.193，265-275(1951))的方法測定蛋白含量。
保溫完成后，通過加入4倍量含110mg每種載體甾固醇的氯仿-甲醇(2/1v/v)使反應終止。根據Gomez等的方法(“人皮膚睪酮-4-14C和D-二氫睪酮-3，17-二酮-4-14C的體外新陳代謝”，Biochem.，7，24-32(1968))，經薄層層析分析提取的甾固醇。經重結晶提高每種甾固醇的純度。用所形成的二氫睪酮的量指示5α-還原酶活性。該酶抑制作用表示為抑制百分率(100-(加入測試化合物的轉化率÷對照組的轉化率)×100)(％)，設定對照組的轉化率為100％。
發現式(I)化合物顯示出卓越的5α-還原酶抑制活性。在斷尾猴(ベニガオザル)中預防脫毛發和生發(trichogenous)作用(1)使斷尾猴罹患與男性典型脫發類似的脫發。斷尾猴的脫發在青春期(約4歲)后即開始發生。幾乎所有的雄性和雌性斷尾猴都患有脫發癥，而且這主要取決于雄激素的水平。由此，斷尾猴為男性的典型脫發的有用的動物模型。
將雄性斷尾猴(3-16歲)分組，每組含有3-6只動物。將斷尾猴的頭皮清楚地劃分為額區和枕區，其中一區用，例如中國墨汁標記。剃去標記區的頭發。制備各種劑量和各種組合形式的測試化合物的溶液或粉末，將這些測試化合物每日一次或二次均勻地涂抹于剃去頭發的頭皮區，或者口服給予。將同樣量的溶劑(如二甲亞砜等)、霜(皮膚給予)或安慰劑(口服)給予對照動物。每4-6周剃去標記區的頭發并對剃去的頭發稱重。給藥期間為6周至兩年。非那甾胺為5α-還原酶抑制劑并已知可預防上述動物的脫發。提供非那甾胺(口服給予)作為對照藥物進行試驗。
在治療開始和結束時切取頭皮(4mm穿孔)，作為活組織檢查樣品。通過樣品的5α還原酶活性分析和組織檢查，判斷有無脫發。
發現式(I)化合物對脫發有效。在斷尾猴中預防脫毛發和生發作用(2)將雄和雌性斷尾猴(3-16歲)分組，每組含有3-6只動物。制備各種劑量和各種組合形式的測試化合物的溶液或粉末并每日一次將其均勻地涂抹于額區的頭皮上，或者口服給予。給藥期間為6周至兩年。將同樣量的溶劑(如二甲亞砜等)、霜(皮膚給予)或安慰劑(口服)給予對照動物。每個月觀察額區頭發的情況，并從頭發的直徑、密度、發原區和生發時間評價測試化合物的作用。同時拍照并從照片判斷整體效果。在該試驗開始前以及試驗開始后3個月和6個月切取頭部額區的皮膚部分(4mm圓徑)，作為活組織檢查樣品，并通過組織學分析研究對發根發育階段的作用。
發現式(I)化合物對脫發有效。采用有細毛的大鼠的試驗有細毛的大鼠為顯示發根皮脂腺細胞的增生和分泌異常活躍的雄激素-依賴性模型動物。它的發根在未成熟階段(約4周齡)主要為生長階段的發根。但性成熟(約8周齡)時，處于靜止期的發根增加。因此，它在研究對毛發發育的影響方面用作模型動物。
將有細毛的大鼠(雄性，3-12周齡)分組，每組含有5-6只大鼠。制備各種劑量和各種組合形式的測試化合物的溶液或粉末，并每日一次將其均勻地涂抹于背部皮膚上，或者口服給予。給藥期間為4-8周。將同樣量的溶劑(如二甲亞砜)、霜(皮膚給予)或安慰劑(口服)給予對照動物。在完成給藥后的第二天，對這些大鼠實施斷頭術。切取背部皮膚組織(直徑為4mm的圓形)。通過組織學檢查研究對皮脂腺和發根的毛發發育階段的作用。
發現式(I)化合物對皮脂溢和脫發有效。
此外，在上述試驗實施例中，可以根據文獻(B de Brouwer等，Br.J.Dermatol.，137，699-702(1997))所述的方法，使用裸鼠，對毛發生長進行評價。N-[1-甲基-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-氧代-4-氮雜-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺向30ml無水甲苯中，順序加入1.0g 3-氧代-4-氮雜-5α-雄-1-烯-17β-甲酸、1.6g三苯膦和1.4g 2，2-二吡啶基二硫化物。于室溫下攪拌生成的混合物過夜。使該反應混合物經35g硅膠柱層析，用丙酮-二氯甲烷(1∶9至1∶1)洗脫，得到1.11g 2-吡啶基硫酯化合物。向30ml無水二氯甲烷中，順序加入同樣合成的5.0g 2-吡啶基硫酯化合物和5.0g 1-(4-甲氧基苯基)-1-甲基乙胺并于室溫下攪拌生成的混合物3天。該反應混合物用100ml二氯甲烷稀釋后，用1N鹽酸、水、碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水順序洗滌該混合物，經硫酸鎂干燥并減壓濃縮。殘留物經15g硅膠柱層析，用丙酮-二氯甲烷(1∶9至1∶1)洗脫，得到5.2g標題化合物。NMR譜(CDCl3)δppm0.68(3H，s)，0.98(3H，s)，0.90-2.20(16H，m)，1.70(3H，s)，1.72(3H，s)，3.35(1H，t，J＝9Hz)，3.80(3H，s)，5.48(1H，br.)，5.76(1H，br.)，5.83(1H，d，J＝10Hz)，6.82(1H，d，J＝10Hz)，6.88(2H，d，J＝9Hz)，7.32(2H，d，J＝9Hz)。IR譜Vmaxcm-1(KBr)2969，2938，1672，1599，1514，1455，1248，1181，1035，825。[制劑實施例1]片劑(5-mg片劑)化合物 基本配方(mg/片)參考實施例1的化合物 5羥丙基甲基纖維素 15羧甲基淀粉鈉 9.5結晶纖維素30.5sodium cross carmellose 20乳糖(過篩后) 38.75黃色三氧化二鐵0.05硬脂酸鎂(過篩后) 1.2片120.0[制劑實施例2]醇溶液參考實施例1的化合物 15.0(wt.％)水45乙醇 40[制劑實施例3]清潔泡沫參考實施例1的化合物 10.00(wt.％)水70.439春黃菊0.01Aloe vera膠 0.01尿囊素0.001三乙醇胺 0.02METHOCEL(METHOCELTM40-100(Dow)) 1.50甘油 3.00十二烷基硫酸鈉15.00維生素A油 0.01維生素E油 0.01[制劑實施例4]清潔霜參考實施例1的化合物 5.0(wt.％)合成蜂蠟 14.0PPG2十四烷基丙酸酯 5.0羊毛脂醇 0.5礦物油36.0對羥基苯甲酸丙酯 0.15硼砂 1.0水38.35PPG聚乙二醇聚丙二醇[制劑實施例5]皮膚用凝膠參考實施例1的化合物 2.00(wt.％)PPG2十四烷基醚丙酸酯 45.00PPG2十六烷基醚 5.00C18-C36甘油三酯 4.00肉豆蔻酸酸十四烷基酯 3.00三(二十二烷酸)甘油酯 2.00環甲基硅酮34.00聚乙烯5.00[制劑實施例6]皮膚洗劑參考實施例1的化合物 1.0(wt.％)oleth-3磷酸二乙醇胺 1.0乳化蠟2.0C18-C36蠟脂族酸 1.0PPG2十四烷基丙酸酯 5.0甘油 3.0三乙醇胺 0.5水86.5[制劑實施例7]洗發用凝膠參考實施例1的化合物 2.0(wt.％)異丙醇胺十二烷基硫酸酯81.5椰子油脂族酸二乙醇酰胺8.0C18-C36釬焊酸甘油酯 4.5PPG5 ceteth-10磷酸酯 4.0[制劑實施例8]洗發膏參考實施例1的化合物 0.1(wt.％)十二烷基硫酸鈉65.0三(二十二烷酸)甘油酯 2.0水解膠原 1.0
月桂酸二乙醇酰胺 5.0水26.9[工業適用性]非那甾胺為一種在歐洲市場作為治療良性前列腺肥大的藥物已有出售的化合物，它作為用于脫發的藥物，目前正處于臨床試驗階段。
本發明的式(I)化合物及其有關化合物對II型同功酶有比非那甾胺更強的抑制作用。它們對I型同功酶也有強的抑制作用。它們具有比非那甾胺更強的降低血中DHT的作用和低的毒性，因而作為用于治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢的組合物或用于預防前列腺癌引起的骨轉移的組合物是有用的。[序列表ID.1號]合成序列的描述基于編碼I型5α還原酶的cDNA序列設計的引物。合成序列的描述基于編碼I型5α還原酶的cDNA序列設計的引物。合成序列的描述基于編碼II型5α還原酶的cDNA序列設計的引物。合成序列的描述基于編碼II型5α還原酶的cDNA序列設計的引物。
序列表<110>Sankyo company，Limited<120>用于治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢的組合物<130>FP-9820<140><141><150>JP平9-203136<151>1997-07-29<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述基于編碼1型5α-還原酶的cDNA序列設計的引物<400>1ccagccctgg cgatggcaac 20<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述基于編碼1型5α-還原酶的cDNA序列設計的引物<400>2cagagcttga aattctgacc tgtta 25<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述基于編碼2型5α-還原酶的cDNA序列設計的引物<400>3acggcgcgat gcaggttcag tg22<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述基于編碼2型5α-還原酶的cDNA序列設計的引物<400>4agcattgtgg gagctctgct cct 2權利要求
1.用于治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢的組合物或用于預防前列腺癌引起的骨轉移的組合物，它包括作為活性成分的由下式(I)表示的化合物
(其中R1和R2彼此可以相同或不同且各自表示氫原子、羥基或低級烷氧基)或其藥學上可接受的鹽或其它衍生物。
2.用于治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢的組合物或用于預防前列腺癌引起的骨轉移的組合物，它包括作為活性成分的N-[1-甲基-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-氧代-4-氮雜-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺。
3.根據權利要求1或權利要求2的用于治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢的組合物。
4.根據權利要求1或權利要求2的用于治療脫發的組合物。
5.根據權利要求1或權利要求2的用于治療婦女多毛癥的組合物。
6.根據權利要求1或權利要求2的用于治療皮脂溢的組合物。
7.根據權利要求1或權利要求2的用于預防前列腺癌引起的骨轉移的組合物。
8.由下式(I)表示的化合物、其藥學上可接受的鹽或其它衍生物
(其中R1和R2彼此可以相同或不同且各自表示氫原子、羥基或低級烷氧基)在治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢的組合物或預防前列腺癌引起的骨轉移的組合物制備中的用途。
9.N-[1-甲基-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-氧代-4-氮雜-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺在治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢的組合物或預防前列腺癌引起的骨轉移的組合物制備中的用途。
10.根據權利要求8或權利要求9的在制備用于治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢的組合物中的用途。
11.根據權利要求8或權利要求9的在制備用于治療脫發的組合物中的用途。
12.根據權利要求8或權利要求9的在制備用于治療婦女多毛癥的組合物中的用途。
13.根據權利要求8或權利要求9的在制備用于皮脂溢的組合物中的用途。
14.根據權利要求8或權利要求9的在制備用于預防前列腺癌引起的骨轉移的組合物中的用途。
全文摘要
具有下述式(Ⅰ)的化合物:為有效治療脫發、婦女多毛癥或皮脂溢的新組合物或具有預防前列腺癌引起的骨轉移作用的新組合物,其中R
文檔編號C07J73/00GK1271285SQ98809366
公開日2000年10月25日 申請日期1998年7月27日 優先權日1997年7月29日
發明者小島孝一, 浜田孝和, 吉岡史朗 申請人:三共株式會社