專利名稱：環戊烯酮的α－型晶體的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有生理活性例如抗癌活性、并可用在藥物、食品和飲料領域中的反-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮的α-型晶體。
現有技術反-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮具有生理活性例如抗癌活性，該化合物能用在藥物、食品和飲料領域內。
制備反-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮的化學合成方法是已知的[《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)，第217-222頁(1993)]。另外，WO 98/13328公開了一種實際的制備方法，其中是將糖醛酸或糖醛酸衍生物加熱，并從加熱產物中收集反-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮。在上述方法中，沒有任何關于所得反-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮中的晶體的描述。在《瑞士化學學報》Helvetica ChimicaActa，第55卷，第2838-2844(1972)中描述了制備順-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮的方法，并且所述化合物最終是作為升華物質獲得的。
本發明所要解決問題通過上述實際方法制得的反-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮水溶液的真空濃縮殘余物和冷凍干燥產物是微紅棕色糖漿狀物質，并且通常含有10-20％的水，而且它們難以處理并且熱穩定性不好。
本發明的目的是改善反-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮的純度、熱穩定性和可處理性。解決問題的方法本發明者們已經發現，通過下述制備方法可制得具有特定X-射線衍射圖樣的穩定晶體用有機溶劑從反-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮(在下文中將其稱為“環戊烯酮”)的水溶液中萃取環戊烯酮，并將真空濃縮的萃取液結晶；用有機溶劑從環戊烯酮水溶液的真空濃縮殘余物或冷凍干燥物質中萃取環戊烯酮，并將萃取液結晶；或將環戊烯酮水溶液的真空濃縮殘余物或冷凍干燥物質溶在醇等中，然后向所述醇溶液中加入有機溶劑使之結晶，于是本發明者們將所述晶體稱為“環戊烯酮的α-型晶體”。
與環戊烯酮水溶液的常規真空濃縮殘余物或冷凍干燥物質相比，已經發現該α-型晶體具有顯著改善的純度和極大改善的熱穩定性，因此完成了本發明。
總而言之，本發明涉及反-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮的α-型晶體。
附圖的簡要說明附
圖1是該環戊烯酮的α-型晶體的X-射線衍射圖樣。
附圖2顯示了本發明α-型晶體的差示掃描量熱法分析結果。
附圖3顯示了在參照實施例1中獲得的冷凍干燥產物的色譜圖。
附圖4顯示了在實施例1中獲得的本發明α-型晶體的色譜圖。
附圖5顯示了在實施例3中獲得的本發明α-型晶體的色譜圖。
本發明的實施方案下面將在下文中具體闡明本發明。
本發明所用的環戊烯酮可按照在上述《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)中描述的化學方法合成制得。附帶說明一下，環戊烯酮是在通過將至少一種選自下述物質的物質加熱所獲得的產物中制得的化合物糖醛酸、糖醛酸衍生物、含糖醛酸的糖類化合物、含糖醛酸衍生物的糖類化合物、含有包含糖醛酸的糖類化合物的物質、和含有包含糖醛酸衍生物的糖類化合物的物質，并且在本發明中，可使用糖醛酸的純化產物。
糖醛酸(uronic acid)有時又稱為糖醛酸(glycuronic acid)，它是其中醛糖上的醛基維持其本身、同時僅是另一端上的伯醇基被氧化成羧基的羥基醛羧酸的俗稱。在自然界中，糖醛酸是多種動物和植物多糖的構成組分。含糖醛酸的多糖的實例有果膠、果膠酸、藻酸、透明質酸、肝素、硫酸肝素、巖藻依聚糖、硫酸軟骨素、軟骨素、硫酸皮膚素等，并且已知它們表現出多種生理功能。
對于本發明所用糖醛酸沒有特別限制。因此，糖醛酸的實例有半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、古洛糖醛酸(guluronic acid)、甘露糖醛酸和艾杜糖醛酸等，糖醛酸衍生物的實例有上述糖醛酸的內酯、酯、酰胺、鹽等，并且本發明所述糖醛酸衍生物包括加熱后能生成環戊烯酮的任一物質。糖醛酸內酯的實例有葡萄糖醛酸-6，3-內酯(下文中簡稱為葡萄糖醛酸內酯)、甘露糖醛酸-6，3-內酯和艾杜糖醛酸-6，3-內酯。糖醛酸酯的實例有可由糖醛酸制得的糖醛酸甲酯、糖醛酸乙酯、糖醛酸丙二醇酯和糖醛酸羧甲酯等。糖醛酸酰胺可通過將糖醛酸酰胺化制得。糖醛酸的鹽可由常規方法制得。
在本說明書中，含糖醛酸或糖醛酸衍生物的糖類化合物是指，含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物。對于含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物沒有特別限制，其適用的實例有果膠、果膠酸、藻酸、透明質酸、肝素、硫酸肝素、巖藻依聚糖、硫酸軟骨素、軟骨素和硫酸皮膚素，包括作為它們的化學、酶學或物理學處理產物的其分解產物、其分解產物的衍生物、其分解產物的鹽。
在本發明中，含有包含糖醛酸的糖類化合物的物質和/或含有包含糖醛酸衍生物的糖類化合物的物質是指，含有含糖醛酸的糖類化合物的物質和/或含有含糖醛酸衍生物的糖類化合物的物質，對其沒有特定限制，只要所述物質含有包含糖醛酸的上述糖類化合物和/或包含糖醛酸衍生物的糖類化合物就行。
例如，當使用D-葡萄糖醛酸作為糖醛酸，并且將其1％的溶液在121℃加熱4小時時，在熱處理物質中就生成了環戊烯酮。用有機溶劑萃取該加熱物質中的環戊烯酮，并將萃取液濃縮。然后，通過硅膠柱層析法分離該濃縮萃取液，將洗脫下來的環戊烯酮部分濃縮，用氯仿從該濃縮物中萃取環戊烯酮，將該濃縮物的萃取液用正相柱層析法純化，由此就純化了該熱處理物質中的環戊烯酮。
下面給出環戊烯酮的物理特征。附帶說明一下，環戊烯酮的質譜分析是用質譜儀DX302(由日本電子制造)進行的。此外，以重氫氯仿作為溶劑的NMR測定是用JNM-A500(由日本電子制造)進行的。比旋度是用DIP-370旋光計(由日本分光制造)測定的；紫外吸收光譜是用UV-2500分光光度計(由島津制作所制造)測定的；紅外吸收光譜(IR)是用FTIR-8000紅外分光光度計(由島津制作所制造)測定的。
FAB-MSm/z 115[M+H]+使用甘油作為基質。
1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)附帶說明一下，1H-NMR的化學位移值是以CHCl3的化學位移值為7.26ppm作為標準給出的。
這些值與《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)中描述的環戊烯酮的數據幾乎一致。
旋光度[α]D200°(c1.3，水)IR(KBr法)在3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1處記錄有吸收。
UVλmax215nm(水)例如，本發明α-型環戊烯酮可按照下述方法制得對于環戊烯酮的制備方法沒有特別限制，例如，其可按照在下文中提及的參照實施例1和2中的方法制得。
本發明所用有機溶劑的實例有乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、乙醚、正己烷、丙酮、甲醇、乙醇和乙酸，所述有機溶劑可單獨使用，或者以其混合物的形式結合使用。當溶劑單獨使用時，可使用乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、乙醚等，乙酸乙酯和乙酸丁酯是特別優選的。對于混合溶劑，當把乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、乙醚或正己烷加到環戊烯酮在甲醇、乙醇或丙酮中的溶液中時，結晶就發生了，將乙酸乙酯和正己烷加到環戊烯酮的乙醇溶液中以進行結晶是特別適合的。
當僅用一種有機溶劑來使環戊烯酮結晶時，出于對純度和收率的考慮，優選將真空濃縮殘余物或冷凍干燥物例如用乙酸乙酯萃取，并將所述萃取液濃縮以生成晶體。
例如，將在參照實施例1中獲得的真空濃縮殘余物或冷凍干燥物用乙酸乙酯萃取，并將萃取液濃縮，放置以生成α-型晶體。
當使用混合溶劑時，將真空濃縮殘余物或冷凍干燥物溶解在少量甲醇或乙醇中，然后向其中加入乙酸乙酯和正己烷以生成晶體。
例如，將在參照實施例1中獲得的環戊烯酮真空濃縮殘余物或冷凍干燥物溶解在少量甲醇或乙醇中，然后向其中加入乙酸乙酯和正己烷，以生成α-型晶體。乙酸乙酯和正己烷的加入量可取決于用于溶解的甲醇或乙醇的量，對于乙醇溶液，乙酸乙酯和正己烷優選分別以是乙醇4倍和2倍的量使用。
或者，將乙酸丁酯和乙酸加到環戊烯酮的水溶液中并混合，這樣環戊烯酮就轉移到所得的上層溶液中，將所述上層溶液真空濃縮后，環戊烯酮就從中結晶出來。附帶說明一下，環戊烯酮的萃取可以在例如(環戊烯酮的水溶液)∶(乙酸丁酯)∶(乙酸)＝1∶1～50∶0.1～10的條件下進行，或優選在(環戊烯酮的水溶液)∶(乙酸丁酯)∶(乙酸)＝1∶2～20∶0.5～4的條件下進行，(環戊烯酮的水溶液)∶(乙酸丁酯)∶(乙酸)的比例只要在能高效率地萃取環戊烯酮、以及可高效率地獲得本發明α-型晶體的范圍內即可。
只要能發生結晶，可采用任意的環戊烯酮濃度，但是其濃度優選為10-1000mg/ml。
放置溫度沒有特別限制，只要溫度不引起環戊烯酮降解就行，但是溫度實際上是-20℃-室溫。結晶所需時間為1夜-3天，晶體通常是在1夜內獲得的。當加入在前制得的α-型晶體時，能促進結晶過程。
將分離到晶體抽濾或離心過濾，然后干燥，由此可獲得α-型晶體。
下面將解釋本發明的環戊烯酮α-型晶體。
1.元素分析用柳本CHN Coder Type MT-3對在下文實施例3中獲得的本發明環戊烯酮α-型晶體進行元素分析。結果如表1所示。表1
2.X-射線衍射圖樣用X-射線衍射儀(RU-200；由理學電機制造)測定在下文實施例1中獲得的本發明的環戊烯酮α-型晶體的X-射線衍射圖樣，其中所述X-射線衍射儀裝配有閃爍計數器和采用石墨單色儀的Cu輻射裝置。所得結果如表2和附圖1所示。
因此，附圖1是本發明的環戊烯酮α-型晶體的X-射線衍射圖樣，其是以衍射角2θ(°，橫座標)和衍射強度(cps，縱座標)之間的關系表示的。
本發明所用術語“基本上具有下述X-射線衍射圖樣”表示，本發明的環戊烯酮α-型晶體具有下表2所示特征圖樣，并且所述圖樣在由于測試儀器或制備樣本的條件中的差異所導致的一定變異范圍內。表2
3.熱分析該測定是用島津制造的差示掃描量熱儀(DSC-50)進行的。本發明的環戊烯酮α-型晶體的差示掃描量熱法分析結果如附圖2所示。
因此，附圖2表示了本發明的環戊烯酮α-型晶體的差示掃描量熱法分析結果，并且是以溫度(℃，橫坐標)和電流量(mW，縱坐標)之間的關系表示的。
4.純度在下述條件下，用島津制造的高效液相色譜儀分析在參照實施例1中獲得的環戊烯酮的冷凍干燥物、和在下文實施例1和3中獲得的α-型晶體，由色譜圖的面積百分比計算得純度如表3所示。冷凍干燥物的色譜圖如附圖3所示。在實施例1中獲得的α-型晶體的色譜圖如附圖4所示。在實施例3中獲得的α-型晶體的色譜圖如附圖5所示。在附圖3-附圖5中，縱坐標表示折射強度，橫坐標表示洗脫時間(分鐘)。
色譜分析的條件柱DAISOPAK SP-120-5-ODS-BP(由Daiso制造)4.6mm×25cm柱溫40℃流動相0.01％的三氟乙酸水溶液流速0.5ml/分鐘檢測器差示折射計進樣量1μl(10mg/ml)表3
附帶說明一下，“純度(％)”是指，通過高效液相色譜法獲得的色譜圖中環戊烯酮的峰面積除以總峰面積之和再乘以100。因此，其表示環戊烯酮的量在不含水的固體中的比例。
如表3所示，與冷凍干燥物相比，本發明的環戊烯酮α-型晶體的純度有顯著改善。
5.熱穩定性為了比較在參照實施例1中獲得的環戊烯酮冷凍干燥物和在實施例1中獲得的α-型晶體的熱穩定性，通過下述定量測定方法，在初期以及在40℃放置6天后定量測定環戊烯酮。結果如表4所示。
定量方法將環戊烯酮樣本(0.1g)溶解在100ml水中，取2ml所得溶液稀釋5倍。在接近215nm波長的最大吸收波長處測定該溶液的吸收度(A)。通過下式計算環戊烯酮的量(mg/ml)。環戊烯酮的量(mg/ml)＝(A÷773.4)×50000表4
表4中的量(％)表示環戊烯酮的量在其中非環戊烯酮物質是水和雜質的樣本中的比例(％)。
如表4所示，與冷凍干燥物相比，本發明的環戊烯酮α-型晶體的熱穩定性有顯著改善。
實施例用下述實施例進一步闡明本發明的環戊烯酮α-型晶體的制備方法，但是本發明并不僅限于這些實施例。
參照實施例1.
將市售葡萄糖醛酸內酯(由Nacalai Tesque出產)(500g)溶解在38升水中，然后向其中吹入蒸汽以在125℃加熱5小時。冷卻后，將混合物真空濃縮，用NaOH把濃縮物的PH調至5.0。用已經用水預平衡過的Diaion SA-10A(三菱化學)將該溶液上陰離子交換柱(20升)，用水洗脫，以獲得24升非吸附部分。
將該非吸附部分真空濃縮至2.8升，向其中加入NaCl使其終濃度為2M，將混合物分兩部分過用2M氯化鈉水溶液預平衡的合成吸附劑(SP-207；由三菱化學出產)柱(15升)。用2M氯化鈉水溶液洗滌該柱，獲得了用0.1M氯化鈉水溶液洗脫的部分(總共78升)。
將該部分真空濃縮至11升，把該濃縮液按上述方法進行相同SP-207柱層析處理，以獲得24升洗脫液。然而，在這種情況下，將所有樣本都進行一次色譜處理，并且洗脫是用水進行的。
將洗脫液真空濃縮至100ml，用滲透膜(AC-110-1-；由旭化成)通過電滲析進行脫鹽，以獲得100ml 6％的環戊烯酮溶液。將該環戊烯酮溶液真空濃縮，獲得了淺紅棕色濃縮殘余物。把該環戊烯酮溶液冷凍干燥，獲得了淺紅棕色冷凍干燥物。參照實施例2.
將市售葡萄糖醛酸內酯(500g)溶解在38升水中，然后向其中吹入蒸汽以在125℃加熱5小時。冷卻后，將混合物真空濃縮。用已經用水預平衡過的Diaion SA-10A將該溶液上陰離子交換柱(20升)，以獲得總共73升的用水洗脫的非吸附部分和流過溶液。
將該非吸附部分真空濃縮至3升，向其中加入NaCl使其終濃度為2M，將混合物分兩部分過用2M氯化鈉水溶液預平衡的合成吸附劑(SP-207)柱(15升)。用2M氯化鈉水溶液洗滌該柱，并用0.1M氯化鈉水溶液洗脫，以獲得總共78升收集部分。
將該部分真空濃縮至3升，把該濃縮液按上述方法進行相同SP-207柱色譜處理，以獲得30升洗脫液。然而，在這種情況下，將所有樣本都進行一次色譜處理，并且洗脫是用水進行的。
將洗脫液真空濃縮至150ml，用滲透膜(AC-110-1-；由旭化成)通過電滲析進行脫鹽，以獲得150ml 7.2％的環戊烯酮溶液。實施例1將乙酸乙酯(1.5升)加到120g參照實施例1所得環戊烯酮冷凍干燥物中，并在60℃加熱以進行萃取。把所得乙酸乙酯萃取液用無水硫酸鎂干燥，并真空濃縮。在加熱狀態下，將該濃縮殘余物溶解在0.5升乙酸乙酯中，然后在5℃放置過夜以結晶。抽濾出所得晶體，然后真空干燥，獲得了50.9g淺黃色α-型晶體。實施例2將在參照實施例1獲得的環戊烯酮的真空濃縮殘余物(10g)溶解在5ml乙醇中，然后向其中加入20ml乙酸乙酯和10ml正己烷，加入少量實施例1所得α-型晶體，之后在5℃放置過夜。抽濾出析出的晶體，真空干燥，獲得了4.3g淺黃色α-型晶體。實施例3將50ml乙酸乙酯加到10g實施例1所得α-型晶體中，并加熱至溶解。冷卻后，向其中加入實施例2所得α-型晶體，然后在10℃放置過夜以結晶。抽濾出所得晶體，真空干燥，獲得了7.6g淺黃色α-型晶體。實施例4將266ml乙酸丁酯和206.6ml乙酸的混合物與26.6ml參照實施例2所述7.2％環戊烯酮溶液混合，然后攪拌，于是環戊烯酮就被萃取到上層溶液中(初級萃取液)。將乙酸丁酯和乙酸的混合物(5∶1體積比)加到1份(體積份)下層溶液中并混合，然后攪拌，回收所得上層萃取液(次級萃取液)。將初級萃取液和次級萃取液合并，真空濃縮，以獲得15.5ml濃縮萃取液。在5℃，將實施例1所得α-型晶體加到所述溶液中，當析出少量晶體時，將該溶液在-20℃放置過夜以結晶。抽濾出所得晶體，真空干燥，獲得了492mg淺黃色α-型晶體。
本發明的優點本發明的環戊烯酮α-型晶體能非常有效地以高純度和高產量獲得環戊烯酮，并且易于在制備環戊烯酮制劑的過程中操作。此外，與冷凍干燥物相比，它的顏色和熱穩定性有了顯著改善。
權利要求
1.反-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮的α-型晶體。
2.權利要求1的α-型晶體，其中所述晶體基本上具有下述X-射線衍射圖樣
全文摘要
本發明提供了反－4,5－二羥基－2－環戊烯－1－酮的α－型晶體。
文檔編號C07C45/81GK1268110SQ9880849
公開日2000年9月27日 申請日期1998年8月19日 優先權日1997年8月29日
發明者守口誠, 豬飼勝重, 船越政男, 小堀博史, 落合一賴, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社