分離樹突狀細胞膜蛋白基因的制作方法

專利名稱：分離樹突狀細胞膜蛋白基因的制作方法
技術領域：
本發明提供了與在淋巴細胞，例如在免疫系統發揮作用的細胞中發現的基因有關的組合物。這些基因是有用的標志，可能在控制哺乳動物免疫系統的發育、分化和/或生理方面發揮著作用。特別地，本發明提供了核酸、蛋白質、抗體以及它們的使用方法。
背景技術：
哺乳動物循環系統中循環著的成分包括各種類型的細胞，包括紅細胞系和髓細胞系中的紅細胞及白細胞。見，例如，Rapaport(1987)血液學概論(第2版)Lippincott，Philadelphia，PA；Jandl(1987)BloodTextbook of Hematology，Little，Brown andCo.，波士頓，MA.；以及paul(編著)基礎免疫學(第3版)Raven Press，紐約。
樹突狀細胞(DC)是抗原-處理或提呈細胞，發現于機體的所有組織中。見Steinman(1991)Annual Review of Immunology 9271～296；以及Banchereau和Schmitt(編著，1994)基礎和臨床免疫學中的樹突狀細胞Plenum Press，紐約。這些DC可以被分為不同的種類，包括心臟、腎臟、消化道以及肺間質樹突狀細胞，皮膚和黏膜中的朗罕氏細胞，胸腺髓質和次級淋巴組織中的交叉(interdigitating)樹突狀細胞，以及血液和淋巴液樹突狀細胞。盡管上述所有區域中的樹突狀細胞都是CD45+淋巴細胞，顯然是來源于骨髓，但是它們在成熟狀態和微環境方面表現出了不同。
這些樹突狀細胞有效地把抗原處理和提呈到例如T細胞。它們增強來自原初T細胞和記憶T細胞的反應。
初級和次級B-細胞濾泡包括能夠捕獲并長期保留抗原作為免疫復合物的濾泡樣樹突狀細胞。這些樹突狀細胞把天然抗原提呈給B細胞，并且可能參與抗體親和力的成熟、免疫記憶生成以及體液免疫反應的維持。
單核細胞是屬于單核吞噬細胞系統的吞噬細胞，駐留在循環系統中。見Roitt(編著)Encvclopedia of Immunology Academic press，圣地亞哥。這些細胞起源于骨髓中，一旦分化就只在骨髓中保留很短的一段時間。然后它們進入循環系統，并能夠在那兒保留相當長的一段時間，例如幾天。通常稱之為血細胞滲出過程，單核細胞能夠進入組織和體腔中，在那兒它們分化為巨嗜細胞以及可能分化為樹突狀細胞。在炎性反應中，單核細胞的數目會成倍增加，并且這些增加了的單核細胞中的許多會滲出到炎癥部位。
抗原提呈是指這樣一種細胞中事件，即蛋白質抗原被抗原提呈細胞(APC)吸收，處理，然后被識別，啟動免疫反應。最有活性的抗原提呈細胞的代表為巨嗜細胞、樹突狀細胞和某些B細胞，巨嗜細胞是單核細胞的直接發育產物。
巨嗜細胞發現于大多數的組織中，在使很多種蛋白抗原以及微生物內化方面具有很高的活性。它們具有高度發育的胞吞活性，并能夠分泌多種在啟動免疫反應中發揮重要作用的產物。因此，可以相信被單核細胞表達的或者受單核細胞活性誘導的許多基因，可能在抗原吸收、處理、提呈，或者隨后引發的免疫反應的調節中發揮著重要的作用。
然而，在以下這兩方面對樹突狀細胞和單核細胞卻知之甚少它們所表達的蛋白，以及它們的大部分功能與包括活化狀態在內的活化機制。特別是，與啟動免疫反應有關的過程和機制，包括抗原的處理和提呈，還不清楚。對這些細胞的結構、生物學以及生理學特性了解的缺乏限制了對它們的理解。因此，對由于抗原提呈細胞的調節、發育或生理上失常引發的疾病目前還無法處理。
發明概述本發明部分上基于發現各種哺乳動物樹突狀細胞膜蛋白(DCMP)基因的基礎之上，并以特定的DCMP1和DCMP2這兩個具體實例舉例說明。分布資料表明細胞分布較為廣泛，而結構資料顯示出了某些功能。DCMP1表現出與凝集素及脫唾液酸糖蛋白受體這一類物質的相似性。描述的DCMP2具體實例表現出與巨嗜細胞脫唾液酸糖蛋白受體之間明顯的序列相似性。本發明包括所述基因產物的激動劑和拮抗劑，例如天然結構的突變體(突變型蛋白)、融合蛋白、化學模擬物、抗體以及其他結構或功能上的類似物。本發明還指導了分離編碼本發明蛋白的基因。本發明還提供了這些不同蛋白或核酸組合物的各種用途。
在特定的實施例中，本發明提供了一種結合化合物，該化合物中包括一個能夠與DCMP1蛋白特異性結合的抗體位點；或者包括選自下列序列的一種多肽Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu His Thr Thr GlnLys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser Val Cys ValPro(SEQ ID NO4的118～144位殘基)；Gln Val Ala Thr Leu AsnAsn Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys(SEQ ID NO4的166～181位殘基)；或Trp Lys Pro Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gln Gly HisGly Leu Gly(SEQ ID NO4的263～277位殘基)。在優選實施例中，這種結合化合物中的抗體結合位點與SEQ ID NO2或8蛋白之間發生特異性的免疫反應，與SEQ ID NO4的118～144位殘基的人源蛋白發生特異性的免疫反應，是用純化或重組產生的DCMP1蛋白制備而成的，是用純化或重組產生的包含SEQ ID NO4的118～144位殘基序列的人源蛋白制備而成的，位于一種單克隆抗體、Fab或F(ab)2中；或者這種結合化合物是用可檢測方式標記過的，或存在于含緩沖液的組合物中。
本發明包括這些結合化合物的使用方法，包括讓所述的結合化合物與含有抗原的生物樣品接觸從而形成一種結合化合物抗原復合物。在某些實施方案中，生物樣品是人，結合化合物是抗體。本發明還提供了一種檢測試劑盒，該試劑盒包括這種結合化合物以及關于這種結合化合物如何用于檢測的指導性材料；或用于隔離這種結合化合物的隔室。
本發明還提供了一種基本上純化或分離的多肽，該多肽特異性地結合這種結合化合物。在各種實施方案中，這種多肽包括至少一種由至少14個來自靈長類DCMP1蛋白的氨基酸殘基組成的片段；包括SEQ ID NO4的118～144位殘基中的至少14個氨基酸；是一種可溶性多肽；以可檢測方式標記的；存在于一種無菌組合物中；存在于一種含緩沖液的組合物中；能夠結合唾液酸殘基；可重組生產，或有一段天然生成的多肽序列。
提供了核酸的具體實例，包括編碼上述多肽的核酸，在純化了的情況下。通常，該核酸包括至少30個SEQ ID NO1或7編碼部分中的核苷酸；包括至少30個來自SEQ ID NO3的608～688位中的核苷酸；包括至少30個來自SEQ ID NO3的752～799位中的核苷酸，或者它包括一個選擇性地能夠與編碼上述多肽的核酸雜交的插入片段。本發明還提供了用這樣的核酸轉化后的細胞，例如該核酸由SEQID NO1、7中的蛋白編碼部分或者SEQ ID NO3中的適當部分組成。
本發明提供了用這些核酸的至少1條鏈生成一種雙鏈核酸的方法，該方法包括以下步驟所述的鏈與能夠特異性雜交的互補鏈樣品接觸。在優選實施方案方案中，該方法能確保這種雙鏈產物的檢測；或能實現這種雙鏈產物的組織學定位。
替代地，本發明提供了上述結合化合物的使用方法，該方法包括以下步驟讓結合組合物與樣品接觸從而形成一種結合組合物抗原復合物。在優選實施方案中，所述樣品是生物樣品，包括體液；所述抗原位于細胞表面；或者所述抗原進一步被純化。
本發明進一步包括這些多肽的使用方法，該方法包括讓多肽與樣品接觸從而形成一種結合組合物多肽復合物。優選實施方案中，所述多肽進一步被純化。
提供了另一種用于調節樹突狀細胞生理或功能的方法，該方法包括讓所述細胞與下列物質接觸的步驟上述結合組合物、上述DCMP1蛋白或上述多肽。所述功能還可以引發免疫反應的啟動或發展。典型地，所述的接觸是與抗原結合，包括細胞表面抗原、MHC I抗原或MHCII抗原。
發明詳述本發明引述的所有參考文獻在此引入參考的范圍與每個出版物或專利申請各自特別要求的范圍相同，引入只是為了作為參考。I.總論本發明提供了編碼表達在哺乳動物樹突狀細胞(DC)表面的蛋白的DNA序列。關于樹突狀細胞的綜述參見Steinman(1991)AnnualReview of Immunology 9271-296；以及Banchereau和Schmitt(編著，1994)基礎和臨床免疫學中的樹突狀細胞Plenum Press，紐約。因為它們發現于樹突狀細胞上并且在它們的表達中表現出了一些特殊性，所以這些蛋白被命名為樹突狀細胞蛋白。
下面提供了這些蛋白的特定靈長類對應物，例如人的具體實例。嚙齒類，例如小鼠的對應物也存在。下面的描述用于指導人DC基因起示范作用，但是同樣也適用于來自其他來源或多形態或單個突變體等哺乳動物的結構上相關的具體實例，例如序列上相關的具體實例。這些具體實例還包括，例如，表現出很小序列變化的蛋白，例如小于5％的序列變化，以及在殘基數目上變化很小的蛋白，例如殘基取代數目小于20，典型地小于15，優選小于10，以及更優選小于5，包括4、3、2或1。如本發明所述，這些具體實例還包括從全長序列截取下的型式，以及包括這些序列的基本節段的融合蛋白。II.定義“結合組合物”一詞是指能夠與這些DC蛋白特異性結合的分子，例如以抗體-抗原反應的方式結合。其他化合物，例如蛋白質，也能與相應的這類蛋白特異性地連接。典型地，這種特異性連接是生理上相關的蛋白-蛋白相互作用的形式，可以是共價鍵或非共價鍵的形式；并且可以包括多蛋白復合物的成分，包括載體化合物或二聚化配對者。這種分子可以是一種聚合物或化學反應試劑。所述功能類似物可以是一種結構經過修飾的蛋白，或者是一種根本無關的分子，例如，該分子具有能與合適的反應決定簇反應的分子形狀。所述突變體可以是這種蛋白的激動劑或拮抗劑，參見，例如，Goodman & Gilman’s thePharmacological Bases of Therapeutics(第8版)Pergamon Press，Tarrytown，紐約。
本發明中使用的“結合因子DC蛋白復合物”是指一種由結合因子與DC蛋白形成的復合物。結合因子的特定結合活性是指這種因子具有一種能夠識別相應DC蛋白位點的特定結合位點。例如，用DC蛋白制備的抗體，以及能夠識別DC蛋白上的表位的抗體，這兩者都可以通過特定的結合形成抗體DC蛋白復合物。典型地，結合因子DC蛋白的形成能夠確保處于其他蛋白及生物產物混合物中的DC蛋白能夠被測量。“抗體DC蛋白復合物”是指一種其中結合因子是抗體的結合因子DC蛋白復合物。所述抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體或者甚至可以是抗體中的抗原結合片段，例如包括Fv、Fab或Fab2片段。
“同源性”核酸序列，在與其他序列比較時表現出顯著的相似性。核酸中的同源性標準是測量本領域進行序列比較時通用的同源性以及/或者系統發育的親緣關系，或者以雜交反應為基礎。下面詳細地描述了在序列比較和雜交反應二者中使用的算法。
“分離的”核酸是指基本上與其他天然狀態下的核酸伴隨成分分離開來的核酸，例如來自起源物種的蛋白質或旁翼基因組序列分離開來的核酸，例如RNA、DNA或一種混合聚合物。這種術語中包括一種從天然生成環境中移取出來的核酸，還包括重組或克隆的DNA分離體以及化學合成的類似物或通過異源系統生物合成的類似物。基本上純化的分子包括該分子的分離體。一種分離的核酸通常是這種分子的同源組合物，但是在一些實施方案中也可以包括少量的異源體。典型地，這種異源體存在于該聚合物的末端或者對所期望的生物功能或活性無關緊要的部分。
當在蛋白質范圍內使用時，本發明中使用的“DCMP1”應該包括一種具有SEQ ID NO2或8所示的氨基酸序列的蛋白質或者是這種蛋白質中的重要片段。它可以是能與相應DCMP1蛋白特定結合成分相互作用的多肽。這些結合成分，例如抗體，典型地能夠以高度親和力與DCMP1蛋白結合，例如至少約100nM，通常為強于約30nM，優選強于約10nM，更優選強于約3nM。
“DCMP2”是指SEQ ID NO4和10提供的序列。靈長類的DCMP2，例如人的被命名為DCMP2的凝集素/脫唾液酸糖蛋白家族成員相關蛋白的核苷酸序列以及相應的氨基酸序列是從SEQ ID NO3和4提供的樹突狀細胞文庫中分離到的。長的形式的序列如所給出的那樣，短的形式不含118～144位殘基對應的序列。這種短的形式也可以在第1064位核苷酸改變。這與脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的單核細胞形式相關，通過第173位和第174位殘基之間的插入片段以及第270位殘基來變化，見表1，以及位于第775位和第776位殘基之間的編碼GEE的序列的插入片段。SEQ ID NO9和10描述了另一種變異體。
本發明使用的“多肽”或“蛋白質”包括所述蛋白質的重要片段或節段，以及包含一連串氨基酸殘基，該氨基酸殘基串含有至少約8個氨基酸，一般至少10個氨基酸，更一般至少12氨基酸，經常至少14個氨基酸，更經常至少16個氨基酸，典型地至少18個氨基酸，更典型地至少20個氨基酸，通常至少22個氨基酸，更通常至少24個氨基酸，優選至少26個氨基酸，更優選至少28個氨基酸，以及在特別優選的實施方案中，至少約30個或更多個氨基酸，例如，35個、40個、45個、50個、60個、70個等。
優選的實施方案給出了多個特定長度的獨特性節段，例如非重疊節段。典型地，所述的多個為至少2個，更通常為至少3個，優選5、7或更多個。當長度的下限給定時，比其長的各種長度都是合適的，例如的長度為7的節段有1個，長度為12的節段有2個。節段可以是肽或寡核苷酸。
典型地，“重組”核酸是從結構上定義的。它可以是通過將兩個天然狀態下互不相連的片段融合在一起生成一段序列制備而成的核酸，這意味著排除了天然產物，例如天然生成的突變體形式。
某些形式是用制備方法來定義的。關于這類形式，例如通過一種操作手段制備而成的產物，該操作手段使用重組核酸技術，例如包括核苷酸序列中的人工插入，典型地為篩選或制備。
因此，本發明包括，例如，含有使用合成寡核苷酸方法得到的序列的核酸，以及通過用編碼這些蛋白的非天然生成載體轉化細胞制備而成的產物。這類產物通常是這樣制備而成的用編碼同一個氨基酸或保守氨基酸的冗余密碼子取代一個密碼子，同時典型地導入或除去一個序列識別位點，例如限制性酶切位點。替代地，也可以這樣操作將多個帶有期望功能的核酸節段連接在一起生成一個獨立的遺傳整體，其中包括一種期望的功能結合，而該功能組合是普通天然形式所不具有的。通常限制性酶識別位點是這類人工操作的目標，但是其他位點特異性目標，例如啟動子、DNA復制位點、調節序列、調控序列，或引物節段等其他特征性序列，都可以在設計中引入。一種類似的概念趨近于重組體，例如融合體、多肽。特定情況下包括通過遺傳密碼冗余編碼與這些抗原片段相似的多肽的合成核酸，以及編碼各種不同種突變體的序列的融合。
“可溶性”是通過用Sverdberg單位[S]測量出的沉淀來反映的，Sverdberg單位用于測量一種分子在特定情況下的沉降速度。測定沉降速度的經典方法是采用分析超高速離心，而現在典型地是使用標準超高速離心。見，Freifelder(1982)Physical Biochemistry(第2版)W.H.Freeman & Co.舊金山，CA；以及Cantor和Schimmel(1980)Physical Biochemistry第1～3部分，W.H.Freeman & Co.舊金山，CA。作為初步測定，將一種含有推定的可溶性多肽的樣品放入標準實際大小的超高速離心機中，50Krpm離心10分鐘，可溶性分子保留在上清液中。可溶性顆粒或多肽的沉降速度典型地小于約30S，更典型地小于約15S，通常小于約10S，更通常小于約6S，在特定的實施方案中優選小于約4S，更優選小于約3S。多肽或片段的溶解度取決于環境和多肽本身。許多因素能影響多肽的溶解度，包括溫度、電解環境、多肽的大小和分子特性以及溶劑的特性。典型地，使用多肽的溫度范圍為約4～65℃。通常使用溫度為高于約18℃，更通常高于22℃。用于診斷時，該溫度通常約為室溫或更高一些，但低于分析中所使用的各種成分的變性溫度。用于治療時，盡管在特定情況下原位或體外的溫度可能會有所升降，但該溫度通常為體溫，典型地為約37℃的人體溫度。多肽的大小及結構通常應該處于一種基本上穩定的生理活性狀態，一般不處于變性狀態。該多肽可以與其他多肽聯合形成一種四級結構，例如為了賦予可溶性，或者以一種類似于天然脂雙層相互作用的方式與類脂或去污劑相連。
所述溶劑通常是一種生物相容的緩沖液，用于保持生物活性的一類緩沖液。通常，該溶劑具有中性pH值，典型地為約5～10，優選約7.5。在一些情況下，加入去污劑，典型地為一種溫和的非變性去污劑，例如CHS(半琥珀酸膽甾醇酯)(cholesteryl hemisuccinate)或CHAPS(3-([3-膽酰胺丙基]-二甲銨)-1-丙磺酸)，或以一種低的充足去污劑濃度提供以便避免蛋白質結構或生理特性被破壞。
“基本上純化的”典型地是指把所述的蛋白質同其他來源于初始來源有機體的污染蛋白、核酸或其他生物產物分離開來。純化或“分離”可以用標準方法分析，典型地通過重量分析，一般為至少約50％的純度，更一般為至少約60％的純度，通常為至少約70％的純度，更通常為至少約80％的純度，普遍為至少約85％的純度，更普遍為至少約90％的純度，優選為至少約95％的純度，更優選為至少約98％的純度，最優選的實施方案中，為至少99％的純度。通常加入載體或賦形劑，或者制劑可以被滅菌或包括緩沖成分。
核酸序列比較范圍中的“基本上相似”是指當進行序列比較時在完全對準的情況下，這些節段或它們的互補鏈是相同的，具有合適核苷酸插入或缺失，在至少約50％的核苷酸中，一般為至少56％，更一般為至少59％，經常為至少62％，更經常為至少65％，通常為至少68％，更通常為至少71％，典型地至少74％，更典型地至少77％，普遍為至少80％，更普遍為至少約85％，優選至少90％，更優選至少約95～98％或更高，以及在特別優選的實施方案中高約99％或更多個核苷酸。替代地，當所述節段在選擇性的雜交條件下會與一條鏈或其互補鏈雜交時，典型地使用來自SEQ ID NO1或7序列或3和9的適當部分，那么就說明存在基本上相似。典型地，當在一串至少約30個核苷酸中有至少約55％的相似性時就會發生選擇性雜交，優選在一串至少約25個核苷酸中有至少約65％的相似性，更優選至少約75％，最優選在一串至少約20個核苷酸中有至少約90％的相似性。見，Kanehisa(1984)Nuc.Aicds Res.12203-213。本發明描述的相似性比較的長度可以在更長的范圍內進行，在某些實施方案中在一串至少約17個核苷酸范圍內比較，通常為至少約20個核苷酸，更通常為至少約24個核苷酸，典型地至少約28個核苷酸，更典型地為至少約40個核苷酸，優選至少約50個核苷酸，更優選至少約75～100個或更多個核苷酸。比較DCMP1時的測量結果并不能反映比較DCMP2具體實例的測量結果。
與雜交領域中的同源或基本相似有關的“嚴緊性條件”，是指涉及鹽類、溫度、有機溶劑以及其他參數的嚴格性組合條件，典型地是指雜交反應中控制的那些條件。參數間的組合比單一參數的量度更重要。見，例如，Wetmur和Davidson(1968)分子生物學雜志31349-370。能夠在嚴緊性條件下與目標核酸結合的核酸探針對于該目標核酸是特異性的。典型地這種核酸探針的長度大于11個核苷酸，并且該探針與目標核酸中的探針指定區域之間充分相同或互補從而在嚴緊性條件下能與目標核酸結合。
通過緊密相關物種的種間雜交，能夠克隆并分離到其他哺乳動物的相應的DCMP蛋白。實例參見以下描述。遠緣相關的物種之間的相似性相當低，因此，建議應當在非常緊密相關的物種間進行雜交。替代地，也可以制備一種表現出很低的種間特異性的抗體制劑用于克隆表達方法中。
在涉及蛋白質或肽鏈時，短語“特異性地結合抗體”或“發生特異性的免疫反應”意味著，存在著一定數目異源的蛋白及其他生物產物情況下，一種反應的發生取決于特定蛋白是否存在。因此，在設定的免疫測定條件下，特定的抗體結合到一種具體的蛋白質上，并且不與樣品中存在的其他蛋白發生明顯的結合。在這類條件下特異性結合抗體要求根據抗體針對某種具體蛋白的特異性來篩選抗體。例如，使用針對帶有SEQ ID NO2或8描述的氨基酸序列的人DCMP1蛋白的抗體，可以篩選獲得能夠與DCMP蛋白而不與其他蛋白發生特異性免疫反應的抗體。這些抗體識別與同源性人DCMP1蛋白高度相似的蛋白質。III.核酸這些DCMP選擇性地表達在樹突狀細胞上。如本發明公開的那樣，優選實施方案中使用的標準方法能夠用來分離其他物種的基因，例如鳥、哺乳動物等溫血動物。交叉雜交使得能從個體、品系或種分離到相關蛋白。根據本發明提供的信息，可以成功地獲得大量分離合適核酸克隆的方法。在合適的雜交條件下，Southern印跡雜交實驗能夠鑒定出其他物種中的同源基因。
如下所述，通過標準方法，可以用純化蛋白或特定肽鏈生產抗體。合成肽鏈或純化蛋白也能被提呈免疫系統生產多克隆或單克隆抗體。見，例如，Coligan(1991)Current Protocol in ImmunologyWiley/Greene，NY；以及Harlow和Lane(1989)抗體實驗指南ColdSpring Harbor Press，NY，在此引入作為參考。替代地，DCMP抗原結合組合物能夠用作特定的結合反應試劑，可以利用其特異性結合的優勢，用于例如DCMP的純化。
特定的結合組合物能夠用于篩選一種表達文庫，該文庫是從表達相應DCMP蛋白的細胞系中制備得到的。現有許多種篩選方法，例如表面表達配體的標準染色或者淘選。胞內表達的篩選也能夠通過染色或免疫熒光方法實現。結合組合物能夠親和純化或挑選出表達有抗原的細胞。表1靈長類的，例如人的凝集素/脫唾液酸糖蛋白受體家族成員的序列對比。ASGPRh1和ASGPRh2是肝脫唾液酸糖蛋白受體(見SEQ ID N05和6)；ASGPRm是巨嗜細胞衍生ASGPR；DCMP2有短、長以及突變體的形式，SEQ ID NO4和10；DCMP1出現于SEQ ID NO2和8。ASGPRh1 MTKE..YQDLQHLDNEESDHHQLRKGPPPPQPLLQRLCSGP...............RLLLLSLGASGPRh2 MAKD..FQDIQQLSSEENDHP.FHQGPPPAQPLAQRLCSMV...............CFSLLALSASGPRm MTRT..YENFQYLENKVKVQG.FKNGPLPLQSLLQRLRSGP...............CHLLLSLGDCMP2s MTRT..YENFQYLRNKVKVQG.FKNGPLPLQSLLQRLRSGP...............CHLLLSLGDCMP2l MTRT..YENFQYLENKVKVQG.FKNGPLPLQSLLQRLRSGP...............CHLLLSLGDCMP2v MTRT..YENFQYLENKVKVQG.FKNGPLPLQS................................DCMF1 MTSEITYAEVR...........FKNEFKSSGINTASSAASKERTAPHKSNTGFPKLLCASLLIFF特征**** +++++ASGPRh1 LSLLLLVVVCVIGS.QNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLE.ASGPRh2 FNILLLVVICVTGS.QSAQLQAELRSLKEAFSNFSSSTLTEVQAISTHGGSVGDKITSLGAKLE.ASGPRm LGLLLLVIICVVG.FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEGDCMP2s LGLLLLVIICVVG.FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEGDCMP2l LGLLLLVIICVVG.FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEGDCMP2v ..LLLLVIICVVG.FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEGDCMP1 LLLAISFFIAFVIFFQKYS.Q..LLEKKTT.KELVHTTLE....CVKKNMPVEETAWS.......特征 ++++++++ASGPRh1 .KQQK.........................DLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGSASGPRh2 .KQQQ.........................DLKADHDALLFHLKHFPVDLRFVACQMELLHSNGSASGPRm FKQERQA...........................VHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNNGEDCMP2s FKQERQA...........................VHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNN..DCMP2l FKQERQAGVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVPVHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNN..DCMP2v FKQERQA...........................VHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNNGEDCMP1 .................................................................特征ASGPRh1 ER....TCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTASGPRh2 QR....TCCPVNWVEHQGSCYWFSHSGKAWAEAEKYCQLENAHLVVINSWEEQKFIVQHTNPFNTASGPRm EASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLVVINSREEQNFVQKYLGSAYTDCMP2s .ASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLVVINSREEQNFVQKYLGSAYTDCMP2l .ASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLVVINSREEQNFVQKYLGSAYTDCMP2v EASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLVVINSREEQNFVQKYLGSAYTDCMP1 .......CCPKNWKSFSSNCYFISTESASWQDSEKDCARMEAHLLVINTQEEQDFIFQNLQEESA特征 ..........................................................ASGPRh1 W.MGLHDQNGP..WKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCA..HFTDDGR...WNDDASGPRh2 W.IGLTDSDGS..WKWVDGTDYRHNYKNWAVTQPDNWHGHELGGSEDCV..EVQPDGR...WNDDASGPRm W.MGLSDPEGA..WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCA..HFHPDGR...WNDDDCMP2s W.MGLSDPEGA..WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDNWQGHGLGGGEDCA..HFHPDGR...WNDDDCMP2l W.MGLSDPEGA..WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCA..HFHPDGR...WNDDDCMP2v W.MGLSDPEGA..WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCA..HFHPDGR...WNDDDCMP1 YFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPREPSD.......PNERCVVLNFRKSPKRWGWNDV特征 ................................XXX..............................ASGPRh1 VCQRPYRWVCETELDKASQEPPLLASGPRh2 FCLQVYRWVCEKRRNATGE...VAASGPRm VCQRPYHWVCEAGLGQTSQESHDCMP2s VCQRPYHWVcEAGLGQTSQESHDCMP2l VCQRPYHWVCEAGLGQTSQESHDCMP2v VCQRPYHWVCEAGLGQTSQESHDCMP1 NCLGPQRSVCEMMKIH.......L特征 ......................特征***內化結構域(一種延伸結構域出現在NK受體NKA中)；+++跨膜結構域；...C型凝集素結構域；XXX蔗糖特異性結構域。在同源性方面，DCMP1受體與凝集素結構域中的巨嗜細胞凝集素最接近。
序列分析表明這些DCMPs是凝集素/脫唾液酸糖蛋白受體超家族的成員。使用這些肽段也可以設計并生產出合適的寡核苷酸，用于篩選文庫確定其中是否存在類似基因，例如相同或多形態突變體，或者用于鑒定DC。可以使用遺傳密碼選定合適的寡核苷酸，作為探針用于篩選。與聚合酶鏈反應(PCR)技術結合，合成寡核苷酸能用于從文庫中篩選出期望的克隆。
也可以使用互補序列作為探針或引物。在鑒定了可能的氨基酸末端的基礎上，也可以具體地使用其他肽鏈，例如與錨定載體偶聯的或用多聚A互補PCR技術偶聯的肽鏈或者與其他肽鏈的互補DNA偶聯的肽鏈。
對編碼這些DC蛋白的基因進行核酸操作的技術，例如把編碼多肽的核酸序列亞克隆到表達載體中、探針的標記、DNA雜交等，在下列文獻中普遍都有描述Sambrook，et al.(1989)分子克隆-實驗指南(第2版)vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press，紐約，該文獻在此引入作為參考，下文中簡稱為“Sambrook，et al.”，以及參見Coligan，et al.(1987并且定期增補)Current Protocols In Molecular Biology Greene/Wiley，紐約，NY，簡稱為“Coligan，et al.”。
分離編碼這些DC蛋白的DNA序列的方法有許多種。例如，使用序列與本發明公開的序列相同或互補的標記寡核苷酸探針，把DNA從基因組或cDNA文庫中分離出來。可以使用全長探針，或者通過與把公開的序列與其他蛋白進行比較以及選擇特定引物，可以生產寡核苷酸探針。此類探針可直接用于雜交分析以分離編碼DC蛋白的DNA，或者可設計用于擴增技術如PCR的探針以分離編碼DC蛋白的DNA。
為了制備cDNA文庫，從表達DC蛋白的細胞中分離出mRNA。用mRNA制備cDNA，并將cDNA連接到重組載體中。把該載體轉化到重組宿主中進行增殖、篩選及克隆。制備和篩選cDNA文庫的方法是眾所周知的。見Gubler和Hoffman(1983)Gene 25263-269；Sambrooket al；或Coligan et al。
就基因組文庫而言，可以從組織中提取出DNA，用機械剪切或酶促消化的方法進行消化產生長約10～12kb的片段。然后用梯度離心法分離這些片段，并將其克隆到λ噬菌體載體中。這些載體和噬菌體進行體外包裝，如文獻中所述，例如Sambrook， et al.或Coligan，etal.。利用benton和Davis(1977)Science 196180-182中描述的噬斑雜交，對重組噬菌體進行分析。按照例如Grunstein et al.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 723961-3965一文中一般描述的方法，進行克隆雜交。
通過它能與本發明描述的核酸探針雜交的性能，例如在克隆雜交或噬斑雜交實驗中，能夠從cDNA文庫或基因組文庫中鑒定出編碼DC蛋白的DNA。使用本領域技術人員熟悉的一般方法就能分離出相應的DNA區域。見Sambrook et al。
也可以采用各種擴增目標序列的方法來制備編碼DC蛋白的DNA，例如采用聚合酶鏈反應。聚合酶鏈反應(PCR)技術可以用于擴增這類直接來自mRNA、來自cDNA以及來自基因組文庫或cDNA文庫的核酸序列。這些編碼DC蛋白的分離序列也可以作為PCR擴增的模板。
在PCR技術中，合成寡核苷酸引物，該引物與要擴增的DNA區域的兩個5’端互補。然后用這兩個引物進行聚合酶鏈反應。見Innis，etal.(編著)(1990)PCR ProtocolA Guide to Methods andApplications Academic Press，圣地亞哥，CA。可以選擇引物，擴增編碼選定的全長DC蛋白的整個區域，或者擴增需要的較小片段。一旦這些區域用PCR擴增后，那么就可以對它們進行測序，以及可以使用一般方法從這些序列中制備出寡核苷酸探針。然后，用這些探針分離其他形式DC蛋白的編碼DNAs。
可以采用下列方法化學合成用作探針的寡核苷酸Beaucage和Carruthers(1983)Tetrahedron Lett.22(20)1859-1962中首次描述的固相亞磷酰胺三酯法以及Needham-VanDevanter et al.(1984)Nucleic Acids Res.126159-6168。例如，采用非變性丙烯酰胺凝膠電泳或采用Pearson和Regnier(1983)J.Chrom.255137-149中描述的陰離子交換HPLC，進行寡核苷酸的純化。合成寡核苷酸的序列的驗證可以采用Maxam和Gilbert的化學降解法，該方法見Grossman和Moldave(1980編著)Methods in Enzymology 65499-560 Academic Press，紐約。
如文中所述，本發明提供了編碼DC蛋白的分離DNA或片段。此外，本發明還提供了編碼一種生物活性蛋白質或多肽的分離或重組DNA，該DNA在合適的條件下，例如在高度嚴緊性條件下能夠與本發明描述的DNA序列雜交。所述的生物活性蛋白質或多肽可以是天然形式或者是重組的蛋白或片段，并具有如SEQ ID NO2、4、8或10所描述的序列。優選的實施方案是全長的天然分離體，例如來自靈長類的全長的天然分離體。在糖基化形式中，該蛋白應該表現的更大。進一步，本發明包括這些分離或重組DNA或其片段的用途，這些DNA或其片段編碼的蛋白質與每一種對應的DC蛋白具有同源性。這些分離DNA在5’和3’兩側具有各自的調節序列，例如啟動子、增強子、聚腺苷酸化(poly-A)信號以及其他序列。IV.制備DC基因產物編碼這些DC蛋白或其片段的DNAs可以從以下來源獲得化學合成、cDNA文庫的篩選或者對從很多種細胞系或組織樣品中制備的基因組文庫進行篩選。
這些DNAs能夠在很多種宿主細胞中表達，用于合成例如用來生產多克隆或單克隆抗體的全長蛋白質或其片段；用于結合實驗；用于構建和表達修飾后的分子；以及用于結構/功能研究。所有這些蛋白及其片段都能在用合適表達載體轉化或轉染過的宿主細胞中表達。這些分子能夠基本上被純化，不含除重組宿主衍生蛋白以外的蛋白質或細胞污染物，因此基本上能夠與藥學上可接受載體和/或稀釋劑結合用于藥物組合物。這些抗原或其部分可以與其他蛋白一起以融合體的形式表達。
典型地，表達載體為含有期望的DC基因或其片段的自身-復制DNA或RNA構建體，通常任選地連接有合適的基因調控單元，在適當宿主中這些調控單元能夠影響表達。影響表達所需要的調控單元的特定類型取決于最終使用的宿主細胞。通常，基因調控單元可以包括一個原核啟動系統或一個真核啟動表達調控系統，典型地包括一個轉錄啟動子、一個任選的控制轉錄發生的操縱子、提高mRNA表達水平的轉錄增強子、編碼一個合適的核糖體結合位點的一段核酸以及終止轉錄和翻譯的序列。通常表達載體還含有一個復制起始位點使得載體能夠不依賴宿主細胞而獨立復制。
本發明的載體包含編碼各種DC蛋白或其片段，典型地為編碼一種生物活性多肽或蛋白的DNAs。這些可以處于病毒啟動子的調控之下并且能夠編碼一種選擇標記。本發明進一步還提供了這類表達載體的用途，這些表達載體能夠在原核或真核宿主中表達編碼DC蛋白的真核cDNA，這種情況下載體與宿主相容，編碼所述蛋白的真核cDNA插入到載體中從而實現隨著含有這種載體的宿主的生長所述的cDNA得到表達。通常，把表達載體設計為，在宿主細胞中適當復制或擴增大大增加每個細胞中期望基因的拷貝總數。一般不需要表達載體在宿主細胞中復制，例如，使用不含能夠被宿主細胞識別的復制起始位點的載體，能夠實現上述蛋白或其片段在各種宿主中的瞬時表達。也可以使用這樣的載體能夠通過重組引發DC基因或其片段整合到宿主DNA中的載體，或者整合了一個能夠調控內源基因表達啟動子的載體。
本發明使用的載體包括質粒、病毒、噬菌體、可整合的DNA片段以及其他能夠把DNA片段整合到宿主基因組中的載體。表達載體是含有基因調控單元的特定化的載體，這些調控單元能夠影響任選連接的基因。質粒是最常用的載體但是能完成等效功能的其他形式的載體也都適合用于本發明。見，例如，Pouwels，et al.(1985及增補)CloningVectorA Laboratory Manual Elsevier，N.Y.；以及Rodriquez，et al.(編著)(1988)VectorA Survey of Molecular Cloning Vectorand Their Uses Buttersworth，波士頓，MA。
合適的宿主細胞包括原核細胞、低等真核細胞以及高等真核細胞。原核細胞包括格蘭氏陰性菌和格蘭氏陽性菌。例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。低等真核細胞包括酵母，例如啤酒糖酵母和畢赤氏酵母屬以及Dictyostelium屬中的種。高等真核細胞包括現有的來自動物細胞的組織培養細胞系，這些動物細胞既包括昆蟲細胞和鳥等非哺乳動物起源，還包括人、靈長類以及嚙齒類等哺乳動物起源。
原核宿主-載體載體系統包括很多種用于許多不同物種的載體。如本發明所述，通常使用的大腸桿菌及其載體包括可用于其他原核細胞的等效載體。一種用于擴增DNA的代表性載體是pBR322或其衍生物。能夠用于表達DC蛋白的載體包括，但不限于，這些載體含lac啟動子(pUC-系列)的載體、含trp啟動子的載體(pBR322-trp)、含Ipp啟動子的載體(pIN-系列)；含λ-pP或pR啟動子的載體(pOTS)或含ptac等雜合啟動子的載體(pDR540)。見，Rodriguez和Denhardt(編著)VectorA Survey of Molecular Cloning Vectorand Their Uses 10205-236 Buttersworth，波士頓，MA中的Brosius，et al.(1988)“使用λ-、trp-、lac-以及Ipp-衍生啟動子的表達載體”，一文。
低等真核細胞，例如酵母和Dictyostelium，可以用來接受含DC基因序列的載體的轉化。為了實現本發明，最常用的低等真核細胞是面包酵母、啤酒糖酵母。盡管還有大量其他品系和種可以使用，但一般常用代表性的低等真核細胞。典型地，酵母載體由一個復制起始位點(整合型除外)、一個選擇基因、一個啟動子、編碼期望蛋白或其片段的DNA以及用于翻譯終止、聚腺苷酸化、轉錄終止的序列。用于酵母的合適表達載體包括3-磷酸甘油酸激酶及各種其他糖基化酶基因啟動子等組成型啟動子，或乙醇脫氫酶2啟動子等可誘導啟動子，或金屬硫蛋白(metallothionine)啟動子。合適的載體包括下列類型載體的衍生物自身-復制低拷貝數(例如YRp-系列)、自身-復制高拷貝數(例如YEp-系列)、整合型(例如YIp-系列)或微-染色體(例如YCp-系列)。
高等真核組織培養細胞用于表達DC蛋白的優選宿主細胞。理論上，大多數的任意一種高等組織培養細胞系都可以使用，例如昆蟲桿狀病毒表達系統，無論其來自無脊椎動物或脊椎動物。然而，優選哺乳動物細胞，因為它能夠在共翻譯和翻譯后兩方面都能實現恰當處理。這些細胞的轉化或轉染以及增殖都采用常規方法。有用的細胞系包括Hela細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、乳鼠腎(BRK)細胞系、昆蟲細胞系、鳥類細胞系、猴(COS)細胞系。用于這些細胞系的表達載體通常包括一個復制起始位點、一個啟動子、一個翻譯起始位點、RNA剪接位點(例如如果使用的是基因組DNA)、一個聚腺苷酸化位點以及一個轉錄終止位點。這些載體還可能包括選擇基因或擴增基因。合適的表達載體可以是質粒、病毒或帶有衍生啟動子的反轉錄病毒，例如從下列來源衍生出來的啟動子腺病毒、SV40、細小病毒、痘苗病毒或巨細胞病毒。合適的表達載體的代表性實例包括pCDNA1、pCD，見Okayama，et al.(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMClneoPoly-A，見Thomasm，et al.(1987)Cell 51503-512；以及pAC373或pAC610等桿狀病毒載體。
在某些情況下，這些DC蛋白不必糖基化就能引發特定分析中的生物反應。然而，往往希望在一種能夠提供一種特殊或特定糖基化形式的系統中表達DC多肽。在這種情況下，通常形式就是表達系統天然提供的形式。然而，通過把多肽例如以非糖基化形式暴露于引入到異源表達系統中的合適的糖基化蛋白，可以對這種上述形式進行修飾。例如，DC基因可以與一個或多個編碼哺乳動物或其他糖基化酶的基因共轉化。進一步還能理解到，過度的糖基化可能對DC蛋白的生物活性有害，本領域技術人員可以利用常規實驗優化糖基化的程度以賦予最佳生物活性。可以把DC蛋白構建成與細胞膜連接的磷酯酰肌醇(PI)，但是用磷酯酰肌醇切割酶處理能夠將其從膜上除去，例如用磷酯酰肌醇磷脂酶-C。這樣就能以生物活性形式釋放出抗原，并且確保用蛋白質化學的一般方法就能完成純化。見，例如，Low(1989)Biochem.Biophys.Acta 988427-454；Tse，et al.(1985)Science 2301003-1008；Brunner，et al.(1991)J.Cell Biol.1141275-1283；以及Coligan，et al.(編著)(1996并定期增補)CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley & Sons，紐約，NY。
既然這些DC蛋白已經被特征描述，因此通過合成肽鏈用的常規方法就能制備出DC蛋白的片段或衍生物。這些常規方法包括下列文獻中描述的方法Stewart和Young(1984)固相肽鏈合成PierceChemical Co.，Rockford，IL；Bodanszky和Bodanszky(1984)ThePractice of Peptide Synthesis Springer-Verlag，紐約，NY；以及bodanszky(1984)肽鏈合成原理Springer-Verlag，紐約，NY。還參見Merrified(1986)Science 232341-347；以及Dawson，et al.(1994)Science 266776-779。例如，疊氮法、酰基氯法、酸酐法、混合酸酐法、活性酯法(例如對硝基苯酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯或氰甲基酯)、碳化二咪唑(carbodiimidazole)法、氧化-還原法或二環己基碳二亞胺(DCCD)/添加劑法，這些方法都可以使用。固相合成和液相合成二者都可以應用于上述方法。
利用肽鏈分離，例如通過抽提、沉淀、電泳以及各種形式的層析等，能夠把上述制備到的蛋白質及其片段從反應混合物中分離和純化出來。根據預期用途，以不同純度制備本發明的DC蛋白。利用已知的蛋白質純化技術或利用抗體或本發明中描述的結合伴隨成分，能夠完成純化，例如利用免疫吸附親和層析。這種免疫吸附親和層析具體操作如下首先把抗體連接到一種固相載體上，讓被連接的抗體與下列物質接觸來源適當的細胞的溶解裂解液、表達蛋白質的其他細胞的裂解液或者生產蛋白質作為DNA技術結果的細胞的裂解物或上清液，見下文。
眾多細胞系都可以用于篩選與其他細胞相比高水平表達所述蛋白的細胞。各種細胞系，例如小鼠胸腺基質細胞系TA4，因其良好的處理特性可以用于篩選及選擇。天然DC細胞蛋白可以從天然來源分離獲得，或者使用適當的表達載體從轉化細胞中表達獲得。實現表達蛋白的純化可以使用一般方法，或者可以與能從細胞裂解物或上清液中高效地有效純化的遺傳工程手段結合使用。FLAG或His6節段可以用來作為這類純化特性。V.抗體能夠制備針對以下各種DC蛋白的抗體，包括單個的、多形態的、等位基因的、品系或種突變體及其片段，以天然生成(全長)形式和重組形式兩種形式存在。此外，也可以制備到針對活性形式或非活性形式的DC蛋白的抗體。抗獨特型抗體也可以使用。
a.制備抗體大量的免疫原可以用于生產與DC蛋白特異性反應的抗體。重組蛋白是用于生產單克隆或多克隆抗體的優選免疫原。也可以純化或非純化的形式使用天然生成蛋白。也可以利用本發明描述的人DC蛋白序列制備合成多肽，用這些多肽作為免疫原制備抗DC蛋白的抗體。如本發明所述，重組蛋白可以在原核細胞或真核細胞中表達。然后把產物注射到能夠產生抗體的動物中。可以將生產出的單克隆抗體或多克隆抗體隨后用于免疫測定中測量蛋白質。
生產多克隆或單克隆抗體的方法對于本領域技術人員來說是已知的。簡而言之，將免疫原優選純化蛋白質與佐劑混合，然后用該混合物免疫動物。取血樣監測該動物對于上述免疫原制劑的免疫反應，測定與關注的DC蛋白間的反應滴度。當得到適當高滴度的抗免疫原抗體時，從動物中收取血，制備抗血清。如果需要的話，可以對抗血清進行分級分離，富集對上述蛋白質具有活性的抗體。見，例如，Harlow和Lane。
單克隆抗體可以用本領域技術人員熟悉的各種技術獲得。簡而言之，從用目的抗原免疫過的動物中取出脾細胞，使脾細胞無限增殖化，往往通過與骨髓瘤細胞融合。見，例如，Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol.6511-519，在此引入作為參考。無限增殖的替代方法包括用EB病毒轉化、癌基因、或反轉錄病毒、或其他本領域已知的方法。從來自單個無限增殖細胞的克隆中篩選出能生產具有期望抗原特異性及親和力的抗體，通過各種技術可以提高這些細胞生產的單克隆抗體的產量，包括注射到脊椎動物宿主的腹膜腔中。替代地，利用Huse，et al.(1989)Science 2461275-1281中概述的一般方法對來自人B細胞的DNA文庫進行篩選，可以分離得到編碼單克隆抗體或其結合片段的DNA序列。
用上述載體與這些片段的共軛物免疫動物制備抗這些DC蛋白預定片段的抗體，包括結合片段及單鏈型式。從分泌期望抗體的細胞中制備單克隆抗體。從這些抗體中篩選出能與正常或缺陷型DC蛋白結合的抗體，或者篩選出具有激動或拮抗活性的抗體。這些單克隆抗體結合1KD通常至少約1mM，更通常為至少約300μM，典型地至少約100μM，更典型地至少約30μM，優選至少約10μM，更優選至少約3μM或更優。
在一些情況下，希望從各種哺乳動物宿主中制備出單克隆抗體，例如從小鼠、嚙齒類動物、靈長類、人等。制備這些單克隆抗體的技術的描述見，例如，Stites et al.(編著)基礎和臨床免疫學(第4版)Lange Medical Publications Los Altos，CA，以及其中引述的文獻；Harlow和Lane(1988)抗體實驗指南CSH pressGoding(1986)單克隆抗體原理及實踐(第2版)academic press，紐約，NY；以及特別是Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497，其中討論了一種生產單克隆抗體的方法。簡單地概述，這種方法包括用一種免疫原注射動物引發體液免疫反應。然后宰殺該動物，從脾中取細胞，然后將脾細胞與骨髓瘤細胞融合。結果得到一種能夠體外增殖的雜交細胞或“雜交瘤”。然后從這些雜交瘤中篩選分離出單個的克隆，其中的每一個克隆分泌單一種類的抗免疫原抗體。這樣，得到的單一種類的抗體就是來自免疫動物的無限增殖并克隆的B細胞的產物，這些產物響應于該免疫原物質上的一個特異性識別位點產生的。
其他可以使用的技術包括噬菌體或類似載體中抗體文庫的篩選。見，Huse，et al.(1989)“generation of a large combinationlibrary of immunoglubin repertoire in phage lambda，”Science2461275-1281；以及Ward，et al.(1989)Nature 341544-546。本發明的多肽或抗體可以經過或不經修飾使用，包括嵌合或人源化抗體。通常，通過共價鍵或非共價鍵的形式連接一種能提供可檢測信號的物質，對上述多肽和抗體進行標記。現在已知有很多種標記物及共軛技術，它們廣泛地報道于科技和專利文獻中。合適的標記物包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光組分、化學發光組分、磁性顆粒等。有關這些標記物的教導的專利，包括美國專利US3817837、US3850752、US3939350、US3996345、US4277437、US4275149以及US4366241。另外，還可以生產重組免疫球蛋白。見，Cabilly的美國專利US4816567以及Queen，et al.(1989)Proc.Natl.Acad.USA 8610029-10033。
本發明的抗體也可以用于親和層析分離各種DC蛋白。制備層析柱，把抗體連接到固相載體上，例如連接瓊脂糖、葡聚糖凝膠等顆粒上。讓細胞裂解液通過層析柱，洗滌柱體，接著增加溫和變性劑的濃度，從而釋放出純化的DC蛋白。
這些抗體也可以用于從表達文庫篩選特定的表達產物。通常，這種方法中使用的抗體都用一種組分做了標記，該組分能夠使得抗原的檢測因抗體的結合而變得容易。
抗DC蛋白的抗體可以用于分析或鑒定表達有相應蛋白的特定細胞群體成分。通過分析表達DC蛋白的細胞的表達產物，能夠診斷疾病，例如免疫損傷、DC缺失或DC的過量表達。
抗各種DC的抗體也可以用于制備抗獨特型抗體。這些抗體可以用于檢測和診斷各種與相應抗原有關的免疫疾病。
b.免疫分析特定的蛋白質能夠通過多種免疫測定方法來測量。關于免疫學或免疫分析方法的總體上的綜述參見，Stites和Terr(編著)1991基礎和臨床免疫學(第7版)。而且，利用下列文獻中全面綜述的幾種方法中的任意一種，都能夠實現本發明的免疫測定Maggio(編著)EnzymeImmunoassav CRC Press，Boca Raton，佛羅里達；生物化學和分子生物學中的實驗技術.Elsevier Science Publishers B.V.，阿姆斯特丹一書中的Tijan(1985)“酶免疫測定的理論及實踐，”；以及Harlow和Lane(1989)抗體實驗指南，上述文獻在此引入作為參考。參見Chan(編著)(1987)免疫測定操作指南Academic Press，0rlando，FL；Price和Newman(編著)(1991)免疫測定的理論和實踐Stockton Press，NY；以及Ngo(編著)(1988)非同伉素免疫分析Plenum Press，NY。
用于測量這些DC蛋白的免疫測定，可以通過多種本領域技術人員已知的方法實現。簡而言之，測量這些蛋白的免疫測定可以是競爭性或非競爭性結合測定。在競爭性結合測定中，待分析的樣品與標記的分析樣對結合到固體表面的捕獲試劑上的特異性結合位點展開競爭。優選地該捕獲試劑是上述制備的能與DC蛋白特異性反應的抗體。結合到捕獲試劑上的標記分析物濃度與樣品中出現的游離分析物成反比。
在競爭性結合免疫測定中，樣品中出現的DC蛋白與標記蛋白對競爭性地與特異性結合試劑結合，例如，抗體特異性地與DC蛋白反應。可以把結合試劑結合到固體表面以實現被結合標記蛋白與未被結合標記蛋白的分離。替代地，競爭性結合測定可以在液相中進行，大量本領域已知技術中的任意一種都可以用于被結合標記蛋白與未被結合標記蛋白的分離。分離之后，測定被結合標記蛋白的量。樣品中出現的蛋白的量與標記的蛋白結合量成反比。
替代地，可以進行一種同源性免疫測定，其中不需分離的步驟。在這些免疫測定中，由于蛋白質與其特異性結合試劑的結合，該蛋白上的標記物發生變化。標記蛋白中的這種變化導致標記物發出信號的增強或減弱，從而在免疫測定結束時能夠通過測量標記物來檢測或定量蛋白質。
也可以使用多種非競爭性免疫測定方法對這些DC蛋白進行定量測定。例如，可以使用一種雙位點、固相夾心免疫測定。在這種類型的測定方法中，把一種針對蛋白質的結合試劑，例如把抗體結合吸附到固體載體上。第二蛋白結合試劑也可以是抗體，能夠結合到該蛋白質的另一個位點上，它也被標記。當所述蛋白的兩個位點都被結合后，除去那些未被結合的標記結合試劑，測定結合到固體載體上的標記結合試劑的量。被結合的標記結合試劑的量與樣品中的蛋白含量成正比。
也可以用Western印跡分析測定樣品中DC蛋白的存在。進行電泳，例如，對懷疑含有該蛋白的樣品。電泳分離蛋白質以后，把蛋白質轉印到一種合適的固體載體上例如硝酸纖維素濾膜，用能與變性后的蛋白反應的抗體溫育該固體載體。這種抗體可以被標記，或者替代地通過隨后用經過標記的、能與這種第一抗體結合的第二抗體溫育來實現檢測。
上述免疫測定模式使用標記測定成分。這種標記可以是多種形式的。可以根據本領域已知的方法，把標記物直接或間接偶聯到測定的期望成分上。很多種的標記物都可以使用。可以從幾種方法中選用一種來標記該組分。傳統上使用的是包括3H、125I、35S、14C或32P的放射性標記物。非放射性標記物包括能夠與標記抗體結合的配體、熒光物、化學發光試劑、酶以及以及能夠作為標記蛋白的特異性結合配對成員的抗體。標記物的選擇取決于以下因素所需的靈敏度、易與化合物連接、對穩定性的需求以及現有的儀器。關于可以使用的各種標記物或信號產生系統的綜述，見美國專利US4391904，在此引入作為參考。
能與特定蛋白反應的抗體也能通過多種免疫測定方法來測量。用免疫測定技術測量抗體中使用的免疫或免疫測定方法，這方面的綜述，見，例如，上述的Stites和terr(編著)基礎和臨床免疫學(第7版)；上述的Maggio(編著)酶免疫分析；以及上述的Harlow和Lane(1989)抗體實驗指南。
與上述內容類似，多種不同的免疫測定模式、分離技術以及標記物也能夠用于特定蛋白的測量。VI.純化的DC蛋白SEQ ID NO1和2提供的是靈長類，例如人，DCMP1的核苷酸序列及氨基酸序列。SEQ ID NO7和8提供的是嚙齒類，例如小鼠，DCMP1的核苷酸序列及氨基酸序列。SEQ ID NO3和4提供的是靈長類，例如人，DCMP2的核苷酸序列及氨基酸序列。SEQ ID NO9和10描述的是另外一個突變體。SEQ ID NO5和6提供的是類似的靈長類肝脫唾液酸糖蛋白序列。這些肽鏈序列使得能夠制備出用于生產識別這些節段的抗體的肽鏈，使得能夠制備出編碼這些序列的寡核苷酸。VII.物理突變體本發明還包括具有以下序列的蛋白質或多肽，即基本上與SEQ IDNO2或8的氨基酸序列或SEQ ID NO4或10的部分序列相似的氨基酸序列。還可以獲得表現出如下數目殘基被取代的突變體，例如，20或更少，優選10或更少，更優選5個或更少。當取代是保守性的取代時，這些突變體會具有相似的免疫原性或抗原性，或者能與相應的天然序列蛋白交叉反應。天然突變體包括包括單個的、多形態的、等位基因的、品系或種突變體。
通過優化殘基配對，如果需要按需求導入間隙，測定氨基酸序列的相似性或序列的一致性。當把保守性取代看作配對時這就會發生變化。典型地，保守性取代包括在下列基團中的取代甘氨酸、丙氨酸，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸，天冬氨酸、谷氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺，絲氨酸、蘇氨酸，賴氨酸、精氨酸，以及苯丙氨酸、酪氨酸。同源氨基酸序列包括每個相應蛋白序列中的天然等位突變和種間突變。典型的同源蛋白或多肽與相關DC蛋白的氨基酸序列具有從50～100％的相似性(如果導入間隙)，到75～100％的相似性(如果把保守性取代也包括在內)。一致性測量至少為約50％，通常至少60％，更通常至少65％，普遍至少70％，更普遍至少75％，優選至少80％，以及更優選至少，在特別優選的實施方案中，至少85％或更高。見，Needleham，etal.(1970)分子生物學雜志48443-453；Sankoff，et al.(1983)Time Warps，String Edits，and MacromoleculesThe Theoryand Practice of Sequence Comparison第一章，Assison-Wesley，Reading，MA；以及出自IntelliGenetics的軟件包，Mountain View，CA；以及the University of Wisconin Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI。
為了進行序列比較，典型地把一個序列作為參考序列，而用測試序列與它比較。當使用序列比較算法時，把測試序列和參考序列輸入到電腦中，指定序列整理，如果需要，設定序列算法的程序參數。然后，根據設定的程序參數，用序列比較算法計算出測試序列相對于參考序列一致性的百分比。
利用下列方法可以在序列比較中進行視覺調準，例如，利用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482中的局部同源性對比，利用Needlman和Wunsch(1970)分子生物學雜志48443中的同源性對比算法，利用Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444中相似性方法的研究，用計算機執行這些算法(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.Madison，WI)，或者利用目測檢查(一般性的描述見上述Ausubel et al.)。
有用算法的一個實例是PILEUP，PILEUP能從一組相關序列中創建一種多序列對比，用連續、配對算法表明相互關系以及序列一致性的百分比。它也可以繪制成一種樹或樹形圖，顯示用于創建該算法的簇的相互關系。PILEUP使用的是Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35351-360中的連續對比方法的簡化形式。所使用的這種方法與Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5151-153中描述的方法類似。這種程序能夠對比多達300個序列，其中每個序列的最大長度可達5000核苷酸或氨基酸。多個序列對比方法從兩個最相似的序列的配對對比開始，產生一個由兩對比序列組成的簇。然后，把這個簇與下一個最相關的序列或由對比序列生成的簇進行對比。利用兩個單個序列配對對比的簡單延伸，就可以對兩簇序列進行對比。通過一系列連續、配對對比實現最終序列對比。通過指定特定序列以及它們的氨基酸或核苷酸在在序列比較區域的配對以及通過指定程序參數，可以運行該程序。例如，可以用一個參考序列與其他測試序列進行比較用下列參數來測定序列一致性的百分比默認的間隙權重(3.00)，默認的間隙長度權重(0.10)和加權的末端間隙。
適合于測定序列一致性百分比及序列相似性的算法的另一個實例是BLAST算法，該算法描述見Altschul，et al.(1990)分子生物學雜志215403-410。用于運行BLAST分析的軟件可以從國家生物技術信息中心公開獲得(httpwww.ncbi.nih.gov/)。這種算法包括首先通過查出查詢序列中長度W的短序列單元來鑒定高分值序列對(HSPs)，這些序列單元在與數據庫序列中的等長序列單元對比時應符合或滿足陽性價值的閾分值T。T被認為是相鄰序列單元分值閾(上面已引述的Altschul，et al.)。把這些起始相鄰序列單元樣作為種序列啟動發現含有它們的較長HSPs。只要積累的配對分值能夠不同增大，就可以將序列單元樣沿每個序列向兩個方向擴展。當發生下列情況時這些序列單元樣的擴展會終止配對的積累分值從從所能實現的最大分值降為定量X后；由于一個或多個陰性-分值的殘基對比的積累，所述積累分值達到0或0以下；其中一個序列的末端已經到達。BLAST算法的參數W、T和X決定對齊的敏感度和速度。BLAST程序把序列單元長11作為默認值，BLOSUM分值矩陣(見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)校準值(B)50，期望值10，M＝5，N＝4以及雙鏈比較。
除計算序列一致性的百分比外，BLAST算法還進行了兩序列之間相似性的統計學分析(見，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787)。BLAST算法提供的一個相似性測量值為最小加和概率(sum probability)(P(N))，這個值指示兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然發生配對的概率。例如，如果當測試核酸與參考核酸比較時最小加和概率的值小于約0.1，就認為該核酸序列與參考序列相似，更優選最小加和概率的值小于約0.01，最優選小于0.001。
如下所述，兩個多肽的核酸序列基本相似的進一步的指示是，第一個核酸編碼的多肽與第二個核酸編碼的多肽之間能發生免疫學交叉反應。因此，例如，如果這兩個多肽的區別僅在于保守性取代上，那么典型地一個多肽與另一個多肽基本相同。如下所述，兩個核酸序列基本相同的另一個指示是這兩個分子在嚴緊性條件能夠相互雜交。
典型地，編碼相應哺乳動物DC蛋白的核酸能在嚴緊性的條件下與SEQ ID NO1或7或者SEQ ID NO3的適當部分雜交。例如，典型地編碼相應DC蛋白的核酸在嚴緊性條件下能與SEQ ID NO1、7、3或9雜交，只要很少有假陽性雜交信號。通常，嚴緊性條件為在特定離子強度和pH下選擇比被雜交序列的解鏈溫度(Tm)低10℃的溫度。所述的Tm是當目標序列的50％與優選匹配的探針雜交時的溫度。典型地，嚴緊性條件是這樣的pH7的情況下洗滌液中的鹽離子濃度為約0.02摩爾，溫度至少約50℃。其他顯著影響雜交嚴緊程度的因素包括，尤其為，堿基組成及互補鏈的大小，是否加入甲酰胺等有機溶劑，以及堿基錯配程度。一個優選實施方案要包括能與公開序列在42℃以及含有50％甲酰胺和20～50mM NaCl的條件下雜交的核酸。嚴緊性條件下的雜交應該給定一種至少是普通背景兩倍的背景，優選至少3～5倍或更高。
通過核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入以及核苷酸延伸倒位，可以容易地對分離DC基因DNA進行修飾。這些修飾會導致新的DNA序列，這些新的序列編碼這些DC抗原、它們的衍生物或具有高度相似物理學、免疫學或抗原活性的蛋白質。
經過修飾的序列能夠用于生產突變體抗原或提高表達。提高后的表達包括基因擴增、增強轉錄、增強翻譯以及其他機制。這些突變的DC蛋白衍生物包括相應蛋白或其片段的預定突變體或點特異性突變體。“突變的DC蛋白”包括符合以下條件的多肽除由于缺失、取代或插入導致其具有與天然發現DC蛋白不同的氨基酸序列外，其他方面都落入上述建立的DC蛋白同源性定義之內。特別是，通常“點特異性突變DC蛋白”包括具有與SEQ ID NO2或8所示蛋白明顯類似的序列的蛋白質。通常，突變體具有許多與那些原來的序列相同的理化特性和生物學特性，例如抗原性或免疫原性，優選實施方案中包括了公開序列中的大部分或全部。類似的概念可以應用于這些不同的DC蛋白，尤其是在各種溫血動物中發現的那些概念，例如靈長類和哺乳類動物。
盡管位點特異性突變位點是預定的，突變體不需要是位點特異性的。通過制備氨基酸插入或缺失進行DC蛋白誘變。可以制造取代、缺失、插入或其任意組合達到最終結構。插入包括氨基末端或羧基末端融合。在目標密碼子上進行隨機誘變，然后從表達突變體中篩選期望活性。在序列已知的DNA中的預定位點上制備取代突變的方法是本領域技術人員眾所周知的，例如，通過M13引物誘變或聚合酶鏈反應(PCR)技術。參見，Sambrook，et al.(1989)以及Ausubel，et al.(1987及增補)。正常情況下，DNA中的突變不應該把編碼序列置于閱讀框之外，優選不會制造出能夠雜交生成環或發夾等次級mRNA結構的互補性區域。
本發明還提供了重組蛋白，例如用來自這些蛋白的節段制備的異源融合蛋白。一種異源融合蛋白是天然狀態下正常情況不會以同樣方式融合的蛋白或節段的融合體。因此，免疫球蛋白與相應DC多肽形成的融合產物是一種連續蛋白分子，該分子具有融合到典型肽鏈接頭中的序列，典型地制備成一種單個的翻譯產物，該產物表現出來自每個肽鏈來源的特性。一種類似的概念可以應用于異源核酸序列。
此外，也可以把來自其他蛋白質的類似的功能性結構域結合起來制備出新的結構。例如，可以在不同的新的融合多肽或片段之間，“交換”結構域或其他節段，典型地在相關蛋白之間，例如在凝集素或脫唾液酸糖蛋白家族內。優選地，使用完成的結構性結構域，例如完整的Ig部分。見，例如，Cuuningham，et al.(1989)Science 2431330-1336；以及O’Dowd，et al.(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。因此，表現出新的特異性組合的新型嵌合多肽會因蛋白結合特性與其他功能性結構域之間的功能性連接而產生。另外，還可以使用丙氨酸篩選誘變，優選對不參與形成二級結構的殘基進行誘變，以避免大部分通常會破壞三級結構的關鍵殘基。
這些DC蛋白的“衍生物”包括氨基酸序列突變體、糖基化突變體以及與其他化學單元形成的共價或聚集共軛物。利用本領域眾所周知的方法，把這些DC蛋白氨基酸側鏈或者N-或C-末端發現的基團功能性連接起來制備共價衍生物。這些衍生物可以包括，但不限于，羧基末端的脂肪族酯或酰胺，或含有羧基側鏈的殘基，含羥基基團殘基的O-酰基衍生物，例如賴氨酸或精氨酸。酰基基團選自包括C3～C18正常烷基的烷基-單元的基團，從而形成烷酰基芳酰基種類。當免疫原性單元是半抗原時，與載體蛋白的共價連接可能是重要的。
特別是，把糖基化變化包括在內，例如在多肽的合成及處理的過程中，或在進一步的處理步驟中通過改變多肽的糖基化形式來制備。完成該過程特別優選的方法是把多肽暴露于糖基化酶，該糖基化酶來自正常情況能提供這種處理的細胞，例如哺乳動物糖基化酶。還提供了去糖基化酶。另外還包括與同一初始氨基酸序列之間只有其他較小變化的型式，包括磷酸化氨基酸殘基，例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸，或其他單元，包括核糖基基團或交叉-連接試劑。另外，還包括含有取代的蛋白質，該蛋白應該保留有基本的免疫原性，能夠生產出識別SEQ ID NO2、4、8或8的蛋白的抗體。典型地，相對于公開序列這些蛋白含有少于20個殘基的取代，更典型地少于10個殘基的取代，優選少于5個，更優選少于3個。替代地，蛋白以結構性的結構域開始和結尾，通常保留了抗原性和交叉免疫原性。
一組主要的衍生物是DC蛋白或其片段與其他蛋白或多肽的共價其軛物。這些衍生物可以用N-或C-末端融合等重組培養的方法合成，或利用本領域已知的試劑通過反應性的側鏈基團把蛋白質交叉連接。優選使用交叉-連接的蛋白衍生物位點是游離氨基、糖單元以及半胱氨酸殘基。
還提供了這些DC蛋白與其他同源或異源蛋白之間融合而成的多肽。異源多肽可以是不同的表面標記之間的融合，導致例如一種雜合蛋白。同樣，也可以構建異源融合，使其表現出衍生蛋白特性或活性的結合。典型的實例是熒光素酶等報道多肽與蛋白質的節段或結構域，例如與受體結合節段之間的融合，從而使得能夠容易地測定出融合蛋白的存在或位置。見，例如，Dull等人的美國專利US4859609。其他的基因融合伴侶包括細菌的β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、β-內酰胺酶、α淀粉酶、乙醇脫氫酶以及酵母α交配因子。見，例如，Godowski，et al.(1988)Science 241812-816。
這些多肽還可以具有經過了下列化學修飾的氨基酸殘基磷酸化、磺化、生物素化，或者添加或除去其他單元，尤其是那些分子形狀與磷酸基團類似的單元。在一些實施方案中，所述的修飾是有用的標記試劑，或能夠作為純化的目標，例如親和配體。
本發明還提供了除氨基酸序列或糖基化突變體之外的DC蛋白衍生物的用途。這些衍生物可以包括與化學單元的共價或聚集連接。這些衍生物通常分為以下3類(1)鹽，(2)側鏈或末端殘基的共價修飾，以及(3)吸附復合物，例如與細胞膜。這些共價或聚集衍生物可以作為免疫原，免疫測定中的試劑或者用于純化方法例如作為親和純化的配體或其他結合配體。例如，通過本領域眾所周知的方法，可以共價形式將DC蛋白固定連接到溴化氰活化后的瓊脂糖凝膠(Sepharose)上，或吸附到用或不用戊二醛交叉連接的聚烯烴表面，用于抗DC蛋白抗體的測定或純化。也可以用可檢測基團對所述DC進行標記，例如通過氯胺T方法用放射性碘標記，以共價形式結合到稀土螯合物上，或共軛連接到另一種熒光單元用于診斷實驗。這些DC蛋白的純化會受到固定化了的抗體的影響。
分離的DC蛋白基因使得可以對那些不表達相應DC蛋白的細胞進行轉化，例如對不同種類或不含相應DC蛋白并表現陰性背景活性的細胞進行轉化。轉化基因的表達使得能夠進行抗原純化細胞系的分離，用特定的或單一種類突變體。這種方法能提供更敏感的檢測，而且可以消除這些DC蛋白的生理學影響。亞細胞組分，例如細胞質或胞膜組分，也能夠被分離和使用。VIII.結合因子DC蛋白復合物用免疫測定實驗對一種DC蛋白進行測定，該DC蛋白能與一種用特定免疫原制備的抗體之間特異性地結合或發生特異性的免疫反應，例如具有SEQ ID NO2、4、8或10的氨基酸序列的免疫原。所述的免疫測定實驗使用一種用SEQ ID NO2、4、8或10蛋白制備的多克隆抗血清。這種抗血清選擇與相關家族其他成員具有低的交叉反應性，并且任意這樣一種交叉反應性能夠通過在用于免疫測定之前的免疫吸附除去。
為了生產用于免疫測定的抗血清，按照本發明的描述分離SEQ IDNO2、4、8或10的蛋白。例如，用哺乳動物細胞系生產重組蛋白。使用弗氏完全佐劑等一般佐劑以及標準的小鼠免疫方法(見上述的Harlow和Lane)。替代地，可以用一種從本發明公開的序列衍生而來并偶聯于載體蛋白上的合成多肽作為免疫原。收集多克隆血清，并用免疫測定實驗測定其抗免疫原的滴度，例如，一種將免疫原被固定在固相載體上的固相免疫測定。利用競爭性結合免疫測定，例如上述文獻Harlow和Lane第570-573頁描述的方法，選取滴度為104或以上的多克隆抗血清，測定其與其他相關蛋白的交叉反應性。優選將兩種不同的相關蛋白用到這種測定中同給定的DC蛋白偶聯。例如，同凝集素蛋白，至少習慣上將兩個其他的家族成員吸附除去相同的表位。在同DCMP1家族成員偶聯時，使用該家族的兩個其他成員。可以重組蛋白的形式生產這些其他的家族成員，并按照本發明描述用普通的分子生物學及蛋白質化學技術對其進行分離。
競爭性結合模式的免疫測定可以用于交叉反應測定。例如，可以將SEQ ID NO2或8的蛋白固定在固相載體上。添加到測定中的蛋白與固定抗原之間展開了結合抗體的競爭。將上述蛋白的與固定抗原競爭結合抗體的能力同SEQ ID NO2或8的蛋白進行比較。用一般計算方法計算上述蛋白交叉反應的百分比。選取并合并符合下列條件的抗血清，即與上面列出的每個蛋白之間交叉反應的百分比低于10％。然后，利用上面列出的蛋白通過免疫吸附從合并的抗血清中除去交叉反應抗體。
然后按照上述方法，將經過免疫吸附且合并后的抗血清用于競爭性結合免疫測定中比較第二種蛋白同免疫原蛋白(例如，SEQ ID NO2或8的蛋白)。為了實現這種比較，將這兩種蛋白都在寬的濃度范圍內單獨測定，測定出每種蛋白在抑制抗血清與固定化蛋白之間50％的結合時所需的量。如果第二種蛋白的這個量比SEQ ID NO2或8蛋白小2倍，那么就認為所述的第二種蛋白同用免疫原生產的抗體之間是特異性的結合。
可以理解到的是DC蛋白可能是一個同源蛋白家族，其中包括2個或更多個基因。對于一種特定的基因產物，例如人Ig家族成員蛋白，本發明不僅包括了如本發明公開的氨基酸序列，而且還提供了等位突變體、多形態突變體、非等位突變體或種突變體蛋白。還可以理解到的是“人DC蛋白”一詞包括利用下列手段導入的非天然突變利用單一位點突變等傳統重組技術進行的精確突變，或者切除編碼這些蛋白的DNA的一小部分或來自該基因的剪接突變體，或者取代或添加少量新的氨基酸。這些小改變必須是在基本保留原始分子的免疫一致性和/或其生物活性的前提下進行。因此，這些改變包括與指定的天然生成的相應DC蛋白之間發生特異性免疫反應的蛋白，例如，具有SEQID NO4序列的人DC蛋白。如上所述就每個蛋白家族的整體而言，被認為是小改變的特定蛋白修飾要包括具有類似化學特性的氨基酸保守性取代。通過將一種蛋白與SEQ ID NO2或8的蛋白進行最優對比，并且利用本發明描述的傳統免疫測定法，能夠測定出本發明的蛋白組合物。IX.用途本發明提供了能夠用于本發明其他部分描述的診斷用途的試劑，例如，關于發育異常的概述中，或者下面的關于用于診斷的試劑盒的描述中。特別地，所述基因能夠用作標記區分細胞類型，包括細胞的基因組方面，以及mRNA及蛋白質的表達模式。
DC基因，例如DNA或RNA可以用作法醫化驗中的組分。例如，提供的核苷酸序列可以用32P或生物素等標記，并能夠作為探針用于一般的限制性片段多肽性印跡實驗中，只要可測量的特性有助于個體間的區分。這些探針可以用于基因指紋圖譜等眾所周知的法醫技術中。此外，從DC序列制備成的核苷酸探針還可以用于原位雜交實驗探測染色體異常。
針對DC蛋白的抗體或其他結合因子可以用于純化相應的DC蛋白分子。如下面實施例中所述，DC蛋白的抗體純化是可能而且是可行的。抗體或其他結合因子也可以用于診斷方式，用本發明描述的眾所周知的技術測定是否有DC成分出現在組織樣品或細胞群體中。把結合因子連接到DC蛋白上的性能為診斷與表達錯誤調節有關的紊亂。抗體和其他DC蛋白結合因子還可以用作組織學或法醫學標記。
如下面實施例中所述，所有這些蛋白的表達都限于特定組織類型。通過控制一種探針，例如針對相應DC蛋白的抗體或核酸，能夠用該探針在原位或體外區分組織及細胞的類型。
本發明還提供了具有重要治療價值的藥物。DC蛋白(天然生成或重組)、其片段、其所對應的抗體、連同被鑒定為對DC蛋白具有結合親和力的蛋白，它們都可以用于治療與異常生理或異常發育有關的疾病，包括異常增殖，例如癌癥或退行性疾病。異常增殖、再生、退化以及萎縮都可以通過本發明提供的組合物醫治而得到調節。例如，與DC蛋白的異常表達或異常信號有關的疾病或紊亂就是所述蛋白的激動劑或接抗劑的目標，例如抗原提呈細胞出現疾病或紊亂的情況。所述蛋白可能在淋巴細胞等造血細胞的調節和發育過程中發揮作用，這些造血細胞影響免疫反應，例如抗原提呈以及因此產生的效應器功能。
利用Northern印跡分析可以得知被證明能夠處理DC蛋白mRNA的細胞類型中的其他異常發育病癥。見Berkow(編著)The MerckManual of Diagnosis and Therapy，Merck & Co.，Rahway，NJ；以及Thorn，et al.Harrison’s Principles of Internal Medicine，McGraw-hill，NY。發育或功能異常，例如免疫系統的發育或功能異常導致嚴重的醫學異常及疾病，這些異常及疾病利用本發明提供的組合物能夠得到有效的預防和治療。
重組DC蛋白或抗體可以純化后施用給患者。可以將這些藥物與另外的活性或惰性成分聯合用于治療，例如，與常規的藥學可接受載體或稀釋劑，例如免疫佐劑，連同生理上無毒的穩定劑及賦形劑。特別地，這些藥物可以用于疫苗領域，所述抗原與這些治療型式的激動劑或拮抗劑中的一種結合在一起。這些結合物經過過濾除菌，按單位劑量分裝，置于單位劑量管瓶中凍干保存或以穩定化了的水溶液制劑的形式保存。本發明還提供了抗體或其結合片段，包括非互補結合的形式。
使用抗體或受體或其片段進行篩選能夠鑒定出對這些DC蛋白具有結合親和力的化合物，包括相關化合物的分離。然后利用隨后的生物學分析測定該化合物是否具有內在的刺激活性，并因其能阻斷所述蛋白的活性而可以作為一種阻斷劑或拮抗劑。同樣，具有內在刺激活性的化合物可以通過所述蛋白活化細胞，并因其能刺激細胞而可作為一種激動劑。本發明進一步還提供了作為所述蛋白的拮抗劑的抗體的用途。
有效治療所需的藥物量取決于許多不同的因素，包括給藥方法、目標位點、患者的生理狀態以及服用的其他藥物。因此，應當精確地滴定治療劑量，使安全性和有效性都達到最佳。典型地，體外使用劑量能夠為原位使用這些藥物時的用量提供有用的指導。治療特定疾病有效劑量的動物實驗為確定人用劑量提供了進一步的預見性指導。各種考慮在文獻中已有描述，例如，Gilman，et al.(編著)(1990)Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第8版)Pergamon Press；以及(1990)Remington’S Pharmaceutical Science(第17版)Mack Publishing Co.，Easton，PA。其中討論的給藥方法如下，例如口服、靜脈注射、腹膜內注射或肌內注射，經皮擴散以及其他方式。藥學上可接受的載體包括水、鹽水、緩沖液，以及例如the Merck Index，Merck & Co.，Rahway，NJ中描述的其他化合物，。劑量范圍一般期望低于1mM的濃度，典型地低于約10μM，通常低于約100nM，優選低于約10pM(皮摩爾)，以及最優選低于約1fM(飛摩爾)，與適當載體結合。常常將緩釋制劑或緩釋裝置用于持續給藥。
DC蛋白、DC蛋白片段、抗DC蛋白和DC蛋白片段的抗體、拮抗劑以及激動劑都可以直接施用給被治療的宿主，或者依據這些化合物的大小，可以按照需要在施用之前將它們偶聯到卵白蛋白或血清白蛋白等載體蛋白上。治療用制劑可以采用多種傳統劑型給藥。盡管所述的活性組分可以單獨給藥，但是優選將其制備成藥用制劑。制劑典型地包括至少一種如上所述的活性成分，連同一種或多種能夠為活性組分接受的載體。每種載體都應該是在制藥學和生理學兩方面均可接受的，也就是說能與其他成分相容并且不會傷害患者。制劑包括那些適于口服、直腸用、滴鼻或胃腸道外(包括皮下、肌內、靜脈內以及皮內)給藥的形式。該制劑可方便地以單位劑量的形式提供，可以采用任意一種制藥領域中熟知的方法制備。見，例如，Gilman，et al.(編著)(1990)Goodman and Gilman’sthe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第8版)Pergamon Press；以及(1990)Remington’S Pharmaceutical Science(第17版)Mack Publishing Co.，Easton，PA；avis，et al.(編著)(1993)藥物的制劑形式胃腸道外藥物Dekker，NY；Lieberman，et al.(編著)(1990)藥物的制劑形式片劑Dekker，NY；以及Lieberman，et al.(編著)(1990)藥物的制劑形式分散系統Dekker，NY。可以將本發明的治療方法與其他化療藥物或化學預防藥物聯合或者結合使用。
本發明的DC蛋白的天然生成形式和重組形式都可以具體地應用于試劑盒及測定方法中，而用這些試劑盒及測定方法能夠篩選出對所述蛋白具有親和活性的化合物。近年來發展的幾種自動測定方法使得能夠在短時間內對幾萬個化合物進行篩選。見，例如，Fodor，et al.(1991)Science 251767-773，以及其他有關化學多樣性文庫(chemical diversity libraries)的文獻，這些文獻中描述了用于測試大量化合物結合親和力的方法。本發明所提供的純化DC蛋白，例如可溶型式，可以大量地獲得，這極大地促進了合適的測定方法的發展。
例如，一旦所述蛋白的結構決定了，那么就能夠發現拮抗劑。由于高度自動化方法的發展，使得利用一種純化蛋白就能對潛在的蛋白類似物進行測試。特別地，利用本發明描述的方法會發現新的激動劑和拮抗劑。發現的這類化合物是特別重要的，它們對相關細胞表面抗原具有聯合的結合親和力，例如，能夠作為DC蛋白種突變體的拮抗劑的化合物。
特別地，通過將重組DC蛋白用于多種篩選技術，本發明可以用于篩選化合物。利用重組蛋白篩選特定配體具有以下優點(a)增加了來自特定來源的蛋白的可更新來源；(b)由于測定中信噪比更優，因而潛在地增加了每個細胞中的抗原數目；(c)種突變體特異性(理論上給出了更強的生物及疾病特異性)。
一種藥物篩選方法可以使用具有如下特性的真核或原核宿主細胞，即能夠穩定地接受重組DNA分子的轉化表達DC蛋白。將所述蛋白脫離其他蛋白單獨表達的細胞可以被分離。這類細胞以活細胞或固定化的形式存在，能夠用于一般的表面蛋白測定。參見，Parce，et al.(1989)Science 246243-247；以及Owicki，et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 874007-4011，這些文獻中描述了用于檢測細胞效應的敏感方法。當所述細胞(DC蛋白的來源)與一種針對所述抗原具有已知結合親和力的抗體接觸，或該抗體轉化的情況下，例如125I-抗體，要測量一種試樣針對該結合組合物的結合親和力時，一種競爭性測定實驗特別有效。然后分離結合態及游離態的標記結合組合物，測定蛋白的結合程度。試樣的結合量與標記抗體對已知來源的結合量成反比。許多技術能夠用來把結合態的試劑同游離態試劑分開，測定結合程度。典型地，這種分離步驟包括以下方法中的一種吸附到濾器上然后洗滌，吸附到塑料上然后洗滌，或者離心細胞膜。也可以將活細胞用于篩選藥物對DC蛋白間接功能的影響，例如抗原提呈或輔助功能。
如同DC蛋白來源，另一種方法使用了來自轉化后的真核或原核細胞的細胞膜。這些細胞可以穩定地被DNA載體轉化，指導適當蛋白的表達，例如，一種構建的膜結合形式。基本上，這種膜是從所述細胞制備而來的，可以用于結合測定，例如上述競爭性測定。
還有一種方法使用的是來自轉化后的真核或原核宿主細胞的溶解的、未純化蛋白或溶解的、已純化蛋白。特異性的增強、自動化的實現以及藥物測試中處理量的變大，這些優勢使得能夠進行一種“分子”結合測定。
用于藥物篩選的另一種技術包括一種能夠為以下過程提供高處理量的方法篩選針對相應DC蛋白具有合適結合親和力的化合物，有關這種方法的詳細描述見，1984年9月13日公開的geysen的歐洲專利申請84/03564。首先，在固相底物上合成大量的不同小肽測試化合物，例如在塑料插腳(pins)或其他一些合適表面上，見，上述文獻Fodor et al。然后讓所有上述插腳與溶解的、未純化或溶解的、已純化DC蛋白反應，并洗滌。下一步驟包括檢測結合后的反應試劑，例如抗體。
用于測定哪些位點對特定的其他蛋白有影響的一種方法是物理結構分析法，例如，X-射線晶體學或2維核磁共振技術。這些技術為確定哪些氨基酸殘基參與形成分子接觸區域提供了指導。關于蛋白結構分析的詳細描述見，例如，Blundell和Johnson(1976)ProteinCrystallography Academic Press，NY。X.試劑盒本發明還提供了把這些DC蛋白、其片段、肽鏈以及它們的融合產物用于多種診斷試劑盒和檢測DC蛋白或信號是否存在的方法中的用途。典型地，所述試劑盒中具有一個小室，其中裝有一種特定DC肽鏈或基因節段或能夠識別這二者之一的試劑，例如抗體。
用于測定一種測試化合物對于相應DC蛋白的結合親和力的試劑盒，典型地包括一種測試化合物、一種標記化合物(例如對于所述蛋白的結合親和力已知的抗體)、一種來源的DC蛋白(天然生成或重組的)以及一種將標記化合物的結合態同游離態分開的方法(例如一種用于固定DC蛋白的固相方法)。一旦化合物篩選完畢，那么就可以用本領域熟知的合適的生物測定方法對那些對于所述蛋白具有合適結合親和力的化合物進行評估，測定這些化合物是否能夠作為調節DC蛋白功能的激動劑或拮抗劑。重組DC多肽的獲得也為這些測定方法的標準化很好地提供了特定的標準。
用于測定試樣中DC蛋白濃度的優選試劑盒，典型地包括一種對于所述DC蛋白的結合親和力已知的標記化合物(例如抗體)、一種來源的DC蛋白(天然生成或重組)以及一種將標記化合物的結合態同游離態分開的方法(例如一種用于固定DC蛋白的固相方法)。通常還會提供內裝時試劑和說明書的小室。
對于相應DC蛋白或其片段具有特異性的抗體(包括抗原結合片段)可以用于診斷，檢測所述蛋白和/或其片段水平是否升高。這類診斷測定可以使用溶胞產物、活細胞、固定化了的細胞、免疫熒光物質、細胞培養物、體液，以及進一步還可以涉及血清中抗原的檢測等。診斷測定可以是同源性的(在游離試劑和抗原-DC蛋白復合物之間無分離步驟)，或者也可以是異源性的(有分離步驟)。各種商品化測定方法的出現，例如放射免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫測定(EIA)、多酶(enzyme-multiplied)免疫測定技術(EMIT)、底物標記熒光免疫測定(SLFIA)等。例如，當使用一種第二抗體，并且它能夠識別抗DC蛋白或其特定片段的抗體，這種情況下就可以使用未標記的第一抗體。類似測定也已在文獻中做了廣泛的討論。見，例如，Harlow和Lane(1989)抗體實驗指南CSH press，NY；Chan(編著)(1987)免疫測定操作指南Academic Press，Orlando，FL；Price和Newman(編著)(1991)免疫測定的理論及實踐Stockton Press，NY；以及Ngo(編著)(1988)Non-Isotopic Immunoassays Plenum Press，NY。特別地，這些試劑可以用于診斷生物樣品中的DC群體，檢測樣品中DC蛋白的過量或不足。這些測定可以用于指導活組織的組織學分析或血樣或組織樣品中DC數目的評估。
抗獨特型抗體可以類似地用于診斷抗DC蛋白抗體的存在，同樣地可以診斷各種異常狀態。例如，DC蛋白的過量可能導致各種免疫反應，這些免疫反應可能是異常生理狀態的癥狀，特別是癌癥或異常分化等細胞增殖的疾病的癥狀。
通常，用于診斷的試劑是以試劑盒的形式提供的，這樣可以使測定的靈敏度達到最佳。對于本發明來說，根據測定實驗、操作方法以及標記物實質的不同，提供了標記或未標記的抗體或受體，或提供了標記的DC蛋白。上述所提供的物質通常結合有其他附加物，例如緩沖液、穩定劑、產生信號所需的物質(例如就酶而言所需的底物)等。優選地，該試劑盒還包括介紹如何正確使用及各成分使用后的處理的說明書。理想地，這些試劑以凍干粉末裝形式提供，這種情況下，只要試劑的濃度適合測定實驗的使用，所述試劑可以重新配制到含水介質中。上述的藥物篩選及診斷測定中的許多組分可以不經修飾直接使用，也可以用多種方法修飾后使用。例如，將一種可直接或間接提供一種可檢測信號的單元以共價或非共價形式連接上去，標記就可告完成。能夠用于直接標記的基團包括125I等放射性標記物，過氧化物酶和堿性磷酸酶等酶(見美國專利US3645090)以及能夠監測熒光強度變化、波長偏移、或熒光偏振的熒光標記物。用于間接標記的方法包括把一種成分生物素化，然后讓其與偶聯到上述一種標記基團上的抗生物素蛋白結合。
能夠將蛋白質的結合態同游離態分開或者替代地將測試化合物結合態同游離態分開的方法還有許多種。可以將所述DC蛋白固定于各種基質上，然后洗滌。合適的基質包括，ELISA板等塑料、濾紙以及玻璃珠等。把DC蛋白固定到基質上的方法包括，但不限于，直接吸附到塑料上，使用捕獲抗體，化學偶聯以及生物素-抗生物素蛋白。這種方法中的最后一步涉及用以下方法中的一種沉淀蛋白/抗體復合物，這些方法包括例如利用聚乙二醇等有機溶劑或硫酸銨等鹽。其他合適的分離技術包括，但不限于，Rattle，et al.(1984)Clin.Chem.301457-1461中描述的熒光抗體可磁化顆粒法，以及美國專利US4659678中描述的雙抗體磁化顆粒分離法。
將蛋白質或其片段與各種標記物連接的方法在文獻中已有廣泛的描述，此處無需再做詳細討論。許多技術涉及使用通過碳化二亞胺或活性酯活化后的羧基來形成肽鍵，或者通過讓巰基與氯乙酰等活化半抗原或與馬來酰亞胺等活化烯烴進行連接反應生成硫醚，或者其他方法。融合蛋白也可以用于這些技術中。
本發明的另一個診斷方面包括使用來自相應DC蛋白的寡核苷酸或聚核苷酸序列。可以用這些序列作為探針檢測來自懷疑患有癌癥或免疫系統出現問題等病癥的患者的樣品中的信號水平。RNA或DNA核苷酸序列的制備、該序列的標記以及該序列的優選大小，這幾方面在本發明中已做了充分描述和討論。正常情況下，寡核苷酸探針應該包括至少約14個核苷酸，通常為至少18個核苷酸，聚核苷酸探針可以達到幾千個核苷酸。各種標記物都可以使用，最常用的是放射性核素，尤其是32P。然而，也可以使用其他技術，例如將生物素修飾的核苷酸導入聚核苷酸中。然后，該生物素作為位點結合抗生物素蛋白或抗體，而這些抗生物素蛋白或抗體可以很多種標記物標記，例如放射性核素、熒光團、酶等。替代地，可以使用能夠識別下列雙鏈結構的抗體DNA雙鏈、RNA雙鏈、DNA-RNA雜合雙鏈或DNA-蛋白雙鏈。反過來，也可以標記抗體，進行測定時把雙鏈結構結合到表面上，以便當雙鏈在表面上形成時，結合到雙鏈結構上的抗體能夠得以檢測。使用任意一種常規技術都可以把探針用于新的反義RNA上，例如核酸雜交、加法及減法篩選、重組探針、雜合體釋放翻譯(HRT)、以及雜合體鎖定(arrested)翻譯(HART)。這還包括聚合酶鏈反應(PCR)等擴增技術。
本發明還提供了也可用于定性或定量檢測其它標記的診斷試劑盒。依靠作為標記的多種指標的組合可以進行診斷和預后。因此，試劑盒可以檢測多個標記的組合。參見例如Viallet等(1989)Progressin Growth Factor Res.189-97。XI.結合配偶體的分離由于已經分離到了特定相互作用結合物的一個成員，所以用現有方法就可以分離出相對的另一成員。參見，Gearing等(1989)EMB0 J.83667-3676。例如，不干擾其與受體的結合而標記DC表面蛋白方法。例如，可以把親和標記物融入配體的氨基或羧基端。可以從表達文庫篩選出同DC蛋白特異結合的克隆，例如用細胞分撿或其它篩選方法來檢測表達這樣結合成分的亞群。參見，例如，Ho等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011267-11271。替代地，可以使用淘選方法。參見例如Seed和Aruffo等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA843365-3369。也可以使用雙雜交篩選體系制備出具有已知DC蛋白序列的合適構建體。參見，例如，Fields和Song(1989)Nature 340254-246。
標記的蛋白交聯技術可用于分離DC蛋白的結合配偶物。這樣可以鑒定出同合適DC蛋白相互特異作用的蛋白。
參見下列實施例可以對本發明的廣泛的范圍有最好的理解，這些實施例并非是要把本發明限定到特定的實施方案。
實施例I.一般方法下述的許多標準方法描述在或引自，例如Maniatis等(1982)(編著)分子克隆實驗手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press，紐約；Sambrook等1989年所著分子克隆實驗手冊(第二版)1-3卷，CSH出版社，紐約；Ausubel，生物學，Greene出版協會，Brooklyn，紐約；或Ausubel等(1987年及增補)(編著)CurrentProtocols In Molecular Biology，Wiley/Greene，紐約；Innis等(1990)(編著)PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，Academic出版社，紐約。
蛋白純化的方法包括如硫酸胺沉淀、柱層析、電泳、離心和結晶以及其它方法，參見，例如，Ausubel等(1987年和定期增補)；Deutscher(1990)酶學方法182卷“蛋白純化指南”及該系列中的其他章節；Coligan等(1996年和定期增補)Current Protocols inProtein Sciences Wiley/Greene，紐約；以及廠商關于蛋白純化產品的使用說明，例如，Pharmacia、Piscataway、NJ或Bio-Rad、Richmond、CA。和重組技術的結合可以使之同合適的片段融合，例如同FLAG序列或可以經蛋白酶去除的等同序列。參見如Hochuli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hochuli(1990)在Setlow(編著)的遺傳工程和原理和方法中1287-98的“用金屬螯合吸附純化重組蛋白”，Plenum出版社，紐約；和Crowe等1992年QIAexpress高水平表達及蛋白純化系統QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
測定免疫學功能的方法的描述見，如Coligan等(1992年和定期增補)現代免疫學方法Wiley/Greene，紐約；也可參見如Paul(ed)(1993)基礎免疫學(第三版)Raven出版社，紐約。FACS分析法的描述參見Melamed等(1990)流式細胞術和分迭Wiley-Liss，Inc.，紐約；Shapiro(1998)空中踐流式細胞術Liss，紐約；和Robinson等(1993)流式細胞術手冊Wiley-Liss，紐約。II.樹突狀細胞的獲得人CD34+細胞的獲得按以下方法。參見，例如，Caux等(1995)在Banchereau和Schmitt基礎和臨床免疫學中的樹突狀細胞1-5頁，Plenum出版社，紐約。外周或臍帶血細胞，有時選用CD34+細胞，培養在含有干細胞因子(SCF)、GM-CSF和TNF-α的無內毒素RPMI 1640培養基(Gibco，Grand Island，紐約)，該培養基補充有10％(v/v)熱滅活的胎牛血清(FBS；Flow Laboratories，Irvine，CA)，10mMHEPES，2mM L-谷氨酰胺，5×105M 2-巰基乙醇和青霉素(100mg/ml)。該培養基稱為完全培養基。
在25×75平方厘米的培養瓶(Corning，NY)中按2×104細胞/毫升接種CD34+細胞，用于擴增。在培養的第5和10天用含有新鮮GM-CSF和TNF-α的培養基平分培養細胞(細胞濃度為1×103細胞/毫升)來維持細胞合適的生長條件。在某些情況下，在大約第6天用FACS分揀表達CD1a的細胞。
在某些情況下，按常規在培養的第12天收集細胞，貼壁的細胞用5mM EDTA溶液處理回收。在另外的情形下，將細胞以5×106細胞/毫升懸浮在完全培養基中，并用1mg/ml 12-豆蔻酰13-乙酸佛波酯(PMA，Sigma)和100ng/ml離子霉素(Calbiochem，Lajolla，CA)處理合適的時間(如1或6小時)來激活CD1a+細胞。這些細胞繼續擴增6天，提取RNA用于構建cDNA文庫。III.RNA分離和文庫構建總RNA的分離采用Chirgwin等(1987)在Biochem.185294-5299中所描述的異硫氰酸胍/氯化銫梯度離心法進行。
可替代地，用OLIGOTEX mRNA純化試劑盒(QIAGEN)分離mRNA。雙鏈cDNA的合成使用，例如用于cDNA合成和質粒克隆的SUPERSCRIPT質粒系統(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。將得到的雙鏈cDNA單向克隆入載體，如pSport1，然后用電穿孔方法轉染入ELECTROMAXDH10BTM細胞(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。IV.測序用隨機挑選的克隆或經過與未激活細胞減法雜交的克隆提取DNA，用標準的方法進行核苷酸序列分析。可以使用Taq DiDeoxyTerminator cycle測序試劑盒(Applied Biosystem，Foster City，CA)進行。標記的DNA片段在合適的自動測序儀上的DNA測序凝膠進行分離。可替代地，分離克隆的測序可按照下述參考文獻中的方法進行例如，Maniatis等1982年所著分子克隆實驗手冊，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，紐約；Sambrook等1989年所著分子克隆實驗手冊(第二版)1-3卷，CSH出版社，紐約；Ausubel等所著生物學，Greene出版協會，Brooklyn，紐約；或Ausubel等(1987年和增補)所著Current Protocols In MolecularBiology，Wiley/Greene，紐約。也可使用化學測序的方法，例如使用Maxam和Gilbert測序方法。V.重組DC基因構建體從合適的細胞類群中分離Poly(A)+RNA，例如使用FastTrackmRNA試劑盒(Invitrogen，San Diego，CA)。對樣品進行電泳，例如在含甲醛的1％瓊脂糖凝膠上，轉移到GeneScreen膜(NEN ResearchProducts，Boston，MA)上。雜交在例如含0.5M Na2HPO4、pH7.2、7％SDS、1mM EDTA和1％BSA(組分V)及比活為107cpm/ml的32P-dCTP標記的DC基因cDNA的65℃條件下進行。雜交膜用含0.2×SSC和0.1％SDS的溶液洗三次，膠片曝光24小時。
重組基因構建體可用于生產檢測信使RNA的探針。插入片段可切割下來用于上述方法的檢測。VI.DC基因蛋白在大腸桿菌中的表達用PCR構建包含有開放閱讀框架的構建體，優選該閱讀框可操作地與合適啟動子、選擇標記，以及調控序列相連。得到的表達質粒轉化入合適的大腸桿菌菌株(Stratagene，La Jolla，CA)，例如Topp5。氨芐青霉素抗性(50μg/ml)的轉化子在LB(Gibco)中37℃培養至550nm處的光密度為0.7。重組蛋白用0.4mM異丙基βD-硫代半乳-吡喃糖苷(Sigma，St.Louis，MO)誘導并在20℃繼續培養18小時。離心收集1升培養物中的細胞并重懸，例如在200ml冰冷的含30％蔗糖、50mM Tris-HCl和1mM EDTA酸中。在冰上放置10分鐘后，加冰冷的水到總體積2升。放置冰上20分鐘后，離心去除細胞并用5μMMillipak 60(Millipore Corp.，Bedford，MA)過濾上清。
重組蛋白的純化用標準的純化方法，例如各種離子交換層析方法。下述的用抗體免疫親和的方法也可使用。當在表達構建體中構建入表位標記物時，就可以使用親和方法。VII.人DC基因作圖DNA分離、限制酶消化、凝膠電泳、Southern印跡轉移以及雜交均按照標準方法進行。參見，Jenkins等(1982) J.Virol.4326-36。轉膜可用Hybond-N尼龍膜(Amerham)。探針用32P-dCTP標記；洗膜用最嚴緊條件，如0.1×SSC，0.1％SDS，65℃。
可替代地，BIOS Laboratories(New Haven，CT)的鼠體細胞雜交板可以同PCR方法結合起來。參見Fan等(1996)Immunogenetics4497-103。
用Stanford G3板做染色體定位可給出最近的標記SHGC-12041，優勢對數(lod)值為7.7。該標記為編碼M130抗原的基因，定位在染色體12p13。該位置含許多編碼C型凝集素家族受體的基因，如典型的CD69和NK受體家族。VIII.個體變異分析根據分布數據，大量的容易得到的細胞類型選作個體樣品。利用PCR技術，大群的個體被用于分析該基因.cDNA或其他PCR方法用于測定相應基因在不同個體中的序列并進行比較。該結果可用于表明種群間的差異程度，并且可以確定那些是可變并對功能沒有很大影響的殘基。IX.抗體制備重組DC蛋白通過用上述在大腸桿菌中的表達來產生，測定生物學活性。可替代地，用純化方法獲得的天然蛋白也可使用。抗體試劑可用于免疫沉淀和示蹤分離方法。可以用活性或變性蛋白免疫合適哺乳動物來生產多克隆血清或單克隆抗體。X.靈長類和嚙齒類的相應DC基因的分離可用編碼這些基因的人cDNA作探針或者用其來設計PCR引物，去分離大猩猩等各種靈長類動物中的對應物。
用推定的DCMP1(tblastn算法)多肽序列對EST數據庫(GenBankdbEST)進行生物信息學搜索發現了，編碼一種與靈長類DCMP1同源的蛋白的小鼠克隆。發現了4個對應于該序列的克隆AA387662 Ko小鼠胚胎115dpc、AA170532小鼠脾、AA475012小鼠乳腺、以及AA423158小鼠乳腺。通過序列分析估計其中的AA170532為全長的序列，所以選擇其進行DNA測序。該克隆含有和DCMP1相似的特征。去除Poly-A序列，該克隆全長1418bp，包含5’端278bp的UTR.至于hDCMP1，推測的起始密碼子并不包含在一致的Kozak區，但在該密碼子上游有終止密碼子。5’端UTR含有同快速降解信號相似的序列，包括三個一致的ATTTA位點。具有潛在的多聚腺苷信號。推定的多肽長約238個殘基，編碼含有一個ITIM和一個C型凝集素結構域的II型膜蛋白。具有三個潛在的N-糖基化位點。同人的蛋白全序列的比較顯示有54％的一致性和65％的同源性。值得注意的是，ITIM結構域高度保守(15個殘基中有13個一致)。讓人感興趣的是保守的近膜端谷氨酰胺單元(FQKYSQLLE)、半胱氨酸殘基可能參與了二硫鍵的形成。C型凝集素結構域同樣也表現為模塊保守，包括EPS基元。在hDCMP1和人肝細胞凝集素觀察到的差異在小鼠也存在，較明顯的是119和163位色氨酸的取代；177位谷氨酰胺的取代及288位的色氨酸被絲氨酸取代。由此看來，該克隆似乎是hDCMP1的小鼠同源物。XI.利用試劑分析細胞類群樣品中樹突狀細胞水平高低的檢測對于異常疾病狀態的檢測很重要。例如，樹突狀細胞在組織或淋巴系統中的增加可能表明DC增生或組織移植排斥的存在。較低的DC群可能表明對，例如細菌或病毒感染，的異常反應，需要進行合適的治療使DC應答正常化。
使用對細胞表面DC蛋白特異的標記結合因子，參見如，Melamed等(1990)流式細胞術和分迭Wiley-Liss，Inc.，紐約；Shapiro(1998)實踐流式細胞術Liss，紐約；和Robinson等(1993)流式細胞術手冊Wiley-Liss，紐約，用FACS分析法測定DCs在細胞混合物中出現的數目，例如在外周血單核細胞(PBMCs)、粘連細胞等。結合因子也可用于對新鮮或固定的組織樣品進行組織學分析，分析DC的浸潤。可對多種細胞類群進行評價，無論是需要破壞細胞或某些分析中需要保持細胞活性。
可以對可溶性細胞內分子的出現進行分析，例如用Openshaw等(1995)在J.Exp.Med.1821357-1367中描述的用DC特異的熒光結合因子。替代地，可使用組織或細胞固定方法。
DC轉錄本水平可以定量，例如用Murphy等(1993)在J.Immunol.Methods 162211-223中描述的半定量PCR方法。設計的引物要保證基因組DNA不能被檢出。XII.表達分布在序列數據庫中對DCMP1 cDNA全序列進行分析，發現其表達譜僅限于一定數量的文庫。在樹突狀細胞文庫中發現數量最多的序列(10)，破骨瘤細胞文庫中則發現4個序列，而在體外用單核細胞、LPS激活的嗜中性粒細胞、軟骨瘤、結腸癌、T淋巴細胞、皮膚瘤和慢性滑膜炎制備的巨噬細胞文庫中僅發現1個序列。在GenBank dbEST中，檢測到了4個克隆AA418441、差減文庫，AA446401、完整胎兒，AA677149、胎兒肝脾，C01555、人基因特征(Human Gene SigNature)，AA380065、皮膚腫瘤。
用RT-PCR對大量不同的細胞系和新分離的細胞進行DCMP1表達的分析表明DCMP1在TF1(骨髓細胞前體)、Jurkat(一T細胞系)、CHA(腎癌)、MRC5(胎兒肺成纖維細胞)、JY(B細胞系)、U937(骨髓-單核細胞淋巴瘤細胞系)中未檢測到，而僅限于生血細胞。就新鮮分離的細胞而言，在未激活或激活的DC細胞、激活的粒細胞、未激活以及激活的外周血淋巴細胞(PBL)中可檢測到表達，在激活的單核細胞和激活的B細胞中也可檢測到低水平的表達。所有激活樣品都是用PMA/離子霉素處理1和6小時的細胞。
另外分析發現DCMP1的表達隨細胞的激活狀態而變化。用RT-PCR對不同激活狀態細胞DCMP1的表達進行了檢測。從扁桃體組織分離的B細胞用PMA/離子霉素處理1或6小時或者與表達CD40L的L細胞共培養3，12或24小時。在未激活的細胞中可檢測到mRNA。但這種表達在用PMA/離子霉素處理1小時內或CD40L處理3小時后不存在。形成對比的是，在T細胞檢測不到表達，即使在用抗CD3/抗CD28溫育后。
在CD34+來源的細胞中，來源于CD34+前體細胞的巨噬細胞在M-CSF存在情況下有很強的表達。這種表達似乎不隨PMA/離子霉素處理而改變。在來源于CD34+前體細胞的DC細胞，在M-CSF和TNFα存在情況下，mRNA水平隨培養過程的時間而變化，其中在培養的第12天達到很高量的表達。在同產生CD40L的L細胞共培養48小時后，DCMP1的表達丟失。在體外用FACS在第6天分揀的具有CD1a/CD14標記的DC細胞在繼續培養6天后，在CD14亞群檢出的mRNA水平要高于CD1a。這種表達受PMA/離子霉素處理的下游調控。
從血液中分離的單核細胞在未激活細胞中檢測不到mRNA。但是，用PMA/離子霉素處理6小時后可檢測到表達。在來源于單核細胞的DC細胞用GM-CSF和IL-4處理后發現DCMP1的表達受上游調控。這種表達不隨PMA/離子霉素處理而改變，但受同表達CD40L的L細胞共培養的下游調控。在此情況下，DCMP1 mRNA的表達在共培養24小時后完全丟失。進一步用抗體檢測的方法來證實人蛋白的表達。
離體分離的DC亞類表達DCMP1。從血液或淋巴組織分離的DC亞類以整合蛋白CD11c的有無為特征。Larson和Springer(1990)Immunol.Rev.114181-217。分離自血液的CD11c+的DC亞類(也稱為GCDC)表達DCMP1。但在用抗CD40L和PMA/離子霉素處理激活后則檢測不到mRNA。形成對比的是，分離自淋巴組織的相同亞類細胞則不表達DCMP1。在從血液分離的CD11c的DC亞類僅觀察到少量的表達。但在來自淋巴組織的細胞卻有較高表達，但也受抗CD40L和PMA/離子霉素處理激活的下游調控。從皮膚分離的郎罕氏細胞表達DCMP1，而環繞的基底膜細胞則沒有表達。XIII.靈長類DCMP1序列分析表明這些DCMPs是凝集素/脫唾液酸糖蛋白受體超家族成員。特別地，肝細胞和巨噬細胞中的凝集素與蛋白和肽的內化有關，內化例如在樹突狀細胞吸收和提呈抗原的中發揮著重要的作用。DCMP1含有一個內化基元(YxxV)和一個類-ITIM基元(IxYxxV；SEQ ID NO2的5-10殘基；更擴展的基元為1-24殘基)。這表明該蛋白可能是抑制性受體家族(KIR；LIR，等)的樹突狀細胞成員，該家族成員可發出陰性信號來抑制細胞的功能。
可能的開放閱讀框架從大約第242個核苷酸開始。潛在的起始密碼子并不包含在一致的Kozak區，但在該密碼子上游沒有可替代的起始密碼子，而且在其上游200處有終止密碼子，因此推測其為編碼蛋白的起始。根據序列預測的多肽大約長237個殘基。未檢測到信號肽，但在386～443處有一推定的跨膜序列。該克隆編碼一種含有一個C型凝集素結構域的II型膜蛋白。3’端UTR含有潛在的快速降解信號，包括三個一致的ATTTA位點。未檢測到信號肽，但在45-62，可替代的為386-443處有一推定的跨膜序列。該克隆編碼一種含有一個C型凝集素結構域的II型膜蛋白。
根據序列分析預測的多肽具有一含49個氨基酸的細胞內結構域，其中包括一個以第7位殘基為中心的基于酪氨酸的基元。具有此種性質的YXX(L/V)基元在肝凝集素和CD23(Fce RIIa)中作為內化基元。這種類型的結構域在Ly49、NKG2A等分子以及類免疫球蛋白分子的KIR家族中可作為激活(ITAM)和抑制(ITIM)基元。抑制作用是由SHP2/SHIP磷酸酶向共有結構域(I/V)XYXX(L/V)的聚集來介導的。DCMP1的開始15個氨基酸同擴展的ITIM結構域具有保守性，因此DCMP1可能參與對細胞的抑制。單一的潛在糖基化位點出現在約第185位。
將DCMP1的C型凝集素結構域的氨基酸序列同其它含此結構域的蛋白序列比較發現DCMP1同肝細胞和巨噬細胞的凝集素(見表1)具有最高的同源性。盡管可觀察到一些其它不同的特征，但C型凝集素折疊中的保守半胱氨酸殘基在整個家族成員中都是保守的。同肝細胞凝集素一樣，DCMP1在凝集素結構域起始處有一雙半胱氨酸基元。該增補的半胱氨酸的功能尚不可知，因為在凝集素結構域中沒有明顯的其它半胱氨酸與之形成二硫鍵。盡管DCMP1中第91位的另一半胱氨酸可能有此功能，但是該殘基可能參與形成分子間二硫鍵。DCMP1凝集素結構域的N末端同肝細胞和巨噬細胞的凝集素(見表1)具有最高的同源性。DCMP1中的鈣結合結構域也是保守的，并且同CD23有最高的同源性，包括EPS基元(195-197殘基)，201位的谷氨酸(E)和218～219位的天冬酰胺和天冬氨酸。值得注意的是NK受體(此處顯示NKGE)和CD94中不含這些基元。
DCMP1為一II型膜蛋白，預測的跨膜節段為約45-62殘基。它同包括脫唾液酸糖蛋白受體、肝細胞凝集素、CD69、CD72、CD23和NK受體在內的蛋白有關。此蛋白在C端(104-237殘基)含有鈣依賴性的C型凝集素胞外結構域，因此表現出糖殘基特異的基元特征。見表1。這些蛋白典型地同糖蛋白上的糖殘基結合，可能參與基本的免疫應答。該家族的一些成員，典型地是CD69、NK受體和CD72，在增殖和誘導特定基因表達的細胞激活事件中傳遞信號。
同小鼠C型凝集素KIR受體Ly49類似，DCMP1含有一內化基元，該基元同抑制性受體(ITIM結構域，參見Vivier和Daeron(1997)Immuology Today 18286-291和Katz和Austen(1997)免疫學雜志1585065-5070的最近綜述)的基團有擴展的同源性。這些受體，要么是免疫球蛋白超家族成員要么是C型凝集素，可以經含SH2結構域的磷酸酶如SHIP、SHP-1和SHP-2傳遞陰性信號。有證據表明為了阻斷激活信號，這些受體與其它的一些活化受體聯合在一起。還有證據暗示此類分子的配體是一IgSF分子。這種分子的實例有MHCI類分子(被CD94/NK受體和Ly-49識別)和FcgR(CD23；識別IgG)。
91位的半胱氨酸殘基可能參與同另一多肽形成二硫鍵，可以是同源或異源二聚體。
PCR分析表明該基因在活化或非活化的樹突狀細胞都有表達。在TF1(生血細胞系)、Jurkat(T細胞系)、MRC5(胎兒肺成纖維細胞系)、JY(B細胞系)、U937(前單核細胞系)或CHA(癌細胞系)這些細胞中都未發現可檢測信號。新鮮分離的未激活或激活的PBL和粒細胞中則檢測到了陽性信號，但是在新鮮分離的T細胞、B細胞和NK細胞或單核細胞卻僅檢測到弱信號。
序列分析表明基因在樹突狀細胞、激活的嗜中性粒細胞、巨噬細胞(用GM-CSF激活)、破骨瘤、皮膚瘤、T淋巴細胞、結腸癌、慢性滑膜炎以及軟骨瘤細胞中都有表達。XIV.DCMP1嚙齒類對應物表2顯示了DCMP1嚙齒類對應物的序列。表2序列顯示了與小鼠的兩個EST之間的同源性，即W33446(見SEQID NO11)和AA170532(見SEQ ID NO8)，它們是DCMP1小鼠對應物的密碼(見SEQ ID NO8)。hDCMP1 MTSEITYAEVRFKNEFKSSGINTASSAASKERTAPLKSNTGFPKLLCASLW33446 --------------------------------------------------170532 MASEITYAEVKFKNESNSLHTYSESPAAPREKPIRDLRKPGSPSLLLTSLmDCMP1 MASEITYAEVKFKNESNSLHTYSESPAAPREKPIRDLRKPGSPSLLLTSLhDCMP1 LIFFLLLAISFFIAFVIFFQKYSQLLE-KKTTKELVHTTLECVKKNMPVEW33446 --------------------------E-KMIIKELNYTELECTKWASLLE170532 MLLLLLLAITFLVAFIIYFQKYSQLLEEKKAAKNIMmDCMP1 MLLLLLLAITFLVAFIIYFQKYSQLLEEKKAAKNIMHNELNCTKSVSPMEhDCMP1 ETAWSCCPKNWKSFSSNCYFISTE--SASWQDSEKDCARMEAHLLVINTQW33446 DKVWSCCPKDWKPFGSYCYFTSTD-LVASWNESKENCFHMGAHLVVIHSQmDCMP1 DKVWSCCPKDWRLFGSHCYLVPTVSSSASWNKSEENCSRMGAHLVVIQSQhDCMP1 EEQDFIFQNLQEESAYFVGLSDPEGQRHWQWVDQTRYNESSTFWHPREPSW33446 EEQmDCMP1 EEQDFITGILDTHAAYFIGLWD-TGHRQWQWVDQTPYEESITFWHNGEPShDCMP1 DPNERCVVLNFR-KSPKRWGWNDVNCLGPQRSVCEMMKIHLmDCMP1 SGNEKCATIIYRWKT--GWGWNDISCSLKQKSVCPMKKINLXV.靈長類DCMP2DCMP2是一種假定的脫唾液酸糖蛋白受體，為一II型跨膜蛋白。在它的胞外區，DCMP2特征性地含有一個單糖識別結構域(CRD)，該結構域是凝集素C型(鈣離子依賴性的)家族的特征(參見Drickamer和Taylor(1993)Ann.Rev。Cell Biol.9237-264。DCMP2同編碼人肝細胞唾液酸糖蛋白受體亞單位的兩個基因(H1和H2)有很高的同源性。Stockert(1995)Physiol.Revs.75591-609。這些肝細胞受體代表了II型C型凝集素家族成員的原始型。肝ASGPR對末端表現為半乳糖殘基的脫唾液酸化的糖蛋白有特異的結合，經籠形蛋白包裹的凹陷途徑介導它們內吞進入肝細胞。顯著地，同這些功能相關的特征在ASGPR和DCMP2都是保守的。因而，DCMP2所包含的一細胞內基元在第5位含一酪氨酸殘基，同配體內吞能力有關。參見Fuhrer等(1991)J.Cell Biol.114423-431。此外，DCMP2在其糖識別結構域中含有一個QPD(Gln-Pro-Asp)半乳糖識別序列(Drickamer(1992)Nature 360183-186)。
還分離到了編碼DCMP2的幾個突變的cDNA克隆，這很可能是選擇性剪接的結果。下面描述三個突變體一短的形式，一長的形式和一命名為DCMP2v的突變體。參見SEQ ID NO4和10以及表1。短的形式和長的形式的不同之處在于前者的胞外區域有一27個氨基酸的插入片段。DCMP2短的形式同最近從人巨噬細胞(M-ASGPR)克隆的ASGPR在胞外結構域有4個氨基酸的差異。Suzuki等(1996)J.Immunol.156128-135。
同DCMP21相比，ASGPRm缺乏對應于GVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVP(SEQ ID NO4的118-144位殘基)的節段，但包含一GEE(SEQ ID NO4的173和174位殘基)插入片段。DCMP2s和DCMP21一致，除了缺乏GVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVP(SEQ ID NO4的118-144位殘基)，第1064位核苷酸由A取代了G，因此編碼的是天冬酰胺而非天冬氨酸。DCMPv和DCMPs類似，但缺乏LLQRLRSGPCHLLLSLGLG(SEQ ID NO4的30-48位殘基)序列，該序列對應于跨膜節段中的一重要部分；同ASGPRm一樣包含一GEE(SEQ IDNO4的173和174位殘基)插入。這些差異的周圍區域，例如在一個表位長度的范圍內，例如12～17個氨基酸內，是令人感興趣的。
重組的DCMP2長的形式已經得到，并且也得到了mABs。此外已經得到用長的形式和短的形式轉染的穩定表達鼠細胞系。
基因最初是從70％純化的CD1a+DC中分離而來，這種DC是培養在GM-CSF和TNFa中的CD34+生血原始細胞的(Caux等(1992)Nature360258-261)衍生細胞。該克隆已插入pSport1載體(NotI/SalI酶切位點)。
PCR分析表明，DCMP2基因在樹突狀細胞有表達，并且可能在TF1(生血細胞系)細胞也有很弱的表達。Jurkat(T細胞系)，CHA(癌細胞系)，MRC5(胎兒肺成纖維細胞系)或JY(B細胞系)中都未發現可檢測信號，但在新鮮分離的未激活或激活(PMA和離子霉素)的樹突狀細胞、粒細胞和未激活或激活的PBL中檢測到了陽性信號。而在單核細胞、未激活或激活的T細胞或B細胞中未檢測到信號。
DC-ASPGR同對應于人單核細胞的鼠ASGPR(M-ASGPR)具有很高的同源性。糖識別結構域的同源性非常顯著(～60％)，該結構域賦予鼠單核細胞ASGPR對半乳糖和N-乙酰半乳糖苷(GalNAc)的特異性。Sato等(1992)J.Biochem.111331-336。這也包括在肝細胞ASGPR的H1和H2亞單位中發現的QPD基元。此外，在鼠單核細胞ASGPR的胞質部分有一YENL的內化信號。
鼠ASGPR作為受體在半乳糖基化糖蛋白內吞中起作用(Ozaki等(1992)I.Biol.Chem.2679229-9235)，允許腫瘤殺傷性巨噬細胞識別腫瘤細胞(Kawakami等(1994)Jpn.J.Cancer Res.85744-749).在此情況下發現，在帶有OV2944-HM-1轉移性卵巢腫瘤細胞的小鼠的肺轉移結節中有鼠M-ASGPR的表達。(Imai等(1995)Immunol.86591-598)。讓人感興趣的，人M-ASGPR表現出對Tn抗原的顯著特異性(Suzuki等(1996)J.Immunol.156128-135)，該抗原帶有一串同人腫瘤有關的末端連接絲氨酸或酪氨酸的GalNAc(Springer(1989)Mol.Immunol.261-5；Φrntoft等(1990)Int.J.Cancer 45666-672)。
根據序列的同源性，可以預測DCMPs也可作為半乳糖基化糖蛋白的內吞受體。此外，通過另一C型跨膜內吞凝集素即甘露糖受體的配體內化作用，引發DC經MHCII途徑對抗原的高效提呈。Cella等(1997)Current Opinion Immunol.910-16。依此類推，DCMPs可能在將配體內化入抗原提呈途徑中起作用。
因此，在基于免疫的佐劑治療中，DCMP2是將抗原運入DC以加強對T細胞提呈這一過程的潛在的高效靶目標。這可以通過體外用半乳糖基化形式的抗原或抗DCMP2單抗偶連的抗原脈沖(pulse)DC來探討。體外提呈效率用抗原特異性T細胞的激活來測定。本發明集中討論腫瘤相關抗原(TAA)的提呈，因為這一方法具有內在的治療前景。尤為感興趣的是TAA相關的惡性黑色素瘤。
此外，由于人M-ASGPR對Tn抗原的特異性，使得這種癌TAA成為一種選擇性靶向DCMP2的候選者。
最近表明外源抗原可以經MHCI途徑處理和提呈。參見Porgador和Gilboa(1995)J.Exp.Med.182255-260；Paglia等(1996)J.Exp.Med.183317-322。特化的受體可能在DC中行使這一功能。
DC中的這些受體可以被靶向至幫助生成TAA特異性的細胞毒性T細胞(CTL)，這種T細胞有重大的潛在治療價值，因為CTL可能在誘導抗腫瘤中發揮作用。XVI.DCMP內化從培養在GM-CSF和TNFα中的CD34+原始細胞中獲取DC，4℃用抗DCMP2單抗或抗CD13染色作為對照。37℃繼續培養大約20分鐘后，分析細胞表面結合的單抗。通過細胞表面熒光的減少來觀察內化。
DCMP21在37℃下迅速內化，而在4℃則不。大約60％的表面標記在15分鐘內消失。這表明DCMP2可作為內吞受體，這同其胞質內結構域出現一內化基元(YENF)相一致。XVII.結合相對成分的分離DC蛋白可以用作特異性結合試劑，利用其特異性結合的優勢，這一點與抗體的使用極其相似。結合試劑要么如上述標記，例如熒光或其它標記物，要么固定于一底物用于淘選方法。
DC蛋白用于篩選那些能表現結合特性的細胞系。可用普通的染色方法來檢測或分揀細胞內或表面表達的配體，或用淘選方法篩選表面表達的轉化細胞。細胞內表達的篩選用各種染色或免疫熒光的程序來進行。參見McMahan等(1991)EMBO J.102821-2832。
例如，在第0天，用溶解在PBS中的10ng/ml纖粘蛋白對帶有兩個小槽的permanox載玻片在室溫下預包被30分鐘，每小槽加包被液1ml。用PBS洗滌一次。然后每槽中加入含2-3×105COS細胞的生長培養基1.5ml。在37℃溫育過夜。
在第一天，每一樣品均制備0.5ml溶液，該溶液是將66mg/mlDEAE-葡聚糖、66mM氯喹以及4mg DNA溶解到無血清DME中制備而成的。對每一組，設立一陽性對照，例如1倍或1/200稀釋的人受體FLAGcDNA，和一陰性對照。用無血清DME洗滌細胞。加入DNA溶液并在37℃溫育5小時。去掉培養基并加入0.5ml溶有10％DMSO的DME，放置2.5分鐘。棄去并用DME洗一次。加入1.5ml生長培養基溫育過夜。
在第2天，換培養基。在第3或4天，固定并染色細胞。用Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)洗滌細胞并用4％多聚甲醛(PFA)/葡萄糖固定5分鐘。用HBSS洗3次。去除所有液體后將載玻片貯存在-80℃。對每一小槽，按下述進行體積為0.5ml的溫育。加含32ml/ml 1M NaN3的HBSS/皂角苷，放置20分鐘。用HBSS/1×皂角苷洗滌細胞。加入蛋白或蛋白/抗體復合物并溫育30分鐘。用HBSS/皂角苷洗滌細胞兩次。如果合適，加入一抗，30分鐘。加二抗，例如1/200稀釋的Vector抗鼠抗體，溫育30分鐘。制備ELISA溶液，例如Vector Elite ABC辣根過氧化物酶溶液，預先溫育30分鐘。例如每2.5ml HBSS/皂角苷使用1滴溶液A(抗生物素蛋白)和1滴溶液B(生物素)。用HBSS/皂角苷洗滌細胞兩次。加入ABC辣根過氧化物酶(HRP)溶液并溫育30分鐘。用HBSS洗滌細胞兩次，第二次2分鐘以封閉細胞。然后加入Vector二氨基聯苯胺(DAB)，5-10分鐘。每5ml用玻璃儀器蒸餾的水加2滴緩沖液，4滴DAB和2滴雙氧水。小心除去小槽中的內容物并用水洗滌載玻片。空氣中干燥幾分鐘，加1滴檢波頭(Crystal Mount)和蓋上蓋玻片。在85-90℃烤5分鐘。
替代地，可以用另外一些單核細胞蛋白特異性結合試劑親和純化或分揀出表達受體的細胞。參見，例如Sambrook等或Ausubel等。
另外一個策略是用淘選方法篩選膜結合受體。按照上述方法構建受體cDNA。可以將配體固定從而固定表達受體的細胞。這種固定化可通過使用能識別如單核細胞蛋白融合構建體的FLAG序列的合適抗體或抗第一抗體的抗體來實現。通過反復選擇和擴增就可以富集合適的克隆并最后分離到表達配體的克隆。
可以用單核細胞蛋白篩選噬菌體表達文庫。合適的標記技術可以保證合適的克隆得到特異性的標記，例如使用抗FLAG抗體。
不脫離本發明的實質和范圍可以做出許多修飾和變化，這一點對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。本發明中的特定實施方案僅僅是為了舉例說明而提供的，本發明只受所附的權利要求以及權利要求所能授權的全部等同范圍的限制。
序列提交SEQ ID NO1是靈長類DCMP1 C-凝集素家族基因的核苷酸序列。SEQ ID NO2是靈長類DCMP1 C-凝集素家族基因的多肽序列。SEQ ID NO3是靈長類DCMP2 C-凝集素家族基因的核苷酸序列。SEQ ID NO4是靈長類DCMP2 C-凝集素家族基因的多肽序列。SEQ ID NO5是靈長類肝ASGPRh1多肽序列。SEQ ID NO6是靈長類肝ASGPRh2多肽序列。SEQ ID NO7是嚙齒類DCMP1 C-凝集素家族基因的核苷酸序列。SEQ ID NO8是嚙齒類DCMP1 C-凝集素家族基因的多肽序列。SEQ ID NO9是突變的DCMP2核苷酸序列。SEQ ID NO10是突變的DCMP2多肽序列。SEQ ID NO11是來自W33446嚙齒類EST的肽鏈序列。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名Schering Corporation(B)街道2000 Galloping Hill Road(C)城市Kenilworth(D)州New Jersey(E)國家美國(F)郵政編碼07033(G)電話(908)298-5056(H)傳真(908)298-5388(ii)發明題目哺乳動物膜蛋白基因，相關反應試劑(iii)序列數11(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機Power Macintosh(C)操作系統8.1.0(D)軟件Microsoft Word 6.0.1(v)目前的申請資料(A)申請號
(B)申請日(vi)在先申請資料(A)申請號US60/053，080(B)申請日1997-6-9(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度1104個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置242..952(xi)序列描述SEQ ID NO1TTCTCACTAT ACTGGTCCTG AGGAAAGGGC TTCTGTGAAC TGCGGTTTTT AGTTTTTATT 60GTGGTTCTTA GTTCTCATGA GACCCCTCTT GAGGATATGT GCCTATCTGG TGCCTCTGCT120CTCCACTAGT TGAGTGAAAG GAAGGAGGTA ATTTACCACC ATGTTTGGTT CCTGTTTATA180AGATGTTTTA AGAAAGATTT GAAACAGATT TTCTGAAGAA AGCAGAAGCT CTCTTCCCAT240T ATG ACT TCG GAA ATC ACT TAT GCT GAA GTG AGG TTC AAA AAT GAA286Met Thr Ser Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Val Arg Phe Lys Asn Glu1 5 10 15TTC AAG TCC TCA GGC ATC AAC ACA GCC TCT TCT GCA GCT TCC AAG GAG 334Phe Lys Ser Ser Gly Ile Asn Thr Ala Ser Ser Ala Ala Ser Lys Glu20 25 30AGG ACT GCC CCT CTC AAA AGT AAT ACC GGA TTC CCC AAG CTG CTT TGT 382Arg Thr Ala Pro Leu Lys Ser Asn Thr Gly Phe Pro Lys Leu Leu Cys35 40 45GCC TCA CTG TTG ATA TTT TTC CTG CTA TTG GCA ATC TCA TTC TTT ATT 430Ala Ser Leu Leu Ile Phe Phe Leu Leu Leu Ala Ile Ser Phe Phe Ile50 55 60GCT TTT GTC ATT TTC TTT CAA AAA TAT TCT CAG CTT CTT GAA AAA AAG 478Ala Phe Val Ile Phe Phe Gln Lys Tyr Ser Gln Leu Leu Glu Lys Lys65 70 75ACT ACA AAA GAG CTG GTT CAT ACA ACA TTG GAG TGT GTG AAA AAA AAT 526Thr Thr Lys Glu Leu Val His Thr Thr Leu Glu Cys Val Lys Lys Asn80 85 90 95ATG CCC GTG GAA GAG ACA GCC TGG AGC TGT TGC CCA AAG AAT TGG AAG 574Met Pro Val Glu Glu Thr Ala Trp Ser Cys Cys Pro Lys Asn Trp Lys100 105 110TCA TTT AGT TCC AAC TGC TAC TTT ATT TCT ACT GAA TCA GCA TCT TGG 622Ser Phe Ser Ser Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Thr Glu Ser Ala Ser Trp115 120 125CAA GAC AGT GAG AAG GAC TGT GCT AGA ATG GAG GCT CAC CTG CTG GTG 670Gln Asp Ser Glu Lys Asp Cys Ala Arg Met Glu Ala His Leu Leu Val130 135 140ATA AAC ACT CAA GAA GAG CAG GAT TTC ATC TTC CAG AAT CTG CAA GAA 718Ile Asn Thr Gln Glu Glu Gln Asp Phe Ile Phe Gln Asn Leu Gln Glu145 150 155GAA TCT GCT TAT TTT GTG GGG CTC TCA GAT CCA GAA GGT CAG CGA CAT 766G1u Ser Ala Tyr Phe Val Gly Leu Ser Asp Pro Glu Gly Gln Arg His160 165 170 175TGG CAA TGG GTT GAT CAG ACA CCA TAC AAT GAA AGT TCC ACA TTC TGG 814Trp Gln Trp Val Asp Gln Thr Pro Tyr Asn Glu Ser Ser Thr Phe Trp180 185 190CAT CCA CGT GAG CCC AGT GAT CCC AAT GAG CGC TGC GTT GTG CTA AAT 862His Pro Arg Glu Pro Ser Asp Pro Asn Glu Arg Cys Val Val Leu Asn195 200 205TTT CGT AAA TCA CCC AAA AGA TGG GGC TGG AAT GAT GTT AAT TGT CTT 910Phe Arg Lys Ser Pro Lys Arg Trp Gly Trp Asn Asp Val Asn Cys Leu210 215 220GGT CCT CAA AGG TCA GTT TGT GAG ATG ATG AAG ATC CAC TTA 9S2Gly Pro Gln Arg Ser Val Cys Glu Met Met Lys Ile His Leu225 230 235TGAACTGAAC ATTCTCCATG AACAGGTGGT TGGATTGGTA TCTGTCATTG TAGGGATAGA1012TAATAAGCTC TTCTTATTCA TGTGTAAGGG AGGTCCATAG AATTTAGGTG GTCTGTCAAC1072TATTCTACTT ATGAGAGAAT TGGTCTGTAC AT 1104(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度237個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Thr Ser Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Val Arg Phe Lys Asn Glu Phe1 5 10 15Lys Ser Ser Gly Tle Asn Thr Ala Ser Ser Ala Ala Ser Lys Glu Arg20 25 30Thr Ala Pro Leu Lys Ser Asn Thr Gly Phe Pro Lys Leu Leu Cys Ala35 40 45Ser Leu Leu Ile Phe Phe Leu Leu Leu Ala Ile Ser Phe Phe Ile Ala50 55 60Phe Val Ile Phe Phe Gln Lys Tyr Ser Gln Leu Leu Glu Lys Lys Thr65 70 75 80Thr Lys Glu Leu Val His Thr Thr Leu Glu Cys Val Lys Lys Asn Met85 90 95Pro Val Glu Glu Thr Ala Trp Ser Cys Cys Pro Lys Asn Trp Lys Ser100 105 110Phe Ser Ser Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Thr Glu Ser Ala Ser Trp Gln115 120 125Asp Ser Glu Lys Asp Cys Ala Arg Met Glu Ala His Leu Leu Val Ile130 135 140Asn Thr Gln Glu Glu Gln Asp Phe Ile Phe Gln Asn Leu Gln Glu Glu145 150 155 160Ser Ala Tyr Phe Val Gly Leu Ser Asp Pro Glu Gly Gln Arg His Trp165 170 175Gln Trp Val Asp Gln Thr Pro Tyr Asn Glu Ser Ser Thr Phe Trp His180 185 190Pro Arg Glu Pro Ser Asp Pro Asn Glu Arg Cys Val Val Leu Asn Phe195 200 205Arg Lys Ser Pro Lys Arg Trp Gly Trp Asn Asp Val Asn Cys Leu Gly210 215 220Pro Gln Arg Ser Val Cys Glu Met Met Lys Ile His Leu225 230 235(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度1458個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA
(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置257..1204(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置608(D)其它資料/注釋＝“不含608～673位核苷酸的短的形式”(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置775(D)其它資料/注釋＝“ASGPRm(表2)具有編碼位于775～776位之間的GEE的序列插入片段”(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置1064(D)其它資料/注釋＝“DCMP2s第1064位核苷酸可以是A，這就使得第270位編碼的氨基酸殘基由原來的asp變為asn”(xi)序列描述SEQ ID NO3GTTGAGGAGA TGGGATGTCC CAGATGATAG GGCTCCTGGG ATTTCAGACC CAAGACCAGC 60AGGACTCCAG TCACCTCTAC CCCAGCTCTC CAGGACACAG CGCTCCCAAC TCTGAGTGAC120GTCCCACCTC TGGTCCTTGC AGCACAACCA ACGTGGGAAT CACACCCTCC AGACCTCCCA180CAGCTCCACC CCAGACTGGG CGCCGGCCCT GCCTCCATTT CAGCTGTGAC AACCTCAGAG240CCGTGTTGGC CCAAGC ATG ACA AGG ACG TAT GAA AAC TTC CAG TAC TTG289Met Thr Arg Thr Tyr Glu Asn Phe Gln Tyr Leu1 5 10GAG AAT AAG GTG AAA GTC CAG GGG TTT AAA AAT GGG CCA CTT CCT CTC 337Glu Asn Lys Val Lys Val Gln Gly Phe Lys Asn Gly Pro Leu Pro Leu15 20 25CAG TCC CTC CTG CAG CGT CTC CGC TCT GGG CCC TGC CAT CTC CTG CTG 385Gln Ser Leu Leu Gln Arg Leu Arg Ser Gly Pro Cys His Leu Leu Leu30 35 40TCC CTG GGC CTC GGC CTG CTG CTG CTG GTC ATC ATC TGT GTG GTT GGA 433Ser Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Ile Ile Cys Val Val Gly45 50 55TTC CAA AAT TCC AAA TTT CAG AGG GAC CTG GTG ACC CTG AGA ACA GAT 481Phe Gln Asn Ser Lys Phe Gln Arg Asp Leu Val Thr Leu Arg Thr Asp60 65 70 75TTT AGC AAC TTC ACC TCA AAC ACT GTG GCG GAG ATC CAG GCA CTG ACT 529Phe Ser Asn Phe Thr Ser Asn Thr Val Ala Glu Ile Gln Ala Leu Thr80 85 90TCC CAG GGC AGC AGC TTG GAA GAA ACG ATA GCA TCT CTG AAA GCT GAG 577Ser Gln Gly Ser Ser Leu Glu Glu Thr Ile Ala Ser Leu Lys Ala Glu95 100 105GTG GAG GGT TTC AAG CAG GAA CGG CAG GCA GGG GTA TCT GAG CTC CAG 625Val Glu Gly Phe Lys Gln Glu Arg Gln Ala Gly Val Ser Glu Leu Gln110 115 120GAA CAC ACT ACG CAG AAG GCA CAC CTA GGC CAC TGT CCC CAC TGC CCA 673Glu His Thr Thr Gln Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro125 130 135TCT GTG TGT GTC CCA GTT CAT TCT GAA ATG CTC CTG CGA GTC CAG CAG 721Ser Val Cys Val Pro Val His Ser Glu Met Leu Leu Arg Val Gln Gln140 145 150 155CTG GTG CAA GAC CTG AAG AAA CTG ACC TGC CAG GTG GCT ACT 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1105Pro Asp Asp Trp Gln Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala270 275 280CAC TTC CAT CCA GAC GGC AGG TGG AAT GAC GAC GTC TGC CAG AGG CCC 1153His Phe His Pro Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro285 290 295TAC CAC TGG GTC TGC GAG GCT GGC CTG GGT CAG ACC AGC CAG GAG AGT 1201Tyr His Trp Val Cys Glu Ala Gly Leu Gly Gln Thr Ser Gln Glu Ser300 305 310 315CAC TGAGCTGCCT TTGGTGGGAC CACCCGGCCA CAGAAATGGC GGTGGGAGGA 1254HisGGACTCTTCT CACGACCTCC TCGCAAGACC GCTCTGGGAG AGAAATAAGC ACTGGGAGAT 1314TGGAAGCACT GCTAACATTT TGAATTTTTT TCTCTTTAAT TTTAAAAAGA TGGTATAGTG 1374TTCTTAAGCT TTTATTTTTT TTCCAACTTT TGAAAGTCAA CTTCATGAAG GTATAATTTT 1434TACATAATAA AAATGCACTC ATTT 1458(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度316個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Thr Arg Thr Tyr Glu Asn Phe Gln Tyr Leu Glu Asn Lys Val Lys1 5 10 15Val Gln Gly Phe Lys Asn Gly Pro Leu Pro Leu Gln Ser Leu Leu Gln20 25 30Arg Leu Arg Ser Gly Pro Cys His Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu Gly35 40 45Leu Leu Leu Leu Val Ile Ile Cys Val Val Gly Phe Gln Asn Ser Lys50 55 60Phe Gln Arg Asp Leu Val Thr Leu Arg Thr Asp Phe Ser Asn Phe Thr65 70 75 80Ser Asn Thr Val Ala Glu Ile Gln Ala Leu Thr Ser Gln Gly Ser Ser85 90 95Leu Glu Glu Thr Ile Ala Ser Leu Lys Ala Glu Val Glu Gly Phe Lys100 105 110Gln Glu Arg Gln Ala Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu His Thr Thr Gln115 120 125Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser Val Cys Val Pro130 135 140Val His Ser Glu Met Leu Leu Arg Val Gln Gln Leu Val Gln Asp Leu145 150 155 160Lys Lys Leu Thr Cys Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr165 170 175Glu Gly Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His Gln Asp Ser Cys180 185 190Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly Met Ser Trp Ala Glu Ala Glu Lys Tyr195 200 205Cys Gln Leu Lys Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn Ser Arg Glu Glu210 215 220Gln Asn Phe Val Gln Lys Tyr Leu Gly Ser Ala Tyr Thr Trp Met Gly225 230 235 240Leu Ser Asp Pro Glu Gly Ala Trp Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr245 250 255Ala Thr Gly Phe Gln Asn Trp Lys Pro Gly Gln Pro Asp Asp Trp Gln260 265 270Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His Phe His Pro Asp275 280 285Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro Tyr His Trp Val Cys290 295 300Glu Ala Gly Leu Gly Gln Thr Ser Gln Glu Ser His305 310 315(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度291個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽鏈(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Thr Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Gln His Leu Asp Asn Glu Glu Ser1 5 10 15Asp His His Gln Leu Arg Lys Gly Pro Pro Pro Pro Gln Pro Leu Leu20 25 30Gln Arg Leu Cys Ser Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu35 40 45Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Gly Ser Gln Asn Ser50 55 60Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe Ser Asn Phe65 70 75 80Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly85 90 95Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln100 105 110Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys115 120 125Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu130 135 140Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu145 150 155 160His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala165 170 175Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val180 185 190Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val195 200 205Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val210 215 220Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln225 230 235 240Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala245 250 255His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro260 265 270Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln Glu Pro275 280 285Pro Leu Leu290(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度287個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽鏈(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Ala Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln Leu Ser Ser Glu Glu Asnl 5 10 15Asp His Pro Phe His Gln Gly Pro Pro Pro Ala Gln Pro Leu Ala Gln20 25 30Arg Leu Cys Ser Met Val Cys Phe Ser Leu Leu Ala Leu Ser Phe Asn35 40 45Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Thr Gly Ser Gln Ser Ala Gln50 55 60Leu Gln Ala Glu Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ala Phe Ser Asn Phe Ser65 70 75 80Ser Ser Thr Leu Thr Glu Val Gln Ala Ile Ser Thr His Gly Gly Ser85 90 95Val Gly Asp Lys Ile Thr Ser Leu Gly Ala Lys Leu Glu Lys Gln Gln100 105 110Gln Asp Leu Lys Ala Asp His Asp Ala Leu Leu Phe His Leu Lys His115 120 125Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe Val Ala Cys Gln Met Glu Leu Leu His130 135 140Ser Asn Gly Ser Gln Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His145 150 155 160Gln Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly Lys Ala Trp Ala Glu165 170 175Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Glu Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn180 185 190Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Ile Val Gln His Thr Asn Pro Phe Asn195 200 205Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Asp Gly Ser Trp Lys Trp Val Asp210 215 220Gly Thr Asp Tyr Arg His Asn Tyr Lys Asn Trp Ala Val Thr Gln Pro225 230 235 240Asp Asn Trp His Gly His Glu Leu Gly Gly Ser Glu Asp Cys Val Glu245 250 255Val Gln Pro Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Phe Cys Leu Gln Val Tyr260 265 270Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg Asn Ala Thr Gly Glu Val Ala275 280 285(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度1418個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置279..992(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置1348(D)其它資料/注釋＝“聚A附加基元”(xi)序列描述SEQ ID NO7CTATCCCCCA CTTTGCAGTA CTTGCATATC TTGCTGAGTG GGTTTGAGGG CTACAATTCT 60TATTTTCTTA TGTTAAGAGG TTGCATTTCC CTTATCTCGC CCTGGTGATT CTATGCTGTG120GTTTCTTGTT CTCATCTCGT TTATCCTAGT GAGACATGTC TCTTCTTTCA TACAACTGTG180CAATATGACA ACTTATCACA GTGATTGGTT CTCATATACT ATAGAGCCTT AGAGAAGGAA240CAAGGCTCTC TTCTGACGGA GGAAGATTTT TTCTTGAT ATG GCT TCA GAA ATC293
Met Ala Ser Glu Ile1 5ACT TAT GCA GAA GTG AAG TTC AAG AAT GAA TCC AAC TCC TTG CAC ACC 341Thr Tyr Ala Glu Val Lys Phe Lys Asn Glu Ser Asn Ser Leu His Thr10 15 20TAC TCA GAA TCT CCT GCA GCT CCC AGA GAG AAA CCT ATC CGT GAT CTA 389Tyr Ser Glu Ser Pro Ala Ala Pro Arg Glu Lys Pro Ile Arg Asp Leu25 30 35AGA AAG CCT GGT TCC CCC TCA CTG CTT CTT ACA TCC CTG ATG CTA CTT 437Arg Lys Pro Gly Ser Pro Ser Leu Leu Leu Thr Ser Leu Met Leu Leu40 45 50CTC CTG CTG CTG GCA ATC ACA TTC TTA GTT GCT TTT ATC ATT TAT TTT 485Leu Leu Leu Leu Ala Ile Thr Phe Leu Val Ala Phe Ile Ile Tyr Phe55 60 65CAA AAG TAC TCT CAA CTT CTT GAA GAA AAA AAA GCT GCA AAA AAT ATA 533Gln Lys Tyr Ser Gln Leu Leu Glu Glu Lys Lys Ala Ala Lys Asn Ile70 75 80 85ATG CAC AAT GAA TTG AAC TGC ACA AAA AGT GTT TCA CCC ATG GAA GAC 581Met His Asn Glu Leu Asn Cys Thr Lys Ser Val Ser Pro Met Glu Asp90 95 100AAA GTC TGG AGC TGT TGC CCA AAG GAT TGG AGG CTA TTT GGT TCC CAC 629Lys Val Trp Ser Cys Cys Pro Lys Asp Trp ArG Leu Phe Gly Ser His105 110 115TGC TAC TTG GTT CCC ACA GTT TCT TCA TCA GCA TCT TGG AAC AAG AGT 677Cys Tyr Leu Val Pro Thr Val Ser Ser Ser Ala Ser Trp Asn Lys Ser120 125 130GAG GAG AAC TGC TCC CGC ATG GGT GCT CAT CTA GTG GTG ATC CAA AGC 725Glu Glu Asn Cys Ser Arg Met Gly Ala His Leu Val Val Ile Gln Ser135 140 145CAG GAA GAG CAG GAT TTC ATC ACT GGG ATC TTG GAC ACT CAT GCT GCT 773Gln Glu Glu Gln Asp Phe Ile Thr Gly Ile Leu Asp Thr His Ala Ala150 155 160 165TAT TTT ATA GGG TTG TGG GAT ACA GGC CAT CGG CAA TGG CAA TGG GTT 821Tyr Phe Ile Gly Leu Trp Asp Thr Gly His Arg Gln Trp Gln Trp Val170 175 180GAT CAG ACA CCA TAT GAA GAA AGT ATC ACA TTC TGG CAC AAT GGT GAG 869Asp Gln Thr Pro Tyr Glu Glu Ser Ile Thr Phe Trp His Asn Gly Glu185 190 195CCC AGC AGT GGC AAT GAA AAA TGT GCT ACA ATA ATT TAC CGT TGG AAG 917Pro Ser Ser Gly Asn Glu Lys Cys Ala Thr Ile Ile Tyr Arg Trp Lys200 205 210ACT GGA TGG GGC TGG AAC GAT ATC TCT TGC AGT CTT AAA CAG AAG TCA 965Thr Gly Trp Gly Trp Asn Asp Ile Ser Cys Ser Leu Lys Gln Lys Ser215 220 225GTT TGT CAG ATG AAG AAA ATA AAC TTA TGAATCACTC ATTCTTCATG1012Val Cys Gln Met Lys Lys Ile Asn Leu230 235GGCATTCGAT TCATTGTTAT CCAACCATTA CACAGACACC TGGGAAATTC TACAGGTTCA1072CAGAATTTAA GTGGGCAGCA AATGGTTATG CATACACTGG CCCACATATA TCCTTGTGCA1132TTTACCCACC TACTCTGTCA TAAAATGAAC TTTCATTGAG AATTTTCTAT ATACCACAGA1192GTATACAGAG TCCCTTATGG ACACACATGG AACTTTTTGC CATCTTGTTT ACTCATGCCA1252TTGTATGATA GGTTCTCTTG ACCTATCTGT TTCTGTTTCT CTGTTGTTTT TTTAATGTCT1312TTGGATTTAT TGACATTAAA TTGAGAAGTA AAATTATAAA TATTTAAGTG TCTGGATTGA1372TACACACAGA TATGTACTAT GAAATATAAT TAAATATTTA CTGTCC 1418(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度238個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Ala Ser Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Val Lys Phe Lys Asn Glu Ser1 5 10 15Asn Ser Leu His Thr Tyr Ser Glu Ser Pro Ala Ala Pro Arg Glu Lys20 25 30Pro Ile Arg Asp Leu Arg Lys Pro Gly Ser Pro Ser Leu Leu Leu Thr35 40 45Ser Leu Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ile Thr Phe Leu Val Ala50 55 60Phe Ile Ile Tyr Phe Gln Lys Tyr Ser Gln Leu Leu Glu Glu Lys Lys65 70 75 80Ala Ala Lys Asn Ile Met His Asn Glu Leu Asn Cys Thr Lys Ser Val85 90 95Ser Pro Met Glu Asp Lys Val Trp Ser Cys Cys Pro Lys Asp Trp Arg100 105 110Leu Phe Gly Ser His Cys Tyr Leu Val Pro Thr Val Ser Ser Ser Ala115 120 125Ser Trp Asn Lys Ser Glu Glu Asn Cys Ser Arg Met Gly Ala His Leu130 135 140Val Val Ile Gln Ser Gln Glu Glu Gln Asp Phe Ile Tnr Gly Ile Leu145 150 155 160Asp Thr His Ala Ala Tyr Phe Ile Gly Leu Trp Asp Thr Gly His Arg165 170 175Gln Trp Gln Trp Val Asp Gln Thr Pro Tyr Glu Glu Ser Ile Thr Phe180 185 190Trp His Asn Gly Glu Pro Ser Ser Gly Asn Glu Lys Cys Ala Thr Ile195 200 205Ile Tyr Arg Trp Lys Thr Gly Trp Gly Trp Asn Asp Ile Ser Cys Ser210 215 220Leu Lys Gln Lys Ser Val Cys Gln Met Lys Lys Ile Asn Leu225 230 235(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度1370個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置273..1091(xi)序列描述SEQ ID NO9AAAGCATGGT CTCTGTGTGT TCTAATCCCT GTTCATTCTC ATTTACTGTC CCTGGGATTT 60CAGATCCAAG ACCAGCAGGA CTCCAGTCAC CTCTACCCCA GCTCTCCAGG ACACAGCGCT120CCCAACTCTG AGTGACGTCC CACCTCTGGT CCTTGCAGCA CAACCAACGT GGGAATCACA180CCCTCCAGAC CTCCCACAGC TCCACCCCAG ACTGGGCGCC GGCCCTGCCT CCATTTCAGC240TGTGACAACC TCAGAGCCGT GTTGGCCCAA GC ATG ACA AGG ACG TAT GAA AAC 293Met Thr Arg Thr Tyr Glu Asn1 5TTC CAG TAC TTG GAG AAT AAG GTG AAA GTC CAG GGG TTT AAA AAT GGG 341Phe Gln Tyr Leu Glu Asn Lys Val Lys Val Gln Gly Phe Lys Asn Gly10 15 20CCA CTT CCT CTC CAG TCC CTC CTG CTG CTG GTC ATC ATC TGT GTG GTT 389Pro Leu Pro Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Val Ile Ile Cys Val Val25 30 35GGA TTC CAA AAT TCC AAA TTT CAG AGG GAC CTG GTG ACC CTG AGA ACA 437Gly Phe Gln Asn Ser Lys Phe Gln Arg Asp Leu Val Thr Leu Arg Thr40 45 50 55GAT TTT AGC AAC TTC ACC TCA AAC ACT GTG GCG GAG ATC CAG GCA CTG 485Asp Phe Ser Asn Phe Thr Ser Asn Thr Val Ala Glu Ile Gln Ala Leu60 65 70ACT TCC CAG GGC AGC AGC TTG GAA GAA ACG ATA GCA TCT CTG AAA GCT 533Thr Ser Gln Gly Ser Ser Leu Glu Glu Thr Ile Ala Ser Leu Lys Ala75 80 85GAG GTG GAG GGT TTC AAG CAG GAA CGG CAG GCA GTT CAT TCT GAA ATG 581Glu Val Glu Gly Phe Lys Gln Glu Arg Gln Ala Val His Ser Glu Met90 95 100CTC CTG CGA GTC CAG CAG CTG GTG CAA GAC CTG AAG AAA CTG ACC TGC 629Leu Leu Arg Val Gln Gln Leu Val Gln Asp Leu Lys Lys Leu Thr Cys105 110 115CAG GTG GCT ACT CTC AAC AAC AAT GGT GAG GAA GCC TCC ACT GAA GGG 677Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn Asn Gly Glu Glu Ala Ser Thr Glu Gly120 125 130 135ACC TGC TGC CCC GTC AAC TGG GTG GAG CAC CAA GAC AGC TGC TAC TGG 725Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His Gln Asp Ser Cys Tyr Trp140 145 150TTC TCT CAC TCT GGG ATG TCC TGG GCC GAG GCT GAG AAG TAC TGC CAG 773Phe Ser His Ser Gly Met Ser Trp Ala Glu Ala Glu Lys Tyr Cys Gln155 160 165CTG AAG AAC GCC CAC CTG GTG GTC ATC AAC TCC AGG GAG GAG CAG AAT 821Leu Lys Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn Ser Arg Glu Glu Gln Asn170 175 180TTT GTC CAG AAA TAT CTA GGC TCC GCA TAC ACC TGG ATG GGC CTC AGT 869Phe Val Gln Lys Tyr Leu Gly Ser Ala Tyr Thr Trp Met Gly Leu Ser185 190 195GAC CCT GAA GGA GCC TGG AAG TGG GTG GAT GGA ACA GAC TAT GCG ACC 917Asp Pro Glu Gly Ala Trp Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Ala Thr200 205 210 215GGC TTC CAG AAC TGG AAG CCA GGC CAG CCA GAC GAC TGG CAG GGG CAC 965Gly Phe Gln Asn Trp Lys Pro Gly Gln Pro Asp Asp Trp Gln Gly His220 225 230GGG CTG GGT GGA GGC GAG GAC TGT GCT CAC TTC CAT CCA GAC GGC AGG 1013Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His Phe His Pro Asp Gly Arg235 240 245TGG AAT GAC GAC GTC TGC CAG AGG CCC TAC CAC TGG GTC TGC GAG GCT 1061Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro Tyr His Trp Val Cys Glu Ala250 255 260GGC CTG GGT CAG ACC AGC CAG GAG AGT CAC TGAGCTGCCT TTGGTGGGAC1111Gly Leu Gly Gln Thr Ser Gln Glu Ser His265 270CACCCGGCCA CAGAAATGGC GGTGGGAGGA GGACTCTTCT CACGACCTCC TCGCAAGACC1171GCTCTGGGAG AGAAATAAGC ACTGGGAGAT TGGAAGCACT GCTAACATTT TGAATTTTTT1231TCTCTTTAAT TTTAAAAAGA TGGTATAGTG TTCTTAAGCT TTTATTTTTT TTCCAACTTT1291TGAAAGTCAA CTTCATGAAG GTATAATTTT TACATAATAA AAATGCACTC ATTTAAAGAG1351TAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1370(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度273個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Thr Arg Thr Tyr Glu Asn Phe Gln Tyr Leu Glu Asn Lys Val Lys1 5 10 15Val Gln Gly Phe Lys Asn Gly Pro Leu Pro Leu Gln Ser Leu Leu Leu20 25 30Leu Val Ile Ile Cys Val Val Gly Phe Gln Asn Ser Lys Phe Gln Arg35 40 45Asp Leu Val Thr Leu Arg Thr Asp Phe Ser Asn Phe Thr Ser Asn Thr50 55 60Val Ala Glu Ile Gln Ala Leu Thr Ser Gln Gly Ser Ser Leu Glu Glu65 70 75 80Thr Ile Ala Ser Leu Lys Ala Glu Val Glu Gly Phe Lys Gln Glu Arg85 90 95Gln Ala Val His Ser Glu Met Leu Leu Arg Val Gln Gln Leu Val Gln100 105 110Asp Leu Lys Lys Leu Thr Cys Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn Asn Gly115 120 125Glu Glu Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu130 135 140His Gln Asp Ser Cys Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly Met Ser Trp Ala145 150 155 160Glu Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Lys Asn Ala His Leu Val Val Ile165 170 175Asn Ser Arg Glu Glu Gln Asn Phe Val Gln Lys Tyr Leu Gly Ser Ala180 185 190Tyr Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp Pro Glu Gly Ala Trp Lys Trp Val195 200 205Asp Gly Thr Asp Tyr Ala Thr Gly Phe Gln Asn Trp Lys Pro Gly Gln210 215 220Pro Asp Asp Trp Gln Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala225 230 235 240His Phe His Pro Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro245 250 255Tyr His Trp Val Cys Glu Ala Gly Leu Gly Gln Thr Ser Gln Glu Ser260 265 270His(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度75個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽鏈(xi)序列描述SEQ ID NO11Glu Lys Met Ile Ile Lys Glu Leu Asn Tyr Thr Glu Leu Glu Cys Thr1 5 10 15Lys Trp Ala Ser Leu Leu Glu Asp Lys Val Trp Ser Cys Cys Pro Lys20 25 30Asp Trp Lys Pro Phe Gly Ser Tyr Cys Tyr Phe Thr ser Thr Asp Leu35 40 45Val Ala Ser Trp Asn Glu Ser Lys Glu Asn Cys Phe His Met Gly Ala50 55 60His Leu Val Val Ile His Ser Gln Glu Glu Gln65 70 7權利要求
1.一種基本純化或重組的DCMP1多肽，該多肽表現出與SEQ ID NO2或8至少約85％的序列一致性。
2.一種基本純化或重組的DCMP2多肽，該多肽包括a)選自下列序列的一段多肽1)Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu His Thr Thr Gln LysAla His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser Val CysVal Pro(SEQ ID NO4的118～144位殘基)；2)Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr GluGly Thr Cys Cys(SEQ ID NO4的166～181位殘基)；或3)Trp Lys Pro Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gln Gly HisGly Leu Gly(SEQ ID NO4的263～277位殘基)；或b)具有下列兩種特征的序列1)包含來自SEQ ID NO10中描述的DCMP2v中的至少17個連續氨基酸；以及2)缺少一個至少含12個連續氨基酸的節段，這些氨基酸來自FKNGPLPLQS LLQRLRWGPC HLLLWLGLGL LLLVIIC(SEQ IDNO4的20～56位殘基)。
3.一種包括權利要求1或2中多肽的融合蛋白。
4.一種結合化合物，它能夠特異性地與權利要求1或2中的多肽結合。
5.權利要求4中的結合化合物，它是一種抗體或抗體片段。
6.一種編碼權利要求1或2中多肽的核酸。
7.一種表達載體，其中含有權利要求6中所述的核酸。
8.一種宿主細胞，其中含有權利要求7中所述的載體。
9.一種用重組手段生產多肽的方法，其中包括在所述多肽能夠表達的條件下培養權利要求8中所述的宿主細胞。
全文摘要
本發明描述了編碼哺乳動物各種淋巴細胞蛋白的核酸及其相關試劑,其中的哺乳動物包括靈長類,相關試劑包括特異性的抗體以及純化蛋白。本發明還提供了所述試劑的使用方法及相關試劑盒。所述的蛋白質是樹突狀細胞膜蛋白(DCMP),該蛋白與凝集素及脫唾液酸糖蛋白受體具有相似性。
文檔編號C07K19/00GK1262689SQ9880696
公開日2000年8月9日 申請日期1998年7月8日 優先權日1997年7月9日
發明者J·瓦拉德奧, O·拉維爾, E·E·M·巴特斯, J·福德, S·塞蘭德, S·J·E·勒貝奎 申請人:先靈公司