用于阿爾茨海默氏癥的死前診斷和體內成像以及防止淀粉樣蛋白沉淀的柯胺g的烷基、鏈...的制作方法

專利名稱：用于阿爾茨海默氏癥的死前診斷和體內成像以及防止淀粉樣蛋白沉淀的柯胺g的烷基、鏈 ...的制作方法
技術領域：
本發明利用國立老化研究所(the Institute of Ageing，批準號為AG-05443，AG-05133和AG-08974)的基金完成。該申請是1996年5月1日遞交的美國專利申請08/640740和PCT/US96/05918的后續申請，以及1995年5月1日遞交的美國專利申請08/432019和1994年7月29日遞交的美國專利申請08/282289的部分后續申請。
背景技術：
本發明涉及適于在活體患者內使淀粉樣蛋白沉淀物成像的化合物的鑒別。更具體地說，本發明涉及使體內腦組織中的淀粉樣蛋白沉淀物成像，進行阿爾茨海默氏癥的死前診斷的方法。本發明還涉及這類化合物的治療用途。
阿爾茨海默氏癥(“AD”)是一種神經變性疾病，特征為記憶喪失和其它認知性缺陷。McKhann等，神經學(Neurology)34939(1984)。在美國，它是引起癡呆的最常見原因。AD可打擊年齡在40-50歲左右的年輕人。然而，不進行危險的腦組織活組織檢查，該疾病很難確診，發病的時間也未可知。AD的發病趨勢隨年齡增加而增加，85-90歲老年人中的該病患者比例估計可高達40-50％。Evans等，JAMA 2622551(1989)；Katzman，神經學(Neurology)4313(1993)。
根據定義，AD通過對腦組織的檢查，通常是采用活組織檢查來確診。Khachaturian，Arch.Neurol.421097(1985)；McKhann等，神經學(Neurology)34939(1984)。從神經病理學上說，該病的特征為存在神經斑(NP)、神經纖維結(NFT)和神經元喪失，以及多種其它的發現物。Mann，Mech.Ageing Dev.31213(1985)。阿爾茨海默氏癥患者的死后腦組織切片顯示出以神經斑的蛋白質胞外核形式存在的淀粉樣蛋白，這就是AD的特征。
這些神經斑的淀粉樣蛋白核由稱之為β-淀粉樣蛋白(Aβ)的蛋白質主要通過β-褶皺樣片狀構型排列而成。Mori等，生物化學雜志(Journal of Biological Chemistry)26717082(1992)；Kirschner等，PNAS 83503(1986)。神經斑是該疾病的早期癥狀，固定不變。Mann等，神經科學雜志(J.Neurol.Sci.)89169；Mann，Mech.Ageing Dev.31213(1985)；Terry等，J.Neuropathol.Exp.Neurol 46262(1987)。
Aβ的最初沉淀可能發生在臨床癥狀出現的很久以前，這值得注意。目前建議的診斷AD的“顯微鏡最低標準”是基于大腦組織中發現的神經斑的數量。Khachaturian，Arch.Neurol.，supra(1985)。不幸的是，神經斑的計數必須延遲到死后。
含淀粉樣蛋白的神經斑是AD和Down氏綜合癥患者以及載脂蛋白E4等位基因同型接合者的大腦組織的選擇性區域的主要特征，后者很容易發展為AD。Corder等，科學(Science)261921(1993)；Divry，P.，神經物理學雜志(J.Neurol.Psych.)27643-657(1927)；Wisniewski等在Zimmerman，H.M.編輯的《神經病理學進展》(Progress in Neuropathology)(Grune和Stratton，N.Y.1973)pp.1-26。通過用硫黃素S或剛果紅對大腦組織切片染色可方便地證實大腦組織的淀粉樣蛋白。Puchtler等，J.Histochem.Cytochem.1035(1962)。剛果紅染色的淀粉樣蛋白特征為二色外觀，顯示出黃綠偏振色。該二色帶是淀粉樣蛋白的β-褶皺樣片狀結構的結果。Glenner，G.N.Eng.J.Med.，3021283(1980)。淀粉樣蛋白的生物化學和組織化學的詳細討論可參見Glenner，N.Eng.J.Med.，3021333(1980)。
至今為止，AD的診斷大多仍通過臨床標準評價、腦組織活體檢查和死后組織研究進行。開發阿爾茨海默氏癥體內診斷方法的研究包括(1)基因測試，(2)免疫分析方法和(3)成像方法。
基于對數個稀有正染色體顯性的AD家族中的Aβ前體蛋白的點突變的發現證實Aβ代謝異常是AD發展的必需和充分條件。Hardy，Nature Genetics 1233(1992)；Hardy等，科學(Science)256184(1992)。這些突變發生在Aβ由其前體蛋白生成Aβ所需的N-和C-末端開裂點附近。St.George-Hyslop等，科學(Science)235885(1987)；Kang等，自然(Nature)325733(1987)；Potter WO92/17152。然而，對大量AD家族的基因分析證實AD是基因異源的。St.George-Hyslop等，自然(Nature)347194(1990)。僅在某些早發性AD家族中顯示出與第21對標志染色體的連接，但在遲發性AD家族中未觀察到該連接。最近，Sherrington等鑒別了染色體14上的一種基因，該基因預計含有多個跨膜結構域，類似一完整的膜蛋白[自然(Nature)375754-760(1995)]。該基因可引發高達70％的早發性正染色體顯性AD。初步的數據認為染色體14的突變引起Aβ產量的增加。Scheuner等，Soc.Neurosci.Abstr.211500(1995)。在患早發性AD的Volga德國家族中的第1對染色體上鑒別出非常類似的基因突變。Levy-Lahad等，科學(Science)269973-977(1995)。
載脂蛋白E基因型的篩選已被建議作為診斷AD的輔助手段。Scott，Nature 366502(1993)；Roses，Ann.Neurol.386-14(1995)。但由于載脂蛋白E4等位基因僅是AD的一種危險因素，而非該疾病的標志，因此該技術的運用產生了困難。在許多AD患者中不存在該基因，但在許多非癡呆的老年人中卻存在著該基團。Bird，Ann.Neurol.382-4(1995)。
已經開發了用于檢測AD患者中存在的神經化學標志物和檢測腦脊液中AD相關的淀粉樣蛋白的免疫分析方法。Warner，Anal，Chem.591203A(1987)；Potter的世界專利92/17152；Glenner等的美國專利4666829。據證明這些診斷AD的方法不能檢測所有患者的AD，尤其是在該疾病的早期，這些方法是介入性的，需要脊柱穿刺放液。另外，已進行了開發單克隆抗體用作Aβ成像探針的嘗試。Majocha等，J.Nucl.Med.，332184(1992)；Majocha等，WO 89/06242和Majocha等，美國專利5231000。抗體探針的主要缺陷是存在使這些大分子穿過血腦屏障的困難。使用抗體體內診斷AD將需血腦屏障顯著異常以獲得進入腦的通路。還沒有使人信服的功能性證據表明AD中確實存在血腦屏障異常。Kalaria，Cerebrovascular&BrainMetabolism Reviews 4226(1992)。
在AD診斷中使用Aβ抗體也有缺陷，因為它們除使神經斑著色外，還典型地使含非β片狀(非纖維狀)Aβ的Aβ沉淀著色。Yamaguchi等，Acta Neuropathol.，77314(1989)。這些沉淀可以是一種單獨的損傷類型，并非一定與AD的癡呆病程有關。后一種論點是基于在認知正常的對照動物和老齡狗中發現了非纖維狀的淀粉樣蛋白沉淀提出的。Moran等，臨床醫學(Medicina Clinica)9819(1992)；Shimada等，獸醫科學雜志(Journal of Veterinary MedicalScience)54137(1992)；Ishihara等，腦組織研究(Brain Res.)548；196(1991)；Giaccone等，神經科學通訊(Neurosci.Lett.)114178(1990)。即使非纖維狀淀粉樣蛋白沉淀是神經斑的前體，AD的關鍵病理學過程可能是明顯良性的非纖維狀淀粉樣蛋白沉淀進入神經斑，產生其相關的變性暈。因此，需要一種對纖維狀Aβ沉淀和NFT具特異性的探針，作為比抗體對AD病理學更具特異性的標記物，它還可以標記非纖維狀淀粉樣蛋白沉淀。
最近，放射性標記的Aβ肽已被用于標記AD腦組織中的擴散的、致密的和神經性斑。Maggio等，WO93/04194。然而，這些肽都具有抗體的缺點。具體地說，肽一般不能穿過血腦屏障，以達到成像所需的量。
剛果紅可用于體內診斷非腦實質中的淀粉樣變性。但是剛果紅不適于體內診斷腦組織中Aβ的沉淀，因為僅有0.03％注射劑量的碘化剛果紅可進入腦實質。Tubis等，J.Amer.Pharm.Assn.49422(1960)。與剛果紅相關的放射碘化的重氮聯苯胺化合物如BenzoOrange R和Direct Blue 4曾被建議用于體外和體內檢測患者器官中淀粉樣蛋白沉淀的存在和定位。Quay等，美國專利5039511和4933156。然而，同剛果紅一樣，Quay建議的所有化合物都包含強酸性的磺酸基團，該基團嚴重地限制了這些化合物進入腦，以致它們在腦實質中很難達到成像有效量或可檢測量。
直至死后才能評估AD中的淀粉樣蛋白沉淀妨礙了該毀滅性疾病的研究。十分需要一種死前定量淀粉樣蛋白沉淀的方法作為輕度的或臨床上易混淆的病癥的診斷工具以及檢測防治Aβ沉淀的有效性的工具。因此，開發一種通過成像腦實質中淀粉樣蛋白沉淀死前體內診斷AD的安全和特異性的方法具有極大的意義。雖然，對于體內診斷AD已進行過各種嘗試，但目前還沒有死前探測腦組織淀粉樣蛋白沉淀的方法。還沒有一種使用高親和性探針探測淀粉樣蛋白沉淀的方法，所述探針毒性低，能夠穿過血腦屏障，并且與正常腦組織相比能更有效地結合于AD腦組織，從而在患者死前可識別腦組織中的AD淀粉樣蛋白沉淀。可以說，沒有一種體內AD診斷方法已被證明是達到了這些標準。
新近的數據表明結合淀粉樣蛋白沉淀的化合物對AD和II型糖尿病具有潛在的治療作用。如上所述，它們是存在AD腦組織中的、擴散性和神經性斑塊(典型的)的兩大類疾病。擴散斑塊不顯示誘發形態學反應，例如神經斑中發現的反應性星形膠質細胞、營養障礙性軸突、小神經膠質細胞、突觸喪失和全補體激活。Joachim等，Am.J.Pathol.135309(1989)；Masliah等，Loc.Cit.1371293(1990)；Lue和Rogers，Demential 3308(1992)。這些形態學反應預示了所有神經毒性和細胞變性過程發生于神經斑的纖維性Aβ沉淀的鄰近區域。據報道，在體外，有許多類型的細胞都會發生Aβ-誘發的神經毒性和細胞變性。Yankner等，科學(Science)250279(1990)；Roher等，BBRC 174572(1991)；Frautschy等，Proc.Natl.Acad.Sci.8883362(1991)；Shearman等，Loc.cit.911470(1994)。據顯示，Aβ肽的聚集是體外神經毒性產生的前提。Yankner，Neurobiol.Aging 13615(1992)。在擴散和神經斑中的Aβ積聚狀態的差異可解釋圍繞擴散斑的神經毒性反應缺乏。Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.，9112243(1994)。最近，有三個實驗室的報道認為剛果紅抑制體外Aβ-誘發的神經毒性和細胞變性。Burgevin等，NeuroReport 52429(1994)；Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.9112243(1994)；Pollack等，神經科學通訊(Neuroscience Letters)184113(1995)；Pollack等，神經科學通訊(Neuroscience Letters)197211(1995)。已經揭示了涉及抑制纖維形成和預防所形成纖維的神經毒性的兩種機理。Lorenzo和Yankner，Proc，Natl.Acad. Sci.9112243(1994)。據顯示，剛果紅可使胰腺的胰島細胞免受淀粉不溶素引起的毒性作用。Lorenzo和Yankner，Proc，Natl.Acad.Sci.9112243(1994)。淀粉不溶素是一種類似于Aβ的纖維性肽，它沉積于II型糖尿病的胰腺中。
某些偶氮染料可致癌是本領域已知的。Morgan等，Environmental Health Perspectives，102(增補)263-78，(1994)。這種潛在的致癌性是建立在偶氮染料可通過腸細菌被廣泛代謝為游離的母體胺這一事實基礎上的。Cerniglia等，生物化學和生物物理學研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Com.)1071224-1229(1982)。在聯苯胺染料(和許多其它取代的聯苯胺)的情況下，致癌物是游離胺。這些事實對于淀粉樣蛋白的成像研究沒有什么暗示，因為在這些研究中僅有極少量的高特異活性的放射性標記染料被直接注入血流中。在此，施用的量可忽略不計，并且染料也不與腸細菌接觸。
在治療用途方面，這些事實也具有重大意義。從治療化合物釋放出一種已知的致癌物是無法令人接受的。重氮染料代謝的第二個問題是許多給藥的藥物在吸收前是通過腸細菌代謝的。即使釋放的代謝物是無毒的，也存在著降低了生物利用度的缺陷。
因此，仍然需要可結合淀粉樣蛋白的化合物，它們與剛果紅類似，但能夠進入腦組織中(而剛果紅不能)。這類化合物可用于預防與纖維形成有關的細胞變性，由此治療淀粉樣蛋白相關性疾病，例如AD和Downs綜合癥，并用于治療II型糖尿病的胰腺胰島細胞毒性。
仍需要可結合淀粉樣蛋白的化合物，它們是無毒性的和可生物利用的，并且可用于治療。
發明概述本發明的目的是提供一種通過體內成像腦實質中的淀粉樣蛋白死前診斷AD的安全特異性方法。本發明的另一個目的是提供一種識別患者死前的腦組織中AD淀粉樣蛋白沉淀的方法，該方法使用一種低毒的、可穿過血腦屏障的并能區分AD腦組織與正常腦組織的高親和性的探針探測淀粉樣蛋白。另一個目的是提供一種治療AD的方法，該方法防止Aβ沉淀或產生毒性。另一個目的是提供一種在活組織檢查或死后組織分析中染色和檢測淀粉樣蛋白沉淀的技術。另一個目的是提供一種在活組織檢查和死后組織分析中定量組織勻漿中淀粉樣蛋白沉淀的方法。
為實現上述和其他目的，本發明一方面，提供一種可結合淀粉樣蛋白的式I化合物或其水溶性無毒鹽
是C≡C，CR’＝CR’，CR’2-CR’2，C≡C-C≡C，CR’＝CR’-CR’＝CR’，C≡C-CR’＝CR’或CR’2-CR’2-CR’2-CR’2(其中各個R’獨立地表示H或低級烷基)；X是C(R”)2(其中各個R”獨立地是H、F、Cl、Br、I、低級烷基、(CH2)nOR’(其中n＝1，2或3)、CF3、CH2-CH2F、O-CH2-CH2F、CH2-CH2-CH2F、O-CH2-CH2-CH2F、CN、(C＝O)-R’、N(R’)2、NO2、(C＝O)N(R’)2O(CO)R’、OR’、SR’、COOR’、Rph、CR’＝CR’-Rph、CR’2-CR’2-Rph(其中Rph表示未取代或取代的苯基(苯基的取代基可選自R”中定義的非苯基取代基)、三-烷基錫、下式的四唑或噁二唑
其中R’是H或低級烷基)
或者X是CR’＝CR’，N＝N，C＝O，O，NR’(其中R’表示H或低級烷基)，S或SO2；R1和R2各自獨立地是H、F、Cl、Br、I、低級烷基、(CH2)nOR’(其中n＝1，2或3)、CF3、CH2-CH2F、O-CH2-CH2F、CH2-CH2-CH2F、O-CH2-CH2-CH2F、CN、(C＝O)-R’、N(R’)2、NO2、(C＝O)N(R’)2O(CO)R’、OR’、SR’、COOR’、三-烷基錫，Rph、CR’＝CR’-Rph、CR’2-CR’2-Rph，其中Rph表示未取代或取代的苯基(苯基的取代基可選自R1和R2中定義的非苯基取代基)、下式的四唑或噁二唑
(其中R’是H或低級烷基)、或下式的三氮烯
(其中R8和R9是低級烷基)或者
各個Q獨立地選自下列的結構之一IA、IB、IC、ID、IE、IF和IG，其中IA具有下列結構
其中R3、R4、R5、R6或R7各自獨立地是如上R1所定義的；IB具有下列結構
其中R10、R11、R12、R13、R14、R15或R16各自獨立地是如上R1所定義的；IC具有下列結構
其中R17、R18、R19、R20或R21各自獨立地是如上R1所定義的；ID具有下列結構
其中R22、R23或R24各自獨立地是如上R1所定義的；和
表示下式的六個雜環之一
IE具有下列結構
其中R25、R26或R27各自獨立地是如上R1所定義的；和
表示下式的六個雜環之一
IF具有下列結構
其中R28、R29、R30、R31或R32中之一是如上式I中所定義的連接
并且R28、R29、R30、R32或R32彼此獨立地如上R1所定義；IG具有下列結構
其中R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39中之一是如上式I中所定義的連接
并且R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39彼此獨立地如上R1所定義。
本發明的另一個目的是提供一種如上定義的可結合淀粉樣蛋白的式I化合物或其水溶性無毒鹽，其中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一個選自131I，123I，76Br，75Br，18F，19F，125I，CH2-CH2-18F，O-CH2-CH2-18F，CH2-CH2-CH2-18F，O-CH2-CH2-CH2-18F和式I中特別說明的含碳取代基，其中的至少一個碳是11C或13C。
本發明的另一個目的是提供一種可與淀粉樣蛋白結合的如上定義的式I化合物或其水溶性無毒鹽，其中通過與合成Aβ肽或阿爾茨海默氏癥腦組織結合測定的該化合物與Aβ結合的離解常數(KD)為0.0001～10.0μM。
本發明的另一個目的是提供一種可與淀粉樣蛋白結合的如上定義的式I化合物或其水溶性無毒鹽的合成方法，式I中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一個選自131I，123I，76Br，75Br，18F和19F，該方法包括可與淀粉樣蛋白結合的如上定義的式I化合物或其水溶性無毒鹽(其中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一個是三-烷基錫)與含131I，123I，76Br，75Br，18F或19F的鹵化試劑反應的步驟。
本發明的另一個目的是提供一種用于體內成像淀粉樣蛋白沉淀的藥物組合物，該組合物包含(a)可與淀粉樣蛋白結合的如上定義的式I化合物或其水溶性無毒鹽，其中其中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一個選自131I，123I，76Br，75Br，18F，19F和式I中特別說明的含碳取代基，其中的至少一個碳是11C或13C，和(b)可藥用載體。
本發明的另一個目的是提供一種在被測試者體內檢測淀粉樣蛋白沉淀的方法，該方法包括下述步驟(a)使用可檢測量的上述藥物組合物，和(b)檢測化合物與所述被測試者中淀粉樣蛋白沉淀的結合。本發明的另一個目的是提供一種在被測試者體內檢測淀粉樣蛋白沉淀的方法，其中的淀粉樣蛋白沉淀位于被測試者的大腦中。本發明的該方法可用于疑患有淀粉樣變性相關性疾病或綜合癥，它們選自阿爾茨海默氏癥、Down氏綜合癥和載脂蛋白E4等位基因同型接合者。
本發明的另一個目的涉及防止與淀粉樣變性相關性適應癥中的纖維形成有關的細胞變性和毒性的藥物組合物及方法，所述適應癥是例如AD和II型糖尿病。這類藥物組合物含有柯胺G的烷基、鏈烯基和炔基衍生物和可藥用載體。這類化合物是無毒的。
本發明的另一個目的涉及在活組織檢查和死后組織樣品分析中作為觀察和測定淀粉樣蛋白沉淀的著色劑的探針的用途。
本發明的另一個目的涉及在活組織檢查和死后組織樣品的分析中用于定量淀粉樣蛋白沉淀的放射性標記的探針的用途。
本發明的另一個目的涉及一種識別阿爾茨海默氏癥腦組織與正常腦組織的方法。
本發明的其它目的、特征和優勢將通過下列詳細說明體現。然而，應該清楚這些詳細說明和具體的實施例在表明本發明優選實施方案的同時，僅是以說明方式給出的，因為本領域普通技術人員顯然可根據這些詳細描述在本發明的精神和范圍內進行各種變化和修飾。
附圖概述附

圖1A說明了柯胺G和幾種已經合成和試驗了的柯胺G類似物或衍生物的化學結構，包括3-碘代衍生物(3-ICG)、3-碘代二甲氧基衍生物(3-ICG(OMe)2)、二甲酯衍生物(CG(COOMe)2)、苯酚衍生物、水楊酸(SA)、苯胺衍生物(1/2CG)、剛果紅、3，3’-二碘代衍生物(3，3’-I2CG)、3，3’-二溴代衍生物(3，3’-Br2CG)、3，3’-二氯代衍生物(3，3’-Cl2CG)、3-溴衍生物(3-BrCG)和5-氟水楊酸衍生物((5-FSA)CG)。附圖中的數量是指各化合物抑制[14C]柯胺G與合成肽、Aβ(10-43)結合的Ki(μM)。
附圖1B說明了幾種已經合成和試驗了的柯胺G類似物或衍生物的化學結構，包括柯胺G的3，3’-二羧酸衍生物(3，3’-(COOH)2CG)、2，2’-二磺酸衍生物(2，2’-(SO3)2CG)、3-溴，3-異丙基水楊酸衍生物(3-Br-(3-iPrSA)CG)、3-異丙基水楊酸衍生物((3-iPrSA)CG)、2，4-二苯酚衍生物(2，4-二苯酚)、間羥苯甲酸鹽衍生物((6-OHSA)CG)、3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺衍生物(3，3’，5，5’-(CH3)4)CG)、3，3’-二甲基衍生物(3，3’-(CH3)2CG)、2，2’-二甲基衍生物(2，2’-(CH3)2CG)、苯并異噁唑衍生物(CG苯并異噁唑)，和3-羧基炔衍生物(3-(COOH)-C3C)。附圖中的數量是指各化合物抑制[14C]柯胺G與合成肽、Aβ(10-43)結合的Ki(μM)。
附圖2A-2K說明了柯胺G的鏈烯基衍生物和柯胺G類似物、尤其是雜環類似物的鏈烯基三-烷基錫衍生物的化學結構。注意除三-烷基錫部分僅存在于聯苯基的一側外，這些結構表示分子的一半，該分子是圍繞結構中右上角所示的波折線鍵對稱。三-烷基錫衍生物是制備高特異性活性的鹵代放射性衍生物的穩定中間體和中間體前體。雜環類似物表示在相同結構位置上代替弱酸性結構部分作為柯胺G的酸度適當的羧基基團的替代物。這些三-烷基錫前體化合物雖以其質子化形式表示，但本領域專業技術人員將認識到它們的去質子化形式和互變異構體也包括于這些附圖中。
2A)柯胺G的鏈烯基衍生物；2B)柯胺G的鏈烯基三-烷基錫衍生物；2C)3-羥基-1，2-苯并異噁唑類似物的鏈烯基三-烷基錫衍生物；2D)鄰苯二甲酰亞胺或異吲哚-1，3(2H)-二酮類似物的鏈烯基三-烷基烯衍生物；2E)鄰苯二甲酰肼或2，3-苯并二嗪-1，4(2H，3H)-二酮類似物的鏈烯基三-烷基錫衍生物；
2F)2，3-苯并噁嗪-1，4(3H)-二酮類似物的鏈烯基三-烷基細衍生物；2G)(2H)1，3-苯并噁嗪-2，4(3H)-二酮類似物的鏈烯基三-烷基錫衍生物；2H)(3H)2-苯并吖嗪-1，3(2H)-二酮類似物的鏈烯基三-烷基錫衍生物；2I)1，8-萘二甲酰亞胺類似物的鏈烯基三-烷基錫衍生物。
2J)四唑類似物的鏈烯基三-烷基錫衍生物。
2K)噁二唑類似物的鏈烯基三-烷基錫衍生物。
附圖3通過數種柯胺G的結構類似物表示的[14C]柯胺G與Aβ(10-43)結合的移位曲線。采用的縮略語與附圖1中的相同。附圖3A)柯胺G(空心三角形)；(5-FSA)CG(實心菱形)；3，3’-(COOH)2CG(實心正方形)；2，2’-(SO3)2CG(實心圓圈)。附圖3B)柯胺G(空心三角形)；剛果紅(空心圓圈)；苯胺衍生物(空心倒置三角形)；苯酚衍生物(空心正方形)；水楊酸(X)。該曲線表示由于微團的形成在高濃度下的結合增加了。Bedaux，F.等，Pharm.Weekblad 98189(1963)。
附圖4A是柯胺G與Aβ(10-43)結合的Scatchard圖。該曲線表示適于一個具兩個獨立結合位點的模型的非線性最小二乘方。該直線表示單一成分。
附圖4B[14C]CG與典型對照品(菱形)和AD腦組織樣品(正方形)結合的Scatchard分析。虛線與AD線的斜率相同，以有助于與對照品斜率的比較。AD腦組織樣品的放大率為48 NP/x200，Kd為0.35μM，Bmax為790 fmol/μg蛋白。對照品的KD為0.48μM，Bmax為614 fmo1/μg蛋白。
附圖5是說明結合分析與肽濃度的線性關系圖。在典型分析中采用約0.9μg Aβ(10-43)。
附圖6A是說明柯胺G與Aβ(10-43)結合的時間過程圖。
附圖6B是說明結合速率常數(Ki)測定的圖。
附圖6C是柯胺G從Aβ(10-43)離解的時間過程圖。
附圖7是表示柯胺G與Aβ間相互作用的分子模型圖。
附圖8A是說明AD腦組織中被結合的[14C]柯胺G的量與神經斑(NP)的數量間的相互關系圖。
附圖8B是說明AD腦組織中被結合的[14C]柯胺G的量與神經纖維纏結(NFT)的數量間的相互關系圖。在附圖8A和8B中，X-軸表示在x200放大比率下每視野中上/中額(n＝10)或上顳皮層(n＝10)的染色切片平均NP或NFT數量。實心符號和加重線表示沒有淀粉樣蛋白沉淀血管病的腦組織，空心符號和虛線表示具有淀粉樣蛋白沉淀血管病的腦組織。Y-軸表示與用于染色的組織相鄰的腦組織樣品勻漿中的總的、絕對[14C]柯胺G結合(fmol/μg蛋白)。使用約75μg和150nM[14C]柯胺G。
附圖9A、9B和9C。附圖9A顯示了放大率高于20 NP/x200的柯胺G與AD腦組織樣品的各種腦組織區域的結合，稱為“高斑AD腦”。附圖9B顯示了放大率低于20 NP/x200的柯胺G與AD腦組織樣品的各種腦組織區域的結合，稱為“低斑AD腦”。數據點表示在指定腦組織區域中的[14C]柯胺G結合與在該同一大腦的小腦(CB)中[14C]柯胺G結合的比率。水平線表示平均值，誤差線表示對照品(圓圈)和AD腦組織(9A和9B中的菱形)的標準誤差。腦組織區域包括額極(FP)、尾頭(head of caudate，CAU)、上額和中額(SMF)、顳上(ST)、下頂骨(IP)和枕(OC)皮層。星號表示與對照比較的顯著差異(*p＜0.05；**p＜0.001)。附圖9C中表示了兩份Down氏綜合癥腦組織樣品。9C中的菱形表示一名23歲的Down氏綜合癥患者(但還沒有AD癥狀)的腦組織。9C中的三角形表示一名已發展為AD的51歲Down氏綜合癥患者的腦組織(絕大多數Down氏綜合癥患者在40多歲時就發展為AD)。
附圖10圖示說明經尾靜脈注射了[14C]柯胺G并在所示時間處死的小鼠中柯胺G的組織水平。空心符號和細線表示絕對放射性(以cpm/g組織(左軸)為單位)。實心符號和重劃線表示腦組織放射性與腎(最高)或血液(中等)放射性的比率。右軸標繪了該比率。
附圖11上圖(TOP)通過Stokes和Trickey的“臨床病理學雜志”(J.Clin.Pathol.)26241-242(1973)描述的方法，用1，4-二(2-(3-羧基-4-羥苯基)乙烯-1-基)-苯染色的AD腦組織顳下葉切片。可見大量神經斑、一神經纖維纏結和頻繁的神經纖維網線。腦血管淀粉樣蛋白也被濃重地染色(但未顯示)。使用熒光顯微鏡獲得顯微照片。下圖(BOTTOM)同樣用1，4-二(2-(3-羧基-4-羥苯基)乙烯-1-基)-苯染色的轉基因鼠的腦組織切片[Tg(HuAPP695.SWE)2576；Hsiao等，科學(Science)27499-102(1996)]顯示了濃重的染色斑。
附圖12的條棒圖顯示在有或沒有柯胺G的存在下，通過3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑鎓，MTT，還原測定的Aβ(25-35)的濃度增加對大鼠嗜鉻細胞瘤(PC-12)的細胞氧化還原活性的影響。縱軸標繪了MTT還原產物在560nm處的吸收。實心條棒顯示了單獨Aβ(25-35)的影響，在MTT還原中該影響作用是劑量依賴性減少的。實心條棒內的白色顯示了與對照品(無Aβ(25-35)，無柯胺G)的顯著性差異。空心條棒顯示了20μM柯胺G的保護作用。空心條棒內部的黑色顯示了在有或沒有柯胺G的存在下的MTT還原之間的顯著性差異。
附圖13的條棒圖顯示了通過3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物，MTT，還原測定的增加濃度的柯胺G對Aβ(25-35)誘導的大鼠嗜鉻細胞瘤(PC-12)的氧化還原活性的還原作用的保護性作用。縱軸標繪了MTT還原產物在560nm處的吸收。實心條棒顯示了沒有Aβ(25-35)存在下的柯胺G的作用。在對照品(無Aβ(25-35)，無柯胺G)和沒有Aβ(25-35)存在下的各濃度的柯胺G之間沒有顯著性差異。空心條棒顯示了在1μM Aβ(25-35)和增加濃度的柯胺G的存在下的MTT還原。實心條棒內部的白色顯示在各濃度柯胺G下，在有或沒有Aβ(25-35)存在下的MTT還原反應的顯著性差異。空心條棒內部的黑色顯示了Aβ(25-35)對照品(無柯胺G)與Aβ(25-35)加增加濃度的柯胺G之間的MTT還原的顯著性差異。
附圖14比較了柯胺G與失活苯酚衍生物對由Aβ(25-35)誘發的毒性的影響。除對照試驗外，各試驗中的Aβ(25-35)濃度均為1μM。柯胺G在0.1和1μM顯示了保護作用，苯酚衍生物未顯示出保護作用，它或許還促進了Aβ的毒性。
優選實施方案的詳細描述本發明探索了烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物和其放射性標記的衍生物具備穿過體內血腦屏障以及與斑塊中沉淀的Aβ、腦血管中淀粉樣蛋白中沉淀的Aβ和構成NFT中沉淀蛋白的淀粉樣蛋白結合的能力。柯胺G是一種剛果紅衍生物，其關鍵結構的差異是剛果紅中的磺酸結構部分在柯胺G(附圖1)中被羧基代替。該結構的變化使得柯胺G比剛果紅和大分子如抗體能更好地進入大腦中。Tubis等，美國化學會志(J.Am.Pharmaceut.Assn.)49422(1960)。另外，柯胺G是特異性較抗體更強的AD病理生理學標記物，抗體也可以標記不確定的病理學癥狀的非纖維性Aβ沉淀。
本發明的烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物具有下列特性(1)體外與合成Aβ特異性結合，(2)與腦組織切片中的β-片狀纖維沉淀結合，和(3)體內穿過不妥協(non-compromised)血腦屏障的能力。
本發明的方法可確認患者器官或機體內，優選大腦中的淀粉樣蛋白沉淀的存在和位置。本發明的方法包括將可測定量的含如上定義的式I化合物(稱為“可檢測化合物”)或其可藥用水溶性鹽的藥物組合物施用于患者。“可測定量”是指足以能夠檢測所述化合物與淀粉樣蛋白結合所施用的可檢測化合物的量。“成像有效量”是指足以使可檢測化合物與淀粉樣蛋白結合成像所施用的化合物的量。
本發明采用淀粉樣蛋白探針，該探針與非侵入性神經成像技術協同用于體外定量淀粉樣蛋白的沉淀，后者是例如磁共振光譜(MRS)或磁共振成像(MRI)，或者γ成像，如正電子成像術(PET)或單光子發射計算機成像術(SPECT)。術語“體內成像”是指可檢測本發明的上述標記的式I化合物的任何方法。對于γ成像，在同次體內成像過程中，測定由被檢測器官或區域放出的輻射并以總結合或其中一種組織中的總結合與(例如，除以)同一被檢測對象的另一種組織的總結合比率表示。體內總結合被定義為通過體內成像技術的整個信號，無需通過第二次注射相同量的標記的化合物與未標記的、但化學結構相同的化合物校準。“被檢測者”是哺乳動物，優選人類，最優選疑患癡呆的人。
對于體內成像，使用的檢測儀器類型是選擇確定標記的主要因素。例如放射性同位素和19F特別適于本發明方法中的體內成像。使用的儀器類型將指導放射性核素或穩定同位素的選擇。例如選擇的放射性核素須是采用選定類型的儀器可檢測衰退的一類。另一種考慮涉及放射性核素的半衰期。半衰期應足夠長，以使在被靶最大攝取所需的時間仍可被檢測到；但又應足夠短，以使被檢測者不會遭受有害的輻射。本發明的放射性標記化合物可使用γ成像檢測，該成像檢測可檢測到放射出的適當波長的γ輻射。γ成像方法包括，但不限于，SPECT和PET。對于SPECT測定，選擇的放射性標記優選不具有特定的發射，但在140-200 Kev范圍產生大量光子。對于PET測定，放射性標記將是發射正電子的放射性核素，例如19F湮沒形成兩種511Revγ射線，該射線可被PET照相機檢測。
本發明中，制備可與淀粉樣蛋白結合的化合物/探針，它們用于體內成像和定量淀粉樣蛋白沉淀。將這些化合物與非侵入性神經成像技術協同應用，后者是例如磁共振光譜(MRS)或磁共振成像(MRI)，正電子成像術(PET)或單光子發射計算機成像術(SPECT)。依據本發明，烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物可通過本領域已知的通用有機化學技術用19F或13C標記應用于MRS/MRI。參見，例如March，J.“高級有機化學反應，機理與結構”(第3版，1985)，其內容引入本文以供參考。烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物還可以通過本領域已知的技術用18F、11C、75Br或76Br放射標記應用于PET，Fowler，J.和Wolf，A.在“正電子成像術和放射自顯影法”(Positron EmissionTomography and Autoradiography)(Phelps，M.，Mazziota，J.，和Schelbert，H.編輯)391-450(Raven Press，NY 1986)對該方法進行了描述，該內容引入本文以供參考。烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物還可以通過本領域已知的幾種技術用123I放射標記應用于SPECT。參見，例如Kulkarni，Int.J.Rad.Appl.&Inst.(PartB)18647(1991)，其內容引入本文以供參考。此外，烷基、鏈烯基和炔基的柯胺G衍生物可用任何適宜的放射性碘同位素標記，例如，但不限于，131I、125I或123I，該標記可直接通過碘化重氮碘化重氮化的氨基衍生物(參見Greenbaum，F.Am.J.Pharm.10817(1936))，或者通過將不穩定的重氮化胺轉化為穩定的三氮烯，或通過將非放射性的鹵代前體轉化為穩定的三-烷基錫衍生物，然后采用數種本領域熟知的方法將其轉化為碘化合物。參見Satyamurthy和Barrio，有機化學雜志(J.Org.Chem.)484394(1983)，Goodman等，有機化學雜志(J.Org.Chem.)492322(1984)，和Mathis等，J.Labell.Comp.and Radiopharm.1994905；Chumpradit等，藥物化學雜志(J.Med.Chem.)34877(1991)；Zhuang等，J.Med.Chem.371406(1994)；Chumpradit等，藥物化學雜志(J.Med.Chem.)374245(1994)。例如將烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物的穩定三氮烯或三-烷基錫衍生物與含131I、125I、123I、76Br、75Br、18F或19F的鹵化試劑反應。柯胺G的穩定三氮烯和三-烷基烯衍生物和其類似物是新的前體，它們可用于合成許多本發明的放射性標記化合物。因此，這些三氮烯和三-烷基錫衍生物也構成本發明的一類實施方案。
烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物也可用已知的金屬放射性標記物標記，例如用锝-99m(99mTc)。引入與這類金屬離子結合的配體的取代基改性無需放射性領域的普通技術人員的過度試驗就可進行。然后使用這些金屬放射性標記的烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物檢測淀粉樣蛋白沉淀。
本發明的方法可以使用可通過核磁共振光譜檢測的同位素進行體內成像和光譜測定。特別適用于磁共振光譜的元素包括19F和13C。
適用于本發明目的的放射性同位素包括β-放射體、γ-放射體、正電子-放射體和X-射線放射體。這些放射性同位素包括131I、123I、18F、11C、75Br和76Br。依據本發明，適用于磁共振成像(MRI)或磁共振光譜(MRI)的穩定同位素包括19F和13C。適用于體外定量或組織檢查或死后組織分析的勻漿物中淀粉樣蛋白的放射性同位素包括125I、14C和3H。用于PET體內成像的優選放射性標記是18F，用于SPECT成像的放射性同位素優選123I，用于MRS/MRI的放射性同位素優選15F，用于體外研究的放射性同位素優選3H或14C。依據本發明，也可利用任何常規的可視診斷探針探測方法。
該方法可用于診斷輕度或臨床上難以確診的AD。采用這一技術可對淀粉樣蛋白沉淀的高危人群的淀粉樣蛋白沉淀進行縱向研究，所述高危人群是例如Down氏綜合癥、家族性AD和載脂蛋白E4等位基因同型接合者。Corder等，科學(Science)261921(1993)。如果沉淀發生在癡呆發生的很久以前或如果沉淀與癡呆無關，該方法可確定產生暫時性后果的淀粉樣蛋白沉淀。該方法可用于檢測預防淀粉樣蛋白沉淀的治療效果。
通常，可測定的標記的烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物的劑量可根據，例如患者年齡、健康狀況、性別和疾病的程度有所變化，相反，如果存在伴隨治療和其它變化，該劑量應由本領域的專業醫師加以調整。劑量可在0.001mg/kg～1000mg/kg、優選在0.1mg/kg～100mg/kg范圍內變化。
對被檢測者的施用可局部或系統性進行，通過靜脈內、動脈內、鞘內(通過脊髓液)等進行。施用也可在皮內或腔內進行，這取決于檢測部位。經過使化合物與淀粉樣蛋白產生結合的足夠時間，例如30分鐘～48小時，通過常規成像技術，例如MRS/MRI、SPECT、平面閃爍成像、PET以及浮出(emerging)成像技術檢測觀察下的被檢測區域。確切的方案需根據患者的具體情況加以調整，例如根據上述的檢測的身體部位、施用的方法和使用的標記類型；對于本領域技術人員而言，特定的方法的確定是常規性的。對于腦組織成像，優選測定結合的放射性標記的柯胺G或柯胺G衍生物或其類似物的量并與與患者小腦組織結合的標記的柯胺G或柯胺G衍生物的量比較(以比率形式)。然后將該比率與年齡相當的正常腦組織進行比較。
本發明的藥物組合物以注射組合物的形式施用是有益的。適于此目的的典型組合物包含可藥用載體。例如組合物在每毫升含氯化鈉的磷酸鹽緩沖液中可含有約10mg人血清白蛋白和約0.5～500微克標記的烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物。其它的可藥用載體包括水溶液、無毒賦形劑，包括鹽、防腐劑和緩沖劑等，例如在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES，15th Ed.EastonMack Publishing Co.pp.1405-1412和1461-1487(1975)和THE NATIONAL FORMULARYXIV.，第14版，華盛頓，美國藥物協會(14th Ed.WashingtonAmerican Pharmaceutical Association)(1975)中所述，這些內容均引入本文以供參考。
非水性溶劑的實例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有機酯溶劑，例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、鹽水溶液、非胃腸載體，例如氯化鈉、林格氏葡萄糖溶液等。靜脈內載體包括流體和營養補充劑。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧劑、螯合劑和惰性氣體。根據本領域普通技術人員的常識調整藥物組合物的pH和各成分的濃度。參見，Goodman和Gilman的《治療的藥理學基礎》(THEPHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS)(第7版)。
本發明的特別優選的藥物組合物是除特異性地與體內淀粉樣蛋白結合外，還能夠穿過血腦屏障并且在適宜劑量水平是無毒的和具有滿意作用時間的那些組合物。
分子模型在Evans Sutherland PS-330計算機繪圖系統上，運行計算機模型制作程序Macromodel(哥倫比亞大學C.Still 2.5版)制作分子模型，產生具反平行β-片狀構型的Aβ肽鏈。Kirschner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83503(1986)。使用無需進一步進行結構修飾的淀粉樣肽。排列Aβ肽以使交互鏈間距為4.76埃，即β-片狀纖維的特征。Kirschner，出處同上。柯胺G能量被降至最低，以纖維模型排列以達到與Aβ(10-43)的賴氨酸-16與疏水苯丙氨酸-19和-20區的最大接觸。
與Aβ合成肽的特異性結合的特點親和性、動力學、最大結合首先用稱為Aβ(10-43)的合成Aβ肽分析柯胺G和柯胺G衍生物結合的特點。選擇10-43肽的原因是據顯示該肽提供包含Aβ肽的所有特征結構的模型體系。Hilbich等，J.Mol.Biol.218149(1991)。Aβ的10-43氨基酸片段采用匹茲堡大學的肽合成設備用9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC)化學合成。用質譜分析該肽，其主要成分的Ma為3600g/mole(計算值3598)。該肽采用Hilbich等的方法進一步純化，概括地說，包括在Biogel P10柱(2×180cm，200-400目，Biorad，Richmond，CA)上用70％甲酸進行連續分子大小排除色譜，然后通過Biogel P4柱(2×100cm，200-400目)用1M乙酸進行第二次洗脫。Hilbich等，J.Mol.Biol.218149(1991)。將該肽凍干并貯存于-80℃至用于結合分析時。
Aβ(10-43)的氨基酸序列如下
合成Aβ(10-43)的結合分析在12×75mm的硼硅酸鹽玻璃管中進行結合分析。在10％乙醇/水中加入各種濃度的非放射性柯胺G衍生物。乙醇是防止微團形成所必需的，該微團是與重氮染料衍生物形成的，在沒有肽的存在下，濾器可捕獲微團。往上述溶液中，加入25μl 0.36 mg/ml Aβ(10-43)的水懸浮液并加入10％乙醇，使體積達950μl。在室溫培養10分鐘后，加入50μl[14C]柯胺G的40％乙醇溶液，根據使用的[14C]柯胺G制品，得到[14C]柯胺G終濃度為100-125nM的溶液。將結合混合物在室溫培養30分鐘。通過真空濾過Whatman GF/B濾器，用BrandelM-24R細胞捕獲器(Gaithersburg，MD)分離結合的和游離的放射性，然后在室溫用3毫升10％乙醇洗滌兩次。濾器用7.0ml塑料閃爍瓶中的4 ml Cytoscint-ES(ICN Biomedicals，Inc.，Irvine，CA)平衡過夜后，計數。在該次和所有各次結合分析中，培養至少重復進行三次，結果以平均值±標準偏差表示。
動力學研究在13×100mm硼硅酸鹽玻璃管中通過上述過濾分析樣品進行柯胺G與Aβ(10-43)結合的動力學研究。為測定結合的動力學，將25μl0.36 mg/ml Aβ(10-43)放入475μl 10％乙醇中并在零時間向該溶液中加入4.5ml 125nM[14C]柯胺G。使該混合物快速渦旋并在5、10、20、30、45、60、75、135、240和300秒的時間通過真空濾過WhatmanGF/B濾器，用Brandel M-24R細胞捕獲器(Gaithersburg，MD)使結合反應停止，然后在室溫用3毫升10％乙醇洗滌兩次；如上測定結合的放射性。
為測定結合動力學，將25μl 0.36mg/ml Aβ(10-43)放入450μl10％乙醇中，然后加入25μl 2.5μM[14C]柯胺G的40％乙醇溶液。使該混合物快速渦旋并在室溫培養30分鐘。該混合物在零時間用4.5ml 10μM非放射性柯胺G的10％乙醇溶液稀釋，使該混合物快速渦旋，如上在0.5、1.5、3、5和15分鐘的時間使解離停止，如上測定結合的放射性。
與阿爾茨海默氏癥腦組織的特異性結合特點柯胺G與AD和對照腦組織勻漿物的結合由匹茲堡大學的阿爾茨海默氏癥研究中心的神經病理學中心獲得活檢腦組織樣品。對照品定義為按照出版的NIA會議報道設立的標準未達到AD神經病理學標準(足夠的NP或NFT數量)的樣品。Khachaturian，Arch.Neurol.421097(1985)。對由8名對照者(年齡58-75歲)、11名AD(年齡61-84歲)和兩名Down氏綜合癥患者(年齡23和51歲)獲取的腦組織樣品進行研究。有六名高密斑(放大率＞NP/x200)和五名低密斑(放大率＜20 NP/x200)AD腦。有兩名臨床有癡呆表現、但沒有NP或NFT的對照者接受了“缺乏組織學特征的癡呆患者”診斷。Knopman Dementia 4132(1993)。另一名對照者患癡呆和橄欖體小腦腦橋萎縮。其它的對照者沒有神經性疾病的臨床或組織學證據。將活檢樣品立即在-70℃冷凍并貯存在該溫度下直至勻化。計數所研究的各腦組織的上中額腦回和顳上同形皮質連接處的皮層2和4之間的五個獨立但相鄰的區域(放大率x200)NP和NFT數量。定量評價上/中額皮層中淀粉樣蛋白血管病的存在。采用Bielschowsky銀浸滲方法識別NP和NFT，用剛果紅染色識別腦淀粉樣蛋白血管病。該方法的細節先前已有報道。Moossy等，Arch.Neurol.45251(1988)。在解剖學上，用于CG與上/中額或顳上皮層結合的樣品與用于NP和NFT計數的樣品相鄰。
將上額和中額皮層連接處、顳上皮層、額極、尾頭(head ofcaudate)、頂下皮層、枕皮層或小腦的組織約100mg分別用Polytron組織勻漿器(PT 10/35，Brinkman Instruments Inc.，Westbury，NY)在6檔在10％乙醇中以10-20mg腦組織/毫升的濃度勻漿30秒。從每個腦組織并不能獲得所有個區域。在12×75mm硼硅酸鹽玻璃試管中，在室溫下將25-150μl每份的組織樣品(通過Lowry等，生物化學雜志(J.Biol，Chem.)193265(1951)的方法測得蛋白質為約25-300μg)與10-750nM[14C]CG(26.8 Ci/mole)在終體積為1.0ml的10％乙醇中在室溫培養30分鐘。對于小腦比率研究，采用約150μg蛋白和75nM[14C]CG的標準條件，對于涉及NP、NFT和淀粉樣蛋白血管病的研究，采用約75μg蛋白和150nM[14C]CG的標準條件。乙醇是阻止微團形成所必需的，微團是與重氮染料衍生物形成而發生的，因為在沒有組織存在的情況下，通過濾器可捕獲微團。通過使用Brandel M-24R細胞捕獲器(Gasithersburg，MD)真空濾過Whatman GF/B濾器分離結合了的和游離的放射性，然后在室溫用10％乙醇洗滌兩次。濾器在4ml Cytoscint-ES閃爍劑(ICN Biomedicals，Inc.，Irvine，CA)在7.0ml塑料閃爍瓶中平衡后，計數。可飽和的(特異性)結合定義為總結合減去在20μM未標記的CG存在下的剩余的(非可飽和的)結合。在所有結合測定中，培養進行至少三次，結果用平均值±標準誤差(除非有其它具體說明)表示。結果以確定的腦組織區域的fmol[14C]/μg蛋白的絕對值表示，或以該腦組織區域的fmol/μg蛋白與該腦中小腦的fmol/μg蛋白的比率表示。
辛醇/水的分配在5.0ml 1-辛醇中制備柯胺G或其類似物的約75μM溶液。加入5ml磷酸鹽緩沖鹽水(0.15M NaCl，5mM磷酸鉀，pH7.4)，通過快速渦旋使兩層混合。然后將該化合物在1000g離心，以便于兩個澄明相的形成。用分液漏斗分離兩層，將每層600μl的溶液用400μl乙醇稀釋并在389nm測定柯胺G的吸收或各類似物的λmax。在兩種溶劑中校準摩爾吸收差后，測定濃度，分配系數用辛醇層中濃度除以水層中的濃度表示。實驗重復進行三次。
阿爾茨海默氏癥腦組織中柯胺G與淀粉樣蛋白沉淀結合成像為肉眼觀察證實CG衍生物與組織的結合，將具有嚴重腦血管淀粉樣蛋白沉淀的AD腦組織的8微米石蠟切片采用改進的斯托克斯氏方法用1，4-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-苯染色，以及采用Trickey，臨床病理學雜志(J.Clin.Pathol.)26241-242(1973)中記載的方法用1mM 1，4-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-苯代替剛果紅染色，該方法其它條件相同。將染了色的切片用螢光顯微鏡檢查。
測定化合物穿過血腦屏障的能力小鼠研究 在雌性Swiss-Webster小鼠的尾靜脈注射0.03μCi/g[14C]柯胺G的0.9％氯化鈉溶液。在注射15分鐘、35分鐘、1小時、4小時和24小時后斷頸處死小鼠。快速獲取頸動脈血、腦、肝和腎組織，稱重并在蒸餾/去離子水中用磨沙玻璃勻漿器勻化。稱取等份重量的樣品加到18.0ml塑料閃爍瓶(Beckman Poly-Q-Vial)中并加入10.0ml閃爍合劑(Cytoscint-ES(ICN))并平衡過夜后計數。組織中[14C]柯胺G的含量以cpm/mg組織表示。
由組織提取放射性的實驗如上所述進行，不同的是注射0.05μCi/g[14C]柯胺G并在60分鐘時處死小鼠。然后取出腦和肝組織，采用Folch方法提取。Folch等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)226447(1957)。在兩種組織中，有機層中含有的提取的放射性活性超過95％。將有機層蒸發至干，再懸浮于少量10％甲醇/90％ACN中，加注到硅膠柱(Prep Nova Pak HR Silica，7.8×300mm，Waters，Milford，MA)上，用相同的溶劑等度洗脫。在這些條件下，溶劑前期的餾分洗脫了99％的放射性，但大多數脂質被保留的時間更長，使溶劑前期洗脫的餾分適于加注到上述的反相C4柱上。將全部的溶劑前餾分收集、干燥并再懸浮于10％ACN/90％磷酸鈉緩沖液(5mM，pH6)，然后與真實的非放射性柯胺G一起加注到C4柱上。收集每分鐘的餾分，加入10ml Cytoscint-ES后，計數。
在另一個實施方案中，本發明涉及一種藥物組合物和防止與在某些“淀粉樣變性相關性”適應癥中的纖維形成相關的細胞變性和毒性的方法，所述適應癥是例如阿爾茨海默氏癥、Down氏綜合癥和II型糖尿病，遺傳性腦出血性淀粉樣變性(荷蘭人)、淀粉樣蛋白A(反應性)、繼發性淀粉樣變性、家族性地中海熱、伴隨蕁麻疹和聾啞的家族性腎病(Muckle-wells綜合癥)、淀粉樣蛋白λL-鏈或淀粉樣蛋白κL-鏈(自發的、骨髓瘤或巨球蛋白血癥相關的)Aβ 2M(長期血液透析)、ATTR(家族性淀粉樣蛋白多神經病)(葡萄牙人、日本人、瑞典人)、家族性淀粉樣蛋白心肌病(丹麥人)、單獨的心臟淀粉樣蛋白(系統性老年淀粉樣變性)、AIAPP或淀粉不溶素胰島瘤、心鈉素(單獨的心房淀粉樣蛋白)、procalcitonin(甲狀腺髓瘤)，凝溶膠蛋白(家族性淀粉樣變性(芬蘭人))、cystatin C(伴隨淀粉樣變性的遺傳性腦缺血(冰島人))、AApo-A-I(家族性淀粉樣變性多神經病(衣阿華州))、AApo-A-II(小鼠的加速敏感)、纖維蛋白原相關性淀粉樣蛋白；和Asor或PrP-27(瘙癢病，Creutzfeld Jacob病，Gertsmann-Straussler-Scheinker綜合癥，牛海綿狀腦炎)或載脂蛋白E4等位基因同型接合者。該方法包括向疑患或易發展為這類淀粉樣變性相關性適應癥的對象施用含柯胺G或一種其上述的衍生物的藥物組合物。
由于某些重氮化合物致癌，本發明的治療化合物僅包括無毒的、非致癌性化合物。即，本發明通過使用不含可被代謝為致癌聯苯胺化合物的基團的烷基、鏈烯基和炔基化合物解決了潛在致癌性的問題。
任何涉及低生物利用度的潛在問題也通過使用偶氮化合物的烷基、鏈烯基和炔基衍生物而得以避免。這些化合物不是細菌或哺乳動物偶氮還原酶的底物。
確實，本發明的化合物由于存在含1，4-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-苯鍵的化合物而具有有益的治療用途，該化合物不是腸細菌偶氮還原酶的底物。
體外研究表明Aβ神經毒性需要纖維形成，并被剛果紅抑制。具體地研究還表明結合淀粉樣纖維的染料剛果紅通過抑制纖維形成或結合形成的纖維抑制纖維狀Aβ的神經毒性。Lorenzo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112243-12247(1994)。還表明剛果紅抑制糖尿病相關性淀粉不溶素(另一種類型的淀粉樣纖維)的胰腺胰島細胞毒性。Lorenzo等，出處同上。還參見Burgevin等，NeuroReport 52429(1994)；Pollack等，J.Neurosci.Letters 184113-116(1995)；Pollack等，Neuroscience.Letters 197211(1995)。這些數據表明可結合淀粉樣蛋白的化合物，例如柯胺G的烷基、鏈烯基和炔基衍生物，它們與剛果紅類似，但又與剛果紅不同，它們可進入血腦屏障，可有效地防止與淀粉樣變性相關性適應癥中的纖維形成有關的細胞變性和毒性。
實施例8及附圖12和13表明柯胺G的作用非常相似于那些先前報道的剛果紅，它們具有劑量依賴性，對嗜鉻細胞瘤有預防作用。因此，這些體外分析提供了選擇用于防止與纖維形成有關的細胞變性和毒性的藥物組合物的化合物。
本發明試驗了化合物，例如柯胺G和其上述的衍生物體內防止淀粉樣纖維形成或相關性細胞變性的效能，所述試驗是通過測定動物模型的營養障礙性軸突的形成、突觸減少、神經原纖維纏結形成和神經膠質增生進行的，所述動物模型是例如腦淀粉樣變性的“老年性動物模型”，Wisniewski等，J.Neuropathol.&Exp.Neurol.32566(1973)；家族性地中海熱的小鼠模型(Neurochem.，Inc.Kingston，Ontario，加拿大)和阿爾茨海默氏癥類型神經病的轉基因鼠模型，Games等，Nature 373523-527(1995)；Hsiao等，Science 27499-102(1996)。在家族性地中海熱模型中，動物發展為系統性淀粉樣變性。在本發明的體內分析中，比較使用了和未使用本發明的化合物處理的動物的系列尸體剖檢。在腦淀粉樣蛋白形成的動物模型中，除了下述系列的淀粉樣蛋白形成，還通過營養障礙軸突的形成、突觸的減少、神經原纖維纏結形成和神經膠質增生在使用了和未使用本發明的化合物處理的動物的系列尸體剖檢中測定了與淀粉樣蛋白有關的神經變性。
依據本發明，將含有柯胺G或其衍生物的藥物組合物施用于預期存在淀粉樣蛋白或淀粉樣纖維形成、細胞變性和毒性的對象。在優選的實施方案中，這類對象是人類，包括例如那些易發展腦淀粉樣蛋白的危險人群，包括老年非癡呆人群及淀粉樣變性相關性疾病和II型糖尿病患者。術語“防止”包括改善與纖維形成相關的細胞變性和毒性。“改善”是指防止已具毒性表征，例如癡呆患者的細胞變性和毒性發展為更嚴重的形式。
用于防止與淀粉樣變性相關性疾病中的纖維形成有關的細胞變性和毒性的藥物組合物含有柯胺G或其上述的衍生物和可藥用載體。在一種實施方案中，這類藥物組合物含有血清白蛋白、柯胺G或柯胺G衍生物和含氯化鈉的磷酸鹽緩沖劑。其它的可藥用載體包括水溶液，無毒的賦形劑，包括鹽、防腐劑和緩沖劑等，它們是例如在“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES”(第15版，EastonMackPublishing Co.，pp.1405-1412和1461-1487(1975))、“THENATIONAL FORMULATION XIV.”(第14版，WashingtonAmericanPharmaceutical Association (1975))和“UNITED STATESPHARMACOPEIA XVIII”(第18版，WashingtonAmericanPharmaceutical Association(1995))中所述的賦形劑，這些內容均引入本文以供參考。
非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有機酯，例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液，鹽水溶液、非胃腸載體，例如氯化鈉、林格氏葡萄糖溶液等。靜脈載體包括流體和營養補充劑。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧劑、螯合劑和惰性氣體。根據本領域普通技術人員掌握的技術調整藥物組合物的pH和各種成分的確切濃度。參見，Goodman和Gilman的“THE PHARMACOLOGICALBASIS FOR THERAPEUTICS”(第7版)。
依據本發明，這類藥物組合物可以液體或固體形式口服或以懸浮液或溶液形式靜脈或肌內注射給藥。術語“藥學有效量”是指可防止與纖維形成有關的細胞變性和毒性的量。該量可根據患者的年齡、體重和健康狀況發生所需的變化，可由本領域普通技術人員按照熟知的方案加以調整。在一種實施方案中，每日劑量在0.1～100mg/公斤，或者可劃分為較小劑量每日分2～4次給藥。這樣的方案可每日終生給藥。或者，藥物組合物可以0.1～100mg/kg的劑量肌內給藥，每周一至六次。
在另一種實施方案中，本發明涉及一種在活組織檢查或死后組織分析中檢測淀粉樣蛋白沉淀的方法。該方法包括將福爾馬林固定的組織與上述式I化合物的溶液一起培養。該溶液優選是用式I化合物飽和的25～100％乙醇溶液(剩余為水)。培養完后，將化合物染色或標記組織中的淀粉樣蛋白沉淀，然后可通過標準方法檢測或肉眼觀察染色了的或標記了的沉淀。這類檢測手段包括顯微技術，例如亮視野顯微鏡檢查、熒光顯微法、激光同焦點和交叉極化顯微法。
在另一種實施方案中，本發明涉及一種在活組織檢查和死后組織分析中定量淀粉樣蛋白的方法。該方法包括將標記的柯胺G的烷基、鏈烯基和炔基衍生物，優選式I化合物或其水溶性無毒鹽與活組織檢查或死后組織的勻漿一起培養。獲取組織并用本領域熟知的方法勻化。優選的標記是放射性標記，當然也可以使用其它本領域技術人員熟知的標記物，例如酶、化學發光劑和免疫熒光化合物。優選的放射性標記是125I、14C或3H，式I的優選標記取代基是R1～R7、R10～R27中的至少一個。含淀粉樣蛋白沉淀的組織將與標記的柯胺G的烷基、鏈烯基或炔基衍生物結合。然后采用本領域技術人員已知的各種機理，例如過濾將結合了的組織與未結合的組織分離。然后通過本領域普通技術人員已知的任何方法定量結合的組織。參見實施例3。然后通過與用已知量的淀粉樣蛋白和放射性標記的柯胺G衍生物產生的標準曲線進行比較，將組織結合的放射性標記的柯胺G衍生物的單位轉化為每100mg組織中的淀粉樣蛋白的毫克單位。
在另一個實施方案中，本發明涉及區別阿爾茨海默氏癥腦組織與正常腦組織的方法，包括從正常者和疑患阿爾茨海默氏癥者的腦組織中獲取(i)小腦組織和(ii)同一腦的除小腦外的另一區域的組織。參見實施例3。采用本領域技術人員熟知的方法勻化分離的組織，然后將其與放射性標記的烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物一起培養。計算各類型組織(例如小腦、非小腦、正常和異常腦組織)與放射性標記的烷基、鏈烯基和炔基柯胺G衍生物結合的組織的量，計算從正常者腦組織與疑患阿爾茨海默氏癥者腦組織獲取的非小腦與小腦組織的結合比率。比較這些比率。如果疑患阿爾茨海默氏癥患者腦組織的比率超過正常腦組織的90％，確診為阿爾茨海默氏癥。
實施例1、柯胺G和其衍生物的合成柯胺G的合成合成柯胺G(即，4，4’-二(3-羧基-4-羥基苯基偶氮)-聯苯)需要下列反應步驟。這些反應步驟被稱為“柯胺G合成”的通用方法。將聯苯胺·2HCl(28.9mg，0.11mmol，Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)加到50毫升園底燒瓶中的1.5ml 1∶1 DMSO∶蒸餾/去離子水中。除非另有說明，各反應步驟均在0℃下進行，加入29μl濃鹽酸，攪拌后得到一澄明溶液。往該聯苯胺溶液中，滴加15.5mg(0.22mmol)NaNO2在300μl 1∶1 DMSO/H2O中的溶液，所得溶液pH約為2-3。將該反應混合物攪拌45分鐘，然后往該四氮化聯苯胺混合物中在10分鐘期間滴加24.8mg(0.18mmol)溶于2.0ml含250mg/ml Na2CO3的100％DMSO懸浮液中的水楊酸甲酯(Aldrich)，期間保持pH約為10.5。將所得混合物在0℃攪拌1小時，然后室溫攪拌過夜。
之后，調整pH至約7后，該混合物用每次50ml氯仿萃取三次。合并的氯仿萃取液用每次50ml水洗滌三次，然后使其干燥，得柯胺G二甲酯(即，4，4’-二(3-羧基-4-羥基苯基偶氮)-聯苯)，該產物進一步用氯/己烷重結晶純化。該酯然后用約100ml含四當量氫氧化鈉的1∶1乙醇∶水解離水解并回流3小時。蒸發乙醇后，凍干水分，得到柯胺G的四鈉鹽。通過將四鈉鹽溶于水中，用氯洗滌一次除去未水解的二甲酯，將pH調至約2并用每次50ml乙酸乙酯萃取三次，形成柯胺G的游離酸。將合并的乙酸乙酯萃取液用每次50ml的水洗滌三次并使其干燥。
在這些條件下，通過反相HPLC，用C4柱(Vydac 214-TP510)和磷酸鈉緩沖液(5mM，pH6)∶乙腈(ACN)90∶10溶劑系統等度洗脫10分鐘，然后將乙腈的含量增至50％洗脫20分鐘(流速3.5ml/分)分析表明所得產物不殘留水楊酸甲酯、水楊酸或聯苯胺，僅有微量單取代的產物，4-羥基-4’-(3-羧基-4-羥基苯基偶氮)-聯苯。用雙波長、二極管陣列檢測儀(Perkin Elmer 235C)在290和365nm檢測柱洗脫液。在這些條件下，柯胺G在17.6分鐘洗脫。
通過質子NMR在500MHz于DMSO-d6中用TMS作為內標證實柯胺G和其衍生物的結構。用SA表示水楊酸結構部分的特定環位置上的質子，BZ表示聯苯胺結構部分的質子，柯胺G四鈉鹽的峰分布如下百萬分之6.75(ppm)，SA-3，雙峰J＝8.73Hz；7.82ppm，SA-4，雙雙峰J＝8.73和2.72Hz；7.91ppm，BZ-2/6，雙峰J＝8.44；7.95ppm，BZ-3/5，雙峰J＝8.44Hz；和8.28ppm，SA-6，雙峰J＝2.72Hz。在40％乙醇中的UV/可見光譜顯示λ最大在398nm。通過NMR與內標比較峰面積，計算柯胺G的濃度測定柯胺G的摩爾吸收，然后立即測定在40％乙醇中稀釋的NMR等份樣品進行UV/可見光譜。在40％乙醇中于398 nm的摩爾吸收為5.5×104AU/(cm·M)。
通過改進的上述方法合成[14C]柯胺G。除在100％水中使用四氮化聯苯胺外，其余如上所述。將50μl 2.5M碳酸鈉水溶液加到0.5ml圓錐形小瓶中的50μCi結晶水楊酸-羧基-14C(Sigma)中。將60μl四氮化聯苯胺的混合物加到該圓錐形小瓶中，在0℃渦旋并保持1小時。為避免單取代的聯苯胺副產物的形成，將12.5μl 250mM非放射性水楊酸(Sigma)在2.5M碳酸鈉中的溶液加到該反應混合物中并在0℃保持1小時。使小瓶在室溫保持過夜。將全部混合物溶于少量35％ACN后，注入上述的C4柱中。收集對應于柯胺G標準品的峰洗脫液并凍干。通過測定398nm處的吸收，然后計數相同等份樣品的放射性，計算的特定活性為26.8 Ci/mol。將該[14C]柯胺G貯存于40％乙醇中。當將純化了的[14C]柯胺G再注入C4柱時，用21％ACN以3.5ml/分流速等梯度洗脫，在10.4分鐘時與真實柯胺G共同洗脫的放射性＞98％。除下述例外，許多柯胺G衍生物都可采用“柯胺G合成”通用方法合成。衍生物的結構可由NMR鑒別。附圖1顯示了柯胺G和其數種衍生物的結構。
同樣，可采用改進的上述方法合成[3H]柯胺G。用美國放射性標記化學公司(American Radiolabelled Chemical，Inc.(St.Louis))制備的商品3，3’-[3H]聯苯胺將含8.26Ci無載氣氚氣的0.7mg 3，3’-二碘代聯苯胺、1mg鈀/碳催化劑、200μl N，N-二異丙基乙基胺和500μlTHF的混合物在室溫處理3小時。未提供確切收率和特定活性。3，3’-[3H]聯苯胺與真實聯苯胺一起洗脫并顯示沒有單碘取代的雜質。由于市售提供的原料含某些殘留的N，N-二異丙基乙基胺，它會干擾重氮化，3，3’-[3H]聯苯胺通過從Vydac C4柱上用100％水(pH＝6.0)～100％0.01N HCl(pH＝2.2)的10分鐘線性梯度洗脫(4.0ml/分)純化。采用該方法，在約9.5分鐘時洗脫3，3’-[3H]聯苯胺，其不含N，N-二異丙基乙基胺，可采用不會影響重氮化反應的溶劑。在數百微升體積中用100倍過量亞硝酸鈉重氮化，然后與百倍過量的水楊酸碳酸鈉溶液偶聯，得到柯胺G的含氚衍生物(4，4’-二(3-羧基-4-羥基苯基偶氮)-3，3’-[3H]聯苯)，如上通過HPLC純化，得出其特異性活性為～35 Ci/mmol。
柯胺G的鏈烯基(CH＝CH)衍生物的合成通過氫化鋁鋰還原，將4，4’-聯苯二羧酸(Aldrich)轉化為4，4’-二(羥甲基)聯苯，該產物隨后通過與碘化鈉和三氟化硼乙醚化物在ACN中反應轉化為4，4’-二(碘甲基)聯苯。該碘代化合物與過量亞磷酸三乙酯在90℃加熱1小時，得到4，4’-聯苯基二甲基膦酸四乙酯。類似地處理1，4-萘-二羧酸(Aldrich)或9，10-蒽-二羧酸(Aldrich)，得到相應的膦酸四乙酯。用己烷重結晶后，將磷酸酯溶于DMF，用10倍量的甲醇鈉處理，然后用2當量的5-甲酰基水楊酸的DMF溶液處理。在室溫攪拌24小時后，將反應混合物傾入水中。用鹽酸將水酸化至pH5.0，沉淀出熒光產物，4，4’-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-聯苯，該產物可被選擇性地萃取到乙酸乙酯中，從而與任何單取代的副產物分離。類似地用5-甲酰基水楊酸處理對亞二甲苯基二膦酸四乙酯(TCI America)或其衍生物，得到1，4-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-苯。同樣，通過用5-甲酰基水楊酸處理相應的磷酸酯可得到1，4-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-萘或9，10-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-蒽。其它衍生物可通過使用其它的甲酰基水楊酸類似物、甲酰基苯甲酸或者羥基-或甲氧基苯甲醛獲得。
當所需的骨架連接物不是上述列出的那些時，可將適宜的二羧酸(例如，2-溴對苯二甲酸(Aldrich))還原為二醇，轉化為碘化物，然后轉化為上述二膦酸四乙酯。當所需的側鏈基團不是水楊酸時，可首先使適宜的酚(該酚通常也包含一酸性功能基)在酚基的鄰位或對位碘代(取決于存在的其它取代基)，然后采用標準方法在碘代的位置甲酰化。
柯胺G的丁二烯基(CH＝CH-CH＝CH)衍生物的合成將對亞二甲苯基二膦酸四乙酯(TCI America，Portland，OR)溶于無水DMSO中，用10倍過量的叔丁醇鉀(Aldrich)處理，再在無水DMSO中用2當量3-甲氧基羰基-4-甲氧基肉桂醛(由5-碘-2-甲氧基苯甲酸甲酯和丙烯醛用標準方法)處理。在室溫攪拌24小時后，將反應混合物傾入水中。水用鹽酸酸化到pH5.0后，沉淀出熒光產物，1，4-二(4-(3-羧基-4-甲氧基苯基)-1，3-丁二烯-1-基)-苯，該產物可被選擇性地萃取到乙酸乙酯中與任何單取代的副產物分離。用過量硫代乙醇鈉在DMF中回流開裂甲氧基，得到水楊酸衍生物。如上所述，類似地處理其它骨架連接的磷酸酯和適宜肉桂醛衍生物的混合物，得到所需產物。
柯胺G的烷基取代的鏈烯基(CR’＝CR’)衍生物的合成首先用氫化鋁鋰還原，將4，4’-聯苯二羧酸(Aldrich)或1，4-苯二羧酸(Aldrich)轉化為二(羥甲基)化合物，隨后用BaMnO4在乙酸乙酯中處理，轉化為二甲醛。該二甲醛與R’MgX(其中R’是低級烷基，X是Br或I)通過格利雅反應產生HOCR’H-Ph-Ph-CR’H-OH或HOCR’H-Ph-CR’H-OH。將烷基取代的二(羥甲基)化合物通過與碘化鈉和三氟化硼的乙醚化物在ACN中轉化為烷基取代的二(碘甲基)化合物。該碘代化合物與過量亞磷酸三乙酯在90℃加熱約1小時，得到烷基取代的二甲基膦酸四乙酯。類似地處理1，4-萘-二羧酸(Aldrich)或9，10-蒽二羧酸(Aldrich)可得到相應的烷基取代的二甲基膦酸四乙酯。
然后，可合成三種烷基取代的化合物，即AR-CR’＝CR’-Q，AR-CR’＝CH-Q或AR-CH＝CR’-Q(其中R’是低級烷基，Q如式I中所定義)。AR-CR’＝CR’-Q化合物的制備可通過烷基取代的二甲基膦酸四乙酯與適宜的芳基酮，如5-乙酰基水楊酸的反應進行(Crescent ChemicalCo.，Inc.，Hauppage NY)。AR-CR’＝CH-Q的制備可通過烷基取代的二甲基膦酸四乙酯與適宜的醛，如5-甲酰基水楊酸(aldrich)的反應進行。AR-CH＝CR’-Q化合物的制備可通過二甲基膦酸四乙酯與適宜的芳基酮，如5-乙酰基水楊酸的反應進行(Crescent Chemical Co.，Inc.，Hauppage NY)。反應條件與上述制備鏈烯基(CH＝CH)衍生物的條件相同。
柯胺G的炔基(C≡C)衍生物的合成通過與甲醇、原甲酸三甲酯和硫酸反應，將5-碘代水楊酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)轉化為甲酯。然后在鈀的存在下，將獲得的5-碘代水楊酸甲酯與(三甲硅烷基)乙炔(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)反應。除去三甲硅烷基，如上在鈀的存在下，將2當量的所得5-乙炔基水楊酸甲酯與4，4’-二溴代聯苯(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)反應。通過上述的酯水解制備柯胺G的炔基類似物，4，4’-二(2-(3-甲氧基羰基-4-羥基苯基)乙炔-1-基)-聯苯。
柯胺G的炔基(C≡C)和乙烯基(CH＝CH)衍生物合成的另一種方法如上所述，在碳酸鉀的存在下，通過與碘甲烷反應將5-溴水楊酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)轉化為甲酯/甲基醚。在鈀的存在下，將如此獲得的2-甲氧基-5-溴代苯甲酸甲酯與(三甲硅烷基)乙炔(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)反應。除去三甲硅烷基，如上在鈀的存在下，將2當量的所得2-甲氧基-5-乙炔基水楊酸甲酯與4，4’-二溴代聯苯(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)反應。通過上述的酯水解制備柯胺G的炔基類似物，4，4’-二(2-(3-羧基-4-甲氧基苯基)乙炔-1-基)-聯苯。通過常規方法將該炔基類似物還原形成柯胺G的乙烯基類似物。
另一種合成鏈烯基衍生物的方法可采用Suzuki或Steel反應，它們將2-甲氧基-5-乙炔基苯甲酸的硼或錫衍生物(或其它上述的羥基-酸衍生物)與1，4-二碘代苯、4，4’-二碘代聯苯或其它的二碘代或二溴代骨架連接物偶聯。在某些情況下，優選制備1，4-二乙炔基苯(或4，4’-二乙炔基聯苯)并將其與5-碘代水楊酸(或類似的碘代羥基-酸)偶聯。
柯胺G的二-炔基(C≡C-C≡C)衍生物的合成通過與甲醇、原甲酸三甲酯和硫酸反應，將5-碘代水楊酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)轉化為甲酯。然后在鈀的存在下，將獲得的5-碘代水楊酸甲酯與(三甲硅烷基)乙炔(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)反應。除去三甲硅烷基，如上在鈀的存在下，將2當量的所得5-乙炔基水楊酸甲酯與4，4’-二(2-溴乙炔-1-基)苯(由三甲硅烷基乙炔與1，4-二碘代苯合成)反應。通過上述的酯水解制備柯胺G的二-炔基類似物，4，4’-二(4-(3-甲氧基羰基-4-羥基苯基)-1，3-丁二炔-1-基)-苯。
柯胺G的鏈烯-炔基(C＝C-C≡C)衍生物的合成類似于上述的鏈烯基和炔基衍生物的合成，用Suzuki或Steel反應將苯、聯苯或其它骨架基團的金屬-鏈烯基衍生物與2-甲氧基-5-(2-碘代乙炔-1-基)-苯甲酸甲酯(其它適宜的羥基酸衍生物)偶聯，或者可將2-甲氧基苯甲酸甲酯的5-金屬-鏈烯基衍生物與1，4-二(2-碘代乙炔-1-基-苯(或4，4’-二(2-碘代乙炔-1-基)-聯苯)偶聯。
柯胺G的烷基(CH2-CH2)或二-烷基(CH2-CH2-CH2-CH2)衍生物的合成將上述的鏈烯基、炔基、二-鏈烯基、二炔基或鏈烯-炔基衍生物采用標準方法用氫氣和鉑或鈀催化劑氫化。
二-氟鏈烯基柯胺G衍生物的合成通過用3-甲酰基-5-氟水楊酸取代5-甲酰基水楊酸合成5-氟衍生物，1，4-二(2-(2-羥基-3-羧基-5-氟苯基)乙烯-1-基)-苯。在Schiemann反應中，柯胺G的[18F]芳基氟化物衍生物可通過用18F-標記的前體，例如[18F]LiBF4，通過用Cs[18F]分解三氮烯或者通過親核性18F取代X取代基合成，其中X＝甲苯磺酰基、三氟甲磺酸基、NO2、N(CH3)3或鹵素。參見Fowler，J.和Wolf，A.，“正電子成像術和放射自顯影法”(Phelps，M.，Mazziota，J.，和Schelbert，H.編輯)391-450(Raven Press，NY，1986)和Kilbourn，M.，氟-18標記的放射性藥物(Natl.Acad.Press，Washington，D.C.)(1990)。
芳族氟烷基和氟烷氧基衍生物的合成芳族氟烷基衍生物可采用Bishop等在“藥物化學雜志”(J.Med.Chem.)341612(1991)中描述的方法合成，其中適宜的O-烯丙基醚的克萊森重排形成芳族烯丙基衍生物，該衍生物可進一步功能化，得到氟乙基或氟丙基衍生物。或者，可采用Sonogashira等(四面體通訊(Tetrahedron Letters)4467-4470(19759))的借助鈀的偶聯方法將芳族的碘化物方便地轉化為長度為2-5個碳原子的芳族炔。接下來將炔衍生得到氟烷基衍生物。氟烷氧基衍生物可采用Chumpradit等，“藥物化學雜志”(J.Med.Chem.)3621(1993)中的方法制備，其中將適宜的酚用適宜的1-溴代(或碘代或磺酰氧)-ω-氟烷烴烷基化，得到相應的氟烷氧基衍生物。
芳族烷基磺酰氧基和烷氧基磺酰氧基衍生物的放射性氟化獲得芳族[18F]氟烷基和[18F]氟烷氧基衍生物的放射性氟化是采用Mathi s等的方法(Nucl.Med.Biol.19571(1992))進行的，其中將芳族烷基或烷氧基磺酰氧基(例如，烷氧基甲磺酸基)衍生物用[18F]氟取代得到芳族[18F]氟烷基和[18F]氟烷氧基化合物。
通過三-烷基錫途徑的放射性碘化和放射性溴化合成三烷基錫衍生物柯胺G的鏈烯基三-烷基錫衍生物的通式結構如附圖2B所示。在通式中，聯苯結構部分一側上3位的三-烷基錫基通常被取代，但其它位置，包括水楊酸或雜環結構部分上的三-烷基錫基團也有可能被取代。這些三-烷基錫衍生物是制備用于人類的放射性碘化和放射性溴化化合物的穩定中間體。更具體地說，這些三-烷基錫衍生物用于制備適用于體內成像淀粉樣蛋白的鹵代的放射性化合物。
合成三-烷基錫衍生物的通用方法采用先前公開的方法，由適宜的芳基鹵化物、[(C6H5)3P]3Pd(0)和六烷基二錫制備三-烷基錫衍生物，先前公開的方法包括Kosugi，M.等，化學通訊(Chem.Lett.)1981829；Heck，R.純化學和應用化學(Pure and Appl.Chem.)1978691；Echavarren，A.和Stille，J.美國化學會志(J.Am.Chem.Soc.)19875478；Mitchell，T.有機金屬化學雜志(J.Organometallic Chem.)19861；和Stille，J.純化學和應用化學(Pure and Applied Chem.)19851771。這些衍生物也可通過Mathis等的方法(J.Labell.Comp.andRadiopharm.1994905)用正丁基鋰和三-烷基氯化錫獲得。
4，4’-二(3-甲氧基羰基-4-羥基苯基偶氮)-聯苯的3-三-烷基錫衍生物的合成通過合成3-溴聯苯胺或3-碘聯苯胺(出處同上)、四氮化和與水楊酸甲酯偶聯(如合成柯胺G中的)合成3-溴代或3-碘代-4，4’-二(3-甲氧基羰基-4-羥基苯基偶氮)-聯苯或其二甲酯衍生物，當需要甲氧基化合物時，將上述的酚甲基化。在氬氣氛下，將1mmol酚的酯或甲氧基酯、[(C6H5)3P]3Pd(0)(0.1～0.2mmol)、六丁基二錫或六甲基二錫(1.25mmol)和二氧六環(25ml)在70℃加熱16小時。將反應混合物冷卻并蒸發溶劑。用氟化鉀水溶液除去鹵化物。有機物用乙酸乙酯萃取，經硫酸鎂干燥，過濾，減壓除去溶劑。殘余物經硅膠純化，得到3-三-烷基錫-4，4’-二(3-甲氧基羰基-4-羥基苯基偶氮)-聯苯。
三-烷基錫衍生物的放射性碘化或放射性溴化三丁基或三甲基錫衍生物采用公開的方法用Na[125I]或Na[123I]進行放射性碘化，或者用Na[75Br]或Na[76Br]進行放射性溴化，這些方法是例如Mathis等，J.Labell.Comp.and Radiopharm.1994905；Chumpradit等，藥物化學雜志(J.Med.Chem.)34877(1991)；Zhuang等，J.Med.Chem.371406(1994)；Chumpradit等，藥物化學雜志(J.Med.Chem.)374245(1994)。通常，0.5mg三-烷基錫化合物、0.2ml無水乙腈、10μl 2M H3PO4、2～100μl高特異性活性(＞2000 Ci/mmol)的Na[125I]或Na[123I](或者Na[75Br]或Na[76Br])在pH 9-12的氫氧化鈉中的溶液和二氯胺-T(DCT)(20μl2.5mg/ml DCT，在乙腈中)放在1ml的反應小瓶中。將小瓶蓋蓋并在室溫暗處下攪拌。通過HPLC檢測反應，30分鐘后用50μl 2M Na2S2O3使反應停止。產物通過標準色譜技術純化。Mathis等，J.Labell.Comp.and Radiopharm.1994905。同樣，可采用類似方法制備低特異活性18F衍生物。
制備非放射性I、Br、Cl、F和-SH衍生物的通用方法一般說來，5-甲酰基水楊酸的3-或4-氨基衍生物或附圖2所示的水楊酸的雜環類似物的相應衍生物可用亞硝酸鈉和鹽酸或硫酸轉化為相應的重氮化合物。碘衍生物可通過形成碘化重氮，然后轉化為芳基碘化物，或者通過三氮烯中間體直接制備。參見，例如Greenbaum，F.Am.J.Pharm.10817(1936))；Satyamurthy N.和Barrio J.，有機化學雜志(J.Org.Chem.)484394(1983)；和Goodman M.等，有機化學雜志(J.Org.Chem.)492322(1984)。芳基溴化物和氯化物可按照Sandmeyer反應用CuCl或CuBr處理重氮化合物或者通過如制備碘衍生物的三氮烯制備。芳基氟化物可按照Schiemann反應用NaBF4、HBF3或NH4BF4處理或者通過如合成碘衍生物的三氮烯分解制備。芳基硫醇可用含硫的親核性物質，例如HS-、EtO-CSS-和S22-處理重氮化合物制備。或者，芳基硫醇可用含硫的親核性物質置換芳基鹵化物制備。這些方法記載于March，J.，高等有機化學反應、機理和結構(ADVANCED ORGANIC CHEMISTRYREACTIONS，MECHANISM，AND STRUCTURE)(第3版，1985)中。
制備放射性C、F和Tc衍生物的通用方法除上述方法外，用99mTc或用發射正電子的放射性核素11C、18F、75Br和75Br放射性標記的高特異活性可采用本領域熟知的文獻方法實現。下面描述了幾種可能的特異性方法，但對于本領域專業人員而言，也存在其它熟知的方法，例如Fowler，J.和Wolf，A.“正電子成像術和放射自顯影法”的“正電子發射體標記的化合物”(Phelps，M.，Mazziota，J.，和Schelbert，H.編輯)391-450(Raven Press，NY 1986)；Coenen，H.等，Radiochimica Acta 3447(1983)；和Kulkarni，Int.J.Rad.Appl.&Inst.(Part B)18647(1991)，這些內容引入本文以供參考。
99mTc衍生物可通過與芳基硫醇復合制備。用11C的放射性標記可方便地通過上述的N-甲基化、O-甲基化，對適宜的烷基、鏈烯基或炔基柯胺G類似物進行[11C]碘甲烷、[11C]烷基化或[11C]羧基化實現。[18F]芳基氟化物衍生物可通過上述Schiemann反應中的取代18F-標記的前體，例如[18F]LiB4，通過用Cs[18F]進行三氮烯分解，或通過親核性18F取代X取代基(其中X＝甲苯磺酰基、三氟甲磺酸基、NO2、N(CH3)3或鹵素)進行制備。采用75Br或76Br的放射性溴化可使用類似于放射性碘化的親電性(Br-)或親核性(Br-)取代技術完成，參見Coenen，H.出處同上。
3-羥基-1，2-苯并異噁唑衍生物和相關衍生物(參見附圖2C)的合成按照Bshagen的方法(Chem.Ber 100954-960；1967)，用羥胺鹽酸鹽將2，6-二羥基苯甲酸(γ-間羥苯甲酸)甲酯(TCL America，Portland，OR)轉化為羥肟酸。仍按照Boshagen的方法，使用SOCl2，然后用三乙胺將羥肟酸轉化為相應的3-羥基-1，2-苯并并噁唑(Chem.Ber 100954-960；1967)。將該化合物轉化為甲酰基衍生物后，如上鏈烯基衍生物合成中所述，與適宜的二膦酸四乙酯偶合(在某些情況下可以是溴化的)。之后，如上所述將溴代衍生物轉化為三-烷基錫和碘代衍生物。
或者按常規將5-甲酰基水楊酸與適宜的二膦酸四乙酯偶合，將所得的4，4’-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-苯首先轉化為二甲酯，然后轉化為羥肟酸，最后通過上述Boshagen的方法得到苯并異噁唑。第三類3-羥基-1，2-苯并異噁唑可由包括4，6-二羥基-1，3-苯并二甲酸、3，6-二羥基苯二甲酸和2，5-二羥基對苯二甲酸(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)的幾種二羥基苯二甲酸合成。甲酰基化后，通過標準方法與適宜的二膦酸四乙酯偶聯，然后轉化為二甲酯，二羥基/二甲酯通過上述Boshagen方法與羥胺反應轉化為二羥基/二羥肟酸。向雙苯并異噁唑的轉化可通過用SOCl2和三乙胺處理，然后再采用上述的Boshagen方法進行。
鄰苯二甲酰亞胺或異吲哚-1，3(2H)-二酮衍生物(參見附圖2D)的合成如上鏈烯基衍生物合成中所述，將由3-羥基鄰苯二甲酸酐(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)制備的3-羥基鄰苯二甲酰亞胺轉化為甲酰基衍生物并與適宜的二膦酸四乙酯(在某些情況下可以是溴代的)偶聯。然后如上所述，將溴衍生物轉化為三-烷基錫和碘代衍生物。
2，3-苯并二嗪-1，4(2H，3H)-二酮衍生物(參見附圖2E)的合成用肼將由3-羥基鄰苯二甲酸酐(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)制備的3-羥基鄰苯二甲酰肼轉化為甲酰基衍生物，并如上在鏈烯基衍生物的合成中所述，與合適的二膦酸四乙酯(在某些情況下可以是溴代的)偶合。然后如上所述，將溴衍生物轉化為三-烷基錫和碘代衍生物。
2，3-苯并噁嗪-1，4(3H)-二酮衍生物(參見附圖2F)的合成使用羥胺將3-羥基鄰苯二甲酸酐(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)轉化為2，3-苯并噁嗪。然后如上鏈烯基衍生物的合成中所述，將苯并噁嗪衍生物轉化為甲酰基衍生物并與適宜的二膦酸四乙酯(在某些情況下可以是溴代的)偶聯。然后如上所述，將溴衍生物轉化為三-烷基錫和碘代衍生物。
(2H)1，3-苯并噁嗪-2，4(3H)-二酮衍生物(參見附圖2G)的合成采用Effenberger等的方法(Chem.Ber.1051926-1942；1972)合成該化合物。概括地說，是通過甲酰基水楊酸衍生物合成中使用的相同方法，將4-羥基苯甲醛(Aldrich)與適宜的二膦酸四乙酯偶聯。然后通過在三乙胺的存在下與乙氧羰基異氰酸酯(O＝C＝N-CO-O-Et)反應將所得加成物轉化為氨基甲酸酯。通過在二苯基醚中加熱將該取代的氨基甲酸酯(或N-乙氧羰基-氨基甲酸苯基酯)轉化為苯并噁嗪二酮。然后如上所述，將苯并噁嗪二酮轉化為三-烷基錫和碘代衍生物。
(3H)2-苯并吖嗪-1，3(3H)-二酮衍生物(參見附圖2H)的合成將3-羥基苯乙酸(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)甲酰化，轉化為酰胺，然后通過如上甲酰基水楊酸衍生物合成的相同方法，將其與適宜的二膦酸四乙酯偶聯。然后通過與氯甲酸乙酯反應，將該加成物轉化為N-(3-羥基苯基乙酰氧基)-氨基甲酸乙酯。通過在二苯基醚中加熱將該取代的氨基甲酸酯(或N-乙氧羰基-氨基甲酸苯基酯)轉化為苯并吖嗪二酮。然后如上所述，將苯并噁嗪二酮轉化為三-烷基錫和碘代衍生物。
1，8-萘二甲酰亞胺衍生物(參見附圖2I)的合成如上鏈烯基衍生物合成中所述，將4-氨基-1，8-萘二甲酰亞胺轉化為甲酰基衍生物并與適宜的二膦酸四乙酯(在某些情況下可以是溴代的)偶聯。然后如上所述，將溴衍生物轉化為三-烷基錫和碘代衍生物。
四唑和噁二唑衍生物(參見附圖2J和2K)的的合成按照Holland和Pereira的方法(J.Med.Chem.10149(1967))和Holland的美國專利3448107，通過與疊氮化鈉或疊氮化鋁反應，將2-氰基苯酚(Aldrich Chem.Co.，Milwaukee，WI)轉化為四唑。概括地說，是在氬氣氛下，將柯胺G的2-氰基苯酚或鏈烯基氰基苯酚衍生物(由4-甲酰基-2-氰基苯酚與適宜的二膦酸四乙酯偶聯制備)(1mmol)的40ml DMF溶液用疊氮化鈉(10mmol)和三乙胺鹽酸鹽(10mmol)處理。將該混合物在120℃攪拌2小時后，將其冷卻并以上述柯胺G合成中描述的后處理方式進行后處理。
通過用酸酐(如，乙酸酐)處理如上制備的四唑合成噁二唑。另一種方法是Bamford等在J.Med.Chem 383502(1995)中描述的方法。在該方法中，將柯胺G或水楊酸的酰肼鏈烯基衍生物(通過用肼處理相應的酯獲得)在二環己基碳化二亞胺的存在下用異硫氰酸甲酯處理。
用作對照的柯胺G衍生物的合成通過用兩當量的苯胺(Fisher Chemical Co.，Fair Lawn，NJ)代替一當量的聯苯胺合成該苯胺衍生物。通過用聯苯胺-2，2’-二磺酸(Pfaltz&Bauer，Inc.，Waterbury，CT)代替聯苯胺合成2，2’-二磺酸衍生物。通過用一當量的苯酚代替一當量的水楊酸合成苯酚衍生物。剛果紅(Aldrich認可的級別)可從市場獲得。
實施例2柯胺G和柯胺G衍生物與Aβ的結合特異性與合成Aβ(10-43)的結合在體外，柯胺G可與合成Aβ(10-43)很好地結合。附圖4A顯示了柯胺G與Aβ(10-43)結合的Scatchard分析。高親和性成分的KD為0.257μM，B最大為3.18nmol柯胺G/mg Aβ(10-43)。低親和性成分用這些數據來定義不是太好，其表現出的KD為4.01μM，B最大為18.7nmol柯胺G/mg Aβ(10-43)。低親和性成分表示高濃度的柯胺G與明顯的低親和性位點的結合，而不是與制品中雜質的結合。注射到體內的柯胺G的量是如此之低，以致不會與任何低親和性成分產生結合。在極低的濃度下，高親和性結合與低親和性結合的比率非常大。
柯胺G結合的量與使用范圍內的肽濃度呈線性關系，如附圖5所示。
結合動力學動力學研究顯示了相當快速的結合(附圖6A)，基本用1分鐘就可完成，[柯胺G]＝112μM時的t為8.9±1.8秒，也顯示了速度稍慢的結合(附圖6C)，t＝55±9.4秒[結合速率常數(K-1)＝1.26×10-2秒-1]。附圖6B顯示了根據Bennett和Yamamura.Bennett，J.P.和Yamamura，H.I.在神經遞質受體結合(NEUTOTRANSMITTERRECEPTOR BINDING)(N.Y.Raven Press 1985)pp.61-89中描述的方法轉化的結合動力學數據。附圖6A中結合曲線的線性部分轉化為附圖6B中的直線，其中將ln[Beq/(Beq-Bt)]對時間作圖，其中Beq是達平衡時(4分鐘)結合的柯胺G的量，Bt是在t時間時結合的量。該直線的斜率等于K觀察，K1＝(K觀察-K1)/[柯胺G]，其中K1是由附圖6C的數據測定的解離速率常數。附圖6C中的曲線尊從下列等式At=A0e-k-1t]]>其中At是在t時間時仍保持結合的柯胺G的量，A0是在0時間時結合的柯胺G的量，t是以分鐘為單位的時間，K-1是解離速率常數。由該分析計算得到的結合速率常數(K1)為3.75×10M-1秒-1，KD＝K-1/K1＝0.34μM，與Scatchard分析保持了良好的一致性。
柯胺G衍生物可抑制柯胺G與Aβ的結合在附圖1的化學結構下面和附圖3顯示的數種替代曲線顯示了柯胺G衍生物抑制[14C]柯胺G與Aβ(10-43)結合的K1值。K1被定義為IC50/(1+[L]/KD)，其中[L]是分析中[14C]柯胺G的濃度(0.100～0.125μM)，KD是0.26μM，柯胺G的KD通過上面的Scatchard分析測定。柯胺G自身的K1為0.37±0.04μM，該值與由Scatchard和動力學分析中獲得的值非常一致。剛果紅的K1為2.82±0.84μM。柯胺G的二氟代衍生物、(5-FSA)CG(附圖1)是柯胺G自身效能的三分之一(K1＝1.16±0.19μM)。根據二氟代柯胺G衍生物的活性，認為18F二氟代柯胺G衍生物可用于PET成像，19F二氟代柯胺G衍生物可用于腦組織的MRS/MRI成像。
3-ICG的效能較柯胺稍強。根據3-ICG的活性，認為123I二氟代柯胺G衍生物可用于SPECT成像。甲基化的3-ICG的酚(3-ICG(OMe)2)將親和性降低了10倍。CG(COOMe)2中的甲基化的羧基使親和性降低了更多(約200倍)。如果將酸性結構部分全部除去，象苯酚衍生物中那樣，就完全消除了結合親和性。
這些結果表明在與Aβ的結合中，柯胺G類似物的酸性結構部分起著重要作用，酚結構部分起著輔助作用。通過氫與酸結合，酚可以發生作用，該結合作用穩定了酸結構部分的結構取向。鄰位酚基的存在也可能通過氫結合或通過芳香系統整體的電荷分布變化改變酸上電荷的分布。或者，酚基可通過連接酚和酸與淀粉樣蛋白結合位點的兩個配位基直接參與與淀粉樣蛋白的結合。如在間羥苯甲酸衍生物，(6-OHSA)CG中那樣，在羧基的鄰位加上第二個酚基可產生出該系列中最高的親和性化合物，其K1為0.094+0.02μM。
增加聯苯骨架的親脂性在一定程度上表現出親和性的增加。二鹵代衍生物，3，3’-I2CG、3，3’-Br2CG和3，3’-Cl2CG均具有非常類似的K1值，它們約是柯胺G的一半。
通過在2位進行取代扭轉聯苯基的兩個苯環間的兩面角的角度，大大降低了親和性。這通過柯胺G的2，2’-二-磺酸衍生物，2，2’-(SO3)2CG的失活得以證實。由于3，3’二羧酸衍生物、3，3’(COOH)2CG，僅顯示失去7倍柯胺G的活性，附加的酸性結構未必是使2，2’-二-磺酸活性喪失的唯一原因。該2，2’-衍生物是獨特的，即2位龐大的磺酸基破壞了聯苯基的平面化。分子模型研究表明2，2’-二磺酸衍生物中聯苯基的兩個苯環間的兩面角為83°。柯胺G和所有其它活性衍生物中的該角約為35-40°。
在探索柯胺G的功能基配位基性質的重要性中，研究了苯胺衍生物的結合，這些衍生物在附圖1中僅表示出了半個分子。可按照下式計算大約的結合能量AG＝-RT ln Keq其中ΔG是結合反應的能量，R是摩爾氣態常數[8.31441J/(mol·°K)]，T是°K時的溫度，Keq是該反應的平衡常數[探針]+[肽]＝[探針·肽]和Keq＝1/KD-1/K1。使用的柯胺G的KD值為0.26μM，結合能量大概為38KJ/mol。如果苯胺衍生物以一半的能量進行結合，則預期的解離能量約為19KJ/mol。如果苯胺衍生物的K1為73μM，則結合能量為23KJ/mol，該值與預期值的一致性可被接受。水楊酸自身全然缺乏結合活性證實了柯胺G和苯胺衍生物中的疏水性區域的重要性。
柯胺G對Aβ的親和性比剛果紅對該肽的親和性高數倍。該結合是可逆的，無論是通過Scatchard分析、動力學方法或結合抑制測定法測定的結合常數均約為250～400nM。由于其非結晶性，淀粉樣蛋白纖維具有較差的溶解性，剛果紅或柯胺G與淀粉樣蛋白配合的結構還從未被精確的結構測定技術，例如X線晶體照相術或多維NMR所確定。已有人提出了剛果紅與淀粉樣蛋白相互作用的模型。Cooper，實驗室研究(Lab.Invest.)31232(1974)；Romhanyi，VirchowsArch.354209(1971)。該研究認為剛果紅不與單個淀粉樣蛋白肽分子結合，但與由于β片狀纖維定向的交叉的數個Aβ分子結合。Klunk等，組織化學和細胞化學雜志(J.Histochem.Cytochem.)371273(1989)。
附圖7顯示了該模型圖，該圖是用MacroModel 2.5生成的，其中柯胺G跨越了反平行β片狀構型的5個肽鏈。使用的這些肽未進行結構精確化。排列Aβ以使交互鏈間距為4.76埃，即β-片狀纖維的特征。以黑色和白色劃出交互的肽鏈。柯胺G(黑色)被能量最小化，與纖維模型排列，使與賴氨酸-16(附圖頂部的淺灰色橢圓形)和疏水性苯丙氨酸19/20區域(底部)的接觸達到最大。兩個視角對于該同一模型而言，彼此相差90°。白色箭頭表示獲得另一個視角采用的方向。
柯胺G的羧基結構間的19.1埃間距與跨越5個鏈的距離19.0埃匹配得很好(4×4.76埃，相鄰兩個鏈間距4.76埃，Kirschner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83503(1986))。如果象Hilbich等認為的那樣，Aβ的天然結構與發夾環形結構有關(Hilbich等，J.Mol.Biol.218149(1991))，那么鏈1與2、3與4、5與6等將被折疊為同分子的一半，而模型卻是完整的。另一值得注意的重要點是該模型中的正電荷氨基酸殘基是必需的，例如Aβ中的賴氨酸-16。先前的研究顯示了剛果紅的結合與淀粉樣蛋白纖維樣品中的正電荷氨基酸的數量密切相關。Klunk等，組織化學和細胞化學雜志(J.Histochem.Cytochem.)371273(1989)。柯胺G的單配位基苯胺類似物的親和性降低、水楊酸的失活以及聯苯胺結構上具有兩個鹵素的較強親脂性化合物(見附圖1)效能的增強支持了附圖7中模型的二配位基性質和疏水性相互作用的重要性。2/2’-二磺酸衍生物的失活證明了接近平面的聯苯基的重要性。
實施例3、柯胺G對阿爾茨海默氏癥腦組織與正常腦組織的識別柯胺G與AD腦組織的結合特性為搞清柯胺G與AD腦組織的增加的結合，對柯胺G和柯胺G衍生物與AD腦組織樣品的結合進行Scatchard分析。(附圖4B，表1)。在采用的條件下，對照品和AD腦組織顯示了單一結合成分。AD腦組織的KD較對照品低16％，但差異不明顯(p＝0.29)。AD腦組織的B最大較對照腦組織高36％，但差異仍不夠顯著(p＝0.09)。因此，AD腦組織中的增加的結合主要是由于其中存在的同樣的結合成分較對照腦組織多，而不是有獨特成分的存在。
表1、AD與對照腦組織的結合參數比較
CG與AD腦組織的結合與腦組織結合皮層中的NP數量明顯相關。附圖8A顯示了[14C]CG結合與AD腦組織的上/中額和顳上皮層中的NP數量的關系。無論是否包括對照(r＝0.69；p＝0.001)，或是單獨考慮AD腦組織(r＝0.59；p＝0.007)，與NP的關系都是明顯的。附圖8B顯示了與NFT數量的類似關系。正如與NP的關系一樣，無論是否包括對照(r＝0.60；p＝0.001)，或是單獨考慮AD腦組織(r＝0.50；p＝0.026)，結合與NFT的關系也是顯然的。結合與NFT有關并不出人意料，因為CG是剛果紅的衍生物，而剛果紅可使NFT染色。NP的數量與NFT數量也顯著相關(r＝0.82；p＝0.0001)。
由于在該研究中，對使用的腦組織，無論淀粉樣蛋白血管病是否存在都只能獲得定性的數據，因此未能進行CG結合與腦血管淀粉樣蛋白水平的類似相關性研究。當存在淀粉樣蛋白血管病時，CG結合與NP數量的關系出現混淆變化。附圖8A顯示出在沒有淀粉樣蛋白血管病的腦組織中CG結合與NP比例數量關系(r＝0.79；p＝0.01)與具有腦血管淀粉樣蛋白沉淀的腦組織(r＝0.49；p＝0.15)相比有所提高。但在與NFT數量的比例關系中，沒有發現類似的提高。柯胺G與AD腦組織結合的KD與在[14C]柯胺G與合成的Aβ的體外結合中測得的類似，表明在腦組織勻漿物中的結合也可表示為與Aβ間的相互作用。柯胺G的結合與NFT的關系表明了柯胺G也是與腦組織中的這些結構物結合。此外，由于NFT數量與NP數量密切相關，[14C]柯胺G與NF的結合關系可能剛好是[14C]柯胺G與NP結合的附帶現象。
通過與合成Aβ肽或阿爾茨海默氏癥腦組織的結合測定的本發明提供的有價值的柯胺G衍生物或類似物的親和性KD至少為0.01～10.0μM；在本發明方法中也使用結合親和性在0.0001～0.01μM的具有較高親和性的化合物。
鑒于上述考慮，柯胺G結合不是Aβ特異性的。相反，柯胺G結合可以反映出腦組織中包含的淀粉樣蛋白總量，包括神經斑中聚集的Aβ沉淀和腦血管淀粉樣蛋白沉淀。NFT中的磷酰化σ蛋白沉淀也可與柯胺G結合。Goedert，M.等，PNAS 854051(1988)。NFT也包括四元結構類似于Aβ纖維的反平行β-片狀纖維。Kirschner等，Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83503(1986)。
總柯胺G結合和相對柯胺G結合區分AD與正常腦組織如上和如下所述的體外結合分析在本領域中被廣泛地用作篩選用于體內腦組織結合化合物的模型和預知隨后體內成像研究成功的模型。參見，Young，A.等，在“正電子成象術和放射自顯影術”的“受體測定體外和體內”部分(Phelps，M.，Mazziota，J.和Schelbert，H.編輯)pp.73-111(1986)。本發明的標記的柯胺G和柯胺G衍生物還可用于上述和下述的體外結合分析，用于在活組織檢查和死后樣品分析中定量淀粉樣蛋白沉淀。
在AD腦組織和對照腦組織中均觀察到了[14C]柯胺G的浸透性(特異性)結合，它占AD腦組織中總結合的60～80％。非浸透性結合在AD腦組織和對照腦組織中非常相象。AD腦組織中的浸透性結合和總結合均多于對照。盡管采用總結合時獲得的敏感性較低，但該參數更能預知體內研究的成功性，而體內研究才是本發明的最終目的。如果使皮層區域的柯胺G結合標準化為其中AD和對照腦組織中的柯胺G結合非常相象的腦組織區域的結合，對于目的擴展的體內研究將是有益的。這免除計算絕對結合量的需要，體內該量的計算是較為困難的。我們測定了小腦組織中的結合作為可能的對照區域，因為在該腦組織區域中典型NP非常地少(Joachim等，Am.J.Pathol.135309(1989))。柯胺G與對照小腦組織結合的平均數量和與AD小腦組織結合的數量基本相同(表2)，支持了小腦作為內部對照的應用。因此，小腦比率(CBR)準確反映了[14C]柯胺G結合的絕對數量，體現了對各腦組織提供內部對照的優點。在無論是以絕對值(fmol/μg蛋白)(表2)還是以與同一大腦的小腦中結合的比率(表3)表示，AD腦組織中的結合都是高的。CBR是更敏感的量度，并且在兩種腦組織中顯示了較低的變化性。使用總結合和CBR將大大有助于這些離體結果向體內研究的擴展。因此，每當合適時就采用這些參數來表示下面的結果。
表2、AD和對照腦組織中的總結合比較*<
>*高密斑和低密斑腦混合。
表3、以與小腦的比率形式比較AD和對照腦組織中總結合*<
>*各樣品的CBR通過用樣品中[14C]柯胺G結合的絕對值除以同一大腦的小腦樣品中的[14C]柯胺G結合的絕對值獲得。表中的值是從各腦組織區域獲得的平均值(±SEM)。高密斑和低密斑腦混合。
附圖9A和9B顯示了被標準化為同一腦中小腦中結合的[14C]柯胺G與六個腦組織區域的結合。附圖9A中顯示了柯胺G與AD腦組織區域的結合的放大率大于20 NP/x200，為“高密斑AD腦”。附圖9B中顯示了柯胺G與AD腦組織區域的結合的放大率小于20 NP/x200，為“低密斑AD腦”。在所有各個腦組織區域中，與AD腦組織的結合明顯要比對照多(見表3)。在上/中額皮層，對照樣品與AD的各樣品之間沒有重疊。在除枕骨皮層外的各腦組織區域中，在對照和AD樣品之間也沒有重疊(放大率為＞20 NP/x200)。在典型NP沉淀最少的腦組織區域中，例如枕骨皮層(和小腦)中觀察到了AD與對照結合之間的最大重疊。
附圖9C顯示了從兩名Down氏綜合癥患者獲得的數據。所有Down氏綜合癥患者到其四十多歲時均產生Aβ沉淀，有許多發展為AD。Wisniewski等，Neurology 35957(1985)；Schapiro等，Neurobol.Aging 13，723(1992)。這兩類患者均顯示出超出對照范圍的[14C]柯胺G結合。由于年輕患者(23歲)有淀粉樣蛋白沉淀，但沒有臨床癡呆癥狀，附圖9C表明柯胺G可測定其與非癡呆患者對照的差異，該對照者在臨床癡呆癥狀出現很久以前，最終發展為AD。
本發明的化合物和方法提供了兩種區分AD腦與正常腦組織的測量；(1)總的柯胺G結合(表2)或(2)在指定腦組織區域中的柯胺G結合與同一腦中的小腦組織中的柯胺G結合比率(表3)。這些測量對于體內定量AD神經斑提供了兩大優點。第一，通過提供一種測量總結合，而非特異性Aβ結合的方法，患者無需接受為測量非特異性結合而進行的第二次放射性物質注射，本發明即可定量Aβ沉淀。因此，數據可以只用總結合表示。在所示的各種實驗中，獲得的特異性結合的數據甚至高于AD與對照腦組織間的差異。
第二，腦組織攝取的柯胺G衍生物的差異將影響腦組織中柯胺G的絕對濃度。因此，需要某些解釋這些被檢測對象間差異的機理。通過尋找幾乎沒有Aβ沉淀顯示的腦組織區域，將每位患者作為其自身的對照(即，實驗“空白”)。由于典型NP很少存在于小腦中(Joachim等，Am.J.Pathol.135309(1989))，將柯胺G與小腦的結合用作各腦組織研究的對照。結果以在指定腦組織區域中的柯胺G結合與同一腦的小腦中的柯胺G結合的比率表示(附圖9和表3)。
在體內定量AD中淀粉樣蛋白時，應考慮腦萎縮的影響。因此，當使用柯胺G和柯胺G的衍生物探針體內定量淀粉樣蛋白時，腦組織萎縮可根據MRI體積測量法加以校準。與本發明的方法協同進行的MRI體積測量法與本領域常規采用的那些方法類似。參見，Pearlson，G.和Marsh，L.在“精神病學年度綜述(Annual Review ofPsychiatry)(第12卷)”中的“精神病學中的磁共振成象術”(Oldham，J.等編輯，第347-381(1993))。因此，測定單位體積腦組織區域的總放射性的方法將使用下面的等式
指定測量的信號/腦組織區域“A”的體積或S/VA是指表示如下的小腦比率
其中S/VCB是信號/該成像研究中同一被測試者的小腦的體積。將疑患有AD或其它以淀粉樣蛋白沉淀為特征的病癥患者的除小腦外的任何腦組織區域的該比率與年齡相當的正常對照者組的相同腦組織區域的該比率正常范圍進行比較。將和神經斑高度沉淀的腦組織區域結合與和小腦結合的比率用作區別阿爾茨海默氏癥與對照者參數。
實施例4柯胺G、柯胺G衍生物和剛果紅的辛醇-水分配系數辛醇-水分配系數是化合物相對親脂性的一種量度。親脂性越強的化合物，越容易穿過血腦屏障。參見，Goodman和Gilman的《治療的藥理學基礎》(THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS)(第7版)。柯胺G的辛醇/水分配系數為60.22±3.97，剛果紅的該系數為0.665±0.037(p＜0.001)。這表明柯胺G的親脂性比剛果紅強約90倍，因此從理論上說，柯胺G更易于穿過哺乳動物的血腦屏障。柯胺G的3-碘代和3，3’-二碘代衍生物(附圖1)的辛醇/水分配系數分別為72.53±0.74和112.9±7.3。這些辛醇/水分配系數表明這些衍生物(它們是某些用于體內研究的放射性標記的柯胺G衍生物的非放射性類似物)的親脂性比剛果紅強170倍，是柯胺G的兩倍。這表明它們將比剛果紅或柯胺G能更好地進入腦組織。
實施例5柯胺G和柯胺G衍生物穿過血腦屏障的能力及柯胺G的代謝用淀粉樣蛋白探針體內診斷AD需要它們能夠穿過血腦屏障，進入腦實質的淀粉樣蛋白沉淀中。
用Swiss-Webster小鼠進行柯胺G穿過血腦屏障的能力的研究。靜脈注射后，在15分鐘時測定的腦/血比率超過10∶1，在35分鐘時達到20∶1(附圖10)。超過該時間，腦組織中保持的放射性接近恒定，但血中的放射性逐漸降低，而肝臟中的放射性逐漸增高。腦/腎比率在15分鐘時最高(加樣后經過的時間)，達到0.5。當靜脈注射[14C]柯胺G后60分鐘取出腦和肝臟時，在反相HPLC上，有＞95％的回收放射性與真實柯胺G一同洗脫，表明在該段時間內，柯胺G沒有發生明顯代謝。
柯胺G能進入正常小鼠的腦中，腦/血比率很高。經過30分鐘后，腦中的放射性保持相對恒定，但血液中的放射性逐漸降低，而肝臟中的放射性逐漸增高。這表明高的腦/血比率是由于肝臟有效除去血液中柯胺G的結果，而不是柯胺G在腦中進一步積累的結果。在60分鐘時，在腦和肝臟中測得了基本上所有的放射性，證明了未變化的柯胺G。剛果紅不能穿過血腦屏障。Tubis等，J，Amer.Pharm.Assn.49422(1960)。大部分剛果紅通過肝臟和脾臟清除，豚鼠中的腦/腎比率約為0.07。Tubis等，出處同上。柯胺G也通過肝臟清除，但較容易進入腦中。
體內動物測試為確定劑量范圍、轉運通過血液屏障的效力和結合能力提供了另一種基礎。為此，特別優選使用Games等(Nature 373523(1995))或Hsiao等(Science 27499-102(1996))的轉基因鼠模型以及用于腦淀粉樣蛋白變性的“老年性動物”模型，即轉基因鼠動物或者老齡的狗或猴子，已知它們可發展為可變數量的阿爾茨海默氏癥類型的腦神經斑，參見Wisniewski等，J.Neuropathol.&amp;Exp.Neurol.32566(1973)；Selkoe等，Science 235873(1987)，測試結合和測定效力。這種體內測定需要對照-活檢或尸檢檢查以證實和定量淀粉樣蛋白沉淀的存在。
用于測試本發明組合物和方法的其它適宜的動物模型通過轉基因生產。例如，Quon等，Nature，352239-241(1991)用大鼠神經特異性烯醇化酶助催化劑抑制劑區域制備轉基因小鼠。參見，Wirak等，Science，253323-325(1991)。其它模型可通過對動物直接顱內給予β/A4肽來生產(Tate等，Bull.Clin.Neurosci.，56131-139(1991))。
值得注意的是，沒有一種體內動物模型被證明是AD神經病理學研究的極好模型。相反，它們可能更接近正常老化的淀粉樣蛋白沉淀模型。這是一種特別真實的老齡哺乳動物模型。所有這些模型都顯示出了如上面在老齡狗模型中討論的擴散斑優勢。雖然有一些腦血管淀粉樣蛋白，但基本沒有神經斑(除Games等和Hsiao等的轉基因鼠外)。其它轉基因鼠模型常僅顯示出擴散斑。因此，雖然這些模型可用于研究腦組織中探針的分布，但這些模型顯示根據上述柯胺G與AD腦組織結合的體外研究預期在AD大腦組織中觀察到的相同數量差異的可能性極小。
烷基、鏈烯基或炔基柯胺G衍生物穿過血腦屏障的能力的評價將劑量為約10mCi特異活性為約500Ci/mol或更高的適宜放射性標記的柯胺G衍生物靜脈注射到正常被測試者和疑患有AD的患者中，通過SPECT或PET成像檢測分析該衍生物在腦(相對于其它器官)中的可檢測性，并定義腦檢測性的時間過程。將能夠進行可靠檢測的劑量定義為“成像有效劑量”。
對烷基、鏈烯基或炔基柯胺G衍生物區別AD與年齡相當的人對照者的評價將成像有效劑量的適宜的放射性標記的柯胺G衍生物注射到疑患由于病癥，如AD引起的腦組織淀粉樣蛋白沉淀的被檢測者中。經過15分鐘至24小時，通過SPECT或PET檢測腦組織的放射性信號。同時檢測包括檢測儀視野下的所有腦組織區域。建立視野以使其包括小腦的大部分區域、顳上皮層、上/中額皮層和間腦區。在研究前可進行MRI掃描以通過實施例3中討論的方法校準在目的區域內腦萎縮產生的誤差。計算實施例3中討論的可變S/VA、S/VCB和比率A并將它們與之前由年齡相當的正常對照檢測者獲得的類似標準比率進行比較。
實施例6鏈烯基柯胺G衍生物與淀粉樣蛋白結合的組織學定位附圖11上部的圖示范了通過1，4-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-苯染色的人AD腦組織。該染色方法是Stokes和Trickey(J.Clin.Pathol.26241-242(1973))用1，4-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-苯代替剛果紅進行的染色方法。該方法著染的顏色較用柯胺G、剛果紅或硫黃素S觀察到的顏色濃厚得多。許多淀粉樣蛋白斑和神經纖維網以及神經纖維纏結都很容易被識別。附圖11底部的照片顯示了用1，4-二(2-(3-羧基-4-羥基苯基)乙烯-1-基)-苯染色的轉基因鼠腦組織的切片[Tg(HuAPP695.SWE)2576；Hsiao等，Science 27499-102(1996)]。密集的淀粉樣蛋白斑被強烈地染色。在人和小鼠腦組織中，腦血管淀粉樣蛋白都被強烈地染了色(未顯示數據)。
實施例7烷基、鏈烯基或炔基柯胺G衍生物的毒性評價將劑量為10～100mg/kg的非放射性柯胺G對小鼠進行腹膜內給藥，在72小時時間內未觀察到明顯的行為影響或毒性。[14C]柯胺G的施用劑量在1mg/kg數量級。
根據建立LD50的實驗，柯胺G基本未顯示出急性毒性。甚至當將不會由于注射液體積的影響而產生有害作用的可注射到小鼠的最大體積(約0.025ml/g)的飽和柯胺G溶液注射到小鼠(100mg/kg)中時，在72小時的最長試驗期間也未觀察到明顯行為變化。通過SPECT或PET檢測放射性標記的衍生物所需的劑量的數量級低于該劑量。
剛果紅可以較放射性柯胺G衍生物大得多的劑量注射到人體中。剛果紅顯示的LD50為190mg/kg小鼠(Tubis等，J.Amer.Pharm.Assoc.49422(1960))，該值與柯胺G顯示的＞100mg/kg的LD50相當。因此，這兩種化學類似物在小鼠中都產生類似的低毒性。
可將其它的烷基、鏈烯基或炔基柯胺G衍生物在小鼠和其它高等哺乳動物中通過較寬濃度范圍的注射，通過本領域熟知的方法研究動物對各種毒性信號的反應，進行類似的毒性試驗。參見，Goodman和Gilman的《治療的藥理學基礎》(第7版)。
實施例8柯胺G防止Aβ(25-35)誘導的毒性的能力評價防止Aβ(25-35)在PC-12細胞中誘導的毒性使大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC-12)在加有10％胎牛血清的RPMI1640培養基中生長。將100μl培養基中的約5000指數生長細胞平鋪在96孔培養板中，使其在37℃下過夜。在加入20μl以獲得指定終濃度(0.01～10μM Aβ(25-35)和0.03～20μMCG)之前，將在37℃預聚集7天的Aβ(25-25)與柯胺G(CG)或相關化合物在水溶液中進行預培養。將細胞培養24小時后，加入13.3μl 5mg/ml MTT(3，(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基溴化四唑鎓)的無菌磷酸鹽緩沖鹽水溶液。在37℃培養4.5小時后，加入100μl萃取緩沖液(20％w/v SDS在50％DMF/水中的溶液；用2.5％80％乙酸和2.5％1N HCl將其pH調至4.7)并將培養板培養過夜。Hansen等，J.Immunol.Methods 119203(1989)。然后測定560nm的顯色。將最大生存力定義為其中僅加入了20μl蒸餾的去離子水的對照孔的吸收。最大毒性由其中細胞通過加入0.1％(終濃度)Triton X-100溶解的孔來定義。
PC12細胞與Aβ(25-25)一起培養導致這些細胞還原MTT的能力呈濃度依賴性降低(附圖12)。附圖12顯示了通過測定MTT的還原反應，在有或沒有柯胺G的存在下，Aβ(25-25)濃度增高對PC12細胞的細胞還原氧化活性的影響。MTT的還原產物在560nm產生吸收，將該吸收作為縱軸作圖。實心條棒顯示了單獨存在的Aβ(25-25)的影響，表明Aβ(25-25)對MTT還原程劑量依賴性降低。實心條棒內部的白色顯示出與對照(無Aβ，無柯胺G)的明顯差異。空心條棒顯示了20μM柯胺G的防護作用。空心條棒內部的黑色顯示出在有或沒有柯胺G存在下的MTT還原反應間的明顯差異。
附圖13表明柯胺G濃度的增加對Aβ(25-25)誘導的PC12細胞的細胞還原氧化活性的還原作用的影響。實心條棒顯示了在沒有Aβ(25-25)存在下的柯胺G影響。對照(無Aβ、無柯胺G)與有任意濃度的柯胺G存在、但沒有Aβ(25-25)存在的情況之間沒有顯著差異。空心條棒顯示了在1μMAβ(25-25)存在下和柯胺G濃度增高下的MTT還原反應。實心條棒內部的白色顯示了在有或沒有Aβ(25-25)存在下的各濃度柯胺G下的MTT還原反應的顯著差異。空心條棒內部的黑色顯示了在Aβ(25-25)對照(無柯胺G)和Aβ(25-25)加濃度增高的柯胺G之間的MTT還原反應的顯著差異。
先前已有報道，剛果紅在2μM濃度下防止Aβ誘導的毒性，達20μM時才能產生完全防護作用。Burgevin等，NeuroReport 52429(1994)Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.9112243(1994)；Pollack等，Neuroscience Letters 184113(1995)；Pollack等，Neuroscience Letters 197211(1995)。柯胺G顯示的防護作用依賴于Aβ(25-25)的濃度(附圖12)和柯胺G的濃度(附圖13)。柯胺G在0.2μM濃度下產生防護作用，該濃度與柯胺G與合成Aβ結合的Ki，0.37μM(附圖1)非常接近。柯胺G顯示出比剛果紅更有效，其產生作用的范圍在0.1～1.0μM。這與柯胺G和合成Aβ結合的Ki值0.37μM和剛果紅與合成Aβ的Ki值0.28μM相一致。
在另一個實驗(附圖14)中，在與1μMAβ(25-25)一起培養的細胞中測定了柯胺G和酚衍生物(參見附圖1)的影響，后者不與Aβ結合。柯胺G在0.1和1μM下顯示出防護作用，但酚衍生物不顯示出防護作用，它或許還增高了Aβ的毒性。
這些結果表明剛果紅、柯胺G的親脂性衍生物在非常接近于與Aβ結合的濃度下可防止細胞培養物中Aβ誘導的細胞毒性。該防護作用顯示了結構特異性，因為不與合成Aβ結合的酚衍生物也不能防止Aβ誘導的細胞毒性。由于柯胺G能很好地分配到腦組織中，這些結果為柯胺G和結合Aβ的柯胺G衍生物具有潛在AD治療作用提供了根據。
柯胺G的防護作用的機理目前尚未清楚。存在兩種可能性。一種是，柯胺G可能干擾Aβ的聚集。另一種是，柯胺G可能干擾靶細胞上Aβ的作用(直接或間接的)。剛果紅確實抑制Aβ的聚集并且防止聚集Aβ的毒性作用。Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.9112243(1994)。在上面的實驗中，未必是干擾聚集，因為在與柯胺G一起培養之前，Aβ已被預聚集。因此，對聚集的抑制可以證明是柯胺G的重要治療作用，但不可能解釋柯胺G對預聚集的Aβ的防護作用。附圖7中描述的柯胺G與Aβ結合的模型顯示了柯胺G是如何“包覆”Aβ表面的。這可能會改變人們關于如何通過細胞表面受體或其它大分子，例如補體蛋白產生纖維沉淀以及干擾由這些大分子介導的Aβ的毒性作用的認識。柯胺G和剛果紅有可能在Aβ聚集之前和之后產生多種作用。從治療學的觀點看，這是非常有益的，因為患者可能出現在有Aβ聚集物預先存在時，也有可能出現在淀粉樣蛋白沉淀繼續時。
權利要求
1.一種可結合淀粉樣蛋白的式I化合物或其水溶性無毒鹽
是C≡C，CR’＝CR’，CR’2-CR’2，C≡C-C≡C，CR’＝CR’-CR’＝CR’，C≡C-CR’＝CR’或CR’2-CR’2-CR’2-CR’2(其中各個R’獨立地表示H或低級烷基)；X是C(R”)2(其中各個R”獨立地是H，F，Cl，Br，I，低級烷基，(CH2)nOR’，其中n＝1，2或3，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R’，N(R’)2，NO2，(C＝O)N(R’)2O(CO)R’，OR’，SR’，COOR’，Rph，CR’＝CR’-Rph，CR’2-CR’2-Rph(其中Rph表示未取代或取代的苯基，苯基的取代基可選自R”中定義的非苯基取代基，三-烷基錫，下式的四唑或噁二唑
其中R’是H或低級烷基)或者X是CR’＝CR’，N＝N，C＝O，O，NR’(其中R’表示H或低級烷基)，S或SO2；R1和R2各自獨立地是H、F、Cl、Br、I、低級烷基、(CH2)nOR’(其中n＝1，2或3)、CF3、CH2-CH2F、O-CH2-CH2F、CH2-CH2-CH2F、O-CH2-CH2-CH2F、CN、(C＝O)-R’、N(R’)2、NO2、(C＝O)N(R’)2O(CO)R’、OR’、SR’、COOR’、三-烷基錫，Rph、CR’＝CR’-Rph、CR’2-CR’2-Rph，其中Rph表示未取代或取代的苯基(苯基的取代基可選自R1和R2中定義的非苯基取代基)、下式的四唑或噁二唑
(其中R’是H或低級烷基)、或下式的三氮烯
(其中R8和R9是低級烷基)或者
各個Q獨立地選自下列的結構之一IA、IB、IC、ID、IE、IF和IG，其中IA具有下列結構
其中R3、R4、R5、R6或R7各自獨立地是如上R1所定義的；IB具有下列結構
其中R10、R11、R12、R13、R14、R15或R16各自獨立地是如上R1所定義的；IC具有下列結構
其中R17、R18、R19、R20或R21各自獨立地是如上R1所定義的；ID具有下列結構
其中R22、R23或R24各自獨立地是如上R1所定義的；和
表示下式的六個雜環之一
IE具有下列結構
其中R25、R26或R27各自獨立地是如上R1所定義的；
表示下式的六個雜環之一
IF具有下列結構
其中R28、R29、R30、R31或R32中之一是如上式I中所定義的連接
并且R28、R29、R30、R31或R32彼此獨立地如上R1所定義；IG具有下列結構
其中R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39中之一是如上式I中所定義的連接
并且R33、R34、R36、R36、R37R38或R39彼此獨立地如上R1所定義。
2.權利要求1的化合物，其中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一個選自131I，123I，76Br，76Br，75F，18F，CH2-CH2-18F，O-CH2-CH2-18F，CH2-CH2-CH2-18F，O-CH2-CH2-CH2-18F，19F，125I，和如式I中說明的含碳取代基，其中的至少一個碳是11C或13C。
3.權利要求1的化合物，其中通過與合成Aβ肽或阿爾茨海默氏癥腦組織結合測定的該化合物與Aβ結合的離解常數(KD)為0.0001～10.0μM。
4.一種合成權利要求1的化合物的方法，式I中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一個選自131I，125I，123I，76Br，75Br，18F和19F，該方法包括將權利要求1的化合物與含131I，125I，123I，76Br，75Br，18F和19F的鹵化試劑反應的步驟，所述權利要求1的化合物中取代基R1-R7和R10-R39中的至少一個是三-烷基錫或三嗪。
5.一種用于體內成像淀粉樣蛋白沉淀的藥物組合物，該組合物包含(a)權利要求2的化合物，和(b)可藥用載體。
6.一種在被測試者體內檢測淀粉樣蛋白沉淀的方法，該方法包括下述步驟(a)使用可檢測量的權利要求5的組合物，和(b)檢測所述化合物與所述被測試者中淀粉樣蛋白沉淀的結合。
7.權利要求6的方法，其中的淀粉樣蛋白沉淀位于被測試者的腦組織。
8.權利要求6的方法，其中所述被檢測者疑患有選自阿爾茨海默氏癥、遺傳性阿爾茨海默氏癥、Down氏綜合癥和載脂蛋白E4等位基因同型接合者的疾病或綜合癥。
9.權利要求6的方法，所述檢測選自γ成像、磁共振成像和磁共振分光光譜法。
10.權利要求9的方法，其中所述γ成像是PET或SPECT。
11.權利要求7的方法，其中所述藥物組合物通過靜脈注射給藥。
12.權利要求7的方法，其中將所述被檢測者的(i)所述化合物與除小腦外的腦組織的結合與(ii)所述化合物與小腦的結合的比率與正常被檢測者的所述比率進行比較。
13.一種抑制與淀粉樣變性相關性疾病中的纖維形成有關的細胞變性和毒性的方法，所述方法包括向患有或疑患這類疾病者施用藥學有效量的柯胺G或其衍生物。
14.權利要求13的方法，其中所述的柯胺G衍生物是可與淀粉樣蛋白結合的式I化合物或其水溶性無毒鹽
是C≡C，CR’＝CR’，CR’2-CR’2，C≡C-C≡C，CR’＝CR’-CR’＝CR’，C≡C-CR’＝CR’或CR’2-CR’2-CR’2-CR’2(其中各個R’獨立地表示H或低級烷基)；X是C(R”)2(其中各個R”獨立地是H，F，Cl，Br，I，低級烷基，(CH2)nOR’，其中n＝1，2或3，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R’，N(R’)2，NO2，(C＝O)N(R’)2O(CO)R’，OR’，SR’，COOR’，Rph，CR’＝CR’-Rph，CR’2-CR’2-Rph(其中Rph表示未取代或取代的苯基，苯基的取代基可選自R”中定義的非苯基取代基，三-烷基錫，下式的四唑或噁二唑
其中R’是H或低級烷基)或者X是CR’＝CR’，N＝N，C＝O，O，NR’(其中R’表示H低級烷基)，S或SO2；R1和R2各自獨立地是H、F、Cl、Br、I、低級烷基、(CH2)nOR’，(其中n＝1，2或3)、CF3、CH2-CH2F、O-CH2-CH2F、CH2-CH2-CH2F、O-CH2-CH2-CH2F、CN、(C＝O)-R’、N(R’)2、NO2、(C＝O)N(R’)2O(CO)R’、OR’、SR’、COOR’、三-烷基錫，Rph、CR’＝CR’-Rph、CR’2-CR’2-Rph，其中Rph表示未取代或取代的苯基(苯基的取代基可選自R1和R2中定義的非苯基取代基)、下式的四唑或噁二唑
其中R’是H或低級烷基、或下式的三氮烯
(其中R8和R9是低級烷基)或者
各個Q獨立地選自下列的結構之一IA、IB、IC、ID、IE、IF和IG，其中IA具有下列結構
其中R3、R4、R5、R6或R7各自獨立地是如上R1所定義的；IB具有下列結構
其中R10、R11、R12、R13、R14、R15或R16各自獨立地是如上R1所定義的；IC具有下列結構
其中R17、R18、R19、R20或R21各自獨立地是如上R1所定義的；ID具有下列結構
其中R22、R23或R24各自獨立地是如上R1所定義的；和
表示下式的六個雜環之一
IE具有下列結構
其中R25、R26或R27各自獨立地是如上R1所定義的；和
表示下式的六個雜環之一
IF具有下列結構
其中R28、R29、R30、R31或R32中之一是如上式I中所定義的連接
并且R28、R29、R30、R31或R32彼此獨立地如上R1所定義；IG具有下列結構
其中R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39中之一是如上式I中所定義的連接
并且R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39彼此獨立地如上R1所定義。
15.權利要求13的方法，其中所述淀粉樣變性適應癥選自阿爾茨海默氏癥、Down氏綜合癥和II型糖尿病、遺傳性腦出血性淀粉樣變性(荷蘭人)、淀粉樣蛋白A(反應性)、繼發性淀粉樣變性、家族性地中海熱、伴隨蕁麻疹和聾啞的家族性淀粉性變性腎病(Muckle-wells綜合癥)、淀粉樣蛋白λL-鏈或淀粉樣蛋白κL-鏈(自發的、骨髓瘤或巨球蛋白血癥相關的)Aβ2M(長期血液透析)、ATTR(家族性淀粉樣蛋白多神經病)(葡萄牙人、日本人、瑞典人)、家族性淀粉樣蛋白心肌病(丹麥人)、單獨的心臟淀粉樣蛋白(系統性老年淀粉樣變性)、AIAPP或淀粉不溶素胰島瘤、心鈉素(單獨的心房淀粉樣變性)、procalcitonin(甲狀腺髓瘤)，凝溶膠蛋白(家族性淀粉樣變性(芬蘭人))、cystatin C(伴隨淀粉樣變性的遺傳性腦缺血(冰島人))、AApo-A-I(家族性淀粉樣變性多神經病(衣阿華州))、AApo-A-II(小鼠的加速敏感)、纖維蛋白原相關性淀粉樣蛋白；和Asor或PrP-27(瘙癢病，Creutzfeld Jacob病，Gertsmann-Straussler-Scheinker綜合癥，牛海綿狀腦炎)或載脂蛋白E4等位基因同型接合者，以及與載脂蛋白E4等位基因同型接合相關的適應癥。
16.一種防止與淀粉樣變性相關性適應癥中的纖維形成有關的細胞變性和毒性的藥物組合物，它含有權利要求1的柯胺G衍生物和可藥用載體。
17.一種檢測活組織檢查或死后的人或動物組織中的淀粉樣蛋白沉淀的方法，包括下述步驟(a)將用福爾馬林固定的組織與權利要求1化合物的溶液一起培養生成標記的沉淀，然后(b)檢測標記的沉淀。
18.權利要求17的方法，其中所述溶液由用權利要求1的化合物飽和的25～100％乙醇(其余為水)組成。
19.權利要求17的方法，其中所述檢測通過選自亮視野顯微鏡檢查、熒光顯微法、激光同焦點和交叉極化顯微法的顯微技術進行。
20.一種在活組織檢查和死后組織分析中定量淀粉樣蛋白的方法，該方法包括下列步驟a)將放射性標記的柯胺G衍生物與活組織檢查或死后組織的勻漿一起培養，b)將與組織結合了的放射性標記的柯胺G衍生物與未與組織結合的放射性標記的柯胺G衍生物分離，c)定量與組織結合的放射性標記的柯胺G衍生物，和d)通過與標準曲線進行比較，將與組織結合的放射性標記的柯胺G衍生物的單位轉化為每100mg組織中的淀粉樣蛋白的毫克單位。
21.權利要求20的方法，其中所述的放射性標記的柯胺G衍生物是可與淀粉樣蛋白結合的式I化合物或其水溶性無毒鹽
是C≡C，CR’＝CR’，CR’2-CR’2，C≡C-C≡C，CR’＝CR’-CR’＝CR’，C≡C-CR’＝CR’或CR’2-CR’2-CR’2-CR’2(其中各個R’獨立地表示H或低級烷基)；X是C(R”)2(其中各個R”獨立地是H，F，Cl，Br，I，低級烷基，(CH2)nOR’，其中n＝1，2或3，CF3，CH2-CH2F，O-CH2-CH2F，CH2-CH2-CH2F，O-CH2-CH2-CH2F，CN，(C＝O)-R’，N(R’)2，NO2，(C＝O)N(R’)2O(CO)R’，OR’，SR’，COOR’，Rph，CR’＝CR’-Rph，CR’2-CR’2-Rph(其中Rph表示未取代或取代的苯基，苯基的取代基可選自R”中定義的非苯基取代基，三-烷基錫，下式的四唑或噁二唑
其中R’是H或低級烷基)或者X是CR’＝CR’，N＝N，C＝O，O，NR’(其中R’表示H低級烷基)，S或SO2；R1和R2各自獨立地是H、F、Cl、Br、I、低級烷基、(CH2)nOR’(其中n＝1，2或3)、CF3、CH2-CH2F、O-CH2-CH2F、CH2-CH2-CH2F、O-CH2-CH2-CH2F、CN、(C＝O)-R’、N(R’)2、NO2、(C＝O)N(R’)2O(CO)R’、OR’、SR’、COOR’、三-烷基錫、Rph、CR’＝CR’-Rph、CR’2-CR’2-Rph，其中Rph表示未取代或取代的苯基(苯基的取代基可選自R1和R2中定義的非苯基取代基)、下式的四唑或噁二唑
其中R’是H或低級烷基、或下式的三氮烯
(其中R8和R9是低級烷基)或者
各個Q獨立地選自下列的結構之一IA、IB、IC、ID、IE、IF和IG，其中IA具有下列結構
其中R3、R4、R5、R6或R7各自獨立地是如上R1所定義的；IB具有下列結構
其中R10、R11、R12、R13、R14、R15或R16各自獨立地是如上R1所定義的；IC具有下列結構
其中R17、R18、R19、R20或R21各自獨立地是如上R1所定義的；ID具有下列結構
其中R22、R23或R24各自獨立地是如上R1所定義的；和
表示下式的六個雜環之一
IE具有下列結構
其中R25、R26或R27各自獨立地是如上R1所定義的；和
表示下式的六個雜環之一
IF具有下列結構
其中R28、R29、R30、R31或R32中之一是如上式I中所定義的連接
并且R28、R29、R30、R31或R32彼此獨立地如上R1所定義；IG具有下列結構
其中R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39中之一是如上式I中所定義的連接
并且R33、R34、R35、R36、R37、R38或R39彼此獨立地如上R1所定義。
22.權利要求21的方法，其中R1-R7和R10-R39中的至少一個是用選自125I、3H和在式I中說明的含碳取代基的放射性物標記的，所述含碳取代基中的至少一個碳是14C。
23.一種區別阿爾茨海默氏癥腦組織與正常腦組織的方法，包括下列步驟a)從正常者和疑患阿爾茨海默氏癥者的腦組織中獲取(i)小腦組織和(ii)同一大腦的除小腦外的另一區域的組織；b)將所述組織與放射性標記的柯胺G衍生物一起培養，以使所述組織與所述放射性標記的柯胺G衍生物結合；c)根據權利要求20的方法，定量與放射性標記的柯胺G衍生物結合的淀粉樣蛋白的量；d)計算非小腦的腦組織區域中淀粉樣蛋白的量與小腦中淀粉樣蛋白的量的比率；e)比較正常者的所述組織中淀粉樣蛋白的量的比率與疑患阿爾茨海默氏癥者的組織中淀粉樣蛋白的量的比率；f)如果疑患阿爾茨海默氏癥者腦組織的所述比率高于正常者腦組織得到的比率的90％，則確診為阿爾茨海默氏癥。
全文摘要
本文描述了可與淀粉樣蛋白結合的柯胺G的非偶氮衍生物化合物,含有這些化合物的藥物組合物以及使用這些化合物體內鑒別阿爾茨海默氏癥腦組織和診斷以淀粉樣變性為特征的其它病癥,例如Down氏綜合癥。還描述了含有柯胺G的非偶氮衍生物的藥物組合物和使用這些組合物在淀粉樣變性相關性適應癥中防止細胞變性和淀粉樣蛋白誘導的毒性的方法。還描述了在活組織檢查和死后組織樣品檢查中使用非偶氮類柯胺G衍生物染色或檢測淀粉樣蛋白沉淀的方法以及使用非偶氮柯胺G衍生物定量活組織檢查和死后組織的勻漿物中淀粉樣蛋白沉淀的方法。
文檔編號C07F7/24GK1261906SQ98806318
公開日2000年8月2日 申請日期1998年4月20日 優先權日1997年4月18日
發明者W·E·克倫克, J·W·佩特格魯, 小C·A·馬蒂斯 申請人:匹茲堡大學