促胃動(dòng)素同系物的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：促胃動(dòng)素同系物的制作方法
背景技術(shù)：
在胃腸環(huán)境中存在許多對(duì)維持營(yíng)養(yǎng)狀況的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要作用的調(diào)節(jié)肽。這些肽可在消化系統(tǒng)合成并在局部作用，但也可在大腦中鑒定到。此外，也有相反的情況，即肽雖合成于大腦，但卻調(diào)節(jié)胃腸道內(nèi)的細(xì)胞。這一現(xiàn)象被稱(chēng)為“腦腸軸”，它對(duì)發(fā)出飽腹信號(hào)、調(diào)節(jié)體溫及其它要求在大腦和消化道之間發(fā)生反饋的生理過(guò)程是重要的。
胃腸肽激素包括促胃液素、縮膽囊素(CCK)、促胰液素、促胃液素抑制肽(GIP)、血管活性腸肽(VIP)、促胃動(dòng)素、抑生長(zhǎng)素、胰多肽(PP)、P物質(zhì)和神經(jīng)肽Y(NPY)，它們以各種不同的機(jī)制進(jìn)行作用。例如，促胃液素、促胃動(dòng)素和縮膽囊素(CCK)是作為內(nèi)分泌和神經(jīng)分泌型激素起作用的。其它一些激素，諸如促胃液素和促胃液素抑制肽之類(lèi)，被認(rèn)為是完全以?xún)?nèi)分泌形式作用的。其它的作用方式包括內(nèi)分泌、神經(jīng)分泌和旁分泌作用的聯(lián)合(抑生長(zhǎng)素)、完全的神經(jīng)分泌作用(神經(jīng)肽Y)；及神經(jīng)分泌和旁分泌作用的聯(lián)合(血管活性腸肽和P物質(zhì))。大部分胃腸激素作用是由膜結(jié)合受體介導(dǎo)的，它們激活第二信使系統(tǒng)。有關(guān)胃腸肽的回顧可見(jiàn)以下文獻(xiàn)Muluihill等，在《基礎(chǔ)與臨床內(nèi)分泌學(xué)》中，pp.551-570，第四版，Greenspan F.S.和Baxter J.D.編.Appleton和LangeNowalk，康涅狄格，1994。
這些胃腸肽中的許多是以非活性前體分子形式合成的，它們需經(jīng)復(fù)雜的多重肽裂解而被激活。已知的“胰高血糖素-促胰液素”家族包括例如血管活性腸肽、促胃液素、促胰液素、促胃動(dòng)素、胰高血糖素和galanin等肽，它們就是通過(guò)復(fù)雜裂解和翻譯后修飾而被調(diào)節(jié)的肽的例子。
促胃動(dòng)素是存在于哺乳類(lèi)腸道組織中的一種22個(gè)氨基酸的肽(Domschke，W.，消化類(lèi)疾病，22(5)454-461，1977)。豬前促胃動(dòng)素原的DNA和氨基酸序列已被確定了(美國(guó)專(zhuān)利5,006,469)。促胃動(dòng)素已被認(rèn)為是能提高胃運(yùn)動(dòng)、通過(guò)刺激胃蛋白酶分泌而影響胃的分泌功能的一個(gè)因子(Brown等，加拿大生理學(xué)及藥學(xué)雜志(Canadian J.of Physid.Pharmacol.)，49399-405，1971)，最近有證據(jù)顯示，它還具有胃和小腸肌動(dòng)調(diào)節(jié)的作用。促胃動(dòng)素的循環(huán)系統(tǒng)濃度增加與消化中的肌電復(fù)合物第三階段及十二指腸的饑餓收縮相關(guān)(chey等，在《腸激素》中，Bloom，S.R.(編)，第355-358頁(yè)，Edinkurgh，churchitl Liuing stone，1978；Lee等人，美國(guó)消化類(lèi)疾病雜志(Am.J.Digestive Diseqses)，23789-795，1978；及Itoh等人，美國(guó)消化類(lèi)疾病雜志，23929-935，1978)?，F(xiàn)已證明促胃動(dòng)素及其同系物會(huì)引起胃腸平滑肌的收縮，但不會(huì)引起其它類(lèi)型平滑肌細(xì)胞收縮(Strunz等，胃腸病學(xué)，68卷；1485-1491頁(yè)，1975)。
本發(fā)明涉及與促胃動(dòng)素具同源性的一種新分泌蛋白，已發(fā)現(xiàn)它在胃腸系統(tǒng)中得到轉(zhuǎn)錄。這一新肽的發(fā)現(xiàn)對(duì)于進(jìn)一步闡明機(jī)體如何維持其營(yíng)養(yǎng)狀況的內(nèi)環(huán)境平衡有重要意義，對(duì)于開(kāi)發(fā)一些治療方法以干預(yù)那些過(guò)程，以及根據(jù)本文教導(dǎo)而很顯而易見(jiàn)的其它一些用途也很重要。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了編碼多肽的分離的多核苷酸分子，其選自(a)包含SEQ ID NO1所示70位至111位核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)和(b)的正同系物(ortholog)；和(d)(a)、(b)或者(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了選自下組的分離的多肽(a)包含SEQ IDNO2所示24位至37位殘基的氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或者(b)的正同系物。
另一方面，本發(fā)明提供了含有下列可操作性地連接在一起的元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；選自下組的DNA片段(a)包含SEQ ID NO1所示70位至111位核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或者(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列；及轉(zhuǎn)錄終止子。
另一方面，本發(fā)明提供了已導(dǎo)入表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含下列可操作性地連接在一起的元件轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；選自下組的DNA片段包含SEQ ID NO1所示70位至111位核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或者(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列；及轉(zhuǎn)錄終止子，其中所述細(xì)胞表達(dá)該DNA片段所編碼的多肽。
另一方面，本發(fā)明提供了含有與藥學(xué)上可接受載體組合的、選自下組的純化多肽的藥物組合物(a)包含SEQ ID NO2所示24位至37位殘基的氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或者(b)的正同系物。
另一方面，本發(fā)明提供了可與選自下組之多肽的表位結(jié)合的抗體(a)包含SEQ ID NO2所示24位至117位殘基的氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或者(b)的正同系物。
另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)zsig33多肽的方法，包括培養(yǎng)已導(dǎo)入了表達(dá)載體的細(xì)胞，該表達(dá)載體包含下列可操作性地連接在一起的元件轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；選自下組的DNA片段包含SEQ ID NO1所示70位至111位核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或者(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列；及轉(zhuǎn)錄終止子，其中所述細(xì)胞表達(dá)該DNA片段所編碼的多肽；和回收該多肽。
另一方面，本發(fā)明提供了刺激胃活動(dòng)的方法，包括給有此需要的哺乳動(dòng)物施用于藥學(xué)上可接受載體中的、含有選自下組之分離多肽的組合物(a)包含SEQ ID NO2所示24位至37位殘基的氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或者(b)的正同系物；其施用量足以提高攝入物質(zhì)的運(yùn)送時(shí)間(transit time)或者胃排空(gastric emptying)。
發(fā)明詳述在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，有必要確定本文所用的某些術(shù)語(yǔ)。
術(shù)語(yǔ)“正同系物”(ortholog)表示從一個(gè)種獲得的多肽或蛋白質(zhì)，它是不同種來(lái)源的多肽或蛋白質(zhì)的功能性對(duì)應(yīng)物。正同系物間的序列差異是物種化的結(jié)果。
術(shù)語(yǔ)“副同系物”(paralog)表示由一種生物體生成的截然不同、但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)。人們認(rèn)為副同系物源于基因的重復(fù)。例如，α-球蛋白、β-球蛋白和肌球蛋白相互之間是副同系物。
術(shù)語(yǔ)“等位變體”表示占據(jù)相同染色體位點(diǎn)的基因的兩種或多種可互換形式的任一種。等位變體通過(guò)突變自然產(chǎn)生，可在種群內(nèi)導(dǎo)致表型多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽中沒(méi)有變化)，或可編碼含有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語(yǔ)等位變體此處也用于表示由基因的等位變體編碼的蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”表示包含編碼目的多肽的區(qū)段與提供其轉(zhuǎn)錄的其它區(qū)段可操作連接的線性或環(huán)狀DNA分子。這樣的其它區(qū)段可以包括啟動(dòng)子和終止子序列，并且可以選擇性包括一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記、增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)等。表達(dá)載體一般起源于質(zhì)?；虿《綝NA，或可以含有兩者的元件。
術(shù)語(yǔ)“分離的”，當(dāng)用于多核苷酸分子時(shí)，表示多核苷酸已從其天然的遺傳環(huán)境中取出、因而不含有其它額外或不需要的編碼序列，并且是適合于基因工程蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中使用的形式。這類(lèi)分離分子是那些與其天然環(huán)境分開(kāi)的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離DNA分子不含有正常與它們相關(guān)的其它基因，但可能包含天然存在的5′和3′非翻譯區(qū)，如啟動(dòng)子和終止子。相關(guān)區(qū)域的鑒定對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的(見(jiàn)例如Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。當(dāng)用于蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”表示發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)處于非其天然環(huán)境的狀態(tài)，如與血液和動(dòng)物組織分開(kāi)。優(yōu)選地，分離蛋白質(zhì)基本上不含其它蛋白質(zhì)，尤其是不含動(dòng)物來(lái)源的其它蛋白質(zhì)。優(yōu)選提供高度純化形式的蛋白質(zhì)，即大于95％純，更優(yōu)選地大于99％純。
術(shù)語(yǔ)“可操作性地連接在一起的”當(dāng)用于DNA區(qū)段時(shí)表示諸區(qū)段的排列方式能使它們發(fā)揮預(yù)期的功能，如在啟動(dòng)子內(nèi)起始轉(zhuǎn)錄，并延伸通過(guò)編碼區(qū)段至終止子。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指從5′末端讀至3′末端的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈和雙鏈多聚體。多核苷酸包括RNA和DNA，可以從天然來(lái)源中分離、體外合成或從天然和合成分子的組合制備。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸分子的互補(bǔ)物”表示與參照序列相比具有互補(bǔ)堿基序列并且方向相反的多核苷酸分子。如序列5′ATGCACGGG 3′與5′CCCGTGCAT 3′互補(bǔ)。
術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)并核苷酸序列”表示包含一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并密碼子(與編碼多肽的參照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。簡(jiǎn)并密碼子含有不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(即GAU和GAC三聯(lián)體都編碼Asp)。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”表示含有提供RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列的基因部分。啟動(dòng)子序列一般，但并不總是，位于基因的5′非編碼區(qū)。
術(shù)語(yǔ)“分泌信號(hào)序列”表示編碼作為更大多肽的組成部分而指導(dǎo)該更大多肽通過(guò)合成此多肽的細(xì)胞的分泌通路的多肽(“分泌肽”)的DNA序列。在通過(guò)分泌通路傳遞的過(guò)程中通常對(duì)該更大多肽進(jìn)行切割以除去分泌肽。
術(shù)語(yǔ)“受體”表示與生物活性分子(即配體)結(jié)合并在細(xì)胞上介導(dǎo)配體效應(yīng)的細(xì)胞相關(guān)蛋白。膜結(jié)合受體的特征在于多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一般參與信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域。配體和受體結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象改變，引起效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)其它分子間的相互作用。此相互作用繼而引起細(xì)胞代謝的變化。和受體-配體相互作用相關(guān)的代謝事件包括基因轉(zhuǎn)錄、磷酸化作用、去磷酸化作用、環(huán)AMP合成的增加、細(xì)胞鈣的遷移、膜脂的遷移、細(xì)胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。大多數(shù)核受體也表現(xiàn)為多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，包括氨基末端、反式激活結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一般情況下，受體可以是膜結(jié)合的、細(xì)胞質(zhì)或核的；單體的(如促甲狀腺激素受體、β-腎上腺素能受體)或多聚體的(如PIGF受體、生長(zhǎng)激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、促紅細(xì)胞生成素受體和IL-6受體。
術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對(duì)”表示在適宜條件下形成非共價(jià)結(jié)合的穩(wěn)定對(duì)的非相同組分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白鏈霉素)是互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對(duì)的典型成員。其它典型互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對(duì)包括受體/配體對(duì)、抗體/抗原(或半抗原或表位)對(duì)、有義/反義多核苷酸對(duì)等。在需要互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對(duì)隨后解離的地方，互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對(duì)優(yōu)選地具有小于109M-1的結(jié)合親和力。
此處所引用的全部文獻(xiàn)均全文引入作為參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明部分上是以一新的ADNA序列的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的，此DNA序列編碼與促胃動(dòng)素具同源性的新型分泌多肽，與它最近的同系物是豬促胃動(dòng)素(見(jiàn)SEQ ID NO3和4)。促胃動(dòng)素是調(diào)節(jié)胃腸生理的多肽家族中的一員。此多肽家族對(duì)胃腸調(diào)節(jié)非常重要，除促胃動(dòng)素外，還包括胰高血糖素、促胃液素、galanin和血管活性腸肽(VIP)。這些多肽均以前體形式合成，需多重步驟才可加工成活性形式。與本發(fā)明多肽特別相關(guān)的是促胃動(dòng)素、血管活性腸肽(VIP)和galanin，它們的加工包括信號(hào)肽的去除，隨后將一個(gè)或多個(gè)附屬多肽斷裂下來(lái)，從而釋放出活性肽。產(chǎn)生的活性肽通常較小(10-30個(gè)氨基酸長(zhǎng))，且可能還需進(jìn)一步的翻譯后修飾，諸如酰胺化、硫酸化或谷氨酸殘基的吡咯烷羧酸(pyrrolidan carbonylic acid)化修飾。
對(duì)相應(yīng)于此新DNA的mRNA的組織分布進(jìn)行分析顯示，它在胃內(nèi)表達(dá)最高，其次是小腸和胰臟，它們的表達(dá)比較明顯，但表達(dá)水平有所降低。EST也存在于肺cDNA文庫(kù)中。此多肽已被稱(chēng)為zsig33。
通過(guò)在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)具推測(cè)的分泌信號(hào)的序列，對(duì)本發(fā)明的新zsig33多核苷酸和多肽進(jìn)行了初步鑒定。發(fā)現(xiàn)有一個(gè)EST序列，預(yù)計(jì)它與促胃動(dòng)素家族相關(guān)。此EST序列來(lái)源于胎兒胰臟文庫(kù)。
由全長(zhǎng)cDNA編碼的新多肽含117個(gè)氨基酸。預(yù)計(jì)的信號(hào)肽序列有23個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO2的氨基酸殘基1至23)。活性肽預(yù)計(jì)為16個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)(SEQ ID NO2的氨基酸殘基24至41)，還有一個(gè)位于SEQ ID NO2之41位氨基酸(Ser)之后的C-末端切割位點(diǎn)。然而，許多胃腸-腦肽要求多重裂解。例如，前促胃液素肽含101個(gè)氨基酸，它在N-末端斷裂，產(chǎn)生相繼較小的肽(G34，G17和G14)(Sugano等，生物化學(xué)雜志，26011724-11729，1985)。其它需要多重加工步驟的多肽包括胰高血糖素，它的C-末端斷裂產(chǎn)生了類(lèi)胰高血糖素肽1和類(lèi)胰高血糖素肽2，還有g(shù)alanin，其中的加工包括已知為GMAP的C-末端肽的裂解。因此，合成出基于SEQ ID NO2的37位氨基酸(Gln)之后斷裂點(diǎn)的附加肽，得到一具生物活性的14氨基酸肽(從SEQ IN NO2的氨基酸殘基24(甘氨酸)至氨基酸殘基37(谷氨酰胺))。
C-末端肽(SEQ IN NO2的氨基酸42至117)也可能具有某些專(zhuān)門(mén)的活性。促胃動(dòng)素活性肽的加工(見(jiàn)SEQ ID NO4)導(dǎo)致釋放出一具70個(gè)氨基酸長(zhǎng)〔即氨基酸殘基50(絲氨酸)至氨基酸殘基119(賴(lài)氨酸)〕的C-末端肽，已知為促胃動(dòng)素相關(guān)肽(MAP)。Adelman等人(美國(guó)專(zhuān)利5006469)曾假設(shè)MAP在消化、食欲及營(yíng)養(yǎng)物攝入的調(diào)節(jié)中擔(dān)負(fù)著一定的作用。
多肽zsig33中高度保守的氨基酸可用作鑒定新家族成員的工具。例如，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)可用于從RNA擴(kuò)增編碼保守基元的保守區(qū)，此RNA可為各種組織來(lái)源的。用來(lái)自本發(fā)明的序列已鑒定了兩個(gè)這樣的保守結(jié)構(gòu)域。第一個(gè)結(jié)構(gòu)域位于SEQ ID NO2的氨基酸殘基31至36，其中鑒定出的基元是Glu X Gln Arg X Gln，其中的X可為任何氨基酸殘基(見(jiàn)SEQ ID NO5)，而第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是SEQ ID NO2中的氨基酸殘基78至84，其中鑒定出的基元是Ala Pro X Asp X GlyIle，其中的X可為任何氨基酸殘基(見(jiàn)SEQ ID NO6中)。特別是，按這些序列設(shè)計(jì)的高度簡(jiǎn)并性引物可用于此目的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，編碼SEQ ID NO2的這些多核苷酸分子中可以存在相當(dāng)多的序列變異，包括所有由U替代T的RNA序列。這樣，本發(fā)明還包括編碼zsig33多肽的多聚核苷酸及它們的RNA等價(jià)物。表一所示單字母密碼用于指示簡(jiǎn)并性核苷酸位置?！敖馕觥笔怯梢粋€(gè)單字母密碼指示的核苷酸?！盎パa(bǔ)”指示互補(bǔ)核苷酸的密碼。例如，密碼Y指C或T，而它的互補(bǔ)物R指A或G，A與T互補(bǔ)，G與C互補(bǔ)。表1核苷酸解析核苷酸互補(bǔ)物AA TTCC GGGG CCTT AAR A|GY C|TY C|TR A|GM A|CK G|TK G|TM A|CS C|GS C|GW A|TW A|TH A|C|T D A|G|TB C|G|T V A|C|GV A|C|G B C|G|TD A|G|T H A|C|TN A|C|G|T N A|C|G|T在下面表2中列出了包括對(duì)于給定氨基酸的所有可能的密碼子。
表2氨基酸單字母 密碼子 簡(jiǎn)并密碼子密碼子CysC TGC TGT TGYSerS AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSNThrT ACA ACC ACG ACT ACNProP CCA CCC CCG CCT CCNAlaA GCA GCC GCG GCT GCNGlyG GGA GGC GGG GGT GGNAsnN AAC AAT AAYAspD GAC GAT GAYGluE GAA GAG GARGlnQ CAA CAG CARHisH CAC CAT CAYArgR AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGNLysK AAA AAG AARMetM ATG ATGIleI ATA ATC ATT ATHLeuL CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTNValV GTA GTC GTG GTT GTNPheF TTC TTT TTYTyrY TAC TAT TAYTrpW TGG TGGTer TAA TAG TGA TRRAsn|Asp BRAYGlu|Gln ZSARAnyXNNN
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解在確定簡(jiǎn)并密碼子，代表編碼每一氨基酸的所有可能密碼子時(shí)引入的某些錯(cuò)讀。例如，絲氨酸(WSN)的簡(jiǎn)并密碼子在某些情況下可編碼精氨酸(AGR)，精氨酸(MGN)的簡(jiǎn)并密碼子在某些情況下可編碼絲氨酸(AGY)。相似的關(guān)系在編碼苯丙氨酸和亮氨酸的密碼之間也存在。因此，簡(jiǎn)并序列所包含的某些多核苷酸可能編碼變體氨基酸序列，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參考SEQ ID NO2的氨基酸序列可以容易地鑒定這種變體序列。根據(jù)本文所述，可以很容易檢測(cè)變體序列的功能活性。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQID NO1中相似大小的區(qū)域或與其互補(bǔ)的序列可雜交。一般來(lái)說(shuō)，嚴(yán)謹(jǐn)條件選擇為比該具體序列在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5℃。Tm是50％的靶序列和完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下)。典型的嚴(yán)謹(jǐn)條件是pH7時(shí)鹽濃度是至少約0.02M，并且溫度是至少約60℃。
如前面所指出，本發(fā)明的分離的多核苷酸包括DNA和RNA。分離DNA和RNA的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。一般優(yōu)選從胃組織中分離RNA，盡管使用來(lái)自其它組織的RNA或分離基因組DNA也可以制備DNA。使用鹽酸胍抽提，接著通過(guò)CsCl梯度離心分離，可以制備總RNA(Chirgwin等，生物化學(xué)，1852-94，1979)。使用Aviv和Leder的方法(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，691408-1412，1972)，從總RNA制備poly(A)+RNA。使用已知的方法從poly(A)+RNA制備互補(bǔ)DNA(cDNA)。然后通過(guò)例如雜交或PCR，鑒定和分離出編碼zsig33多肽的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供來(lái)自其它物種的多肽和多核苷酸對(duì)應(yīng)物(正同系物)。尤其感興趣的是來(lái)自其它哺乳類(lèi)的zsig33多肽，包括小鼠、大鼠、豬、羊、牛、狗、貓、馬和其它靈長(zhǎng)類(lèi)蛋白。利用本發(fā)明提供的信息和組合物，結(jié)合常規(guī)克隆技術(shù)，可以克隆人蛋白質(zhì)的正同系物。例如，使用從表達(dá)此蛋白質(zhì)的組織或細(xì)胞類(lèi)型獲得的mRNA，可以克隆cDNA。通過(guò)用從此處公開(kāi)的序列設(shè)計(jì)的探針探查Northern印跡，可以鑒定mRNA的適當(dāng)來(lái)源。然后從陽(yáng)性組織或細(xì)胞系的mRNA制備文庫(kù)。然后，可以通過(guò)一系列方法，如用完整或部分人cDNA或用基于公開(kāi)序列的一套或多套簡(jiǎn)并探針探查，來(lái)分離編碼zsig33正同系物的cDNA。用從此處公開(kāi)的序列設(shè)計(jì)的引物，使用聚合酶鏈反應(yīng)或PCR(Mullis，美國(guó)專(zhuān)利4 683 202)也可以克隆cDNA。在其它方法中，可以使用cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，用抗zsig33的抗體檢測(cè)目的cDNA的表達(dá)。相似的技術(shù)也可以應(yīng)用于基因組克隆的分離。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，SEQ ID NO1所公開(kāi)的序列及其編碼的多肽代表的是人zsig33基因和多肽的單一等位形式，預(yù)期會(huì)發(fā)生等位變體和其它的剪接。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法探查來(lái)自不同個(gè)體的cDNA或基因組文庫(kù)，可以克隆等位變體。顯示于SEQ ID NO1的DNA序列的等位變體，包括那些含有沉默突變的變體和那些突變導(dǎo)致氨基酸序列變化的變體，都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，SEQ ID NO2的等位變體的蛋白質(zhì)也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明也提供了與SEQ ID NO2的多肽及它們的正同系物基本上同源的分離的zsig33多肽。術(shù)語(yǔ)“基本上同源”此處用于表示與SEQID NO2所示序列或它們的Ortholog有50％、優(yōu)選60％、更優(yōu)選至少80％序列相同的多肽。這樣的多肽與SEQ ID NO2或其Ortholog將更優(yōu)選至少90％相同，并且最優(yōu)選95％或更多的相同。通過(guò)傳統(tǒng)的方法確定序列相同百分率。見(jiàn)例如Altschul等，Bull.Math.Bio.，48603-616，1986和Henikoff和Henikoff，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，8910915-10919，1992。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用缺口開(kāi)放補(bǔ)償(gap opening penalty)為10、缺口延伸補(bǔ)償(gap extension penalty)為1，以及表3所示Henikoff和Henikoff(出處同前)的“blosum 62”評(píng)分矩陣(用標(biāo)準(zhǔn)單字母符號(hào)表示氨基酸)，對(duì)兩個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，以使序列匹配最優(yōu)化。
表3A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 4R-1 5N-2 0 6D-2 -2 1 6C 0 -3 -3 -3 9Q-1 1 0 0 -3 5E-1 0 0 2 -4 2 5G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6H-2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8I-1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L-1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K-1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M-1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F-2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P-1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W-3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y-2 -2 -2 -3 -2 -1- 2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4然后按以下公式計(jì)算相同百分率
使用上述比率用相似方法測(cè)定多核苷酸分子的序列相同性。
基本上同源的蛋白和多肽以一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、刪除或添加為特征。優(yōu)選這些改變的影響較小，即是保守氨基酸置換(見(jiàn)表4)和不會(huì)顯著影響蛋白或多肽的折疊或活性的其它置換；小的刪除，一般1至約30個(gè)氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基、長(zhǎng)達(dá)約20-25個(gè)殘基的小接頭肽或有助于純化的小延伸(親和標(biāo)簽)如多組氨酸臂、蛋白質(zhì)A(Nilsson等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志，41075，1985；Nilsson等，酶學(xué)方法1983，1991)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Smith和Jahnson，基因，6731，1988)、麥芽糖結(jié)合蛋白(Kellerman和Ferenci，酶學(xué)方法，90459-463，1982；Guan等，基因6721-30，1987)，硫氧還蛋白，遍在蛋白，纖維素結(jié)合蛋白，T7聚合酶或其它抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。見(jiàn)Ford等，蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化，295-107，1991，在此引用作為參考。編碼親和標(biāo)簽的DNA可以從商業(yè)供應(yīng)商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，M(A)獲得。
表4保守的氨基酸替換堿性氨基酸 精氨酸賴(lài)氨酸組氨酸酸性氨基酸 谷氨酸天冬氨酸極性氨基酸 谷氨酰胺天冬酰胺疏水氨基酸 亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族氨基酸 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小氨基酸 甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸除了20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之外，還可以用非標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸(如4-羥基脯氨酸、6-N-甲基賴(lài)氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)取代zsig33內(nèi)的氨基酸殘基?？梢杂糜邢迶?shù)目的非保守氨基酸、不由遺傳密碼子編碼的氨基酸及非天然氨基酸取代zsig33的氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質(zhì)合成后已被修飾，和/或其側(cè)鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。非天然氨基酸可化學(xué)合成，或者優(yōu)選地商業(yè)購(gòu)得，它們包括2-哌啶酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，以及3，3-二甲基脯氨酸。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變，鑒定出本發(fā)明zsig33多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells，科學(xué)，2441081-1085，1989)。在后一種技術(shù)中，在分子的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變，并檢測(cè)生成的突變分子的生物學(xué)活性(如對(duì)胃腸細(xì)胞收縮的刺激作用，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物攝入的調(diào)節(jié)作用，和/或消化酶的分泌)，以鑒定對(duì)分子活性比較關(guān)鍵的氨基酸殘基。也見(jiàn)Hilton等，生物化學(xué)雜志，2714699-4708，1996。通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理學(xué)分析，如通過(guò)諸如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記之類(lèi)技術(shù)，并結(jié)合推測(cè)的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變，也可以出鑒定配體-受體相互作用位點(diǎn)。見(jiàn)例如de Vos等，科學(xué)，255306-312，1992；Smith等，分子生物學(xué)雜志224899-904，1992；Wlodaver等，F(xiàn)EBS Lett.30959-64，1992。也可以通過(guò)與胃腸-腦肽激素的胰高血糖素-促胰液素家族的相關(guān)成員一起進(jìn)行同源性分析，推定出必需氨基酸的位置。
用已知的誘變和篩選方法，如那些由Reidhaar-Olson和Sauer(科學(xué)，24153-57，1988)或Bowie和Sauer(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，862152-2156，1989)所公開(kāi)的方法，可以制備和檢測(cè)多個(gè)氨基酸的替換。簡(jiǎn)要地說(shuō)，這些作者公開(kāi)的方法中，使多肽上的兩個(gè)或多個(gè)位置同時(shí)隨機(jī)化，并選擇有功能的多肽，再對(duì)誘變的多肽測(cè)序，以確定每個(gè)位置允許被置換的范圍?？梢允褂玫钠渌椒òㄊ删w展示(如Lowman等，生物化學(xué)3010832-10837，1991；Ladner等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5223409；Huse，WIPO公開(kāi)WO 92/06204)和定區(qū)域誘變(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA，7127，1988)。
如上面所公開(kāi)的誘變方法可以和高效率的自動(dòng)篩選方法結(jié)合，以在宿主細(xì)胞中檢測(cè)克隆的誘變多肽的活性?？梢詮乃拗骷?xì)胞中回收編碼活性多肽(如刺激胃腸細(xì)胞收縮、調(diào)整營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入和/或分泌消化酶)的誘變DNA分子，并用現(xiàn)代儀器快速測(cè)序。這些方法允許目的多肽中單個(gè)氨基酸重要性的快速測(cè)定，并可以應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
使用上面討論的方法，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以鑒定和/或制備與SEQ ID NO2的24位至37位殘基或其等位變體基本上同源、并保持了野生型蛋白質(zhì)性質(zhì)的許多多肽。這些多肽也可以包括如上充分公開(kāi)的其它多肽片段。
本發(fā)明的多肽，包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)及其片段，可以根據(jù)傳統(tǒng)技術(shù)在遺傳工程化宿主細(xì)胞中合成。合適的宿主細(xì)胞是可以用外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并在培養(yǎng)中生長(zhǎng)的那些細(xì)胞類(lèi)型，包括細(xì)菌、真菌細(xì)胞和培養(yǎng)的高等真核細(xì)胞。優(yōu)選真核細(xì)胞，尤其是多細(xì)胞生物的培養(yǎng)細(xì)胞。操作克隆的DNA分子和將外源DNA引入許多宿主細(xì)胞的技術(shù)由Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989和Ausubel等(編輯)，分子生物學(xué)常用方法，John Wiley和Sons，Inc.，紐約，1987公開(kāi)，這些出版物在此引用作為參考。
總的來(lái)說(shuō)，在表達(dá)載體內(nèi)，編碼本發(fā)明的zsig33多肽的DNA序列與其表達(dá)所需的其它基因元件(一般包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子)可操作地連接在一起。載體一般也含有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記及一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在某些系統(tǒng)內(nèi)也可以在分開(kāi)的載體上提供選標(biāo)記，并且可以通過(guò)整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中而提供外源DNA的復(fù)制。啟動(dòng)子、終止子、選擇性標(biāo)記、載體和其它元件的選擇是本領(lǐng)域普通技術(shù)水平內(nèi)的常規(guī)設(shè)計(jì)。許多這樣的元件在文獻(xiàn)中得到描述并可通過(guò)商業(yè)供應(yīng)商得到。
為了將zsig33多肽導(dǎo)入宿主細(xì)胞分泌途徑，可在表達(dá)載體中提供分泌信號(hào)序列(也已知為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。分泌信號(hào)序列可以是zsig33多肽自身的序列，或者來(lái)自另一分泌蛋白(如t-PA)，或是從頭合成的。分泌信號(hào)序列以正確的閱讀框架與zsig33 DNA序列連接。分泌信號(hào)序列一般置于編碼目的多肽的DNA序列的5′端，盡管某些信號(hào)序列可以置于目的DNA序列內(nèi)的別處(見(jiàn)如Welch等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,037,743；Holland等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,143,830)。
在本發(fā)明內(nèi)，培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞也是優(yōu)選的宿主。將外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，細(xì)胞，14725，1978；Corsaro和Pearson，體細(xì)胞遺傳學(xué)，7603，1981；Graham和Van der Eb，病毒學(xué)，52456，1973)、電穿孔(Neumann等，歐洲分子生物學(xué)雜志，1841-845，1982)，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel等編輯，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，John Wiley和Sons，Inc.，紐約，1987)，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Hawley-Nelson等，焦點(diǎn)，1573，1993；Ciccarone等，焦點(diǎn)，1580，1993)，以及利用病毒載體(A.Miller和G.Rosman，生物技術(shù)7980-90，1989；Q.Wang和M.Finer，自然醫(yī)學(xué)(Nature Med.)2714-16，1996)，此處引用作為參考。在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組多肽的合成公開(kāi)于Levinson等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4713339；Hagen等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4784 950；Palmiter等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4579821；和Ringold，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4656134，此處引用作為參考。優(yōu)選的培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括COS-1(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)CRL 1650)、COS-7(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)CRL 1651)、BHK570(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)CRL 10314)、293(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)CRL 1573；Graham等，普通病毒學(xué)雜志，3659-72，1977)和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系(如CHO-K1，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)CRL 61)。其余合適的細(xì)胞系在本領(lǐng)域內(nèi)公知，并可以從公共保藏處如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland獲得。一般優(yōu)選強(qiáng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，例如來(lái)自SV-40或巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子。見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4956288。其它合適的啟動(dòng)子包括那些來(lái)自金屬硫蛋白基因(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4579821和4601978，此處引用作為參考)的啟動(dòng)子以及腺病毒主要晚期啟動(dòng)子。
一般使用藥物選擇來(lái)選擇已插入外源DNA的培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些細(xì)胞通常稱(chēng)作“轉(zhuǎn)染子”。在選擇性藥物存在時(shí)培養(yǎng)的并能夠?qū)⒛康幕騻鬟f給其子代的細(xì)胞稱(chēng)為“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子”。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記是編碼對(duì)抗生素新霉素抗性的基因。在新霉素型藥物如G-418等存在時(shí)進(jìn)行選擇。選擇系統(tǒng)也可以用于增加目的基因的表達(dá)水平，稱(chēng)之為“擴(kuò)增”的過(guò)程。通過(guò)在低水平選擇藥物存在時(shí)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子，然后增加選擇性藥物的量以選擇合成高水平導(dǎo)入基因產(chǎn)物的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。優(yōu)選的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記是賦于對(duì)氨甲蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶。也可以使用其它藥物抗性基因(如潮霉素抗性、多藥抗性、嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)?？梢岳媚軐?dǎo)入改變表型的其它標(biāo)記，如綠色熒光蛋白，或者細(xì)胞表面蛋白，例如CD4、CD8、I類(lèi)MHC、胎盤(pán)堿性磷酸酶，通過(guò)諸如FACS分揀術(shù)或磁珠分離術(shù)，從未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中選出已轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
也可以使用其它更高等的真核細(xì)胞作為宿主，包括昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞。發(fā)根農(nóng)桿菌作為在植物細(xì)胞中表達(dá)基因的載體已在Sinkar等，生物科學(xué)雜志(Bangalore)，1147-58，1987中綜述。昆蟲(chóng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及外源蛋白的產(chǎn)生可見(jiàn)于Guarino等人的美國(guó)專(zhuān)利NO.5,162,222和WIPO出版物WO 94/06463中?？捎猛ǔ?lái)自苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞。用以下兩種方法之一將編碼zsig33多肽的DNA插入桿狀病毒基因組中，代替AcNPV多角體蛋白編碼序列。第一種方法是傳統(tǒng)的方法，即在野生型AcNPV和含有側(cè)翼為AcNPV序列的zsig33的轉(zhuǎn)移載體之間進(jìn)行同源DNA重組。用野生型AcNPV感染合適的昆蟲(chóng)細(xì)胞，如SF9細(xì)胞，并用含有zsig33多核苷酸的轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所說(shuō)的zsig33多核苷酸可操作性地與AcNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子、終止子及側(cè)翼序列連接。參閱King，L.A.和Possee，R.D.，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)手冊(cè)，倫敦，Chapman和Hall；O’Reilly，D.R.等人，桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，紐約，牛津大學(xué)出版社，1944；和Richardson，C.D.(編)桿狀病毒表達(dá)手冊(cè)，分子生物學(xué)方法，Totowa，NJ，人類(lèi)出版社，1995。昆蟲(chóng)細(xì)胞中的天然重組將產(chǎn)生含有由多角體蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的zsig33的重組桿狀病毒。按本領(lǐng)域中的常用方法制備重組病毒貯液。
第二種制備重組桿狀病毒的方法中利用了Luckow(Luckow，V.A，等人，病毒學(xué)雜志(J Virot)674566-79，1993)所描述的基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)。此系統(tǒng)在Bac-to-Bac試劑盒(Life Technologies，Rockvitle，MD)中有售。該系統(tǒng)利用了一種轉(zhuǎn)移載體-pFastBaclTM(生命技術(shù)公司)，它含一個(gè)Tn7轉(zhuǎn)座子，可將編碼zsig33多肽的DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入桿狀病毒基因組，此桿狀病毒基因組如同一大質(zhì)粒保留在大腸桿菌中，稱(chēng)“桿粒”。pFastBaclTM轉(zhuǎn)移載體利用AcNPV多角體蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因(在本例中即為zsig33)的表達(dá)。然而，可對(duì)pFastBaclTM進(jìn)行相當(dāng)程度的修飾。可去除多角體蛋白啟動(dòng)子，而代之以桿狀病毒堿性蛋白啟動(dòng)子(也稱(chēng)Pcor，p6.9或MP啟動(dòng)子)，后者在桿狀病毒感染中表達(dá)得較早，且已顯示出對(duì)表達(dá)分泌蛋白較為有利。參閱Hill-Perkins，M.S.和Possee，R.D.，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)71971-6，1990；Bonning，B.C.等人，普通病毒學(xué)雜志，751551-6，1994；和Chazenbalk，G.D.，和Rapoport，B.，生物化學(xué)雜志2701543-9，1995。在這樣的轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建體中，可使用長(zhǎng)或短形式的堿性蛋白啟動(dòng)子。此外，轉(zhuǎn)移載體可構(gòu)建成其中用昆蟲(chóng)蛋白的分泌信號(hào)序列取代天然zsig33分泌信號(hào)序列的形式。例如，可以在構(gòu)建體中使用蛻皮類(lèi)固醇葡糖基轉(zhuǎn)移酶(EGT)、密蜂蜂毒素(Invitrogen，Carlsbad，CA)或桿狀病毒gp67(PharMingen，圣地哥，C(A)的分泌信號(hào)序列取代天然zsig33分泌信號(hào)序列。此外，轉(zhuǎn)移載體還可包括一融合于框架內(nèi)的DNA，此DNA編碼一表位標(biāo)記，位于所表達(dá)的zsig33多肽C-或N-末端，例如Glu-Glu表位標(biāo)記(Grussenmeyer，T.等，Proc Natl Acad Sci.827952-4，1985)。用本領(lǐng)域已知技術(shù)，將含zsig33的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，然后篩選其中含被打斷的LacZ基因、指示是重組桿狀病毒的桿粒。用常規(guī)技術(shù)分離含重組桿狀病毒基因組的桿粒DNA，并用于轉(zhuǎn)染秋粘蟲(chóng)細(xì)胞，如Sf9細(xì)胞。隨后得到表達(dá)zsig33的重組病毒。用本領(lǐng)域常用制備重組病毒貯液。
利用重組病毒感染宿主細(xì)胞，通常是來(lái)自秋粘蟲(chóng)-草地貪夜蛾的細(xì)胞系。通常參閱Glick和Pasternak，分子生物技術(shù)重組DNA的原理及應(yīng)用，ASM出版社，華盛頓特區(qū)，1994。另一合適的細(xì)胞系是來(lái)自粉紋夜蛾(美國(guó)專(zhuān)利#5,300,435)的High FiveOTM細(xì)胞系(Invitrogen)。利用市售無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)和維持細(xì)胞。對(duì)Sf9細(xì)胞來(lái)說(shuō)，適合的培養(yǎng)基是Sf900IITM(Life Technotogies)或ESF 921TM(表達(dá)系統(tǒng))，對(duì)粉紋夜蛾細(xì)胞來(lái)說(shuō)，則為Ex-cell O405TM(JRH Bioscrences，Lenexa，KS)或Gxpress FiveOTM(Life Technologies)。細(xì)胞從接種密度2-5×105個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)至1-2×106個(gè)細(xì)胞的密度，按感染復(fù)數(shù)為0.1至10(通常大約3)加入重組病毒貯液。通常在感染后12-72小時(shí)，重組病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生重組zsig33多肽，并以不同的效率分泌至培養(yǎng)基中。常在感染后過(guò)48小時(shí)收獲培養(yǎng)物。通過(guò)離心將細(xì)胞與培養(yǎng)基(上清液)分離。含zsig33多肽的上清液用微孔濾膜過(guò)濾，通常濾膜孔徑大小為0.45μm。所用步驟常見(jiàn)于可索要到的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(King，L.A.和Possee，R.D.，同上；O’Reilly，D.R.等，同上；Richardson，C.D.，同上)中。隨后可用本文所述方法完成從上清液中純化出zsig33多肽的步驟。
真菌細(xì)胞，包括酵母細(xì)胞，特別是酵母屬和畢赤酵母屬的細(xì)胞，也可用于本發(fā)明中，以便例如生產(chǎn)zsig33片段或多肽融合體。用外源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞以及從其生產(chǎn)重組多肽的方法公開(kāi)于例如Kawasaki，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4599311；Kawasaki等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4931373；Brake，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4870008；Welch等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5037743；和Murray等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4845075，此處引用作為參考。通過(guò)由選擇性標(biāo)記，通常是抗藥性或在缺少特定營(yíng)養(yǎng)(如亮氨酸)時(shí)生長(zhǎng)的能力確定的表型來(lái)選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在酵母中可使用的優(yōu)選載體系統(tǒng)是由Kawasaki等，(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4931373)公開(kāi)的POT1載體系統(tǒng)，這一系統(tǒng)允許通過(guò)在含葡萄糖的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。可在酵母中使用的合適啟動(dòng)子和終止子包括那些來(lái)自糖酵解酶基因(見(jiàn)如Kawasaki，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4599311；Kingsman等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4615974；和Bitter，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4977092，此處引用作為參考)和醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子和終止子。也見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4990446；5063154；5139936和4661454，此處引用作為參考。用于其它酵母，包括多形漢遜酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母、Pichia methanolica和Candida maltosa的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在本領(lǐng)域內(nèi)已知。參見(jiàn)例如Gleeson等，普通微生物學(xué)雜志，1323459-3465，1986和Cregg，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4882279。根據(jù)McKnight等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4935349的方法可以使用曲霉屬細(xì)胞，此處引用作為參考。轉(zhuǎn)化Acremonium chrysogenum的方法由Sumino等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5162228公開(kāi)，此處引用作為參考。轉(zhuǎn)化脈孢菌的方法由Lambowitz，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4486533公開(kāi)，此處引用作為參考。
根據(jù)傳統(tǒng)方法，在含有營(yíng)養(yǎng)物以及選擇的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)所需的其它成份的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。許多合適的培養(yǎng)基，包括規(guī)定的培養(yǎng)基和復(fù)雜培養(yǎng)基，在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，一般包含碳源、氮源、必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)。如果需要，培養(yǎng)基也可以含有諸如生長(zhǎng)因子或血清的成份。生長(zhǎng)培養(yǎng)基一般將對(duì)含有外加DNA的細(xì)胞進(jìn)行選擇，例如通過(guò)藥物選擇或缺乏必需營(yíng)養(yǎng)物，而這些可以由表達(dá)載體所攜帶的或共轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記來(lái)補(bǔ)償。在含有適當(dāng)碳源、氮源和微量營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中，于大約25-35℃溫度下培養(yǎng)P.methanolica。通過(guò)常規(guī)方式，如晃動(dòng)小搖瓶或攪拌發(fā)酵罐，給液體培養(yǎng)物提供足夠的空氣。P.methanolica的優(yōu)選培養(yǎng)基是YEPD[2％D-葡萄糖，2％BactoTM蛋白胨(Difco Laboratories，Detroit，MI)，1％BactoTM-酵母提取物(Difco Laboratories)，0.004％腺苷和0.006％L-亮氨酸]。
使用分級(jí)分離和/或傳統(tǒng)純化方法及介質(zhì)可以純化表達(dá)的重組zsig33多肽。硫酸銨沉淀和酸或離液劑抽提可以用來(lái)分級(jí)分離樣品。典型的純化步驟可以包括羥基磷灰石層析、大小排阻層析、FPLC和反相高效液相層析。合適的陰離子交換介質(zhì)包括衍生葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、聚丙烯酰胺、特殊性能硅石等。優(yōu)選的是PEI、DEAE、QAE和Q衍生物，尤其優(yōu)選的是DEAE Fast-Flow Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的層析介質(zhì)包括用苯基、丁基或辛基衍生化的那些介質(zhì)，如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等；或聚丙烯樹(shù)脂，如Amberchrom CG71(Toso Haas)等。合適的固體支持物包括玻璃珠、硅基樹(shù)脂、纖維素樹(shù)脂、瓊脂糖珠、交聯(lián)瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、交聯(lián)聚丙烯酰胺樹(shù)脂等，它們?cè)谒玫臈l件下是不可溶的。這些支持物可以用反應(yīng)性基團(tuán)進(jìn)行修飾，使蛋白質(zhì)可以通過(guò)氨基、羧基、硫氫基、羥基和/或碳水化合物組分結(jié)合。偶聯(lián)化學(xué)法的例子包括溴化氰活化、N-羥基琥珀酰亞胺活化、環(huán)氧化物活化、巰基活化、酰肼活化及碳二亞胺偶聯(lián)化合法的羧基和氨基衍生物。這些和其它固體介質(zhì)在本領(lǐng)域內(nèi)公知并廣泛應(yīng)用，可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得。將受體多肽與支持物介質(zhì)結(jié)合的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。特定方法的選擇是一種常規(guī)設(shè)計(jì)，部分決定于所選支持物的特性。見(jiàn)例如親和層析原理和方法，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988。
可利用其大小較小和pI較低的性質(zhì)分離本發(fā)明多肽。例如，在低pH時(shí)，本發(fā)明多肽可與陰離子交換介質(zhì)結(jié)合。其它純化方法包括通過(guò)凝集素親和層析和離子交換層析純化糖基化蛋白質(zhì)(酶學(xué)方法，182卷，“蛋白質(zhì)純化指南”，M.Deutscher(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，1990，529-39頁(yè))。此外，可以構(gòu)建目的多肽和親和標(biāo)簽(如多聚組氨酸、麥芽糖結(jié)合蛋白、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)的融合體以利于純化。
也可以有利地使用蛋白質(zhì)重折疊(和選擇性地重氧化)方法。優(yōu)選純化蛋白質(zhì)至＞80％純度，更優(yōu)選至＞90％純度，甚至更優(yōu)選＞95％，尤其優(yōu)選的是藥學(xué)上的純凈狀態(tài)，即，就污染的大分子、尤其是其它蛋白質(zhì)和核酸來(lái)說(shuō)，純度＞99.9％，沒(méi)有感染和熱源因子。優(yōu)選地，純化的蛋白質(zhì)基本上不含其它蛋白，尤其是動(dòng)物來(lái)源的其它蛋白。
也可用化學(xué)合成方法制備zsig33多肽或其片段。zsig33多肽可以是單體或多體、糖基化或非糖基化、PEG化(pegylated)或非PEG化、酰胺化或非酰胺化、硫酸化或非硫酸化的，也可以包括或不包括一個(gè)起始的甲硫氨酸殘基。例如，也可用完全固相合成、部分固相方法、片段縮合或傳統(tǒng)的液相合成等方法合成zsig33多肽。優(yōu)選用固相肽合成法制備此多肽，例如Merrifield，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)852149，1963中所述方法。用α-氨基端有保護(hù)的氨基酸來(lái)進(jìn)行多肽的合成。也用合適的基團(tuán)保護(hù)具不穩(wěn)定側(cè)鏈的三功能氨基酸，以阻止在多肽裝配中發(fā)生非所需要的化學(xué)反應(yīng)。α-氨基保護(hù)基團(tuán)可被選擇性地去除，從而允許在氨基末端發(fā)生后續(xù)反應(yīng)。去除α-氨基保護(hù)基團(tuán)的條件不會(huì)去除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。
α-氨基保護(hù)基團(tuán)是在分步多肽合成領(lǐng)域中已知比較有用的那些基團(tuán)，包括酰基型保護(hù)基團(tuán)(如甲?；⑷阴；?、乙酰基)、芳香基型保護(hù)基團(tuán)(如生物素)、芳香族尿烷型保護(hù)基團(tuán)〔如芐氧羰基(Cbz)、取代的芐氧羰基和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)〕、脂族尿烷保護(hù)基團(tuán)〔如叔丁基氧羰基(tBoc)、異丙基氧羰基、環(huán)己基氧羰基〕和烷基型保護(hù)基團(tuán)(如苯甲基、三苯甲基)。優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)是tBoc和Fmoc。
所選擇的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)必須在偶聯(lián)過(guò)程中保持完整，且在氨基端保護(hù)基團(tuán)的脫保護(hù)過(guò)程中或偶聯(lián)條件下不會(huì)被去除。合成完成后，側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)也必須是能在不會(huì)改變已合成好的多肽的反應(yīng)條件下被去除。在tBoc化學(xué)法中，三功能氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)大多數(shù)情況下是基于苯甲基的基團(tuán)。在Fmoc化學(xué)法中，則大多數(shù)情況下是基于叔丁基或三苯甲游基的基團(tuán)。
在tBoc化學(xué)方法中，優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)對(duì)精氨酸來(lái)說(shuō)是甲苯磺酰基，對(duì)天冬氨酸來(lái)說(shuō)是環(huán)己基，對(duì)半胱氨酸來(lái)說(shuō)是4-甲基芐基(和乙酰氨基甲基)，對(duì)谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸來(lái)說(shuō)是苯甲基，對(duì)組氨酸來(lái)說(shuō)是芐氧甲基(和二硝基苯基)，對(duì)賴(lài)氨酸來(lái)說(shuō)是2-氯芐氧羰基，對(duì)色氨酸來(lái)說(shuō)是甲?；瑢?duì)酪氨酸來(lái)說(shuō)是2-溴苯甲基。在Fmoc化學(xué)方法中，優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)有，用于精氨酸的2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pme)或2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?pbf)，用于天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺和組氨酸的三苯甲游基，用于天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的叔丁基，用于賴(lài)氨酸和色氨酸的tBoc。
為了合成磷酸肽，可以直接也可在裝配后摻入磷酸基團(tuán)。在直接摻入的方法中，可在Fmoc化學(xué)中用甲基、苯甲基或叔丁基或者在tBoc化學(xué)中用甲基、苯甲基或苯基來(lái)保護(hù)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸上的磷酸基團(tuán)。在Fmoc化學(xué)中也可用無(wú)磷酸基保護(hù)的磷酸酪氨酸進(jìn)行直接摻入。在裝配后摻入的這一方法中，將絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸中未被保護(hù)的羥基在固相上用二叔丁基、二苯甲基或二甲基-N，N′-二異丙基亞磷酰胺進(jìn)行衍生化，然后用叔丁基氫過(guò)氧化物氧化。
經(jīng)常通過(guò)將α-氨基被保護(hù)(側(cè)鏈保護(hù))的氨基酸偶聯(lián)到合適的固體支持物上，從羧基端開(kāi)始進(jìn)行固相合成。當(dāng)氨基酸附著到氯甲基、氯三苯甲游基或羥甲基樹(shù)脂上時(shí)，形成酯鍵，產(chǎn)生的多肽將在C-末端有一游離羧基?；蛘撸?dāng)使用酰胺樹(shù)脂，如二苯甲基胺或?qū)谆郊谆窐?shù)脂(對(duì)tBoc化學(xué)法而言)和Rink酰胺或PAL樹(shù)脂(對(duì)Fmoc化學(xué)法而言)時(shí)，就形成了酰氨鍵，產(chǎn)生的多肽在C-末端有一羰基酰氨基。這些樹(shù)脂，無(wú)論是基于聚苯乙烯或聚酰胺的或聚乙二醇接枝的，有或無(wú)柄或接頭的，第一個(gè)氨基酸有或無(wú)附著，都可購(gòu)買(mǎi)到，它們的制備可參閱Stewant等，《固相多肽合成》(第二版)、(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，1984)和Bayer & Papp Chem.Rept.Prot.33(1986)；和Ath erton等，固相肽合成實(shí)用入門(mén)，IRL出版社，牛津，1989。
若側(cè)鏈保護(hù)是必需的，則用各種活化劑，包括二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIPCDI)和羰基二咪唑(carbonyldiimidazole，CDI)，將側(cè)鏈被保護(hù)(必要的話)和α-氨基被保護(hù)的C-末端氨基酸附著到羥甲基樹(shù)脂上。它可以其三甲基氨化銫的鹽形式或有三乙胺(TEA)或二異丙基乙基胺(DIEA)存在的條件下直接附著到氯甲基或氯三苯甲游基樹(shù)脂上。第一個(gè)氨基酸附著到酰胺樹(shù)脂上的過(guò)程與偶聯(lián)反應(yīng)中酰胺鍵的形成相同。
附著到樹(shù)脂支持物之后，根據(jù)保護(hù)作用的化學(xué)原理(如tBoc，F(xiàn)moc)使用不同的試劑去除α-氨基保護(hù)基團(tuán)。Fmoc去除的程度可以在300-320nm或通過(guò)傳導(dǎo)性元件監(jiān)控。去除了α-氨基保護(hù)基團(tuán)之后，以要求的順序逐步偶聯(lián)剩余的被保護(hù)氨基酸，得到想要的序列。
有很多激活劑可用于偶聯(lián)反應(yīng)，包括DCC，DIPCDI，六氟磷酸2-氯-1，3-二甲基亞氨鎓(2-chloro-1，3-dimethylimidiumhexafluorophosphate，CIP)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)鏻[benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphate，BOP]和它的吡咯烷類(lèi)似物(PyBOP)，六氟磷酸溴-三吡咯烷鏻(bromo-tris-pyrrolidino-phosphoniumhexafluorophosphate，PyBroP)，六氟磷酸O-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓[O-(benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphate，HBTU]和它的四氟硼酸鹽類(lèi)似物(TBTU)或它的吡咯烷類(lèi)似物(HBPyU)，六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓[O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphate，HATU]和它的四氟硼酸鹽類(lèi)似物(TATU)或它的吡咯烷類(lèi)似物(HAPyU)。偶聯(lián)反應(yīng)中最常用的催化性添加劑包括4-二甲氨基吡啶(DMAP)，3-羥基-3，4-二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HODhbt)，N-羥基苯并三唑(HOBt)和1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)。每種被保護(hù)的氨基酸都是過(guò)量使用(＞2.0當(dāng)量)，且偶聯(lián)通常在N-甲基吡咯烷酮(NMP)或DMF、CH2Cl2或它們的混和物中進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)完成的程度可以在每一階段監(jiān)控，如通過(guò)Kaiser等人(分析生物化學(xué)，34595，1970)所述的茚三酮反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控。
想要的肽裝配完全之后，用含合適清除劑的試劑切割肽-樹(shù)脂。Fmoc肽通常用含清除劑(如水，乙二硫醇，苯酚和茴香硫醚)的TFA切割和去保護(hù)。tBoc肽通常用液態(tài)氟化氫在-5～0℃切割和去保護(hù)1～2小時(shí)，這樣從樹(shù)脂上切下多肽并除去了大部分側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。清除劑如苯甲醚，甲硫醚和甲苯硫酚通常與液態(tài)氟化氫一起使用，以防止切割過(guò)程中形成的陽(yáng)離子使多肽中的氨基酸殘基發(fā)生烷化和酰化。色氨酸的甲?；徒M氨酸的二硝基苯基需要在用氟化氫切割之前分別用溶于DMF的哌啶和苯硫基除去。半胱氨酸的乙酰氨基甲基可以用醋酸汞(II)除去，或者用碘、三氟乙酸鉈(III)或四氟硼酸銀除去，它們同時(shí)氧化半胱氨酸成胱氨酸。其它用于tBoc肽切割和去保護(hù)的強(qiáng)酸有三氟甲磺酸(TFMSA)和三甲基甲硅烷基三氟乙酸(TMSOTf)。
此項(xiàng)發(fā)明的分子的活性可以用多種試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定對(duì)胃腸細(xì)胞收縮的刺激，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物攝入的調(diào)節(jié)和/或消化酶的分泌而確定。尤為有用的是測(cè)定平滑肌細(xì)胞收縮性的變化，例如哺乳動(dòng)物十二指腸段或其它胃腸平滑肌組織的收縮反應(yīng)(Depoortere等人，胃腸運(yùn)動(dòng)雜志，1989年第1卷第150-159頁(yè)，此處引作參考文獻(xiàn))。一個(gè)示例性的體內(nèi)試驗(yàn)中使用超聲千分尺測(cè)量接觸面間徑向的尺寸變化和到基值平面縱向的尺寸變化(Hansen等人，胸腔外科醫(yī)生學(xué)會(huì)，1995年第60卷第384-390頁(yè))。
胃運(yùn)動(dòng)在臨床上通常是測(cè)定胃排空(gastric emptying)所需時(shí)間和其后通過(guò)胃腸道的傳送時(shí)間(transit time)。胃空造影掃描對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，簡(jiǎn)單的說(shuō)，就是使用口服反差劑，諸如鋇餐，或放射性標(biāo)記。固體和液體可以獨(dú)立檢測(cè)。檢測(cè)用的食物或液體用同位素(如99mTc)放射性標(biāo)記，注射或服用之后，用伽瑪攝像機(jī)可視化測(cè)定通過(guò)胃腸道的傳送時(shí)間和胃排空情況(Meyer等人，Am.J.Dig.Dis.1976年第21卷第296頁(yè)；Collins等人，腸，1983年第24卷第1117頁(yè)；Maughan等人，糖尿病醫(yī)學(xué)，139增刊5S6-10，1996；和Horowitz等人，Arch.Intern.Med.，1451467-1472，1985)。這些研究可以在服用促動(dòng)劑以量化藥物的功效之前和之后進(jìn)行。
測(cè)定zsig33多肽影響細(xì)胞增殖或分化能力的試驗(yàn)在本領(lǐng)域中是熟知的。例如，測(cè)量增殖的試驗(yàn)包括諸如對(duì)中性紅染料的化學(xué)敏感性(Cavanaugh等人，新藥調(diào)查(Investigational New Drugs)8347-354，1990，此處引作參考文獻(xiàn))，放射性標(biāo)記核苷酸的摻入(Cook等人，分析生化，1791-7，1989，此處引作參考文獻(xiàn))，在增殖細(xì)胞的DNA中摻入5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU)(Porstmann等人，免疫學(xué)方法雜志，82169-179，1985，此處引作參考文獻(xiàn))和四唑鎓鹽的使用(Mosmann，免疫學(xué)方法雜志，6555-63，1983；Alley等人，癌癥研究，48589-601，1988；Marshall等人，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)(Growth Reg.)，569-84，1995；Scudiero等人，癌癥研究，484827-4833，1988；此處均引作參考文獻(xiàn)測(cè)量分化的試驗(yàn)包括例如測(cè)量與組織階段特異表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記、酶活性，功能活性或形態(tài)變化(Watt，F(xiàn)ASEB，-5281-284，1991；Franeis，分化，5763-75，1994；Raes，Adv.Anim.Cell Biol.Technol.Bioprocesses，161-171，1989；均在此處引作參考文獻(xiàn))。
可進(jìn)行試驗(yàn)，以測(cè)量其它細(xì)胞反應(yīng)，包括趨化性、粘附、離子通道流入量的變化、第二信使水平的調(diào)節(jié)和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。這些試驗(yàn)在本領(lǐng)域中是熟知的。參閱，例如，Basic & Clinical EndocrinologySer.第3卷，細(xì)胞化學(xué)生物試驗(yàn)技術(shù)和應(yīng)用，Chayen；Chayen，Bitensky編，Dekker，紐約，1983年。
從觀察到的zsig33的組織分布的觀點(diǎn)看，激動(dòng)劑(包括天然配基/底物/輔助因子/等)和拮抗劑在體外和體內(nèi)應(yīng)用中都有巨大潛力。確認(rèn)為zsig33激動(dòng)劑的化合物在體外和體內(nèi)促進(jìn)刺激胃腸細(xì)胞收縮性、調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物攝入和/或分泌消化酶方面很有用。例如，激動(dòng)劑化合物可用作確定的細(xì)胞培養(yǎng)基的成分，能有效調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)的吸收，因此可用于特異性促進(jìn)胃腸細(xì)胞如G細(xì)胞，腸嗜鉻細(xì)胞和胃、十二指腸、近端空腸、竇房和基底上皮粘膜的生長(zhǎng)和/或發(fā)育。
胃腸-腦肽家族已經(jīng)與神經(jīng)病學(xué)和CNS功能聯(lián)系起來(lái)了。例如，已證明NPY這種在腦和腸中都有受體的肽，當(dāng)施予中樞神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)會(huì)刺激食欲(Gehlert，生命科學(xué)，55(6)551-562，1994)。已在腦的不同區(qū)域(特別是小腦)和垂體中鑒定到了促胃動(dòng)素的免疫反應(yīng)性(Gasparini等人，人類(lèi)遺傳學(xué)，94(6)671-674，1994)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，促胃動(dòng)素在小腦中與神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸共存[Chan-Patay，英國(guó)藥學(xué)會(huì)第50屆年會(huì)論文集(Proc.Sym.50th Anniv.Meet.Br.Pharmalog.Soc.)1-24，1982]。生理學(xué)研究已經(jīng)提供了一些證據(jù)表明，促胃動(dòng)素對(duì)進(jìn)食行為(Rosenfield等人，生理學(xué)行為，39(6)735-736，1987)、膀胱控制、垂體生長(zhǎng)激素釋放有影響。其它胃腸-腦肽，如CCK，腦啡肽，VIP和促胰液素，除了在消化系統(tǒng)中有活性外，還顯示與血壓、心率、行為和疼痛調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，zsig33或其某部分預(yù)計(jì)存在某些神經(jīng)病學(xué)上的聯(lián)系。
利用本發(fā)明氨基酸和DNA序列內(nèi)的位點(diǎn)特異性突變，可以制得一些類(lèi)似物，它們可以是拮抗劑、激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑(Macielay等人，肽化學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)，659，1996)。拮抗劑可用于胃腸運(yùn)動(dòng)過(guò)度的臨床紊亂中，如腹瀉和Crohn癥。拮抗劑在鑒定配體-受體相互作用位點(diǎn)時(shí)可用作研究試劑。
zsig33配體結(jié)合多肽還可用于純化配體。將多肽固定在固體支持物上，如瓊脂糖珠、交聯(lián)瓊脂糖、玻璃、纖維素樹(shù)脂、二氧化硅樹(shù)脂、聚苯乙烯、交聯(lián)聚丙烯酰胺，或在使用條件下比較穩(wěn)定的類(lèi)似材料。將多肽連接到固體支持物上的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，包括胺化學(xué)法、溴化氰活化，N-羥基琥珀酰亞胺活化、環(huán)氧化物活化、巰基活化和酰肼活化。將產(chǎn)生的介質(zhì)制成柱，使含配體的液體過(guò)柱一遍或多遍，以使配體結(jié)合到受體多肽上。然后用不同鹽濃度、離液劑(鹽酸胍)或pH破壞配體-受體的結(jié)合，以洗脫配體。
使用配體結(jié)合受體(或抗體，互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對(duì)之一)或其結(jié)合片段的試驗(yàn)系統(tǒng)和市售生物感應(yīng)器裝置(BIAcoreTM，PharmaciaBiosensor，Piscataway，NJ)可有效地被應(yīng)用。將這些受體、抗體、互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對(duì)的成員或片段固定在接受片的表面上。Karlsson，免疫學(xué)方法雜志，415229-40，1991；和Cunningham與Wells，分子生物學(xué)雜志，234554-63頁(yè)，1993，介紹了這種裝置的使用。使用胺或巰基化學(xué)方法，將受體、抗體、成員或片段共價(jià)結(jié)合到吸附在流動(dòng)槽內(nèi)金膜上的葡聚糖纖維上。使待測(cè)樣品流經(jīng)小槽。如果樣品中存在配體、表位或互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對(duì)的另一成員，它們就會(huì)相應(yīng)地與固定化的受體、抗體或成員結(jié)合，引起介質(zhì)折射率的改變，這種改變可檢測(cè)為金膜表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振。此系統(tǒng)可測(cè)定結(jié)合和解離速率，由此可計(jì)算結(jié)合親和力并評(píng)估結(jié)合的化學(xué)計(jì)量學(xué)。
配體結(jié)合受體多肽還可用于本領(lǐng)域已知的試驗(yàn)系統(tǒng)中。這些系統(tǒng)包括測(cè)定結(jié)合親和力的Scatchard分析(參閱Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.，51660-72，1949)和量熱法分析(Cunningham等人，科學(xué)，253545-48，1991；Cunningham等人，科學(xué)，245821-25，1991)。
zsig33多肽也可以用于制備與zsig33表位、肽或多肽可特異結(jié)合的抗體。制備多克隆和單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(見(jiàn)如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港，紐約，1989；和Hurrell，J.G.R.編輯，單克隆雜交瘤抗體技術(shù)和應(yīng)用，CRC出版公司，Boca Raton，F(xiàn)L，1982，此處引用作為參考)。多克隆抗體可以從許多溫血?jiǎng)游锶珩R、牛、山羊、綿羊、狗、雞、兔、小鼠和大鼠中產(chǎn)生，這一點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員是很明顯的。
通過(guò)使用佐劑如明礬(氫氧化鋁)或者弗氏完全或不完全佐劑，可以增加zsig33多肽的免疫原性?？捎糜诿庖呓臃N的多肽也包括融合多肽，如zsig33或其部分與免疫球蛋白多肽或與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合體。多肽免疫原可以是全長(zhǎng)分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原樣的”，為了進(jìn)行免疫，此部分可以有利地與大分子載體[如匙孔蟲(chóng)血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破傷風(fēng)類(lèi)毒素]連接。
如本文所述，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括多克隆抗體、親和純化的多克隆抗體、單克隆抗體和抗原結(jié)合片段如F(ab′)2和Fab蛋白水解片段。也包括基因工程化的完整抗體或片段，如嵌合抗體、Fv片段、單鏈抗體等，以及合成的抗原結(jié)合肽和多肽。通過(guò)只將非人類(lèi)CDR接枝到人框架和穩(wěn)定區(qū)，或通過(guò)摻入整個(gè)非人可變結(jié)構(gòu)域(可選地通過(guò)置換暴露的殘基而用人樣表面選擇性“覆蓋”它們，其中結(jié)果是產(chǎn)生了“被覆蓋的”抗體)，可以使非人抗體人源化。在一些例子中，人源化抗體可以在人可變區(qū)域框架區(qū)內(nèi)保留非人殘基，以加強(qiáng)正確的結(jié)合特性。通過(guò)使抗體人源化，可以提高生物半衰期，并且在用于人體時(shí)減少不利免疫反應(yīng)的可能。此處對(duì)于產(chǎn)生或選擇抗體有用的其它技術(shù)包括體外使淋巴細(xì)胞與zsig33蛋白或肽接觸以及對(duì)噬菌體或類(lèi)似載體中的抗體展示文庫(kù)進(jìn)行篩選(例如，通過(guò)固定的或標(biāo)記的zsig33蛋白或肽的使用)。
如果抗體與zsig33多肽以106M-1或更高的、優(yōu)選地107M-1或更高、更優(yōu)選地108M-1或更高、最優(yōu)選109M-1或更高的結(jié)合親和性(K(a)結(jié)合，那么抗體定義為特異性結(jié)合?？贵w結(jié)合親和性很容易由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員測(cè)定出來(lái)(如通過(guò)Scatchard分析)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多實(shí)驗(yàn)可以用于檢測(cè)能與zsig33蛋白或肽特異結(jié)合的抗體。典型的實(shí)驗(yàn)在《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Harlow和Lane(編輯)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1988)中得到具體描述。這些實(shí)驗(yàn)的代表性例子包括共存的免疫電泳、放射免疫試驗(yàn)、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELIS(A)、點(diǎn)雜交或Western雜交實(shí)驗(yàn)、抑制或競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，和三明治實(shí)驗(yàn)。此外，也可以通過(guò)與野生型相對(duì)于與突變型zsig33蛋白或肽的結(jié)合而篩選抗體。
針對(duì)zsig33的抗體可以用于標(biāo)記表達(dá)zsig33的細(xì)胞；通過(guò)親和純化分離zsig33；用于測(cè)定zsig33多肽循環(huán)水平的診斷分析；檢測(cè)或定量測(cè)定可溶的zsig33作為潛在病理學(xué)或疾病的標(biāo)記；采用FACS的分析方法中；篩選表達(dá)文庫(kù)；制備抗獨(dú)特型抗體；以及作為中和抗體或拮抗劑而體外和體內(nèi)阻斷zsig33活性。合適的直接標(biāo)簽或標(biāo)記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、磁粒子等；間接標(biāo)簽或標(biāo)記涉及使用生物素-抗生物素蛋白或其它互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對(duì)作為中間體。此處抗體也可以直接或間接與藥物、毒素、放射性核素等等偶聯(lián)，并且將這些偶聯(lián)物用于體內(nèi)診斷或治療應(yīng)用。
本發(fā)明的分子可以用于鑒定和分離介導(dǎo)zsig33功能的受體。例如將本發(fā)明的蛋白質(zhì)和肽固定在柱上，并使膜制品流過(guò)柱子(《固定的親和配體技術(shù)》，Hermanson等，編輯，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，CA，1992，195-202頁(yè))。也可以對(duì)蛋白質(zhì)和肽進(jìn)行放射性標(biāo)記(《酶學(xué)方法》，182卷，“蛋白質(zhì)純化指南”，M.Deutscher編輯，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，1990，721-737)或光親和標(biāo)記(Brunner等，生物化學(xué)年鑒，62483-514，1993和Fedan等，生物化學(xué)藥理學(xué)，331167-1180，1984)，并可以鑒定特異的細(xì)胞表面蛋白。
本發(fā)明多肽、核酸和/或抗體也可用于下述疾病的治療中與胃腸細(xì)胞收縮、消化酶和酸分泌、胃腸運(yùn)動(dòng)、消化酶的補(bǔ)充相關(guān)的疾病；炎癥，特別是當(dāng)其會(huì)影響胃腸系統(tǒng)時(shí)；逆流疾病和營(yíng)養(yǎng)物攝入的調(diào)節(jié)。用本發(fā)明分子治療可受益的一些具體疾病包括有、但不限于糖尿病性胃輕癱，手術(shù)后的胃輕癱，迷走神經(jīng)切斷術(shù)，慢性特發(fā)性假腸梗阻和胃食管逆流疾病。其它應(yīng)用包括進(jìn)行胃排空以進(jìn)行放射性研究，刺激膽囊收縮和竇切除術(shù)。
本發(fā)明分子的運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)病學(xué)效果使之可用于治療肥胖癥及其中神經(jīng)病學(xué)性逆流影響了營(yíng)養(yǎng)物攝入的其它代謝性疾病。本發(fā)明分子可用于調(diào)節(jié)飽腹感、葡萄糖吸收和代謝，以及神經(jīng)病理相關(guān)性胃腸疾病。
本發(fā)明分子也可用作含葡萄糖的抗低血糖制劑添加劑，以及需要快速營(yíng)養(yǎng)作用的口服藥物的吸收增強(qiáng)劑。此外，本發(fā)明分子還可用來(lái)刺激葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放。
對(duì)于藥物使用，可以根據(jù)傳統(tǒng)方法配制本發(fā)明的蛋白質(zhì)，以用于胃腸外、鼻吸入，尤其是靜脈內(nèi)或皮下送遞。靜脈內(nèi)施用是通過(guò)一至幾小時(shí)的典型時(shí)段進(jìn)行大量注射或注入?？偟膩?lái)說(shuō)，藥物配方中將包括與藥學(xué)上可接受載體如鹽水、緩沖鹽水、水中5％葡萄糖等結(jié)合的zsig33蛋白。配方中可以進(jìn)一步包括一種或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩沖劑、防止在小瓶表面發(fā)生蛋白丟失的白蛋白等。配方的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并顯示在如Remington′s藥物科學(xué)，Gennar，編輯，Mack出版公司，Easton PA，1990中，此處作為參考引入。治療劑量一般是每天在0.1-100μg/kg患者體重范圍內(nèi)，優(yōu)選每天0.5-20μg/kg，精確劑量由臨床大夫根據(jù)普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)，并考慮待治療疾病的本性和嚴(yán)重性、患者特性等等來(lái)確定。劑量的確定在本領(lǐng)域普通技術(shù)的水平內(nèi)。可以施用蛋白質(zhì)進(jìn)行急性治療，經(jīng)一周左右，經(jīng)常經(jīng)一至三天左右時(shí)間，或用于慢性治療，經(jīng)過(guò)幾個(gè)月或幾年。例如，zsig33的治療有效量是足以使胃運(yùn)動(dòng)及用來(lái)衡量營(yíng)養(yǎng)物攝入變化情況的參數(shù)發(fā)生臨床上比較顯著的變化的量。這類(lèi)測(cè)量的具體檢測(cè)方法對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是熟知的。
通過(guò)下面非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1搜索cDNA資料庫(kù)中含分泌序列的cDNA，發(fā)現(xiàn)有一段表達(dá)序列標(biāo)記(EST)與促胃動(dòng)素有同源性。cDNA來(lái)自人胎兒胰臟cDNA文庫(kù)。
通過(guò)對(duì)該EST來(lái)源的cDNA進(jìn)行序列分析，確定了該EST序列。此cDNA包含于質(zhì)粒中，由克隆位點(diǎn)切下來(lái)。分析顯示該cDNA包含了編碼zsig33的DNA的整個(gè)編碼區(qū)。
實(shí)施例2使用Clontech公司(Palo Alto，CA)的人類(lèi)多種組織印跡和人類(lèi)RNAMaster點(diǎn)印跡進(jìn)行Northern雜交。探針是約40個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸ZC12，494(SEQ ID NO7)。使用T4多核苷酸激酶(Life TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)和T4多核苷酸激酶反應(yīng)緩沖液(Life Technologies，Inc.)對(duì)探針進(jìn)行末端標(biāo)記。使用NUCTRAP(Stratagene，La Jolla，CA)推進(jìn)柱純化探針。使用EXPRESSHYB(Clontech)溶液進(jìn)行預(yù)雜交，并作為Northern印跡術(shù)的雜交溶液。雜交在42℃進(jìn)行，各印跡用2XSSC和0.05％SDS在室溫下洗滌，接著用1XSSC和0.1％SDS在71℃洗滌。觀察到胃樣品有一個(gè)約600bp的轉(zhuǎn)錄物的強(qiáng)信號(hào)，而胰和小腸樣品有較弱信號(hào)。
實(shí)施例3取兩只雄性Sprague-Dawley大鼠，約12周齡(Harlan，Indianapolis，IN)，用尿烷麻醉后，由一個(gè)小的腹部切口暴露它們的胃。將兩粒2.4毫米大小的轉(zhuǎn)導(dǎo)晶體(Sonometrics，Ontario，Canada)安置在胃竇部，這樣可將環(huán)形收縮測(cè)定為兩粒晶體間距離的變化。晶體用VETBONDTISSUE ADHESIVE(3M，S.t Paul，MN)粘附上去。
將10μl 1μM乙酰膽堿局部施加于兩晶體間的胃部后，兩晶體間的距離發(fā)生急速但短暫的增加。10μl 1μM去甲腎上腺素(NE)引起兩晶體間距離減小。去甲腎上腺素引起的距離減小的幅度大約是乙酰膽堿引起的增加的50％。兩種反應(yīng)都比較短暫。
將陰性對(duì)照-10μl磷酸鹽緩沖液(PBS)局部施加于晶體間，沒(méi)有作用。
zsig33的一段14氨基酸肽[SEQ ID NO2從氨基酸殘基24(Gly)至氨基酸殘基37(Gln)]溶于磷酸鹽緩沖液，局部施加10微升，使終濃度達(dá)到1μg、10μg或100μg。1微克zsig33引起持續(xù)的、節(jié)律性的增大和減小。當(dāng)檢驗(yàn)10微克和100微克濃度時(shí)，效果呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，反應(yīng)的速率和幅度都有所增強(qiáng)。
實(shí)施例4取八只雌性ob/ob小鼠，約6周齡(Jackson實(shí)驗(yàn)室，Bar Harbor，ME)，用兩周時(shí)間使它們適應(yīng)每天4小時(shí)的喂養(yǎng)日程表。以喂養(yǎng)日程表喂養(yǎng)兩周之后，在它們就餐后，緊接著以口服管飼法給小鼠服用100微克溶于100微升無(wú)菌0.1％BSA的14氨基酸zsig33肽(SEQ ID NO2從第24位氨基酸殘基甘氨酸至第37位氨基酸殘基谷氨酰胺)。30分鐘后，給小鼠口服0.5毫升25％葡萄糖進(jìn)行激發(fā)。然后眼窩取血，以測(cè)定血清中葡萄糖水平。在服用zsig33之前，口服葡萄糖激發(fā)之前，和葡萄糖/激發(fā)之后1、2、4和20小時(shí)時(shí)取血樣。
口服葡萄糖刺激之前30分鐘，口服zsig33肽100微克時(shí)，觀察到有增強(qiáng)的餐后葡萄糖吸收現(xiàn)象。
實(shí)施例5用431A型肽合成儀(Applied Biosystems/Perkin Elmes，F(xiàn)oster City，CA)以固相肽合成法合成zsig33-1，即相當(dāng)于SEQ ID NO2的第24位氨基酸殘基甘氨酸至第37位氨基酸殘基谷氨酰胺的肽。以Fmoc-谷氨酰胺樹(shù)脂(0.63mmol/g，Advanced Chemtech，Louisville，KY)作為起始支持樹(shù)脂。用1mmol氨基酸柱體(Anaspec，Inc.San Jose，CA)進(jìn)行合成。六氟磷酸2-(苯并三唑)-1-基-1，1，3，3-四甲基脲鎓(HBTU)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，2m N，N-二異丙基乙基胺，N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷(都購(gòu)自Applied Biosystems/Perkin Elmer)和哌啶(Aldrich ChemicalCo.，St.Louis，MO)的混合物被用作合成試劑。
用Peptide Companion軟件(Peptides International，Louisuille，KY)預(yù)測(cè)zsig33-1肽合成的聚集趨勢(shì)和困難程度。依照生產(chǎn)商的詳細(xì)說(shuō)明，用單偶聯(lián)程序進(jìn)行合成。
按照標(biāo)準(zhǔn)TFA切除步驟(依照肽切割手冊(cè)，AppliedBiosystems/Perkin Elmer，從固相上切下肽。用C18、10μm半制備性柱(Vydac，Hesperial，CA)，通過(guò)RP-HPLC純化肽。收集從柱上洗脫的各級(jí)分，用電子噴霧質(zhì)譜儀分析正確的分子量和純度。收集了兩槽洗脫物。質(zhì)譜分析結(jié)果表明兩槽都含有純化形式的zsig33，分子量為1600道爾頓。這即是預(yù)期的分子量，所以將兩槽合并，冷凍并凍干。
實(shí)施例6使用市售“基因橋4放射雜交組”(GeneBridge 4 Radiation HybridPanel)(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)，zsig33被定位于染色體3上?；驑?放射雜交組含有來(lái)自93個(gè)放射雜交克隆的DNA，再加上兩個(gè)對(duì)照DNA(HFL供體和A23受體)。一個(gè)可公共獲得的WWW網(wǎng)址(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)允許相對(duì)于Whitehead研究所/MIT中心而對(duì)基因組研究所的人類(lèi)基因組圖譜(“WICGR”放射雜交圖譜)作圖，而基因組研究所的放射雜交圖譜是用基因橋4放射雜交組建立起來(lái)的。
為了用“基因橋4放射雜交組”進(jìn)行zsig33的作圖，在96-孔微滴定板(Stratagene，La Jolla，CA)中建立20μl反應(yīng)，并在“RoboCyclerGradient 96”熱循環(huán)儀(Stratagene)中用于PCR。95個(gè)PCR反應(yīng)的每一個(gè)含有2μl 10 x Klentaq聚合酶反應(yīng)緩沖液(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)、1.6μl dNTPs混合液(每種2.5mM；Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)、1μl有義引物ZC13166(SEQ ID NO8)和1μl反義引物ZC13167(SEQ ID NO9)、2μl“RediLoad”(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)、0.4μl“Advantage Klentaq聚合酶混合液”(Clontech Laboratories，Inc.)、來(lái)自每個(gè)雜交克隆或?qū)φ盏?5ng DNA，以及ddH2O，總體積20μl。反應(yīng)用等量礦物油覆蓋并封閉。PCR循環(huán)條件如下95℃5分鐘的一個(gè)初始循環(huán)，95℃變性1分鐘、64℃退火1分鐘和72℃延伸1.5分鐘，35個(gè)循環(huán)，接著最后一個(gè)循環(huán)是72℃延伸7分鐘。反應(yīng)物在3％NuSieve GTG瓊脂糖凝膠(FMC Bioproducts，Rockland，ME)上通過(guò)電泳分離。
結(jié)果顯示，zsig33定位于WICGR第3號(hào)染色體的放射雜交圖上，距離該染色體上的框架標(biāo)記AFMA216ZG1為10.43cR-3000處。近端和遠(yuǎn)端框架標(biāo)記分別是AFMA216ZG1和D3S1263。借助于周?chē)臉?biāo)記，將zsig33定位于完整LDB染色體3圖譜(The Genetic Location Database，University of Southhampton，WWW網(wǎng)址http//cedar.genetics.soton.ac.uk/public-html/)上的3p26.1區(qū)。
實(shí)施例7評(píng)估局部施用zsig33肽(SEQ ID NO2的第24位至第37位氨基酸)對(duì)酚紅通過(guò)禁食的雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis，IN)的胃部的影響。6只8周齡的大鼠在禁食24小時(shí)后，用尿烷(0.5ml/100g的25％溶液)麻醉。麻醉之后，用口服管飼法給大鼠喂以1毫升酚紅溶液(50mg/ml，于2％甲基纖維素溶液中)。
以一個(gè)腹部小切口暴露大鼠的胃，管飼5分鐘之后，在胃部局部施用1微克zsig33肽或隨機(jī)序列的14氨基酸肽對(duì)照。測(cè)量管飼后30分鐘胃容物提取物的光密度，以測(cè)定酚紅在胃部的殘余量。
相比于隨機(jī)肽對(duì)照，zsig33肽將胃部酚紅殘余量減少了約25％，表明zsig33肽增強(qiáng)了這些大鼠的胃排空。
實(shí)施例8取16只8周齡的雌性ob/ob小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)，用2周時(shí)間使它們適應(yīng)特殊的每天4小時(shí)的喂養(yǎng)日程表。這些大鼠在每天上午730-1130間任意喂料。以此喂養(yǎng)日程表喂養(yǎng)兩周之后，小鼠被分成兩組，每組8只。在取食之前和4小時(shí)喂料時(shí)間結(jié)束時(shí)，以管飼法給一組小鼠每只口服1.0微克溶于100微升無(wú)菌0.1％BSQA的zsig33-1(14個(gè)氨基酸的肽)，另一組服用對(duì)照(14個(gè)氨基酸的隨意序列的肽)。小鼠每天注射兩次，并測(cè)量每天的食物獲取量和體重，這樣進(jìn)行了14天。在第14天，第二次管飼法口服zsig33-1肽之后，緊接著給小鼠口服0.5毫升25％葡萄糖進(jìn)行刺激。在給予zsig33-1肽或?qū)φ罩?t＝30分鐘)和服用葡萄糖后過(guò)0、1、2、和4小時(shí)，從后眼窩取血以測(cè)定血清葡萄糖水平。
結(jié)果表明，當(dāng)每只小鼠口服給以1微克zsig33-1時(shí)，對(duì)每天體重或食物獲取量或葡萄糖清除情況沒(méi)有影響，正如第14天測(cè)定的那樣。
實(shí)施例9A.胃腸組織Northern印跡用下列來(lái)源的mRNA進(jìn)行Northern印跡1.來(lái)自人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系SW480的RNA(Clontech，Palo Alto，CA)2.來(lái)自人小腸組織的RNA(Clontech)3.來(lái)自人胃組織的RNA(Clontech)4.人腸平滑肌細(xì)胞系(Hism；ATCC No.CRL-1692；美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD)5.正常人結(jié)腸細(xì)胞系(FHC；ATCC No.CRL-1831；美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)6.正常人胎兒小腸細(xì)胞系(FHs 74 Znt.；ATCC No.CCL 241；美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)用酸胍法(Chomczynski等人，分析生化，162156-159，1987)，從Hism、FHC和FHs74 Int.中分離總RNA。用能保留polyA+RNA的層析柱對(duì)總RNA進(jìn)行洗脫，選擇出polyA+RNA(Aviv等人，proc.Nat.Acad.Sci.69.1408-1412，1972)。用1.5％瓊脂糖凝膠，在2.2M甲醛和磷酸鹽緩沖液中電泳，從每種樣品中分離得到2微克polyA+RNA。將RNA在20XSSC中過(guò)夜轉(zhuǎn)移到Nytran膜(Schleicher and Schuell，Keene，NH)上。印跡用UV Stratalinker 2400(Stratagene，La Jolla，(A)以0.12焦耳處理。然后將印跡在80℃烘烤1小時(shí)。
經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的zsig33全長(zhǎng)cDNA(見(jiàn)SEQ ID NO1)約50μg和42.5μl水用Rediprime pellet試劑盒(Amersham，Arlington Heights，IL)，依照生產(chǎn)商的詳細(xì)說(shuō)明，用33dCTP放射性標(biāo)記。印跡在EXPRESSHYB(Clontech)中55℃雜交過(guò)夜。印跡在室溫下用2XSSC和0.1％SDS清洗，接著在65℃用2XSSC和0.1％SDS清洗，最后在65℃用0.1XSSC和0.1％SDS清洗。結(jié)果顯示，zsig33與胃RNA雜交上了，而與其它組織來(lái)源的RNA未能雜交上。
B.腫瘤Northern雜交用Northern TerritoryTM-人腫瘤組印跡II(Human Tumor PanelBlot II)(Invitrogen，San Diego，CA)和Northern TerritoryTM-人胃腫瘤組印跡(Human Stomach Tumor Panel Blot)(Invitrogen)分析zsig33RNA的表達(dá)模式。
人腫瘤組印跡每道含20微克總RNA，在1％變性甲醛凝膠中電泳。印跡中所含RNA來(lái)自食道腫瘤，正常食道，胃腫瘤，正常胃，結(jié)腸腫瘤，正常結(jié)腸，直腸腫瘤和正常直腸。胃腫瘤組印跡含有分離自4位不同提供者的正常組織的總RNA。每樣品道用20微克RNA，各道交替為來(lái)自每位提供者的正常和腫瘤樣品。
準(zhǔn)備約40bp的寡核苷酸ZC12，494(SEQ ID NO7)作為探針。探針用T4多核苷酸激酶(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)和T4多核苷酸激酶反應(yīng)緩沖液(Life Technologies Inc.)末端標(biāo)記。用NUCTRAP推進(jìn)柱(Stratagene，La Jolla，CA)純化探針。腫瘤印跡和胃印跡用相同方法處理。EXPRESSHYB溶液(Clontech)被用于預(yù)雜交和Northern雜交的雜交溶液。雜交在42℃下進(jìn)行，印跡用0.1XSSC和0.01％SDS在60℃下清洗，接著用0.1XSSC和0.1％SDS在70℃下清洗一次。結(jié)果清楚說(shuō)明，zsig33在人腫瘤組和人胃腫瘤組中都只在正常胃組織中表達(dá)。
從以上敘述可意識(shí)到，盡管為了舉例說(shuō)明，而在此處描述了本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案，但還是可以做許多改進(jìn)而不偏離本發(fā)明的精神和范圍的。因此，本發(fā)明范圍只由所附權(quán)利要求確定，而不受其它限制。
序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人ZymoGenetics，Inc.
1201 Eastlake Avenue EastSeattle，WAUSA98102(ii)發(fā)明名稱(chēng)促胃動(dòng)素同系物(iii)序列數(shù)目7(iv)聯(lián)系地址(A)收件人ZymoGenetics，Inc.
(B)街道1201 Eastlake Avenue East(C)城市Seattle(D)州名WA(E)國(guó)家USA(F)郵政編碼98102(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ，Windows版本2.0(vi)目前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)遞交日(C)分類(lèi)(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?br> (B)遞交日(viii)代理人/代理信息(A)姓名Sawislak，Deborah A(B)登記號(hào)37，438(C)參考/文檔號(hào)97-04PC(ix)電信信息(A)電話206-442-6672(B)傳真206-442-6678(C)電傳(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度351個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置1...351(D)其它信息(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞信號(hào)肽(B)位置1…69(D)其它信息(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置70...351(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG CCC TCC CCA GGG ACC GTC TGC AGC CTC CTG CTC CTC GGC ATG CTC 48Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15TGG CTG GAC TTG GCC ATG GCA GGC TCC AGC TTC CTG AGC CCT GAA CAC 96Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30CAG AGA GTC CAG CAG AGA AAG GAG TCG AAG AAG CCA CCA GCC AAG CTG144Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45CAG CCC CGA GCT CTA GCA GGC TGG CTC CGC CCG GAA GAT GGA G6T CAA192Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60GCA GAA GGG GCA GAG GAT GAA CTG GAA GTC CGG TTC AAC GCC CCC TTT240Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80GAT GTT GGA ATC AAG CTG TCA GGG GTT CAG TAC CAG CAG CAC AGC CAG288Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95GCC CTG GGG AAG TTT CTT CAG GAC ATC CTC TGG GAA GAG GCC AAA GAG336Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110GCC CCA GCC GAC AAG351Ala Pro Ala Asp Lys115(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度117個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80ASp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110Ala Pro Ala Asp Lys115(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度546個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置40...396(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO3GGGCAGAGAC ACACACGCGC CCAGTTGTCC AGCTCCAGG ATG GTG TCC CGC AAG 54Met Val Ser Arg Lys1 5GCT GTG GTC GTC CTG CTG GTG GTG CAC GCA GCT GCC ATG CTG GCC TCC 102Ala Val Val Val Leu Leu Val Val His Ala Ala Ala Met Leu Ala Ser10 15 20CAC ACG GAA GCC TTT GTT CCC AGC TTT ACC TAC GGG GAA CTT CAG AGG 150His Thr Glu Ala Phe Val Pro Ser Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg25 30 35ATG CAG GAA AAG GAG CGG AAT AAA GGG CAA AAG AAA TCC CTG AGT GTC 198Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln Lys Lys Ser Leu Ser Val40 45 50CAG CAG GCG TCG GAG GAG CTC GGC CCT CTG GAC CCC TCG GAG CCC ACG 246Gln Gln Ala Ser Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asp Pro Ser Glu Pro Thr55 60 65AAG GAA GAA GAA AGG GTG GTT ATC AAG CTG CTC GCG CCT GTG GAC ATT 294Lys Glu Glu Glu Arg Val Val Ile Lys Leu Leu Ala Pro Val Asp Ile70 75 80 85GGA ATC AGG ATG GAC TCC AGG CAG CTG GAA AAG TAC CGG GCC ACC CTG 342Gly Ile Arg Met Asp Ser Arg Gln Leu Glu Lys Tyr Arg Ala Thr Leu90 95 100GAA AGG CTG CTG GGC CAG GCG CCG CAG TCC ACC CAG AAC CAG AAT GCC 390Glu Arg Leu Leu Gly Gln Ala Pro Gln Ser Thr Gln Asn Gln Asn Ala105 110 115GCC AAG TAACAGGCCG CTGGGGGAGA AGGAGGACAC AGCTCGGACC CCCCTCCCAC GC 448Ala LysAGGGAGGGCC TAGAAATCCG CTGGGCTTGG AAGGAAAACA CCCTCTCCCA AACAGCCCTC 508AGCCCCCCTC CCCCAGCAAA TAAAGCGTGG AAATAGGC 546(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度119個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Val Ser Arg Lys Ala Val Val Val Leu Leu Val Val His Ala Ala15 10 15Ala Met Leu Ala Ser His Thr Glu Ala Phe Val Pro Ser Phe Thr Tyr20 25 30Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln Lys35 40 45Lys Ser Leu Ser Val Gln Gln Ala Ser Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asp50 55 60Pro Ser Glu Pro Thr Lys Glu Glu Glu Arg Val Val Ile Lys Leu Leu65 70 75 80Ala Pro Val Asp Ile Gly Ile Arg Met Asp Ser Arg Gln Leu Glu Lys85 90 95Tyr Arg Ala Thr Leu Glu Arg Leu Leu Gly Gln Ala Pro Gln Ser Thr100 105 110Gln Asn Gln Asn Ala Ala Lys115(2)關(guān)于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型其它(vii)直接來(lái)源(B)克隆ZC12494(xi)序列描述SEQ ID NO5TTCTTCGACT CCTTTCTCTG CTGGACTCTC TGGTGTTCAG 40(2)關(guān)于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)分子類(lèi)型無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO6Glu Xaa Gln Arg Xaa Gln1 5(2)關(guān)于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)分子類(lèi)型無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Pro Xaa Asp Xaa Gly Ile1 權(quán)利要求
1.編碼多肽的分離多核苷酸分子，其選自(a)包含如SEQ ID NO1的第70位至111位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)和(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列。
2.編碼多肽的分離多核苷酸分子，其選自(a)包含如SEQ ID NO1的第70位至120位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列。
3.編碼多肽的分離多核苷酸分子，其選自(a)包含如SEQ ID NO1的第70位至351位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列。
4.編碼多肽的分離多核苷酸分子，其選自(a)包含如SEQ ID NO1的第1位至111位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列。
5.權(quán)利要求4的分離多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子還包含如SEQ ID NO1的第1位至351位核苷酸所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1的分離多核苷酸分子，其中所述多核苷酸是DNA。
7.含有下列可操作地連接在一起的元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；選自下組的DNA區(qū)段(a)包含如SEQ ID NO1的第70位至111位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位變體；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列；及轉(zhuǎn)錄終止子。
8.其中已導(dǎo)入權(quán)利要求7的表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)由該DNA區(qū)段編碼的多肽。
9.選自下組的一種分離多肽(a)包含如SEQ ID NO2的第24位至37位殘基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位變體；和(c)(a)或(b)的正同系物。
10.選自下組的一種分離多肽(a)包含如SEQ ID NO2的第24位至41位殘基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位變體；和(c)(a)或(b)的正同系物。
11.選自下組的一種分離多肽(a)包含如SEQ ID NO2的第24位至117位殘基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位變體；和(c)(a)或(b)的正同系物。
12.選自下組的一種分離多肽(a)包含如SEQ ID NO2的第1位至37位殘基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位變體；和(c)(a)或(b)的正同系物。
13.權(quán)利要求9的分離多肽，其中所述多肽分子還包含如SEQ IDNO2的第1位至117位殘基所示的氨基酸序列。
14.一種藥物組合物，其中包含權(quán)利要求9的純化多肽與藥學(xué)上可接受載體的結(jié)合。
15.可與選自下組的多肽的表位結(jié)合的抗體(a)包含如SEQ ID NO2的第24位至117位殘基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位變體；和(c)(a)或(b)的正同系物。
16.zsig33多肽的制備方法，包括培養(yǎng)其中已導(dǎo)入了權(quán)利要求7的表達(dá)載體的細(xì)胞，從而所述細(xì)胞表達(dá)由該DNA區(qū)段所編碼的多肽；和回收該多肽。
17.一種刺激胃運(yùn)動(dòng)的方法，其中包括給有此需要的哺乳動(dòng)物施用足以提高攝入物質(zhì)的運(yùn)送時(shí)間或胃排空的一定量藥物組合物，該藥物組合物中含有選自下組的一種分離多肽(a)包含如SEQ ID NO2的第24位至37位殘基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位變體；和(c)(a)或(b)的正同系物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述運(yùn)送時(shí)間或胃排空是通過(guò)放射性標(biāo)記物質(zhì)測(cè)定的。
全文摘要
本發(fā)明涉及與促胃動(dòng)素有同源性的新型cDNA序列的多核苷酸、多肽及其肽片段,以及它們的用途。該新多肽的mRNA特異地分布于胃小腸和胰腺組織中。本發(fā)明還包括激動(dòng)劑、拮抗劑、抗體、表達(dá)新型促胃動(dòng)素同系物編碼cDNA的宿主細(xì)胞,以及利用該新分子提高胃動(dòng)力的方法。
文檔編號(hào)C07K14/575GK1254375SQ98804682
公開(kāi)日2000年5月24日 申請(qǐng)日期1998年3月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月24日
發(fā)明者P·O·舍帕德, T·A·戴舍爾 申請(qǐng)人:津莫吉尼蒂克斯公司