新糖蛋白的制作方法

專利名稱：新糖蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及新穎的聚酰胺共軛物、它們的制備方法和這些共軛物在治療性組合物中的用途。
在人與人之間進行的移植術所需的供體器官越來越缺乏，使人們對異種移植(從非人類的動物到人類的移植)產生了濃厚的興趣。目前，研究的焦點在于將易為利用的動物作為器官來源，例如豬。不過，豬到人的異種移植不得不克服一系列障礙，其中最直接和明顯的是超急性排斥(HAR)。HAR是由預先生成的“天然”多克隆抗體引起的，后者主要針對含有末端Galα1，3Gal結構的碳水化合物細胞表面抗原決定部位(抗αGal)。此外，也可能存在針對豬內皮上含有的N-羥乙酰基神經氨糖酸結構的其他抗體。
為了使移植物長期存活，需要一些策略來對付異種反應性抗體。一種方法是通過注射高親和力的配體來除去抗體，該配體可以充當抗體沉積在移植組織上的抑制劑。另一種方法是免疫除去法，它是血漿除去法的進一步發展，是在臨床上制定的類似于透析的操作程序。免疫除去法涉及血液的體外處理，首先分離血細胞，然后使血漿通過免疫親和柱，將血細胞與排除了抗體的血漿再次混合，將該血液重新輸入到患者體內。
因此，人們需要能夠體內鍵合的配體和能夠體外鍵合的柱材料，它們都能以較高親和力與多克隆異種反應性抗體鍵合。
本發明涉及聚酰胺共軛物，其包含鍵合到聚酰胺主鏈上的(a)異種抗原基；或(b)生物活性基和大分子、大的或小的實體；其中該聚酰胺主鏈包含至少一個式I的結構單元
在(b)的情況下，還包含至少一個式II的結構單元
其中A和A’各自獨立為三價橋連基；R1和R1’各自獨立為直接的鍵或C1-C6亞烷基；X1和X1’各自獨立為-C(O)O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-或-O-；R2和R2’各自獨立為直接的鍵或二價橋連基；X2和X2’各自獨立為直接的鍵或-O-或-NR-；其中的R為氫、OH、C1-C12烷基、C2-C12鏈烯基、C3-C8環烷基、C3-C8環烯基、C2-C7雜環烷基、C2-C11雜環烯基、C6或C10芳基、C5-C9雜芳基、C7-C16芳烷基、具有C2-C6亞烯基和C6或C10芳基-的C8-C16芳烯基、或二C6或C10芳基-C1-C6烷基；Y和Y’各自獨立為直接的鍵或二價橋連基；其條件是當R1或R1’是直接的鍵時，X1或X1’不是-NR-、-S-或-O-。
當本發明的聚酰胺主鏈包含一個以上式I或II的結構單元時，這些單元可以是相同或不同的。它可以是均聚的或共聚的，也可以是另外具有例如其他氨基羧酸等共聚單體的共聚物。共聚主鏈可以是嵌段聚合物，也可以是統計聚合物。若三價橋連基為手性，聚酰胺主鏈可以統一具有L構型或D構型，或者含有兩種構型的結構單元，作為均一的嵌段或包括外消旋物(1∶1混合物)的統計學混合物。
聚酰胺主鏈的結構單元的平均總數[n]可以在10至10000的范圍內，優選為50至1500，更優選為250至1200，最優選為900至1200。多分散性可以在1.001至2.0的范圍內，優選為1.1至1.5，更優選為1.15至1.2。
任何烷基和亞烷基原子團或部分都可以是直鏈或支鏈的。優選地，烷基為C1-C18烷基，更優選為C1-C4烷基，例如可以是甲基、乙基、正或異丙基、正、異或叔丁基。優選地，鏈烯基可以含有2至7個C原子。芳基或雜芳基可以是5元或6元環、或兩個稠合環的雙環原子團，雜芳基中存在的一個或幾個雜原子選自0、N和S原子。例子包括苯基、萘基、呋喃基、吡咯基等等。芳烷基優選具有7至12個C原子，可以是苯基C1-C6烷基，例如芐基或苯乙基。芳烯基的一個例子是肉桂基。A或A’可以是具有至少三價的單原子，例如C、N或Si；特別是
其中Raa為H、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C7環烷基、苯基或芐基。
R2或R2’作為二價橋連基，可以含有1至35個、優選為1至20個、特別是1至16個C原子，例如C1-C35亞烷基、C2-C8亞烯基、C2-C8亞炔基、C3-C12亞環烷基、C6-C10亞芳基或C7-C35亞芳烷基，其中的亞烷基、亞烯基和亞炔基原子團或部分可以被一個或幾個選自-O-、-S-、-C(O)-、-SO2-和-HN-的基團中斷。
橋連基R2或R2’例如可以符合式III-R5-X5-R6-X4-R7-(III)其中X5和X4各自獨立為直接的鍵、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-SO2O-、-OSO2-、-OSO2O-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-、-NHC(O)NH-、-NHSO2-、-SO2NH-、-NHSO2O-、-OSO2NH-或-NHSO2NH-；R5和R7各自獨立為直接的鍵、C1-C20亞烷基、C5或C6亞環烷基、C6-C10亞芳基或C7-C12亞芳烷基；R6為直接的鍵或C1-C20亞烷基，該亞烷基可選地被一個或幾個O原子中斷，優選為2個；其條件是當R6是直接的鍵時，X4也是直接的鍵。
優選地，R2或R2’可以是亞氧烷基或聚亞氧烷基，更優選地在亞烷基中具有2至4個C原子、特別是2或3個C原子，并且具有2至20個、優選為2至10個亞烷基單元，尤其是亞丙氧基和聚亞丙氧基，例如具有2至20個、優選為2至10個亞丙氧基單元的聚亞丙氧基。
以下把包含異種抗原基但不合大分子、大的或小的實體的聚酰胺共軛物稱為“I型共軛物”，把包含生物活性基和大分子、大的或小的實體的聚酰胺共軛物稱為“II型共軛物”。
在I型共軛物中，異種抗原基通過式I結構單元的Y結合到聚酰胺主鏈上。I型共軛物可以包含一個或幾個相同或不同的異種抗原基。
異種抗原基可以是用已知方法可鑒別的任意基團，例如US5695759所公開的方法(關于該方法的內容結合在此作為參考)，包括用異種移植物灌注血液，藉此從人血液中離析異種抗體，例如從異種移植物中除去鍵合的抗體，利用這些抗體例如通過適當的免疫測定法篩選出候選的抗原決定部位。
異種抗原基可以優選地從低聚糖衍生而來，該低聚糖在其還原末端終止于α-連接的D-吡喃半乳糖或N-羥乙酰基神經氨糖酸。
典型情況(關于I型和II型共軛物)下，低聚糖可以由1至20個、優選為1至15個、特別是1至10個糖單體組成，選自天然來源和修飾的糖單體。借助于下列有機化學或生物化學的標準著作，技術人員可熟悉天然來源和修飾的糖單體，和包含這些糖單體的低聚糖，例如最初由化學會編輯、現由倫敦皇家化學會編輯的《專業期刊報道》(Specialist Periodical Reports)，倫敦皇家化學會編、Ferrier等著《碳水化合物化學》(Carbohydrate Chemistry)29(1997)。
糖單體的例子包括D-與L-吡喃醛糖和D-與L-呋喃醛糖，例如甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔羅糖；D-與L-吡喃酮糖和D-與L-呋喃酮糖，例如二羥基丙酮、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖和塔格糖；以及D-與L-吡喃二酮糖，例如戊二酮糖(pentodiulose)和己二酮糖(hexodiulose)。
糖單體一詞也包括是所舉例子變體的糖單體，例如被保護的、部分被保護的或未被保護的D-與L-構型的脫氧糖，優選為2-、3-、4-、5-和6-脫氧醛糖，如巖藻糖、鼠李糖和洋地黃毒糖；1，2-二脫氧醛糖，如葡萄烯糖(glucal)、半乳醛和巖藻醛(fucal)；1-、3-、4-、5-和6-脫氧酮糖；D-與L-構型的2-、3-、4-、5-和6-脫氧氨基糖，如葡萄糖胺、甘露糖胺、半乳糖胺和巖藻糖胺；和脫氧酰氨基糖，如N-酰基葡萄糖胺、N-酰基甘露糖胺、N-酰基半乳糖胺和N-酰基巖藻糖胺，優選為它們的C1-C4烷基酯。另外，這些變體被理解為指的是醛糖糖酸、醛糖二酸和糖醛酸，如葡糖酸或葡糖醛酸，以及抗壞血酸和攜帶氨基酸的糖單體。修飾的糖單體也被理解為指的是具有一個長于6個C原子的碳鏈的糖單體，如庚糖、辛糖、壬糖、庚酮糖、辛酮糖和壬酮糖，以及根據上面列舉的條件而被取代的其代表產物，如酮基脫氧辛酸、酮基脫氧壬酸、N-酰基神經氨糖酸和N-酰基胞壁酸(muraminic acid)。
如果二、三、四或五個上述相同或不同的單體裝配在一起，那么所得的糖表示為二糖、三糖、四糖或戊糖。鍵優選為α-O-配糖鍵或β-O-配糖鍵，例如(1→2)-、(1→3)-、(1→4)-、(1→5)-、(1→6)-、(2→3)-和(2→6)-配糖鍵。二糖的例子為海藻糖、槐糖、曲二糖、昆布二糖、麥芽糖、纖維二糖、異麥芽糖、龍膽二糖、蔗糖和乳糖，及它們的衍生物。三糖的例子為棉子糖和松三糖。而且，低聚糖可以通過S-、N-和C-配糖鍵連接，例如-S-、-NR12-、-NR12C(O)-或-CR13R14-，其中R12、R13和R14彼此獨立為H、C1-C12烷基、C5或C6環烷基、C5或C6環烷基甲基或乙基、苯基、芐基或苯乙基。
在I型共軛物中，單獨或以任意組合或其亞組合使用的下列含義是優選的(a)A為C1-C6烷三基(alkanetriyl)，更優選為甲烷三基(methanetriyl)；(b)R1為C1-C6亞烷基，更優選為-(CH2)4-；(c)X1為-NR-，其中的R具有上述含義，更優選地X1為-NH-；(d)R2為直接的鍵；(e)X2為直接的鍵；(f)Y為式III基團，其中的R5為C1-C8亞烷基，X5為-NH-，R6為直接的鍵，X4為-C(O)-，R7為C1-C8亞烷基，優選地Y為式IIIa基團-(CH2)mNHC(O)(CH2)3-(IIIa)其中的m是一個1至8的數字，優選為1至6；其中關于式I，-(CH2)3-鍵合到S上；(g)異種抗原基、以下稱之為R3a，是式IVa1、IVb1、IVc1、IVd1或IVe1基團
其中各Rz獨立為ORz1、SRz1或NHXzRz1，其中的Xz為-C(O)-、-C(S)-、-S(O)2-、-C(O)Y-或-C(S)Y-，其中的Y為-NH-、-O-、-S-、-S-C1-C6亞烷基、-NH-C1-C6亞烷基、-O-C1-C6亞烷基、-C1-C6亞烷基-O-、-C1-C6亞烷基-S-、-C1-C6亞烷基-NH-、-C1-C6亞烷基-O-C(O)O-、-C1-C6亞烷基-S-C(O)O-或-C1-C6亞烷基-NH-C(O)O-，Rz1為氫、C1-C20烷基、C2-C20鏈烯基、C3-C15環烷基、C3-C15環烯基、C6-C10芳基、C7-C20芳烷基或C2-C9雜芳基，其中的烷基、烯基、環烷基、環烯基、芳基、芳烷基和雜芳基是未取代的或被一個或幾個取代基取代，取代基選自OH、鹵素、鹵代C1-C20烷基、硝基、C1-C18烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烯氧基、氨基、一-C1-C18烷基氨基、二-C1-C18烷基氨基、芐氨基、SO3H、SH、硫代C1-C18烷基和NHC(O)-C1-C18烷基；Zz為-O-或-NHC(O)-；優選為式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf基團
特別優選的I型共軛物中，R3a-Y-為式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基團
一小類優選的I型共軛物包含至少一個式I*結構單元
其中A、R1、X1、R2、X2和Y是如上定義的，R3a為異種抗原基，更優選為式Ia1a的結構單元，最優選為式Iaa的結構單元，
其中Y為式IIIa基團，R03a為式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf基團。
特別優選的I型共軛物包含至少一個式Iaa的結構單元，其中-Y-R03a為式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基團。
按照本發明，I型共軛物的聚酰胺主鏈可以另外包含至少一個式VI的結構單元，
其中A”、R1”、X1”、R2”和X2”獨立地分別具有如上A、R1、X1、R2和X2所定義的含義和優選含義，R8為極性基團，優選為多羥基-C2-C12烷基或多羥基-C3-C12環烷基，更優選為具有1至6個、優選為2至5個羥基的多羥基-C2-C6烷基或多羥基-C3-C6環烷基，最優選為-CH2CHOHCH2OH。
一小類優選的式VI結構單元為式VIa
其中R8是如上定義的。特別優選的式VI結構單元為式VIb1
更優選為式VIb
特別優選的I型共軛物包含至少一個式I*的結構單元和至少一個式VI的結構單元，其中A、A”、R1、R1”、X1、X1”、R2、R2”、X2、X2”、Y、R3a和R8具有上述含義和優選含義。
最優選的I型共軛物包含至少一個式Iaa的結構單元，其中-Y-R03a為式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基團，和至少一個式VIb的結構單元。
在新穎的I型共軛物中，式I*和式VI結構單元的含量例如可以是0.1至99.9mol％，在I型共軛物僅由式I*和式VI結構單元組成的情況下，二者的值加起來等于100％。對于式I*的結構單元來說，含量例如可以是1至50％，優選為10至30％。對于式VI的結構單元來說，含量可以是0至99％，優選為70至90％。
優選的I型共軛物是其中結構單元的平均總數[n]在200至300的范圍內，多分散性為1.1至1.2，式Iaa結構單元的比例[x]為5至30％，或者[n]在900至1200的范圍內，多分散性為1.1至1.2，[x]為5至50％；式VIb結構單元的比例[z]為45至94％；R03a-Y-是相同或不同的，并且選自式Va、Vb、Vc、Vd、Ve和Vf基團。
優選的I型共軛物例子是其中(a)n為250，若R3a-Y-為式Vb基團，則[x]為25％；+75％[z]；(b)n為250，若R3a-Y-為式Vc基團，則[x]為8％；+92％[z]；(c)n為250，若R3a-Y-為式Vc基團，則[x]為16％；+84％[z]；(d)n為250，若R3a-Y-為式Vc基團，則[x]為41％；+59％[z]；(e)n為250，若R3a-Y-為式Vc基團，則[x]為61％；+39％[z]；(f)n為250，若R3a-Y-為式Vd基團，則[x]為23％；+77％[z]；(g)n為250，若R3a-Y-為式Vf基團，則[x]為22％；+78％[z]；(h)n為1000，若R3a-Y-為式Vc基團，則[x]為24％；+76％[z]；(i)n為1050，若R3a-Y-為式Vb基團，則[x]為21％；+79％[z]；(j)n為1050，若R3a-Y-為式Vc基團，則[x]為28％；+72％[z]；(k)n為1050，若R3a-Y-為式Vf基團，則[x]為25％；+75％[z]；(1)n為1050，若R3a-Y-在式I*結構單元三分之一中為式Vb基團，在另三分之一中為式Vc基團，在另三分之一中為式Vf基團，則[x]為27％；+73％[z]；特別例如(i)至(1)。
可以得到新穎的I型共軛物的方法包括使包含至少一個式VII結構單元的聚酰胺
其中A、R1、X1、R2和X2是如上定義的，X3為鹵素，該聚酰胺例如可以由WO 97/19105所公開的方法得到，與式VIIIa’的硫醇反應，R3a-Y-SH (VIIIa’)其中R3a和Y是如上定義的。
該硫醇是已知的，或者可以按照已知方法制備，例如使氨基官能化的異種抗原、如低聚糖與硫代內酯反應。
若異種抗原為一種糖類，它可以按照常規化學過程制備，即利用酶或者隨后用一種混合方法。酶在制備低聚糖衍生物中的用途例如公開在WO 97/28173和WO 97/28174中。
可以得到另外包含至少一個式VI結構單元的I型共軛物的方法包括使包含至少兩個式VII結構單元的聚酰胺與一個或幾個化合物反應，該化合物選自式VIIIa’的硫醇和式IX的硫醇R8-SH (IX)其中R8是如上定義的。
優選地，反應可以在一種強的、非親核性堿的存在下進行，優選為具有至少一個叔N原子的有機堿；特別是二環或多環胺。例子為奎寧環和1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(1，5-5)(DBU)。堿的用量可以至少為等摩爾量，優選為輕微過量。
反應也可以利用堿金屬硫醇鹽R3aSM來進行，其中M為一種堿金屬，例如Li或Na。
可以使用一種極性非質子傳遞溶劑，優選為氮二烷基化的羧酰亞胺、內酰胺、亞砜或砜，例如二甲基甲酰胺。加入或不加入水都可進行反應，例如所加入水的量使聚合物保持在溶液中。實施例A至C1公開了制備I型共軛物的非限制性詳細描述。
新穎的I型共軛物具有有趣的性質，特別是它們具有對體液、例如血液中存在的人多克隆異種反應性抗體的親和力，可用作配體或排除劑。優選地，I型共軛物用于異種抗體的體內排除，方法是在異種移植物的移植之前和/或之后，將I型共軛物給藥，例如注射、輸入或灌注到異種移植物接受者體內。劑量可以是每次注射0.0001至10、優選為0.01至5、更優選為0.2至2mg每kg體重。根據需要，可以在移植前和/或移植后重復給藥，只要抗體的去除具有治療上的益處。
新穎的I型共軛物也可以用作藥物，用于誘導對異種抗原的抗原決定部位產生耐受性或無變應性，或者用來特定地對準具有異種抗原受體的B細胞。當在異種移植物的移植之前例如通過注射給藥到異種移植物接受者體內時，I型共軛物的劑量可以是每次注射0.0001至10、優選為0.001至5、更優選為0.02至2mg每kg體重。根據需要，可以重復注射，以達到耐受性。
I型共軛物的給藥方式可以是以單一的共軛物，或者不同I型共軛物的混合物本身的方式或以適合于靜脈內給藥的組合物的方式，例如為此加之以一種或幾種藥學上可接受的載體或稀釋劑。這樣的混合物可以包含具有不同聚酰胺主鏈和/或異種抗原基的I型共軛物。
優選的組合物中，I型共軛物包含相同或不同的異種抗原基，或者優選的組合物包含I型共軛物的混合物，每種共軛物包含相同或不同的異種抗原基，該異種抗原基來源于一種二糖、優選為式IVb基團，一種三糖、優選為式IVc或IVd基團，或一種戊糖、優選為式IVe或IVf基團。優選地，組合物可以包含這樣一種I型共軛物，它包含一個來源于二糖的基團、一個來源于三糖的基團和一個來源于戊糖的基團，其比例為5至0.1∶5至0.1∶5至0.1，優選的比例為1∶1∶1，或者組合物可以包含I型共軛物的混合物，每種共軛物包含相同的異種抗原基，該異種抗原基來源于一種二糖、一種三糖或一種戊糖，組合物中存在的共軛物比例為5至0.1∶5至0.1∶5至0.1，優選的比例為1∶1∶1。
按照上述，本發明進一步提供了(a)用作藥物的I型共軛物，優選地用作用于從人體液中除去異種抗體的藥劑，或者用作在誘導耐受性或無變應性中提供異種抗原的配體；(b)從異種移植物接受者中除去異種抗原的抗體的方法，該方法包括在體內使所述體液與(a)下的I型共軛物接觸；(c)用于在需要接受治療的受治療者中，誘導對異種抗原的抗原決定部位產生耐受性或無變應性、或者用來特定地對準具有異種抗原受體的B細胞的方法，該方法包括在異種移植物的移植之前和/或之后，將有效量(a)下的I型共軛物例如通過注射、輸入或灌注給藥到異種移植物接受者體內；(d)包含一種(a)下的I型共軛物或如上文所公開的I型共軛物混合物的組合物，優選用在一種方法中，該方法用于從人體液中除去異種抗體或誘導對異種抗原的抗原決定部位產生耐受性或無變應性、或特定地對準具有異種抗原受體的B細胞。
在II型共軛物中，生物活性基通過式I結構單元的Y共軛連接到聚酰胺主鏈上，大分子、大的或小的實體通過式II結構單元的Y’共軛連接到聚酰胺主鏈上。II型共軛物可以包含一種或幾種相同或不同的生物活性基。II型共軛物可以包含一種或幾種相同或不同的大分子、大的或小的實體。單獨一個實體可以連接到來自同一條聚酰胺主鏈的一個、或同時2個或多個結構單元上。另一種選擇是，單獨一個實體可以同時連接到來自不同聚酰胺主鏈的一個或幾個結構單元上。
生物活性基的例子是來源于下列物質的原子團生物堿、碳水化合物、維生素、肽、蛋白質、共軛蛋白、脂質、萜類、低聚核苷酸、抗原和抗體；或任意其他配體，優選以多價方式被其受體或細胞表面識別。優選地，生物活性基來源于抗原，優選為異種抗原，更優選為一種低聚糖，該低聚糖在其還原末端終止于α-連接的D-吡喃半乳糖或N-羥乙酰基神經氨糖酸，例如上文有關I型共軛物的描述。
大分子、大的或小的實體的例子有球狀蛋白質，如血清白蛋白或KLH；聚合物，如聚酰胺、聚酰亞胺、聚乙二醇、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、它們的共聚物及嵌段聚合物、天然及修飾多糖；玻璃珠，硅膠，硅藻土，和由聚集或交聯的脂質單層或雙層、或多個雙層形成的結構。如果大分子、大的或小的實體是一種多糖，它可以由20個以上的糖單體組成，分子量由幾千至高達一億。天然和修飾多糖是為技術人員所熟悉的，它們具有不同的循環單糖單元、鏈長和支化度的性質。修飾的天然多糖可以包括可通過天然多糖與單、雙或多官能的試劑或氧化劑的反應而得到的衍生物，該反應可以通過成醚、成酯或選擇性氧化作用，基本上是以多糖羥基的修飾為基礎的。特別有用的是交聯的多糖，優選為三維連接的多糖。天然和修飾多糖的例子有天然和修飾的淀粉、纖維素、葡聚糖和瓊脂糖。作為交聯、優選為三維連接的多糖，特別有用的是Sephacryl和瓊脂糖Sepharose及其衍生物，例如NHS活化的CH-Sepharose4B或NHS活化的Sepharose 4 Fast Flow(商業上可得到的)。
在II型共軛物中，單獨或以任意組合或其亞組合使用的A、A’、R1、R1’、X1、X1’、R2、R2’、X2和X2’各自獨立地具有如上I型共軛物給出的優選含義之一，包括(g)Y’為式III基團，其中R5為直接的鍵，X5為-NH-，R6為-[(CH2)2O]2(CH2)2-，X4為-NHC(O)-，R7為C1-C8亞烷基，優選地，Y’為IIIb基團-NH[(CH2)2O]2(CH2)2NHC(O)(CH2)3- (IIIb)其中關于式II，-(CH2)3-是連接到S上的；(h)生物活性基、以下稱之為R3，是上式IVa1、IVb1、IVc1、IVd1或IVe1基團，優選為上式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf基團；(i)大分子、大的或小的實體以下稱之為R4，優選來源于天然或修飾多糖，更優選來源于纖維素、瓊脂糖或瓊脂糖凝膠，特別是來源于NHS活化的CH-Sepharose 4B或NHS活化的Sepharose 4 FastFlow，最優選來源于NHS活化的Sepharose 4 Fast Flow。
特別優選的II型共軛物中，R3-Y-為上式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基團。
一小類優選的II型共軛物包含至少一個式I**的結構單元
其中A、R1、X1、R2、X2和Y是如上定義的，R3為生物活性基，更優選為式Ia1的結構單元
最優選為式Ia的結構單元
其中的Y為式IIIa基團，R03為式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf基團。
特別優選的II型共軛物包含至少一個式Ia的結構單元，其中-Y-R03為Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基團。
特別優選的II型共軛物中，R4-Y’-為式Vg基團
一小類優選的II型共軛物包含至少一個式II*的結構單元
其中A、R1、X1、R2、X2和Y是如上定義的，R4為大分子、大的或小的實體，更優選為式IIa1的結構單元
最優選為式IIa的結構單元
其中的-Y’-R04為式Vg基團。
按照本發明，II型共軛物的聚酰胺主鏈可以另外包含至少一個式VI的結構單元，其全部含義和優選含義同上。
特別優選的II型共軛物包含至少一個式I**的結構單元、至少一個式II*的結構單元和至少一個式VI的結構單元，其中A、A’、A”、R1、R1’、R1”、X1、X1’、X1”、R2、R2’、R2”、X2、X2’、X2”、Y、Y’、R3、R4和R8具有如上所述的含義和優選含義。
最優選的II型共軛物包含至少一個式Ia的結構單元、其中-Y-R03為式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基團，還包含至少一個式IIa的結構單元和至少一個式VIb的結構單元。
在新穎的II型共軛物中，式I**、II*和VI結構單元的含量例如為0.1至99.9mol％，在II型共軛物僅由式I**、II*和VI結構單元組成的情況下，各值相加之和等于100％。對式I**的結構單元來說，其含量例如可以是1至50％，優選為10至30％。對式II*的結構單元來說，其含量例如可以是0.1至20％，優選為0.1至5％。對式VI的結構單元來說，含量可以是0至98.9％，優選為50至98.9％。下表公開了有用的比例的例子
優選的II型共軛物是其中結構單元的平均總數[n]在200至300的范圍內，多分散性為1.1至1.2，式Ia結構單元的比例[x]為5至30％，式中的R03-Y-基團選自由Va、Vb、Vc、Vd、Ve和Vf基團組成的組，式IIb結構單元(式IIa結構單元的中間體，見下)的比例[y]為1至5％
其中Z-Y”為H2N[(CH2)2O](CH2)2NHC(O)(CH2)3-；或者是其中[n]在900至1200的范圍內，多分散性為1.1至1.2，[x]為5至50％，[y]為1至5％；式VIb結構單元的比例[z]為45至94％。
優選的II型共軛物例子是其中(a)n為250，若R3-Y-為式Vc基團，[y]為2％，則[x]為25％；+73％[z]；(b)n為250，若R3-Y-為式Vc基團，[y]為2.6％，則[x]為14％；+83.4％[z]；(c)n為250，若R3-Y-為式Va基團，[y]為2％，則[x]為21.5％；+76.5％[z]；(d)n為1050，若R3-Y-為式Vc基團，[y]為2.6％，則[x]為13％；+84.4％[z]；
(e)n為1050，若R3-Y-為式Vb基團，[y]為2.5％，則[x]為16％；+81.5％[z]；(f)n為1050，若R3-Y-為式Vf基團，[y]為2.5％，則[x]為12.5％；+85％[z]；或(g)n為1050，若R3-Y-為式Ve基團，[y]為2.5％，則[x]為16％；+81.5％[z]；特別例如(d)至(g)。
可以得到新穎的II型共軛物的方法包括使包含至少兩個上式VII結構單元的聚酰胺與一個或幾個選自下組的化合物或實體反應式VIII的硫醇R3-Y-SH (VIII)其中的R3和Y是如上定義的，式VIIIa的硫醇Z-Y”-SH (VIIIa)其中Y”為式III的橋連基，其中R5為直接的鍵，其他含義是如上定義的，Z為氫或X4的保護基團，優選為氨基保護基團，和適當衍生的大分子、大的或小的實體。
包含由式VII結構單元與式VIIIa硫醇反應生成的結構單元的聚酰胺共軛物可以在除去保護基團Z后，方便地與式VIII硫醇或適當衍生的大分子、大的或小的實體進行進一步反應。
對“適當衍生的大分子、大的或小的實體”一詞的理解是指攜帶至少一個適于與式IIb結構單元反應的官能團的大分子、大的或小的實體。用于大實體偶聯的官能團例子是為技術人員所已知的，例如描述在Gabius and Gabius(Eds.)《凝集素與癌癥》53ff，Springer Verlag，Berlin Heidelberg(1991)中。例如胺/活化的羧酸酯(N-羥基-琥珀酰亞胺酯、五氟苯基酯)、胺/環氧化物、胺/異氰酸酯、胺/異硫氰酸酯、胺/Michael受體(馬來酰亞胺)、硫醇/適硫物(thiophil)和胺/醛。
衍生的大分子、大的或小的實體可以通過大分子、大的或小的實體與已知的雙官能連接體的反應來制備。
按照上文公開的得到式VIIIa’硫醇的方法，可以得到式VIII和VIIIa的硫醇。
可以得到另外包含式VI結構單元的II型共軛物的方法包括使包含至少三個式VII結構單元的聚酰胺與一個或幾個化合物或實體反應，選自上述式VIII與VIIIa硫醇、適當衍生的大分子、大的或小的實體和式IX硫醇。特別是該方法可以包括使包含至少三個式VII結構單元的聚酰胺與一個或幾個選自上式VIII、VIIIa和IX硫醇的化合物或實體反應，消去保護基團Z，并進一步使所得化合物與適當衍生的大分子、大的或小的實體反應。
反應條件可以按照上述I型共軛物的反應條件。
實施例A至D公開了制備II型共軛物的非限制性詳細描述。
新穎的II型共軛物具有有趣的性質。特別是它們具有對人多克隆異種反應性抗體的親和力，可用作人體液親和色譜法的吸附劑。優選地，體液為血液，特別是血漿。
優選地，II型共軛物用于體外從體液中除去抗體，包括在異種移植物的移植之前和/或之后從異種移植物接受者體內抽出含抗體的體液，通過含有II型共軛物作為吸附劑的親和色譜法從體液中除去預先形成的抗體，然后將排除了抗體的體液重新輸入到接受者體內。
親和色譜法可以優選地以柱色譜法的方式進行，其中按照本領域技術人員已知的方法用II型共軛物裝填柱子，例如US 5149425所述，其有關柱子的裝填、貯存和使用方面的內容結合在此作為參考。
II型共軛物可以僅以單獨一種共軛物的方式使用，或者以不同II型共軛物本身的混合物的方式使用，或以適用于親和色譜法的組合物的方式使用。該混合物可以包含具有不同聚酰胺主鏈、大分子、大的或小的實體和/或抗原基的II型共軛物。
優選的組合物中，II型共軛物包含相同或不同的異種抗原基，或者優選的組合物包含II型共軛物的混合物，每種共軛物包含相同或不同的異種抗原基，該異種抗原基來源于一種二糖、優選為式IVb基團，來源于一種三糖、優選為式IVc或IVd基團，或來源于一種戊糖、優選為式IVe或IVf基團。
用于從患者體液中除去抗體的方法可以按照已知方法進行，例如公開在US 5695759中。優選的接觸溫度可以在5℃至40℃范圍內，優選為25℃至40℃。可以直接將體液連續地重新輸入，或者可以先收集，再重新輸入。根據需要，可以在移植前和/或移植后重復該方法，只要抗體的除去具有治療上的益處。
按照上述，本發明進一步提供了(a)II型共軛物，優選地在體液的親和色譜法中用作吸附劑；(b)從人體液中除去抗體的方法，該方法包括使所述體液與(a)下的II型共軛物進行體外接觸，再將體液重新輸入到患者體內；(c)包含(a)下的II型共軛物或如上文所公開的II型共軛物的混合物的組合物，優選地用在從人體液中除去異種抗體的方法中；和(d)親和色譜法藥筒，包含II型共軛物或其混合物或(c)下的組合物作為吸附劑。
下列實施例沒有限制地闡述本發明。
實施例中使用下列縮寫Ac乙酰基；Bn芐基；Bz苯甲酰基；DBU1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯；DMFN，N-二甲基甲酰胺；DMTST二甲基甲硫基锍三氟甲磺酸酯；eq當量；GlcNAcN-乙酰基葡萄糖胺；n聚合度；Sepharose 4 fast flowNHS活化的Sepharose 4 Fast F1ow(Pharmacia Biotech)；TESOTf三乙基甲硅烷基三氟甲磺酸酯；UDP-Gal尿苷-O(6)-二磷酰基-α-D-半乳糖；RT室溫。
通過對這些化合物的琥珀酰衍生物進行粘度測量和SEC-LALLS(體積排阻色譜法/低角度激光散射法)，測定商業上可從SIGMA得到的聚賴氨酸氫溴化物的平均分子量(M)和多分散性。
A原料化合物的制備實施例A1乙基O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)3的制備
用類似于制備對應的甲硫基衍生物的方法(Garegg和Oscarson《碳水化合物研究》136207-213(1985))制備乙基4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷1，并溶(2.12g，4.47mmol)于無水二乙醚(40ml)和無水二氯甲烷(25ml)。在-25℃、氬氣下，加入1ml TESOTf(225μl)的無水二乙醚(10ml)溶液。然后在-25℃下，歷時7分鐘，加入2，3，4，6-四-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基三氯乙酰亞氨化物(acetimidate)2(7.50g，11.18mmol；按照Wegmann和Schmidt《碳水化合物化學雜志》6357-375(1987)制備)在無水乙醚(22ml)和無水二氯甲烷(11ml)中的溶液。在-25℃下攪拌10分鐘后，加入NaHCO3(10％)(50ml)，繼續劇烈攪拌10分鐘。加入水(100ml)，分離有機相。含水相用二氯甲烷萃取兩次(每次80ml)，有機相用水(100ml)和飽和鹽水(100ml)洗滌，用MgSO4干燥，在減壓下蒸發溶劑。粗產物(10.25g)經硅膠(700g)色譜法純化，用己烷/乙酸甲酯(5∶1)作為洗脫劑，得到乙基O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)3。
實施例A2(3-芐氧基羰基氨基)丙基6-O-芐基-2-脫氧-2-四氯苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷14的制備
(a)用4.1M HBr的乙酸(35ml)溶液處理12.55g(20.4mmol)按照Castro-Palomino和Schmidt方法(《四面體快報》365343-5346(1995))制備的1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脫氧-2-四氯苯二甲酰亞氨基-D-吡喃葡萄糖9。在RT下攪拌18小時后，在冰冷卻和攪拌下小心地將該混合物加入到CHCl3(50ml)和NaHCO3水溶液(10％)(400ml)中。用10％NaHCO3中和(pH7)，隨后用CHCl3萃取(3次150ml)。有機相用飽和鹽水(200ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，在減壓下蒸發溶劑，得到粗的1-溴-3，4，6-三-O-乙酰基-2-脫氧-2-四氯苯二甲酰亞氨基-D-吡喃葡萄糖10，不經純化用于后面的反應中。
(b)向粗產物10(13.15g)的165ml無水甲苯溶液中加入3-芐氧基羰基氨基-1-丙醇(8.61g，41.3mmol)和氰化汞(10.45g，41.3mmol)。混懸液攪拌18小時，用棉絮塞過濾，在減壓下蒸發溶劑。殘余物經硅膠(1.3kg)色譜法純化，用己烷/乙酸乙酯(2∶1)作為洗脫劑，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基3，4，6-三-O-乙酰基-2-脫氧-2-四氯苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷11。
(c)向乙酸酯11(8.18g，10.7mmol)的無水甲醇(220ml)溶液中加入2.4ml鈉(820mg)在無水甲醇(40ml)中的溶液。混合物在RT下攪拌15分鐘，隨后用Amberlite 15H*陰離子交換樹脂(2.8g)處理15分鐘。過濾并在減壓下蒸發溶劑，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基2-脫氧-2-四氯苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷12。
(d)向粗產物12(6.46g)在乙腈(60ml)和α，α’-二甲氧基甲苯(2ml)中的溶液中加入對甲苯磺酸一水合物(96mg)。在RT下攪拌15分鐘后，混合物用乙酸乙酯(350ml)稀釋，用10％NaHCO3水溶液(180ml)萃取，隨后用飽和鹽水(180ml)萃取。有機相用Na2SO4干燥，在減壓下蒸發溶劑。殘余物(6.63g)經硅膠(800g)色譜法純化，用己烷/乙酸乙酯(2∶1)洗脫，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基4，6-二-O-亞芐基-2-脫氧-2-四氯苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷13。
(e)在0℃、氬氣下，向縮醛13(3.74g，5.15mmol)的無水THF(150ml)溶液中加入分子篩4(10g)和NaCNBH3(2.91g，46.35mmol)。在攪拌下加入醚合HCl，直到起泡停止。在1.5小時內，再加入兩份飽和的醚合HCl(每次5ml)，繼續在0℃下攪拌18小時。然后歷時90分鐘加入另外三份醚合HCl各5ml，45分鐘后將混合物傾入冰水(250ml)中。燒瓶用二氯甲烷沖洗，混合物攪拌10分鐘。過濾(硅藻土Celite)后用CH2Cl2萃取。含水相用CH2Cl2(100ml)萃取第二遍，有機相用飽和鹽水(300ml)洗滌，用Na2SO4干燥，在減壓下除去溶劑。殘余物(5.03g)經硅膠(60g)色譜法純化，用己烷/乙酸乙酯(1∶1)洗脫，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基6-O-芐基-2-脫氧-2-四氯苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷14。1H-NMR(400MHz，CDCl3)1.5-1.8(m，CH2)；3.0-3.25(m，NCH2，OH)；3.40(b，OH)；3.5-3.6和3.77-3.87(2m，OCH2)；3.55-3.65(m，H-C(4)，-C(5))；4.05-4.17(m，H-C(2))；4.2-4.3(m，H-C(3))；4.50和4.57(2d，J＝12，OCH2C6H5)；4.9-5.05(m，C(O)OCH2C6H5)；5.1-5.2(m，NH)；5.15(d，J＝8，H-C(1))；7.2-7.4(m，2C6H5)。峰的分配是根據2維1H/1H-相關光譜(COSY)和1H/13C-相關光譜(HSQC)得出的。
實施例A3(3-乙酰氨基氨基)丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)A5的制備
將按照實施例A9e制備的8(13mg，0.0216mmol)、N-乙酰氧基琥珀酰亞胺(3.4mg，0.0324mmol)和二異丙基乙胺(7.3μl，0.0432mmol)的DMF(1ml)溶液在RT下攪拌15小時。在減壓下蒸發溶劑，并經色譜法純化(5g硅膠，氯仿/甲醇/水＝30∶30∶2)，得到A5；1H-NMR(400MHz，D2O)，選擇的信號1.6-1.75(m，OCH2CH2CH2NH)；2.90和2.95(2s，2NH-COCH3)；3.02-3.12和3.12-3.22(2m，O(CH2)2CH2NH)；4.43和4.47(2d，J＝8，H-C(1)，H-C(1’))；5.08(d，J＝4，H-C(1”))。
實施例A43，4，6-三-O-乙酰基-2-脫氧-2-苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亞氨化物37的制備
(a)向按照實施例A2a制備的10(12.3g，18.73mmol)的丙酮(175ml)溶液中加入水(55ml)。在RT下攪拌18小時后蒸發溶劑，殘余的水溶液用甲苯萃取(3×100ml)。有機相的殘余物經色譜法純化(硅膠500g，CH2Cl2& 2％ CH3OH)，得到3，4，6-三-O-乙酰基-2-脫氧-2-苯二甲酰亞氨基-D-吡喃葡萄糖36(主要為β-端基異構體)。
(b)向36(4.0g，6.98mmol)和三氯乙腈(4.2ml，14.88mmol)的CH2Cl2(25ml)溶液中加入18g微細粉碎的無水K2CO3。在RT下攪拌60分鐘后，混合物通過Celite過濾。色譜法(硅膠500g，己烷/乙酸乙酯＝2∶1)得到37(β-端基異構體)。
實施例A5(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)35的制備
(a)在0℃和機械攪拌下，向干燥乳糖28(100g，0.28mol)的吡啶(500ml)混懸液中滴加苯甲酰氯(520ml，5.0mol)。加入4-(N，N-二甲氨基)吡啶后，混合物在RT下攪拌3天，在100℃下再攪拌2天。然后將反應混合物傾入冰水中，用乙酸乙酯萃取。有機相用飽和NaHCO3溶液和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥，蒸發溶劑，使吡啶與甲苯進行共蒸發，得到粗的O-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(1，2，3，6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖)29，為端基異構體混合物。
(b)將29(150g，0.127mol)溶于二氯甲烷(500ml)，在-10℃下加入4.1M HBr的乙酸(100ml)溶液。使混合物溫度緩慢升至RT，用TLC(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)監測轉化過程。反應完全后，混合物用4N NaOH小心地中和，然后傾入冰水中。用乙酸乙酯萃取，萃取液用飽和NaHCO3溶液、鹽水和水洗滌，蒸發溶劑，殘余物在高真空下干燥，得到O-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(1-脫氧-1-溴-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖)30。
(c)在氬氣下，將30(18.9g，16.7mmol)和N-芐氧基羰基丙醇胺(7.0g，33.5mmol)溶于甲苯(絕對，150ml)。在攪拌下加入Hg(CN)2(8.45g，33.45mmol)和HgBr2(1.21g，3.35mmol)。混合物在RT下攪拌18小時，然后經Celite過濾，殘余物用快速色譜法純化(洗脫劑∶甲苯/正己烯/乙酸乙酯5∶5∶2，v/v)，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)31。
(d)在氬氣、RT下，將31(16.3g，12.9mmol)溶于甲醇(絕對，90ml)。加入新制備的NaOMe甲醇溶液(1N，3.9ml)，溶液攪拌16小時。然后再加入NaOMe溶液(3.9ml)，繼續另攪拌7小時。混合物用乙酸中和，并蒸發。殘余物用快速色譜法純化(洗脫劑CH2Cl2/MeOH2∶1，v/v)，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)32。
(e)在回流溫度下，向32(6.5g，12.18mmol)的丙酮(500ml)溶液中加入對甲苯磺酸(770mg，4.06mmol)。20分鐘后反應混合物用NaHCO3溶液(10％)驟冷，蒸發溶劑。殘余物用二氯甲烷萃取數次，用水洗滌，干燥并蒸發。粗產物用快速色譜法純化(洗脫劑∶乙酸乙酯/甲醇9∶1，v/v)，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(3，4-二-O-亞異丙基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)33。
(f)在RT、氬氣下，一邊攪拌一邊向33(2.2g，3.84mmol)的吡啶(絕對，60ml)溶液中滴加苯甲酰氯(6.68ml，57.6mmol)。溶液攪拌16小時。蒸發混合物，并再次溶于二氯甲烷。有機相用1N HCl和水洗滌數次，用NaHCO3溶液(10％)中和。干燥后蒸發溶劑，殘余物用快速色譜法純化(洗脫劑∶甲苯/丙酮15∶1，v/v)，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2，6-二-O-苯甲酰基-3，4-二-O-亞異丙基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)34。
(g)在氬氣下，將34(3.4g，3.11mmol)的乙酸/水(60ml，4∶1，v/v)混懸液在100℃下加熱40分鐘。混合物冷卻至RT，并蒸發。使殘余物與甲苯共蒸發數次，用快速色譜法純化(洗脫劑∶甲苯/丙酮5∶1，v/v)，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)35。
實施例A6(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)A9的制備
(i)(a)將37(無水，3.5g，4.88mmol)和35(無水，2.7g，2.56mmol)的二氯甲烷(絕對，30ml)溶液冷卻至-20℃，加入TESOTf(58μl，0.1eq.)。3小時后另外加入TESOTf(0.2eq.)。另一小時后，反應混合物用三乙胺中和，蒸發，并與甲苯共蒸發兩次。殘余物用快速色譜法純化(洗脫劑∶甲苯/丙酮7∶1，v/v)，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2-脫氧-2-四氯苯二甲酰亞氨基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)38。
(b)在氬氣下，將38(2.64g，1.64mmol)的乙醇(絕對，80ml)溶液在60℃下用乙二胺(220μl，3.28mmol)處理。2小時后，另外加入乙二胺(110μl)，另一小時后，混合物蒸發，并與甲苯共蒸發數次。殘余物用吡啶/乙酸酐(120ml，2∶1，v/v)處理，在RT、氫氣下攪拌60小時。混合物蒸發，并與甲苯共蒸發數次，殘余物用快速色譜法純化(甲苯/丙酮3∶1，v/v)，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)39。
(c)將39的甲醇(絕對，100ml)溶液用新制備的NaOMe(1N，1ml)溶液處理，在RT、氫氣下攪拌16小時。混合物用TFA中和，并蒸發。殘余物用快速色譜法純化(二氯甲烷/甲醇2∶1，v/v)，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)40。
(d)向40(230mg，0.312mmol)、UDP-Gal(273mg，0.447mmol)、BSA(17mg)和MnCl2·6H2O(73.5mg，0.313mmol)在20ml二甲基胂酸鈉緩沖液(0.1M，pH7.3)中的澄清溶液中加入β-(1→4)-半乳糖基轉移酶(2.5U，500μl，Sigma No G-5507，25U/5ml)和堿性磷酸酯酶(25μl，Boehringer No 108146，7500U/498μl)，混合物在37℃下溫育過夜。然后使混合物通過RP-18柱(2.5cmФ，10cm長)，用水洗滌，用甲醇洗脫，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)41。
(e)向MnCl2·6H2O(317.2mg，1.6mmol)在H2O(19ml)和0.5M二甲基胂酸鈉緩沖液(6.8ml，pH6.5)中的溶液中加入225mg(0.250mmol)41、UDP-Gal(219mg，0.36mmol)和BSA(20mg)。將該混合物與2.5ml重組α-(1→3)-半乳糖基轉移酶(3U/ml，按照Joziasse等《歐洲生物化學雜志》19175(1990)制備)和25μl小牛腸堿性磷酸酯酶(Boehringer No 108146，7500U/498μl)在37℃下溫育48小時。使混合物通過短C-18反相柱(2.5cmФ，10cm長)，用水洗滌，用甲醇洗脫。殘余物經硅膠色譜法純化(CH2Cl2/CH3OH/H2O＝10∶2∶0.2)，得到A9。
(ii)(a)將O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖)23(《化學文摘》Reg.No.177331-58-7，500mg，0.54mmol)溶于吡啶(10ml)，緩慢加入乙酸酐(5ml)。溶液在RT下攪拌過夜。蒸發該澄清溶液，與甲苯共蒸餾數次。將殘余物溶解，用硅膠快速40系統純化(洗脫劑∶甲苯/丙酮3∶2 v/v)，濃縮后得到O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(1，2，3，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖)24，為無色糖漿。
(b)在氬氣下，將24(770mg，0.499mmol)溶于DMF(絕對，50ml)。加入分子篩(4，1g)，混合物在RT下攪拌30分鐘。然后向混合物中加入無水乙酸(140mg，1.50mmol)，在50℃下攪拌3小時。反應混合物通過一小片Celite墊過濾，加入冰水。產物用乙酸乙酯萃取，洗滌，干燥(MgSO4)，溶液蒸發至干。殘余物用硅膠色譜法純化，得到O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖)25。
(c)在氫氣下，將25(干燥，570mg，0.38mmol)溶于二氯甲烷(絕對，3ml)。加入三氯乙腈(600μl)，然后滴加DBU，直到反應混合物呈黃色(3-4滴)。混合物在RT下攪拌，直到TLC(甲苯/丙酮1∶1，v/v)顯示原料完全轉化為移行更高的產物(Rf0.48)。溶液小心地蒸發至干，直接用快速色譜法純化(洗脫劑∶甲苯/丙酮1∶1，v/v)，得到O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)三氯乙酰亞氨化物26，為無色糖漿。
(d)在氬氣下，將26(40mg，24.3μmol)和N-芐酯基-1-丙醇胺(15.5mg，73.0μmol)溶于二氯甲烷(絕對，1ml)和正己烷(絕對，3ml)，然后加入約1g研磨的分子篩(4)，混合物在RT下攪拌30分鐘，然后加入TESOTf(5μl)。30分鐘后，混合物用三乙胺中和，蒸發至干。殘余物用快速色譜法純化(洗脫劑∶甲苯/丙酮3∶2，v/v)，分離得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)27。
(e)將27(59mg，34.5μmol)懸浮在甲醇(絕對，1ml)中。加入新制備的甲醇鈉的甲醇溶液(1N，100μl)，混合物在RT、氫氣下攪拌過夜。最后，加入水(0.5ml)，繼續攪拌。1小時后，溶液用TFA(10μl)中和，蒸發至干。殘余物用快速色譜法純化，得到A9。[α]D+44.4(c1.075，H2O).MS(ESI+)1083(M+Na+).1H-NMR(500MHz，CDCl3)，選擇的信號4.31(d，J＝8，H-C(1)β-葡萄糖和β-半乳糖)；4.44(d，J＝8，H-C(1)β-半乳糖)；4.59(d， J＝8，H-C(1)N-乙酰基-β-葡萄糖胺)；5.30(d， J＝4，H-C(1)α-半乳糖)。
實施例A7[3-(4-巰基丁酰)氨基]丙基2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷A6的制備
向3-氨基丙基2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷18a(500mg，1.80mmol)和γ-硫代丁內酯(1.84g，18mmol)的15ml無水和無氧的甲醇溶液中加入三乙胺(1.82g，18mmol)。將溶液在回流下沸騰16小時(氬)。在減壓下蒸發溶劑，殘余物經硅膠色譜法純化。用乙酸乙酯/甲醇(3∶1)洗脫，得到A6。1H-NMR(400MHz，CD3OD)1.72(m，OCH2CH2CH2NH)；1.88(五重峰，J＝7，NH-CO-CH2CH2CH2SH)；1.99(s，COCH3)；2.33(t，J＝7，NH-CO-CH2(CH2)2SH)；2.51(t，J＝7，NH-CO-(CH2)2CH2SH)；3.15-3.95(m，10H)；4.36(d，J＝8.5，H-C(1))。
實施例A8[6-(4-巰基丁酰)氨基]己基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-吡喃半乳糖苷)A4的制備
(a)在氬氣下，向按照實施例A1制備的3(1.0g，1.004mmol)和(6-芐氧基羰基氨基)-1-己醇(0.504g，2.008mmol)的4ml無水二氯甲烷溶液中加入粉碎的分子篩(2.0g，4)，混懸液在RT下攪拌20分鐘。以10分鐘間隔加入1ml一份的含有分子篩(2.5g，4)的DMTST(0.778g，3.012mmol)的二氯甲烷(9ml)溶液，同時繼續在RT和氬氣下攪拌。加入7份后，將混合物傾入乙酸乙酯、10％NaHCO3水溶液和壓碎的冰。混合物攪拌10分鐘，通過CeliteTM過濾。分離含水相，用乙酸乙酯萃取兩次。有機相用10％NaCl水溶液和飽和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，在減壓下蒸發揮發物。殘余物(1.6g)經色譜法(150g硅膠)純化，用甲苯/乙酸乙酯(10∶1)洗脫，得到(6-芐氧基羰基氨基)己基O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖苷)15。
(b)向15(925mg，0.781mmol)的甲醇(30ml)與水(3ml)溶液中加入LiOH·H2O(328mg，7.81mmol)。混合物在氫氣下加熱至60℃達6小時。在減壓下蒸發溶劑，使殘余物在CHCl3與水之間分布。分離CHCl3層并用水洗滌，含水相用CHCl3萃取。有機相用Na2SO4干燥，并蒸發。用甲苯/乙酸乙酯(1∶1)作為洗脫劑的色譜法(100g硅膠)得到(6-芐氧基羰基氨基)己基O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖苷)16。
(c)在氬氣下，向16(479mg，0.512mmol)的二噁烷(16ml)與水(9ml)溶液中加入Pd(OH)2(炭上20％，350mg)。混懸液在H2下攪拌36小時。混合物通過CeliteTM過濾，在減壓下蒸發濾液。將殘余物再溶于二噁烷(16ml)與水(9ml)。加入Pd(OH)2(炭上20％，350mg)后，混懸液在H2下攪拌18小時。過濾(CeliteTM)并蒸發溶劑后，通過AcrodiscTM水溶液進行過濾。濾液冷凍干燥，得到6-氨基己基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖苷)17。
(d)在氬氣下，將化合物17(100mg，0.227mmol)、γ-硫代丁內酯(196μl，2.27mmol)和三乙胺(316μl，2.27mmol)的無水、無氧DMF(7ml)溶液加熱至90℃達24小時。在40℃、減壓下蒸發揮發物，殘余物(160mg)經色譜法(10.5g硅膠)純化，用氯仿/甲醇/水(30∶30∶5)作為洗脫劑，得到A4。1H-NMR(400MHz，D2O)，選擇的信號1.15-1.35(m，O(CH2)2(CH2)2(CH2)2NH)；1.35-1.45(m，O(CH2)4CH2CH2NH)；1.45-1.6(m，OCH2CH2(CH2)4NH)；1.77(五重峰，J＝7.5，NH-CO-CH2CH2CH2SH)；2.24(t，J＝7.5，NH-CO-CH2(CH2)2SH)；2.43(t，J＝7.5，NH-CO-(CH2)2CH2SH)；3.07(t，J＝7，O(CH2)5CH2NH)；4.34(d，J＝8，H-C(1))；5.04(d，J＝4，H-C(1’)).
實施例A9[3-(4-巰基丁酰)氨基]丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)A2的制備
(a)向3(2.3g，2.31mmol)和14(1.12g，1.54mmol)的無水二氯甲烷(10ml)溶液中加入新活化的粉碎分子篩4(2.0g)。混懸液在氬氣下攪拌30分鐘后，以20分鐘間隔分五次加入含有粉碎的分子篩4(1.5g)的DMTST(0.99g，3.85mmol)的CH2Cl2(7.5ml)溶液。加入NaHCO3水溶液(10％)(20ml)后，攪拌10分鐘，加入水(50ml)和乙酸乙酯(150ml)。經CeliteTM過濾并用乙酸乙酯洗滌后，分離含水相，用乙酸乙酯萃取兩次。有機相用飽和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，在減壓下蒸發溶劑。粗產物(3.43g)進行硅膠(550g)色譜法，用己烷/乙酸甲酯(3∶1)洗脫，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(6-O-芐基-2-脫氧-2-四氯苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)4。
(b)將4(1.412g，0.850mmol)、1，2-二氨基乙烷(86μl)和乙醇(40ml)的混合物在氬氣下加熱至60℃。140分鐘后，另外加入1，2-二氨基乙烷(36μl)，繼續加熱1小時。然后在減壓下蒸發溶劑，殘余物經硅膠(170g)色譜法純化。用CH2Cl2/2-丙醇(15∶1)洗脫，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(6-O-芐基-2-脫氧-3-氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)5。
(c)向胺5(975mg，0.699mmol)的吡啶(15ml)溶液中加入乙酸酐(15ml)。在RT下攪拌18小時后，在40℃、減壓下蒸發溶劑和試劑。殘余物(1.26g)經硅膠(125g)色譜法純化，用二氯甲烷/2-丙醇(15∶1)作為洗脫劑，得到(芐氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(3-O-乙酰基-6-O-芐基-2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)6。
(d)向6(898mg，0.608mmol)的甲醇(25ml)與水(2.5ml)溶液中加入氫氧化鋰一水合物(255mg，6.08mmol)。在60℃下攪拌3小時15分鐘后，在減壓下從濃混懸液中蒸發溶劑。將殘余物溶于乙酸乙酯(150ml)，溶液用水(3次70ml)和飽和鹽水(50ml)洗滌。含水洗液用乙酸乙酯萃取一次。有機相用Na2SO4干燥，蒸發溶劑。殘余物(732mg)經硅膠(120g)色譜法純化，用二氯甲烷/2-丙醇(10∶1)作為洗脫劑，然后用乙酸乙酯/丙酮/2-丙醇(5∶1∶1)作為洗脫劑，得到(3-芐氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(6-O-芐基-2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)7。
(e)向7(610mg，0.514mmol)的二噁烷(50ml)與水(28ml)溶液中加入Perlmann催化劑(1.46g，炭上20％Pd(OH)2)。混懸液在H2下劇烈攪拌22小時。過濾(Celite)后蒸發濾液，將殘余物重新溶于二噁烷(50ml)和水(28ml)。加入新催化劑(1.46g，炭上20％Pd(OH)2)，繼續在H2下攪拌3天。過濾并在減壓下蒸發溶劑后，得到290mg(93％)粗的(3-氨基)丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)8。
(f)將100mg(0.166mmol)化合物8溶于5ml無水、無氧DMF。加入γ-硫代丁內酯(0.144ml，1.66mmol)和三乙胺(0.231ml，1.66mmol)后，混合物在氬氣下加熱至90℃達18小時。在45℃真空下蒸發除去溶劑和揮發物。殘余物(140mg)經色譜法(15g硅膠)純化，用氯仿/甲醇/水(30∶30∶10)洗脫，得到A2。1H-NMR(400MHz，D2O)，選擇的信號1.68(五重峰，J＝6.0，OCH2CH2CH2NH)；1.78(五重峰，J＝7.5，NH-CO-CH2CH2CH2SH)；1.95(s，COCH3)；2.25(t，J＝7.5，NH-CO-CH2(CH2)2SH)；2.44(t，J＝7.5，NH-CO-(CH2)2CH2SH)；3.03-3.13和3.13-3.23(2m，OCH2CH2CH2NH)；4.43和4.46(2d，J＝8，H-C(1)，H-C(1’))；5.03(d，J＝4，H-C(1”)).MS/EI703(M-H)-.
實施例A10[3-(4-巰基丁酰)氨基]丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)A3的制備
將按照標準方法從乳糖和半乳糖合成制備的3-氨基丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)18(74mg，0.1319mmol)、γ-硫代丁內酯(114μl，1.319mmol)和三乙胺(184μl，1.319mmol)的無水、無氧甲醇(10ml)溶液在回流下加熱18小時(氫氣)。過濾分離一些不溶性物質(9mg)和在減壓下蒸發濾液后，殘余物(119mg)經硅膠(15g)色譜法純化。用氯仿/甲醇/水(30∶30∶10)洗脫，得到A3。1H-NMR(400MHz，D2O)，選擇的信號1.65-1.85(m，OCH2CH2CH2NH，NH-CO-CH2CH2CH2SH)；2.25(t，J＝7.5，NH-CO-CH2(CH2)2SH)；2.45(t，J＝7.5，NH-CO-(CH2)2CH2SH)；3.1-3.25(m，H-C(2)，O(CH2)2CH2NH)；4.38和4.42(2d，J＝8，H-C(1)，H-C(1’))；5.04(d，J＝4，H-C(1”)).
實施例A11[N-(4-巰基丁酰)]甘氨酰基N-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(1-脫氧-1-氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)A8的制備
將甘氨酰基N-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(1-脫氧-1-氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)(商業上可得到的)(22，205mg，0.222mmol)、1-硫代丁內酯(192μl，2.22mmol)、三乙胺(310μl，2.22mmol)和二硫-D/L-蘇糖醇(51.4mg，0.333mmol)的無水DMF(10ml)脫氣溶液/混懸液在氫氣下加熱至90℃達3.5小時。在減壓(高真空)下蒸發揮發物，殘余物經硅膠(25g)色譜法純化。用氯仿/甲醇/水(30∶30∶10)洗脫，冷凍干燥，得到A8。1H-NMR(400MHz，D2O)，選擇的信號1.8(五重峰，J＝7，CO-CH2CH2CH2SH)；1.93(s，NH-COCH3)；2.34(t，J＝7，CO-CH2CH2CH2SH)；2.47(t，J＝7，CO-CH2CH2CH2SH)；3.32-3.4(m，H-C(2)，葡萄糖)；3.87(m，CO-CH2-NH)；4.33和4.44(2d， J＝8，2H-C(1)，β-半乳糖)；4.60(d，J＝8，H-C(1)，N-乙酰基葡萄糖胺)；4.91(d，J＝9，H-C(1)，葡萄糖)；5.04(d，J＝4，H-C(1)，α-半乳糖)。
實施例A12[3-(4-巰基丁酰)氨基]丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)A10的制備
(a)將A9(25mg，23.6mmol)溶于水(5ml)，加入氫氧化鈀(5mg)。混合物在氫氣、RT下攪拌過夜。使混合物通過一小片Celite墊過濾，以除去催化劑。蒸發并從水中冷凍干燥后，得到3-氨基丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)42，為無色粉末。
(b)向42(450mg，0.4855mmol)和二硫蘇糖醇(112mg，0.728mmol)的無水DMF(30ml)溶液中加入420μl γ-硫代丁內酯和680μl三乙胺。脫氣后，溶液在氬氣下加熱至90℃達18小時。在50℃、減壓下蒸發溶劑，經硅膠色譜法純化(50g，氯仿/甲醇/水＝30∶30∶10)，得到A10。1H-NMR(400MHz，D2O)，選擇的信號1.65-1.85(m，OCH2CH2CH2NHCOCH2CH2CH2SH)；2.25(t，J＝7，COCH2(CH2)2SH)；2.43(t，J＝7，CO(CH2)2CH2SH)；3.10-3.27(m，O(CH2)2CH2NH，H-C(2)，β-葡萄糖)；4.33和4.44(2d，J＝8，2H-C(1)，β-半乳糖)；4.36(d，J＝8，H-C(1)，β-葡萄糖)；4.6(d，J＝8，H-C(1)，2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-葡萄糖)；5.03(d，J＝4，H-C(1)，α-半乳糖).
實施例A1 3N-{8-[N-二苯基-(4-甲氧基苯基)甲基]氨基-3，6-二氧雜-1-辛基}-4-巰基丁酰胺A7的制備
(a)在3小時內，向冷卻至0℃的、攪拌著的三甘醇(39g，0.26mol)的乙醚(200ml)與三乙胺(50ml)乳液中加入甲磺酰氯(10.1ml，0.13mol)。使混合物溫度達到RT，繼續攪拌20分鐘。在減壓下蒸發溶劑，將殘余物重新溶于甲醇/水(95∶5，300ml)。加入NaN3(18.2g，0.28mol)后，溶液在回流下沸騰18小時。然后在減壓下蒸發溶劑，使殘余物在乙醚和飽和鹽水之間分布。干燥(Na2SO4)了的有機相殘余物經硅膠(260g)色譜法純化，用己烷/乙酸乙酯(2∶1)洗脫，得到1，8-二疊氮基-3，6-二氧雜辛烷19。
(b)向二疊氮化物19(14.67g，0.073mol)的THF(100ml)溶液中加入1.5g 5％炭上Pt。混合物在氫氣下攪拌12小時。通過CeliteTM過濾并在減壓下蒸發溶劑，得到1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷20。
(c)在5分鐘內，在5℃下，向20(1.0g，6.76mmol)的吡啶(5ml)溶液中加入二苯基-(4-甲氧基苯基)甲基氯(2.09g，6.76mmol)的吡啶(10ml)溶液。在0℃下攪拌3小時后，在20℃、減壓下蒸發溶劑。使殘余物在乙酸乙酯和飽和鹽水之間分布。分離有機相，干燥(Na2SO4)，蒸發溶劑。殘余物(3.1g)經色譜法(170g硅膠)純化，用氯仿/甲醇/水(65∶25∶4)洗脫，得到8-[N-二苯基-(4-甲氧基苯基)甲基]氨基-3，6-二氧雜-辛胺21。
(d)將21(395mg，0.94mmol)、γ-丁內酯(0.81ml，9.4mmol)和三乙胺(1.31ml，9.4mmol)的無水、無氧甲醇(17ml)溶液在回流下沸騰18小時。在減壓下除去溶劑，殘余物(635mg)經硅膠(100g)色譜法純化。用乙酸乙酯洗脫，得到A7。1H-NMR(400MHz，CDCl3)1.33(t，J＝7，SH)；1.90(五重峰，J＝7，NH-CO-CH2CH2CH2SH)；2.1(寬峰，NH)；2.20(t，J＝7，NH-CO-CH2(CH2)2SH)；2.39(t，J＝6，CH2NH)；2.53(q，J＝7，CH2SH)；3.43(m，CH2NH-CO)；3.5-3.67(m，4OCH2)；3.80(s，OCH3)；6.02(寬峰，NH)；6.78-6.88(2H)，7.15-7.25(2H)，7.25-7.33(4H)，7.35-7.45(2H)，7.45-7.55(4H)(芳族CH).MS(EI)523(M+H)+。B活化的聚酰胺衍生物的制備實施例B1N(6)-氯乙酰基聚-L-賴氨酸B1a、B1b和B1c的制備
(a)在氬氣下，將500mg(2.39mmol eq)聚-L-賴氨酸氫溴化物(M30000-70000)懸浮在8ml DMF中。混懸液冷卻至0℃，加入2.5ml2，6-二甲基吡啶。在15分鐘內滴加1g(5.85mmol)氯乙酸酐的4mlDMF溶液。隨后將混合物緩慢加熱至RT，攪拌5小時。將該微黃色、有點渾濁的溶液滴加至100ml二乙醚/乙醇(2∶1)中，生成無色沉淀。過濾(通過最初不施加真空的多孔玻璃濾器)后，用乙醇、水洗滌，再用乙醇洗滌，最后用二乙醚洗滌。將粗產物溶于盡可能少的DMF，再一次在二乙醚/乙醇中生成沉淀。在真空、RT下干燥后，得到B1a(M30000-70000(n≈250))。1H-NMR(DMSO，500MHz)δ＝8.20(2H，s，2×NH)；4.05(2H，s，-CO-CH2-Cl)；3.80(1H，s，CH)；3.05(2H，s，-CH2-NH-CO-)；2.00-1.20(6H，m，-CH-(CH2)3-CH2-NH-).
(b)以類似方法從50mg(0.24mmol eq)聚-L-賴氨酸氫溴化物(M4000-15000)得到N(6)-氯乙酰基聚-L-賴氨酸B1b(M4000-15000(n≈50))，從50mg(0.24mmol)聚-L-賴氨酸氫溴化物(M150000-300000)得到N(6)-氯乙酰基聚-L-賴氨酸B1c(M150000-300000(n≈1050))。1H-NMR光譜同于化合物B1a。
實施例B2N(6)-氯乙酰基聚-D-賴氨酸B2a、B2b和B2c的合成(a)類似于B1(a)，從100mg(0.48mmol eq)聚-D-賴氨酸氫溴化物(M30000-70000)得到N(6)-氯乙酰基聚-D-賴氨酸B2a(M30000-70000(n≈250))，從250mg(1.196mmol eq)聚-D-賴氨酸氫溴化物(M4000-15000)得到N(6)-氯乙酰基聚-D-賴氨酸B2b(M4000-15000(n≈50))。1H-NMR光譜分別同于化合物B1a和B1b。
(b)使聚-D-賴氨酸氫溴化物(478mg，2.29mmol eq；M150000-300000)的水(50ml)溶液通過裝填了堿性離子交換樹脂(DowexR1×8，20-50目，OH型)的柱子(直徑2cm，長11cm)。用水洗脫，直到pH達到7，然后用10％對甲苯磺酸水溶液中和至pH3。洗脫液冷凍干燥后，將殘余物溶于DMF(10ml)，在0℃下加入2，6-二甲基吡啶以及氯乙酸酐(800mg)的DMF(2ml)溶液。在0℃、氬氣下攪拌18小時后，混合物用乙醇(100ml)稀釋，加入二乙醚(250ml)使產物沉淀出來。用重力式過濾法收集沉淀物，重新溶于DMF(20ml)，然后在10分鐘內將該溶液加入到乙醇(80ml)中。所得混懸液在RT下攪拌16小時，然后在20分鐘內加入二乙醚(300ml)。過濾并在減壓(高真空)下干燥沉淀物，得到B2c(M150000-300000(n≈1000))。1H-NMR光譜同于化合物B1c。
實施例B3N(6)-氯乙酰基-聚-D/L-賴氨酸B3a、B3b和B3c的合成(a)在氬氣下，將250mg(1.19mmol eq)聚-D/L-賴氨酸氫溴化物(M30000-70000)懸浮在4ml DMF中。混懸液冷卻至0℃，加入1.25ml 2，6-二甲基吡啶。在15分鐘內滴加500mg(2.93mmol)氯乙酸酐的2ml DMF溶液。隨后將混合物緩慢加熱至RT，攪拌16小時。后面的操作和純化類似于實施例B1(a)，得到B3a(M30000-70000(n≈250))。1H-NMR(DMSO，500MHz)δ＝8.20(1H，s，N(6)H)；8.05和7.90(每種情況下均為1/2H，2s，N(2)H)；4.25(1H，s(br)，CH)；4.05(2H，s，-CO-CH2-Cl)；3.05(2H，s，-CH2-NH-CO-)；1.70-1.20(6H，m，-CH-(CH2)3-CH2-NH-)。
(b)以類似方法從50mg(0.24mmol eq)聚-D/L-賴氨酸氫溴化物(M4000-15000)得到N(6)-氯乙酰基-聚-L-賴氨酸B3b(M4000-15000(n≈50))，從500mg(2.392mmol)聚-L-賴氨酸氫溴化物(M150000-300000)得到N(6)-氯乙酰基-聚-L-賴氨酸B3c(M150000-300000(n≈1050))。1H-NMR光譜同于化合物B3a。
實施例C1I型共軛物的制備(i)從聚-N(6)-氯乙酰基-L-賴氨酸開始(a)在RT和氫氣下，將B1a(10mg，0.0489mmol eq)和硫醇A2(10.3mg，0.0147mmol)連續溶于2.0ml無水、無氧DMF。向該澄清溶液中加入DBU(7.3μl，0.0489mmol)。在RT下攪拌1小時后，加入硫甘油(12.7μl，0.147mmol)和三乙胺(33.4μl，0.24mmol)，繼續攪拌18小時。將該無色溶液滴加到15ml二乙醚/乙醇(1∶1)中。借助重力，通過多孔玻璃漏斗過濾分離所生成的沉淀，用乙醚/乙醇(1∶1)洗滌，溶于水，所得溶液進行超濾，超濾使用裝有YM-3膜(截止MW3000)的Amicon儀器。用10ml超純水洗滌五次。將溶于水中的濾腔內容物冷凍干燥，得到C1a(x＝0.25(n≈250))，根據1H-NMR(選擇信號的積分)，糖衍生度(derivatisation)為25％(x＝0.25)。1H-NMR(500MHz，D2O)，選擇的信號2.26-2.36(m，NH-CO-CH2CH2CH2S，A2)；2.53-2.58(m，NH-CO-CH2CH2CH2S，A2)；2.58-2.68和2.7-2.8(2m，SCH2-CHOH-CH2OH)；4.49和4.51(2d，J＝8，H-C(1)，H-C(1’)，A2)；5.12(d，J＝4，H-C(1”)，A2)。
如上所述，用不同量的A2、A3、A4或A8和硫甘油處理B1a，根據1H-NMR(積分)得到不同糖衍生度的I型共軛物。<
<p>(b)類似于(a)，從B1b(20mg，97.8μmol eq)、A2(20.7mg，29.3μmol)和硫甘油開始，得到C1f(n≈50)，糖衍生度28％(x＝0.28)。
(c)如上所述，用不同量的A2、A4或A8和硫甘油處理B1c，根據1H-NMR(積分)得到不同糖衍生度的I型共軛物。
(ii)(a)從聚-N(6)-氯乙酰基-D-賴氨酸開始如實施例C1(i)a所述，用A2(10.3mg，14.7μmol)和硫甘油處理B2a(10mg，48.9μmol eq)。將超濾腔內容物通過AcrodiscTM過濾，濾液冷凍干燥，得到C2(x＝0.35(n≈250))，根據1H-NMR(積分)，糖衍生度為35％(x＝0.35)。
(b)類似于(a)，從B2c(100mg，489μmol eq)、A2(86mg，122μmol)和硫甘油開始，得到C2b(n≈1000)，糖衍生度24％(x＝0.24)。
(iii)從聚-N(6)-氯乙酰基-D，L-賴氨酸開始如實施例C1(i)a所述，用A2(10.3mg，0.0147mmol)和硫甘油處理B3a(10mg，0.0489mmol eq)，得到C3(x＝0.22(n≈250))，根據1H-NMR(積分)，糖衍生度為22％(x＝0.22)。
實施例C2II型共軛物前體的制備(i)其中-Y-R03為式Vc基團(來源于A2，三)的II型共軛物前體(a)將聚-N(6)-氯乙酰基-L-賴氨酸(B1a，200mg，978μmoleq)、硫醇A2(172mg，244μmol)和硫醇A7(15.3mg，29.3μmol)溶于無水、無氧DMF(20ml)。向該澄清溶液中加入DBU(146μl，0.978mmol)。在RT和氬氣下攪拌40分鐘后，加入硫甘油(254μl，2.934mmol)和三乙胺(682μl，4.89mmol)，繼續攪拌18小時。將該無色溶液加入到100ml乙醇中，在攪拌下滴加二乙醚(200ml)。借助重力，通過多孔玻璃漏斗過濾分離所生成的沉淀，用乙醇/乙醚洗滌(12，3×30ml)，并溶于水。使用裝有YM-3膜(截止MW＝3000)的Amicon儀器對溶液進行超濾。將溶于水的濾腔內容物冷凍干燥，得到C6a1(x＝0.25，y＝0.03(n≈250))。
(b)在0℃下，向C6a1(366mg)的水(25ml)溶液中加入三氯乙酸(1.2g)。在0℃下攪拌2小時后，溶液用2N氫氧化鈉中和至pH11，使用裝有YM-10膜(截止MW＝10000)的Amicon儀器進行超濾。用三份超純水進行洗滌。向濾腔中加入2N NaOH(10滴)后，繼續用水(六份)洗滌。將溶于水的濾腔內容物冷凍干燥，得到C6bI(x＝0.25，y＝0.02(n≈250))，根據1H-NMR(選擇信號的積分)，糖衍生度為25％(x＝0.25)，根據C6a1的NMR分析結果和C6bI的1H-NMR中一甲氧基三苯甲基信號的缺無，胺衍生度為2％(y＝0.02)。1H-NMR(500MHz，D2O，60℃)，選擇的信號2.65-2.75(m，NH-CO-CH2(CH2)2S，R1，R2)；2.95-3.01(m，NH-CO-(CH2)2CH2S，R1，R2)；3.01-3.08和3.13-3.19(2m，SCH2-CHOH-CH2S，R3)；4.87-4.95(m，H-C(1)，H-C(1’)，R1)；5.52(m，H-C(1”)，R1).
如上所述，不同聚合度的聚-N(6)-氯乙酰基-L-賴氨酸各自用硫甘油和不同量的A7和A2處理，根據1H-NMR(積分)，得到不同糖衍生度和胺衍生度的C6bII、C6BIII和C6bIV。
>(ii)其中-Y-R03為式Vb(來源于A4，二)基團、式Va(來源于A6，一)基團、式Vf(來源于A8，五)或式Ve(來源于A10，五)基團的II型共軛物前體如上所述(實施例C2i)，聚-N(6)-氯乙酰基-L-賴氨酸用硫甘油和不同量的A4、A6、A8或A10處理，根據1H-NMR(積分)，得到不同糖衍生度和胺衍生度的C7a、C7b、C8b1、C9b1和C10b1
DII型共軛物的制備實施例D1包含CH-Sepharose 4B的II型共軛物(a)C6bI在多孔玻璃漏斗上，用1mM HCl(800ml)洗滌4.0gNHS活化的CH-Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)(15分鐘)，加入到C6bI(20mg)的NaHCO3緩沖溶液(0.1M，NaCl中0.5M，pH8，6ml)中。在RT下振搖2小時后，用重力過濾法分離緩沖液，樹脂用NaHCO3緩沖溶液洗滌(0.1M，NaCl中0.5M，pH8，3次50ml)，然后在RT下用1M乙醇胺(pH8)處理1小時。過濾并用水(3次20ml)、TRIS緩沖液(0.1M，NaCl中0.5M，pH8，30ml)、乙酸鹽緩沖液(0.1M，NaCl中0.5M，pH4，30ml)-交替3次-和20％乙醇(3次50ml)洗滌，得到D1a，每ml貯存在20％乙醇中的樹脂具有5μmol碳水化合物抗原決定部位。
(b)C7a如上(實施例D1a)用C7a(25mg)的0.1M NaHCO3(0.5MNaCl，pH8，6ml)溶液處理1.0g NHS活化的CH Sepharose 4B，得到D1b，每ml貯存在20％乙醇中的樹脂具有4μmol碳水化合物抗原決定部位。
實施例D2包含Sepharose 4 Fast Flow的II型共軛物將懸浮在2-丙醇中的11ml Sepharose 4 fast flow用冷的(0℃)1mM HCl洗滌(6次20ml)，在0℃下，用冷的(0℃)NaHCO3緩沖液(0.1M，NaCl中0.05M，pH8，1.5ml)轉移至前體C6bI(150mg)的6ml NaHCO3緩沖溶液(0.1M，NaCl中0.05M，pH8，6ml)中。在RT下振搖3小時后，混合物過濾，樹脂用水(50ml)洗滌，然后懸浮在1M乙醇胺(pH8，20ml)中，在RT下振搖15小時。過濾分離樹脂，交替用TRIS緩沖液(0.1M，NaCl中0.5M，pH8，30ml)和乙酸鹽緩沖液(0.1M，NaCl中0.5M，pH4，30ml)洗滌三次，得到D2a，每ml貯存在20％乙醇中的樹脂具有5μmol碳水化合物抗原決定部位。
按照上述過程，制備II型共軛物D2b、D3、D5、D6、D7和D8
E化合物的生物活性實施例E1I型共軛物的鍵合親和性在4℃下，將Nunc Polysorp盤(目錄#475094)用0.1ml/孔的5μg/ml C1g(→C1g-ELISA)或C1h(→C1h-ELISA)或C1i(→Cli-ELISA)的PBS溶液包被過夜。在4℃下，盤用0.250ml/孔的10％SEA BLOCK溶液(Pierce，目錄#37527)封閉24小時。盤用含有0.02％吐溫20的0.250ml PBS洗滌3次。
采集的人血清(Sigma H-1513)以1∶20稀釋在含有0.1％吐溫20和10％封阻劑BSA(Pierce目錄#37525)的PBS緩沖液中。將60μl等分試樣的人血清稀釋液置于低結合(low-bind)的U形孔中，向孔中連續加入適當濃度系列的I型共軛物的60μl系列稀釋液。
在RT下培養1小時后，將0.100ml血清混合物轉移至洗滌了的聚合物包被的孔上。盤在RT下培養1小時，用含有0.02％吐溫20的PBS洗滌3次。然后向盤中裝入0.100ml抗人IgG-過氧化酶共軛物(Jackson Immunoresearch 109-036-098)或者是抗人IgM-過氧化酶共軛物(Jackson Immunoresearch 109-036-129)的、含有10％封阻劑BSA和0.1％吐溫20的PBS溶液，稀釋比為1∶2500。盤在RT下培養1小時，然后用含有0.02％吐溫20的PBS洗滌5次。盤用0.100ml TMB底物(Sigma目錄#T-3405)顯色，底物顯色10分鐘后用50μl 2M H2SO4終止顯色。用微量滴定盤讀數儀在450-650nm下讀取吸光度。在進行分析時，將吸光度值對共軛物濃度作圖。直鏈B三糖(Dextra目錄#GN334)用作測量相對IC50的標準。
表1用C1g包被的盤測量的I型共軛物鍵合親和性以相對結合親和性對親和性制表(RIC50＝IC50直鏈B/IC50化合物
實施例E2從cynomolgus猴中除去異種抗體一組4只cynomolgus猴(平均重3kg)注射1mg/kg劑量的I型共軛物，時間為第0、72和168小時。動物在不同時間間隔取血，血清用ELISA法化驗對C1g的抗αGal抗體(實施例E1)。單劑量I型共軛物刺激了抗體效價的急劇降低，隨后抗體效價恢復為一個低于原始效價的值。通過第二次、特別是第三次給藥，抗體效價的恢復被有效阻止了較長時間階段。
表3接受C1g注射的cynomolgus猴的抗體效價以相對于標準人血清的效價對結果制表
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實施例E3抗體效價的測量在4℃下，將Nunc Polysorp盤(目錄#475094)用0.1ml/孔的5μg/ml C1g或C1h或Cli的PBS溶液包被過夜。在4℃下，盤用0.250ml/孔的10％SEA BLOCK溶液(Pierce，目錄#37527)封閉24小時。盤用含有0.02％吐溫20的0.250ml PBS洗滌3次。以連續稀釋比向孔中加入0.100ml等分試樣的血清樣本。稀釋比一般如下1∶5；1∶15；1∶45；1∶135；1∶405；1∶1215；1∶3645；1∶10935等。稀釋液為含有0.1％吐溫20和10％SEABLOCK的PBS緩沖液。盤在RT下培養1小時，用含有0.02％吐溫20的PBS洗滌3次。然后向盤中裝入0.100ml抗人IgG-過氧化酶共軛物(JacksonImmunoresearch 109-036-098)或者是抗人IgM-過氧化酶共軛物(Jackson Immunoresearch 109-036-129)的、含有10％封阻劑BSA和0.1％吐溫20的PBS溶液，稀釋比為1∶2500。盤在RT下培養1小時，然后用含有0.02％吐溫20的PBS洗滌5次。盤用0.100ml TMB底物(Sigma目錄#T-3405)顯色，底物顯色10分鐘后用50μl 2M H2S04終止顯色。用微量滴定盤讀數儀在450-650nm下讀取吸光度。在進行分析時，將吸光度值對稀釋因子的對數作圖，將曲線的直線部分外推至X軸，得到效價值。使用標準血清，并使其效價值為1。
實施例E4人血清的免疫親和色譜將5ml固定化II型共軛物裝柱(1×3.5cm)。泵入所采集的人血清(Sigma H-1513，通過0.4μm過濾器過濾)并使其穿過柱子，流速為4ml/分鐘。在柱后每10ml收集一份。如上實施例E3所述，用ELISA化驗法化驗各部分的抗Galα，3Gal異種反應性抗體的存在。利用來自實施例D2的材料，在每次穿過柱子時，每ml凝膠清除至少200ml所采集的人血清。
實施例E5D2b、D6與D7的結合親和性和抗體特異性比較使體積為200ml的血清通過第一支裝有D6的柱子，并進行ELISA化驗(按照實施例E3)。使血清連續通過第二支裝有D2b的柱子并化驗，然后通過第三支裝有D7的柱子，并再次用ELISA法化驗。化驗每支柱子后的樣本。每支供試柱子對除去抗其所攜帶類型低聚糖的抗體來說都是最有效的。因此，D6有效除去二糖結合抗體，D2b除去三糖結合抗體，D7除去戊糖結合抗體。通過兩支柱子的血清排除了抗這些柱子攜帶的兩種抗原決定部位的抗體，但是保留了抗第三種抗原決定部位的抗體。通過所有柱子的血清排除了抗所有三種糖的抗體。
實施例E6混合床柱的結合親和性和抗體特異性將2ml D6、2ml D2b和1ml D7混合。將該材料裝入5ml柱子，使200ml人血清通過該柱子。每10ml為一份。每次收集的第二份進行化驗。用ELISA法對所有三種α半乳糖基化抗原以及對PK1細胞的細胞毒性進行化驗。如實施例E3所述，三種ELISA測量結果表明，混合床柱有效地從血清中除去抗αGal活性。
實施例E7結合至豬細胞上的抗體化驗通過每支柱子的血清樣本(實施例E5)對豬PK15細胞(ATCC#CCL-33)的結合作用。使細胞受胰蛋白酶作用，將1×106個細胞懸浮在0.3ml PBS/0.1％BSA中。將細胞在冰中用0.040ml血清樣本(在56℃下預處理10分鐘)培養30分鐘。將細胞置于3ml PBS中，離心后重新懸浮在0.3ml PBS/0.1％BSA中。加入0.004ml等分試樣的二次抗體(抗hlgG/FITC Jackson ImmunoResearch #109-096-098或抗hlgM/FITC Jackson ImmunoResearch #109-096-129)，在冰中培養30分鐘。在PBS中洗滌一次后，細胞用FACS法分析。所采集的人血清的平均熒光為480，D6柱后血清(實施例E5)為117，D6和D2b柱后血清(實施例E5)為80，D6、D2b和D7柱后血清(實施例E5)為54，混合床柱后血清(實施例E6)為52(均由抗hlgG抗體得到)。用抗hlgM測量，得到類似結果。
實施例E8狒狒中抗αGal抗體的免疫除去將7ml D6、7ml D2b和5ml D7與45ml Sepharose CL2B(Pharmacia)混合，制得免疫除去柱。使用該柱以及Citem 10免疫除去系統(Excorim)從2只狒狒(6kg重)中除去抗αGal抗體。柱子分別通過600ml和500ml(約2血容量)后，抗αGal抗體效價降至原始水平的10％(如實施例E3所述用ELISA法對C1g測量)。
權利要求
1.聚酰胺共軛物，包含鍵合到聚酰胺主鏈上的(a)異種抗原基；或(b)生物活性基和大分子、大的或小的實體；其中該聚酰胺主鏈包含至少一個式I的結構單元
在(b)的情況下，還包含至少一個式II的結構單元
其中A和A’各自獨立為三價橋連基；R1和R1’各自獨立為直接的鍵或C1-C6亞烷基；X1和X1’各自獨立為-C(O)O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-或-O-；R2和R2’各自獨立為直接的鍵或二價橋連基；X2和X2’各自獨立為直接的鍵或-O-或-NR-；其中的R為氫、OH、C1-C12烷基、C2-C12鏈烯基、C3-C8環烷基、C3-C8環烯基、C2-C7雜環烷基、C2-C11雜環烯基、C6或C10芳基、C5-C9雜芳基、C7-C16芳烷基、具有C2-C6亞烯基和C6或C10芳基-的C8-C16芳烯基、或二C6或C10芳基-C1-C6烷基；Y和Y’各自獨立為直接的鍵或二價橋連基；其條件是當R1或R1’是直接的鍵時，X1或X1’不是-NR-、-S-或-O-。
2.根據權利要求1的聚酰胺共軛物，其中(a)該聚酰胺主鏈包含至少一個式Iaa的結構單元
其中R03a-Y-為式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基團
或者(b)該聚酰胺主鏈包含至少一個式Ia的結構單元
其中-Y-R03為式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基團；和至少一個式IIa的結構單元
其中-Y’-R04為式Vg基團
3.根據權利要求1的聚酰胺共軛物，其中該聚酰胺主鏈另外包含至少一個式VIb的結構單元
4.根據權利要求2的聚酰胺共軛物，其中結構單元的平均總數[n](a)在200至300的范圍內，多分散性為1.1至1.2，式Iaa結構單元的比例[x]為5至30％；或者[n]在900至1200的范圍內，多分散性為1.1至1.2，[x]為5至50％；式VIb結構單元的比例[z]為45至94％；R03a-Y-是相同或不同的，并且選自式Va、Vb、Vc、Vd、Ve和Vf基團；或者(b)在200至300的范圍內，多分散性為1.1至1.2，式Ia結構單元的比例[x]為5至30％，其中R03-Y-選自由式Va、Vb、Vc、Vd、Ve和Vf基團組成的組，式IIb結構單元的比例[y]為1至5％，
其中A’、R1’、X1’、R2’和X2’是如權利要求1所定義的，Z-Y”為H2N[(CH2)2O](CH2)2NHC(O)(CH2)3-；或者[n]在900至1200的范圍內，多分散性為1.1至1.2，[x]為5至50％，[y]為1至5％；式VIb結構單元的比例[z]為45至94％。
5.包含根據權利要求1(a)或2(a)的聚酰胺共軛物或這些聚酰胺共軛物混合物的組合物，用在一種方法中，該方法用于從人體液中除去異種抗體或用于誘導對異種抗原的抗原決定部位產生耐受性或無變應性、或特定地對準具有異種抗原受體的B細胞。
6.根據權利要求5的組合物，其中該聚酰胺共軛物包含至少一個異種抗原基來源于二糖的結構單元、至少一個異種抗原基來源于三糖的結構單元和至少一個異種抗原基來源于戊糖的結構單元，其比例為1∶1∶1；或聚酰胺共軛物的混合物，每種共軛物包含相同的異種抗原基，該異種抗原基來源于一種二糖、一種三糖或一種戊糖，這些共軛物在該組合物中含有的比例為1∶1∶1。
7.包含根據權利要求1(b)或2(b)的聚酰胺共軛物或這些聚酰胺共軛物混合物的組合物，用在一種方法中，該方法用于從人體液中除去異種抗體。
8.根據權利要求7的組合物，其中該聚酰胺共軛物包含至少一個生物活性基來源于二糖的結構單元、至少一個生物活性基來源于三糖的結構單元和至少一個生物活性基來源于戊糖的結構單元，其比例為1∶1∶1；或聚酰胺共軛物的混合物，每種共軛物包含相同的生物活性基，該生物活性基來源于一種二糖、一種三糖或一種戊糖，這些共軛物在該組合物中含有的比例為1∶1∶1。
9.親和色譜法藥筒，包含根據權利要求1(b)或2(b)的聚酰胺共軛物或其混合物、或根據權利要求7的組合物，作為吸附劑。
10.用于從異種移植物接受者中除去異種抗原的抗體的方法，該方法包括在體內使所述體液與根據權利要求1(a)或2(a)的聚酰胺共軛物進行接觸；或用于在需要接受治療的受治療者中，誘導對異種抗原的抗原決定部位產生耐受性或無變應性、或者用來特定地對準具有異種抗原受體的B細胞的方法，該方法包括在異種移植物的移植之前和/或之后，將有效量的根據權利要求1(a)或2(a)的聚酰胺共軛物例如通過注射、輸入或灌注給藥到異種移植物接受者體內；或用于從人體液中除去抗體的方法，該方法包括在體外使所述體液與根據權利要求1(b)或2(b)的聚酰胺共軛物進行接觸，然后重新將體液輸入到患者體內。
全文摘要
聚酰胺共軛物,包含鍵合到聚酰胺主鏈上的(a)異種抗原基;或(b)生物活性基和大分子、大的或小的實體,它們的制備方法和這些共軛物在治療組合物中的用途。
文檔編號C07K14/00GK1252807SQ98804283
公開日2000年5月10日 申請日期1998年4月16日 優先權日1997年4月18日
發明者R·杜薩勒, A·卡托波迪斯, W·金茲, R·奧爾萊恩, G·索馬 申請人:諾瓦提斯公司