抗風濕劑的制作方法

專利名稱：抗風濕劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及對于治療、預防慢性關節風濕病等炎癥性疾病有效的醫藥、食品和飲料。
現有技術炎癥被認為是生物體對外界的侵襲進行防御，產生內因性活性物質，使身體狀態適應的結果。但是由此引起的反應多是有害的，會導致病理狀態。另外，自身免疫疾病中的炎癥是由于免疫細胞將其自身視為異物，即使對正常細胞也進行阻礙而造成的。
已有文獻報道指出對于T輔助細胞(Th)存在著Th1細胞和Th2細胞，Th1細胞可以產生促進巨噬細胞(Mφ)等細胞性免疫活化的細胞分裂素——干擾素γ(IFN-γ)、白介素-2；Th2細胞可以產生使與抗體產生有關的體液免疫活化的白介素-4、白介素-5、白介素-10。
另外，還指出Th1細胞與Th2細胞通過分別產生的細胞分裂素可以互相制約。也就是說，Th1細胞產生的IFN-γ可以控制Th2細胞的活化，誘導Th1細胞的活化。相反，Th2細胞產生的白介素-10可以控制Th1細胞的活化，誘導Th2細胞的活化。
自身免疫疾病大致分為臟器特異性的和全身性的。全身性自身免疫疾病或過敏性疾病其癥狀是由Th2占優勢的免疫應答引起的，與此相反，臟器特異性自身免疫疾病或炎癥性疾病是由Th1占優勢的免疫應答引起的。
慢性關節風濕病是自身免疫疾病的一種，可以認為是關節部位的特異性炎癥，也就意味著可能是臟器特異性，即由Th1引起的自身免疫性疾病。實際上，在風濕病患者的炎癥部位，可以確認通過來自Th1的細胞分裂素誘導、活化的Mφ和中性白血病的浸潤，以及Mφ產生的腫瘤壞死因子-α顯著增加。另外，其它的臟器特異性自身免疫疾病或炎癥性疾病也可以看到相同的組織觀察結果，通過由Th1誘導的這些炎癥細胞和炎癥性細胞分裂素使炎癥惡化。
由于這些情況，認為在慢性關節風濕病等臟器特異性自身免疫疾病或炎癥性疾病的治療中，抑制直接引起炎癥的Mφ產生腫瘤壞死因子以及誘導Th1抑制細胞分裂素——白介素-10是很重要的〔醫學の步み，醫齒藥出版(株)發刊，第182卷，第523～528頁；同，第661～665頁(1997)〕。
作為慢性關節風濕病的藥物治療方法，可以通過甾體、非甾體類抗炎藥以及金、D-青霉胺等緩解藥進行內科治療。
發明所要解決的課題本發明的目的在于開發一種可以對于慢性關節風濕等炎癥性疾病的治療有用的化合物，提供含有該化合物的藥物、食品和飲料。課題的解決手段本發明者為了達到上述目的進行了深入的研究，結果發現式[I]表示的化合物，4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮(以下簡稱為環戊烯酮)對于治療或預防風濕病等炎癥性疾病或伴有免疫異常的疾病等是很有用的，從而完成了本發明。
如果概要的說明本發明的話，本發明的第1項發明涉及抗風濕劑，其特征在于含有的有效成分為選自下述式[I]表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物。
本發明的第2項發明涉及風濕病改善用食品飲料或風濕病預防用食品或飲料，其特征在于含有選自上述式[I]表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物。


圖1表示環戊烯酮對Jurkat細胞增殖的影響。
圖2表示環戊烯酮對Molt-3細胞增殖的影響。
圖3表示Molt-3細胞中Fas抗原的表達。
圖4表示Jurkat細胞中Fas抗原的表達。
圖5表示在Molt-3細胞中添加10μM環戊烯酮進行培養時Fas抗原表達細胞比率的變化。
圖6表示環戊烯酮量與足浮腫增加率的關系。
圖7表示環戊烯酮量與腫瘤壞死因子產生量的關系。
圖8表示培養液中環戊烯酮濃度與NO2-濃度的關系。
圖9表示環戊烯酮存在下的培養時間與活細胞數的關系。
圖10表示環戊烯酮對延遲性過敏反應的抑制作用。
圖11表示環戊烯酮對淋巴細胞增殖的抑制作用。
圖12表示環戊烯酮對混合淋巴細胞反應的抑制作用。
圖13表示(-)體環戊烯酮的p-二甲基氨基苯甲酰基衍生物的CD以及(-)體環戊烯酮的立體結構。
圖14表示(+)體環戊烯酮的p-二甲基氨基苯甲酰基衍生物的CD以及(+)體環戊烯酮的立體結構。
發明的實施方式以下，具體的說明本發明。
本發明所使用的式[I]表示的環戊烯酮包括4位和5位羥基的立體構型為順式的異構體和反式的異構體兩者。在本發明中可以使用順式環戊烯酮，也可以使用反式環戊烯酮，還可以使用順式環戊烯酮和反式環戊烯酮的混合物。另外，也可以使用它們的光學活性體。
順式環戊烯酮可以采用化學合成法制得(Helvetica ChimicaActa，第55卷，第2838～2844頁(1972))。反式環戊烯酮也可以采用化學合成法制得(Carbohydrate Res.，第247卷，第217～222頁(1993))，另外也可以通過加熱處理糖醛酸(例如葡萄糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡萄糖醛酸內酯)或含有它們的物質(參考PCT/JP97/03052號說明書)。在本發明中可以使用含有環戊烯酮的這些加熱處理物、其部分精制物以及精制物。
例如，糖醛酸使用D-葡萄糖醛酸，通過將其1％的溶液在121℃條件下加熱處理4小時，在加熱處理物中生成環戊烯酮。用溶劑萃取該加熱處理物中的環戊烯酮，濃縮萃取物。然后用硅膠柱色譜法分離該濃縮物，將洗脫出的環戊烯酮部分濃縮，用氯仿從濃縮物中萃取環戊烯酮，萃取濃縮物通過正相柱色譜法分離得到加熱處理物中的環戊烯酮。
環戊烯酮的物性如下所示。另外，環戊烯酮的質量分析是采用DX302質量分析儀(日本電子社生產)進行的。另外，使用重氯仿溶劑的NMR光譜測定使用JNM-A500(日本電子社生產)。比旋光度使用DIP-370型旋光計(日本分光社生產)測定、UV吸收光譜使用UV-2500分光光度計(島津制作所生產)測定、紅外吸收光譜(IR)使用FTIR-8000紅外分光光度計(島津制作所生產)測定。MS m/z 115〔M+H〕+1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)其中，1H-NMR的化學位移值表示7.26ppm的CHCl3的化學位移值。
旋光度〔α〕D200°(c 1.3，水)UVλmax 215nm(水)IR(KBr法)在3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1處有吸收。
分離得到的環戊烯酮通過光學拆分，可以得到(-)-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮。當然，通過合成方法得到的環戊烯酮也可以進行光學拆分。
例如，將環戊烯酮溶解于乙醇。在該乙醇溶液中再加入己烷/乙醇(94/6)，調制環戊烯酮溶液。可以將該試樣溶液，例如使用Chiral PackAS(Daicel化學工業)柱，在柱溫度40℃、移動相己烷/乙醇(94/6)的條件下進行HPLC，從而光學拆分環戊烯酮。
拆分得到的(-)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮〔以下稱為(-)體環戊烯酮〕的旋光度為〔α〕D20-105°(c 0.30，乙醇)，(+)-順式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮〔以下稱為(+)體環戊烯酮〕的旋光度為〔α〕D20+104°(c 0.53，乙醇)。另外，旋光度是使用上述DIP-370型旋光計(日本分光社生產)來測定的。
以下，按照上述記載的方法對(-)體環戊烯酮和(+)體環戊烯酮分別進行質量分析、通過核磁共振法(NMR)進行結構解析、測定UV吸收光譜、測定紅外吸收光譜。其結果表明，兩種光學活性體具有與光學拆分前的環戊烯酮相同的結果。
將光學拆分得到的(-)體環戊烯酮與(+)體環戊烯酮分別制成對二甲基氨基苯甲酰基衍生物，使用J-720型圓二色性分散計(日本分光社生產)測定圓二色性光譜(CD)，將其結果應用于二苯甲酸鹽偏光力規則(J.Am.Chem.Soc.，第91卷，第3989～3991頁(1969))，確定其立體構型。
(-)體環戊烯酮的對二甲基氨基苯甲酰基衍生物的CD及(-)體環戊烯酮的立體結構如圖13所示。圖中縱軸表示摩爾圓二色性，橫軸表示波長(nm)。另外，上述立體結構如下式[II]所示

(+)體環戊烯酮的對二甲基氨基苯甲酰基衍生物的CD及(+)體環戊烯酮的立體結構如圖14所示。圖中縱軸表示摩爾圓二色性，橫軸表示波長(nm)。另外，上述立體結構如下式[III]所示

如圖13、14及式[II]、式[III]所示，(-)體環戊烯酮為(-)-(4R，5S)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮，(+)體環戊烯酮為(+)-(4S，5R)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮。
以上本發明所使用環戊烯酮或其光學活性體可以采用任何方法制備，可以采用說明書中描述的方法制備，也可以采用化學合成方法合成，本發明也可以使用環戊烯酮的反式體、順式體、其混合物及其光學活性體。
環戊烯酮或其光學活性體的鹽是可藥用鹽，可以采用公知的方法進行轉換。
環戊烯酮在生物體內可與含有SH基的化合物(例如半胱氨酸、谷胱甘肽等)反應，生成作為藥物很有用的代謝衍生物。因此，在投給環戊烯酮后也可以得到該代謝衍生物所顯示出的藥效。在生物體內環戊烯酮與含有SH基的化合物的反應產物可以推測為代謝有效物質的一種。
也就是說，對于含有SH基的化合物(R-SH)舉例來說，環戊烯酮與含有SH基的化合物反應，生成例如下述通式[IV]或下述通式[V]所表示的化合物。另外，通式[V]表示的化合物可以轉變為通式[IV]表示的化合物。
這樣，環戊烯酮在含有SH基的化合物的存在條件下，可以轉變為各代謝衍生物，在生物體內生成的這些代謝衍生物也可以發揮藥效。

(其中，R為從含有SH基的化合物中除去SH基得到的殘基)。

(其中，R為從含有SH基的化合物中除去SH基得到的殘基)。
因此，這些在生物體內形成的反應產物，即以在生物體內形成代謝衍生物為目的的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽的使用也包含在本發明內。
環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽是具有抗風濕病作用、慢性關節風濕抑制作用等生理活性的化合物，以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上達到化合物為有效成分，將其與公知的藥用載體組合使之制劑化，可以制造抗風濕劑。該藥物的制造一般可以將選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物與可藥用的液體或固體載體配合，并在必要時加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩定劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等，制成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體制劑；普通溶液劑、懸濁劑、乳劑等液體制劑。另外，可以將其制成干燥品，在使用前加入適當的載體使之成為液體。
藥用載體可以根據上述給藥方式及劑型進行選擇，口服制劑的場合可以使用例如淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等。另外，制造口服制劑時還可以加入粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑、著色劑、香料等。
另一方面，非口服制劑的場合，可以按照常規方法將本發明的有效成分選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物溶解乃至懸濁于注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等稀釋劑中，必要時加入殺菌劑、穩定劑、等滲劑、無痛化劑等進行調制。
本發明的抗風濕劑可以相應于制劑形態采用適當的給藥途徑給藥。給藥方法也沒有特別的限定，可以內用、外用和注射。注射劑可以靜脈、肌肉、皮下、皮內給藥，外用劑也包括栓劑等。
抗風濕劑的給藥量可以根據其制劑形態、給藥方式、使用目的及其所適用的患者的年齡、體重、癥狀適當設定，雖然并不是一定的，但是一般制劑中含有的選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物的量為成人每天0.1μg～200mg/kg。當然，給藥量根據各種條件而有所變動，既有少于上述給藥量就足夠的場合，也有必須超范圍的場合。本發明的藥劑除可以直接口服之外，還可以添加到任意的飲食品中進行日常的攝取。
環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽除具有上述抗風濕病作用、慢性關節風濕抑制作用以外，還具有對關節炎等的抗炎作用、抑制角叉菜膠浮腫的作用、抑制腫瘤壞死因子產生的作用、增強白介素-10產生的作用、抑制一氧化氮產生的作用、誘發滑膜細胞自然死亡的作用、誘導Fas抗原產生的作用、免疫調節作用(例如抑制延遲性過敏反應的作用、抑制淋巴細胞增殖的作用、抑制混合淋巴細胞反應的作用、抑制IgE產生的作用、拓撲異構酶抑制作用)等多種生理活性，以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物為有效成分的抗炎劑或炎癥預防劑、腫瘤壞死因子抑制劑或腫瘤壞死因子產生預防劑、白介素-10產生增強劑、一氧化氮產生抑制劑、Fas抗原產生誘導劑、免疫調節劑、IgE產生抑制劑、延遲性過敏反應抑制劑、拓撲異構酶抑制劑等藥物可以按照上述抗風濕劑進行制劑化，按照上述抗風濕劑的方法給藥。
這些制劑的給藥量可以按照上述抗風濕劑進行適當設定。例如作為抗炎劑、腫瘤壞死因子產生抑制劑的制劑中所含有的選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中1種以上的化合物的量最好為成人每天10pg～50mg/kg，作為一氧化氮產生抑制劑的制劑中所含有的選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中1種以上的化合物的量為成人每天0.1μg～20mg/kg，可以根據使用目的調節制劑中有效成分的量。這些藥劑除可以直接口服給藥外，還可以添加到任意的食品中進行日常的攝取。
風濕病是骨膜細胞或軟骨細胞發生障礙的自身免疫疾病，本發明的抗風濕劑作為自身免疫疾病也是有用的。
對于慢性關節風濕病等臟器特異性自身免疫疾病或炎癥性疾病，環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽可以抑制直接引起炎癥的腫瘤壞死因子的產生，增強Th1抑制細胞分裂素——白介素-10的產生。因此，可以改善炎癥，例如臟器特異性自身免疫疾病中的風濕病，特別是慢性關節風濕病的癥狀，使作為炎癥標志的C反應蛋白質(CRP)值、類風濕因子(rheumatoid factorsRF)值、紅血球沉降速度(血沉)值大大減少，也可以顯著改善步行困難等并發癥狀。
腫瘤壞死因子是作為在腫瘤部位誘導出血性壞死的因子發現的，現在被認為是與以炎癥為基礎的生物體防御、免疫機構廣泛相關的細胞分裂素。該腫瘤壞死因子的產生調節機構衰竭會給宿主帶來種種不適，腫瘤壞死因子過度或未調節的產生與慢性關節性風濕病、風濕性脊髓炎、變形性關節病、痛風性關節炎、敗血癥、敗血性休克、內毒素休克、格蘭氏陰性菌敗血癥、毒性休克綜合癥、腦型瘧、慢性肺炎、移植片對宿主肺炎反應、同種移植片拒絕反應、流感等傳染性疾病引起的發熱和肌肉痛、對感染或惡性腫瘤的二次惡病質、對人類后天性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的二次惡病質、AIDS、AIDS相關綜合癥、瘢痕瘤形成、潰瘍性大腸炎、多發性硬化癥、自身免疫糖尿病以及全身性紅斑狼瘡等自身免疫疾病在內的多種疾病相關〔MolecularMedicine，第33卷，第1010～1020頁，第1182～1189頁(1996)〕。本發明的抗風濕劑對于治療以腫瘤壞死因子為媒介的或由于腫瘤壞死因子惡化的病癥是有用的。另外，按照本發明，可以提供一種以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物作為有效成分使用的腫瘤壞死因子產生調節方法。另外，按照本發明還可以提供一種含有環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上化合物、以腫瘤壞死因子為媒介的或由于腫瘤壞死因子惡化的疾病改善用食品或飲料，或者疾病的預防用食品或飲料。
一氧化氮(以下簡稱為NO)是來自內皮細胞的血管平滑肌舒張因子(EDRF)的主體〔Nature，第327卷，第524～526頁(1987)〕。本發明提供一種以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物為有效成分的、有必要抑制NO產生的疾病治療用藥物或疾病預防用藥物。在本發明中，對于有必要抑制NO產生的疾病并沒有特別的限定，例如毒性休克或采用某種細胞分裂素治療造成的全身性低血壓、血壓應答低下、自身免疫疾病、炎癥、關節炎、風濕性關節炎、糖尿病、炎癥性腸疾病、血管機能不全、病因性血管擴張、組織損傷、心臟血管貧血、痛感過敏癥、腦缺血、新血管生成引起的疾病、癌等，包括特表平9-504524號、特表平9-505288號、特表平8-501069號、特表平8-512318號、特表平6-508849號公報中記載的疾病。
以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物為有效成分的NO產生抑制劑對于NO產生機構研究、NO作用機制研究也是很有用的，另外，也可以用于篩選與NO有關的物質。
環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽對產生NO的細胞具有NO產生抑制作用。例如如果在巨噬細胞株中添加內毒素(LPS)則出現誘導型NO合成酶(NOS)，培養基中有NO分泌，但在環戊烯酮、環戊烯酮衍生物或其光學活性體共存的條件下使LPS作用可以抑制NO的產生。在采用LPS處理誘導NO產生時，由于NO對細胞的抑制作用導致細胞生存率降低，但在LPS處理時如果加入環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽，則NO的產生降低，減少了對細胞的抑制。
新血管生成對于實體瘤的增大是必需的，血管內皮增殖因子/血管通透性亢進因子(VEGF)在這個過程中起到了重要的作用。在各種癌細胞中，VEGF可以通過NO來誘導的。環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽通過抑制NO的產生，也可以抑制細胞產生VEGF，其結果是可以抑制癌組織周邊的新血管生成。對于將癌細胞移植到皮下形成實體瘤的小白鼠投給環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽，癌組織周邊的血管形成變得不充分，導致癌脫落。
亞硝基胺是亞硝基加成在仲胺上得到的一組化合物，已知有數百種，其多數是通過對DNA的損傷使底物發生癌變。亞硝基與人的癌變也是密切相關的，通常是在胃中通過亞硝酸鹽與胺反應生成的。NO即使在pH中性的生理條件下也可以與胺反應生成亞硝基胺。另外，在免疫學上與癌密切相關的肝吸蟲感染患者或肝硬化患者的NO產生亢進。因此，投給環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽通過防止NO產生亢進可以預防特別是高危組的癌變。如上所述，環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽具有抑制癌變和抑制癌組織的血管生成2個階段的抗癌作用。
另外，NO可以誘發被認為是炎癥性病變特征的浮腫，即血管通透性亢進作用〔Japanese Journal of Cancer Research，第85卷，第331～334頁(1994)〕，另外可以使炎癥性介質前列腺素類的生物合成亢進〔Salvemini等，Proceedings of National Academy of Sciences，USA，第90卷，第7240～7244頁(1993)〕。另一方面，NO可以與超氧自由基迅速反應，生成過氧亞硝酸鹽，過氧亞硝酸鹽可以引起炎癥性細胞、組織障礙。
活化的免疫細胞進入臟器釋放出細胞分裂素時可以誘導NO的產生。胰島素依存性糖尿病是由于胰島β細胞遭到特異性破壞引起的疾病，其破壞是由NO引起的。另外，在伴隨慢性關節性風濕病、變形性關節風濕病、痛風性關節炎、貝切特氏病(Behcet’s disease)的關節炎患者的病變部位，其關節液中含有NO的濃度比相同患者正常關節或健康人關節的關節液中NO的濃度高。如果將環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽投給這些患者，可以抑制病變部位NO的產生，改善癥狀。
腦缺血時以及再灌注后NO的產生增大，隨之腦組織受到損傷。腦缺血時通過將環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽投給患者，可以減輕腦組織的損傷，改善予后。
被稱為Fas抗原(APO-1抗原，CD95)的細胞表面抗原作為誘發細胞自然死亡的分子受到了注目〔Cell，第66卷，第233～243頁(1991)；J.Exp.Med.，第169卷，第1747～1756頁(1989)；J.Biol.Chem.，第267卷，第10709～10715頁(1992)；J.Immunology，第184卷，第1274～1279頁(1992)〕。
Fas抗原出現在胸腺細胞、T細胞、細胞毒性T細胞、B細胞或NK細胞等免疫細胞中。免疫系統在外來的非自身抗原侵入時發生免疫反應，排除非自身抗原。但是，對于自身抗原不具有免疫反應，顯示出自身寬容。這是由于具有自身反應性的淋巴干細胞受到稱作除去克隆的陰性選擇，通過自然死亡被排除。但是，由于Fas抗原基因缺損等生物體的某些異常這些細胞沒有自然死亡時，例如自身反應性T細胞就會在末梢蓄積。另外，在正常的生物體內，負責免疫的細胞——B細胞也顯示出自身寬容，該自身反應性B細胞通常也是自然死亡，當自身反應性B細胞由于Fas抗原基因缺損等異常不能自然死亡時，自身反應性B細胞就會蓄積在末梢。而且，在關節風濕病的場合，上述自身反應性淋巴細胞的異常、滑膜細胞變化異常也是病因的一部分。
以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物為有效成分的Fas抗原產生誘導劑對于誘導由于自身反應性淋巴細胞、變化異常而不能從生物體排除的無用的生物體構成細胞自然死亡是很有用的，可以用于Fas抗原產生誘導方法。另外，作為以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物為有效成分的治療或預防伴有Fas抗原產生異常的疾病的藥物也是很有用的。在本發明中，對伴有Fas抗原產生異常的疾病并無特別的限定，例如自身反應性T細胞、自身反應性B細胞引起的自身免疫疾病、關節風濕病等，包括WO97/0965公報所記載的疾病。
環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽具有增強白介素-10產生的作用、抑制延遲性過敏反應的作用、抑制淋巴細胞生成反應的作用、抑制混合淋巴細胞反應的作用、抑制IgE產生的作用、角叉菜膠浮腫抑制作用等免疫調節作用，以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物為有效成分的免疫調節劑作為這些免疫系統、免疫因子異常引起的疾病的治療劑或預防劑是很有用的。
也就是說，由于白介素-10的產生低下造成Th1活化，引起Th1占優勢的自身免疫的炎癥。這種炎癥與腎炎、肝炎等臟器特異性自身免疫疾病以及移植片拒絕反應或過敏性接觸性皮炎等疾病有關。由于上述免疫調節劑可以增強白介素-10的產生，抑制Th1的活性，因而對于治療或預防這些疾病是很有用的。
另外，淋巴細胞生成反應是指促細胞分裂劑與淋巴細胞表面的受體結合，使淋巴細胞活化，促進其分裂、增殖的反應。混合淋巴細胞反應是指通過混合培養由同種異系動物得到的淋巴細胞，由于主要組織抗原不一致使淋巴細胞活化，促進淋巴細胞分裂、增殖的反應。上述免疫調節劑可以抑制這些反應，對于治療或預防淋巴細胞異常亢進引起的自身免疫性疾病，例如慢性腎炎、慢性大腸炎、I型糖尿病、慢性關節風濕病等慢性疾病是非常有用的，另外對于抑制移植片排異反應也是很有用的。
角叉菜膠足浮腫模型是通過在腳踝部皮下注射起炎劑角叉菜膠，誘導巨噬細胞、中性白細胞等炎癥細胞，由于這些細胞產生的炎癥性因子使血管通透性亢進導致浮腫的反應。上述免疫調節劑的浮腫抑制作用對于必須控制血管通透性亢進的疾病，例如慢性關節風濕病的治療或預防是很有用的。
在以哮喘、變應性濕疹為代表的過敏性疾病中，由肥大細胞釋放化學介質在變態反應中起到了很大的作用。該反應是由于IgE與細胞膜上的受體結合、交聯而引起的，上述免疫調節劑可以抑制IgE的產生，對于以IgE產生為媒介或由于IgE產生而惡化的癥狀，例如IgE引起的過敏性疾病，包括支氣管哮喘、過敏性鼻炎、變應性濕疹、過敏性結膜炎、蕁麻疹、過敏性休克等的癥狀改善和/或疾病預防是很有用的。另外，上述免疫調節劑可以抑制延遲性過敏反應，對于治療、預防伴有延遲性過敏反應的疾病，例如接觸性過敏、過敏性接觸性皮炎、細菌過敏、真菌過敏、病毒過敏、藥物過敏、甲狀腺炎、過敏性大腦炎等是很有用的。
在本發明中可以使用選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽、含有環戊烯酮的加熱處理物以及由該加熱處理物得到的部分精制環戊烯酮的原料，提供一種具有抗風濕作用、抗炎作用、腫瘤壞死因子產生抑制作用、增強白介素-10產生的作用、抑制一氧化氮產生的作用、誘發滑膜細胞自然死亡的作用、抑制淋巴細胞生成的作用、抑制活化淋巴細胞反應的作用、抑制IgE產生的作用、拓撲異構酶抑制作用等的功能性食品或飲料，例如風濕病改善用食品或飲料、增強白介素-10產生用的食品或飲料、抑制一氧化氮產生用的食品或飲料、誘導Fas抗原產生用的食品或飲料、免疫調節用食品或飲料、抑制IgE產生用的食品或飲料、抑制拓撲異構酶用的食品或飲料。
本發明的食品或飲料的制造方法沒有特別的限定，例如可以采用烹調、加工以及通常所使用的食品或飲料的制造方法來制造，制得的食品或飲料中優選以選自具有抗風濕病等生理作用的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上化合物為有效成分，含有、添加和/或稀釋了選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少一種以上化合物的食品或飲料定義為本發明的食品或飲料。
作為本發明的食品或飲料，只要含有、添加和/或稀釋了選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中1種以上的化合物，其形狀并無特別的限定，包括片狀、顆粒狀、膠囊狀、凝膠狀、溶膠狀等可以經口攝取的形狀。
本發明的食品或飲料是由于選自具有生理活性的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上化合物的抗風濕病作用、抗炎作用、腫瘤壞死因子產生抑制作用、增強白介素-10產生的作用、抑制一氧化氮產生的作用、誘發滑膜細胞自然死亡的作用、抑制淋巴細胞生成的作用、抑制活化淋巴細胞反應的作用、抑制IgE產生的作用、拓撲異構酶抑制作用等，通過攝取這些食品或飲料，對于對環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽顯示出敏感性的疾病具有癥狀改善效果或對該疾病的預防效果的健康食品或飲料，對于維持生物體體內平衡也很有用的食品或飲料。
以上，按照本發明，使食品或飲料中適量含有具有生理活性的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽稱為可能。通過這些化合物具有的生理作用，例如誘發滑膜細胞自然死亡的作用、誘導Fas抗原產生的作用、抑制腫瘤壞死因子產生的作用、抑制NO產生的作用、對風濕病特別是慢性關節風濕的癥狀改善作用和/或預防作用，本發明的食品或飲料對于風濕病、風濕病并發癥、步行困難等癥狀的改善或預防是非常有用的。
本發明所使用的化合物即使按其生理活性的有效量給藥也沒有毒性，例如經口給藥時，即使將環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中任意一種按照100mg/kg一次投給大白鼠，確認也沒有死亡例。
實施例以下結合實施例更具體的說明本發明，但本發明并不受這些實施例的任何限制。另外，實施例中的％是指重量％。參考例1將D-葡萄糖醛酸(シグマ社生產G 5269)10g溶解于1升水中，在121℃加熱4小時后，在減壓條件下濃縮至約10ml。將醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2混合液的上層40ml加入到其中混合后，將離心分離得到的上清液在減壓條件下濃縮至約10ml。
將上述萃取液置于采用柱色譜法的硅膠BW-300SP(2×28cm，富士Silycia化學社生產)中，以醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2的上層為洗脫液，用壓縮機加壓至0.2kg/cm2，以每分鐘5ml的流速進行分離。進行分餾使每1餾份為10ml，取各餾份的一部分采用薄層色譜法進行分析，第61-80號餾份中含有高純度的環戊烯酮。集中這些餾份，在減壓條件下濃縮后用40ml氯仿萃取，將萃取液在減壓條件下濃縮，從而得到100mg環戊烯酮。
通過使用Palpack型S柱(寶酒造社生產)的正相HPLC分離該餾份，用215nm紫外線吸收檢測后純度為98％。
將上述環戊烯酮113.9mg溶于乙醇2.85ml中。再在該乙醇溶液中加入己烷/乙醇(94/6)3.85ml，調制成17mg/ml的環戊烯酮溶液。用0.5μm的過濾器過濾該溶液，得到光學拆分HPLC的試樣溶液。
在以下條件下，對該試樣溶液進行光學拆分HPLC，分別收集前峰的(-)體環戊烯酮和后峰的(+)體環戊烯酮，減壓干燥，分別得到(-)體環戊烯酮43.2mg，(+)體環戊烯酮43.0mg。
光學拆分HPLC條件柱Chiral Pack AS(Daicel化學工業生產)2.0cm×25.0cm柱溫度40℃移動相己烷/乙醇(94/6)流速14.0ml/min檢測UV210nm
試樣注入量150μl(2.55mg)由于得到的(-)體環戊烯酮與(+)體環戊烯酮兩者均含有約1％的對映體，在上述條件下再度進行光學拆分。其結果分別從前峰的(-)體環戊烯酮30.0mg得到不含有對映體的(-)體環戊烯酮19.7mg，從后峰的(+)體環戊烯酮37.4mg得到不含有對映體的(+)體環戊烯酮27.7mg。另外，(-)體環戊烯酮、(+)環戊烯酮的光學拆分HPLC的洗脫時間分別為33分、40分。實施例1一女性(56歲)，在5年前被診斷為慢性關節風濕，使用治療藥甾體藥物、抗風濕藥、鎮痛消炎藥，接受慢性關節風濕的治療，但CRP定量值在3mg/dl以上，RF定量值在300U/ml以上、血沉在20ml/hr以上，其癥狀未見改善，步行困難幾乎只能躺著，飲用下述實施例12-(2)得到的飲料，每日50ml(含有環戊烯酮2mg)，飲用1個月后，確認有CRP定量值、RF定量值、血沉等慢性關節風濕癥狀在血液學方面的改善。另外，在這些數值降低的同時，步行等日常生活中的運動機能也得到了顯著改善。實施例2在含10％牛胎兒血清(FBS，Gibco公司生產，26140-079)的Iscob-modified Dulbecco培養基(IMDM，Gibco公司生產，12440-053)中，在5％二氧化碳存在下，在37℃培養存在于慢性關節風濕患者滑膜的成纖維細胞菌株——DSEK細胞(琦玉醫科大學綜合醫療中心第2內科保存細胞株)，使之融合，用胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司生產，25300-054)剝離細胞并收集。將該細胞懸濁于上述培養基中，使之達到25000個/ml，在96孔微孔板的各孔中分別注入100μl。培養5日后，在幾乎融合的時候棄掉培養基，加入2.5、5、10、20或30μM含有環戊烯酮的上述培養基。培養24小時或48小時后，加入10μl預混合WST-1(寶酒造社生產，MK400)，在37℃反應4小時，以450nm的吸光度(A450)減去650nm的吸光度(A650)得到的差作為細胞增殖度。
其結果如表1所示。
表1

培養24小時、48小時的兩種情況下均為添加環戊烯酮的部分與添加水的部分相比，其細胞增殖得到了抑制，在添加了10μM環戊烯酮的部分可以見到生成了死亡的細胞體。添加20μM環戊烯酮的部分幾乎看不到活細胞。
以上說明環戊烯酮對滑膜細胞具有誘發自然死亡的作用、抑制增殖的作用。另外，(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也得到了同樣的結果。實施例3(1)用含10％牛胎兒血清(FCS，Bio Whittaker公司生產)的RPMI1640培養基(Gibco BRL公司生產)，在5％CO2存在下，在37℃培養5×105個/ml的人T細胞性白血病細胞株Jurkat細胞(ATCC TIB-152)以及Molt-3細胞(ATCC CRL-1552)，加入0、5、、10或20μM的環戊烯酮后再培養24小時。細胞增殖使用MTT法〔Mosmann等，J.Immunol.Methods，第65卷，第55～63頁(1983)〕，用560nm處的吸光度測定細胞增殖度。
其結果是與添加水的對照組相比，對于兩細胞株在添加10μM環戊烯酮的部分均可以抑制細胞增殖約50％，在添加20μM環戊烯酮的部分均可以抑制細胞增殖75％以上。即使添加5μM以下的環戊烯酮，也不能顯著影響細胞的增殖。
如上所述，環戊烯酮可以濃度依存的抑制T細胞性白血病細胞株Jurkat細胞和Molt-3細胞的增殖。
其結果如圖1和圖2所示。也就是說，圖1表示環戊烯酮對Jurkat細胞增殖的影響，圖2表示環戊烯酮對Molt-3細胞增殖的影響。在圖1和圖2中，橫軸表示環戊烯酮濃度(μM)，縱軸表示560nm處的吸光度。
(2)如下所述，測定環戊烯酮對Jurkat細胞和Molt-3細胞中Fas抗原表達(誘導其產生)的影響。在含有0、1、5、10或20μM環戊烯酮的含10％FCS的RPMI1640培養基中，在5％CO2存在下、37℃條件下，培養5×105個/ml的Jurkat細胞或Molt-3細胞24小時，按照Munker，R的方法〔Ann.Hematol.，第70卷，第15～17頁(1995)〕使用抗Fas抗體(Boehringer-Ingelheim公司生產)進行2階段免疫染色。
使用流動血細胞計數器(Orthocytron，Ortho DiagnosticSystems公司生產)測定染色后的細胞1×104個的熒光強度，以熒光強度在一定值以上的細胞作為Fas抗原表達細胞，計算其比率。
其結果是對于兩細胞株，添加環戊烯酮時在1～20μM的范圍內Fas抗原表達細胞的比率與濃度成比例地上升。
其結果如圖3或圖4所示。也就是說，圖3表示Molt-3細胞中Fas抗原的表達，圖4表示Jurkat細胞中Fas抗原的表達。圖3和圖4中橫軸表示環戊烯酮的濃度(μM)，縱軸表示Fas抗原表達細胞的比率(％)，確認環戊烯酮具有誘導Fas抗原產生的作用。
(3)加入10μM環戊烯酮，培養Molt-3細胞1、3、6、12或24小時，測定Fas抗原表達細胞的比率。
其結果是添加10μM環戊烯酮時，Fas抗原表達細胞的比率從培養1小時后開始上升，緩慢上升到24小時后。
其結果如圖5所示。也就是說，圖5表示在Molt-3細胞中添加10μM環戊烯酮后培養時Fas抗原表達細胞的比率變化，橫軸表示培養時間(小時)，縱軸表示Fas抗原表達細胞的比率(％)。
如以上實施例3-(1)～(3)所述，確認環戊烯酮具有誘導Fas抗原產生的作用。另外，(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也得到了同樣的結果。實施例4使用6周齡的雄性路易斯大鼠(由Seac-Yoshitomi公司于5周齡、體重約130g時購入，預備飼養1周)，如下所述制作慢性關節風濕動物模型，即角叉菜膠誘發足浮腫模型，評價被測藥物。
用蒸餾水(大冢制藥公司生產)將環戊烯酮調節到1、5mg/ml，按照10ml/kg的給藥量給試驗開始18小時前禁食的大鼠口服。
被測藥物給藥0.5小時后，將懸濁于生理鹽水(大冢制藥公司生產)濃度調節為1％的角叉菜膠(Wako公司產生)以10μl/大鼠的量注射于右腳腳踝處，引起足浮腫。角叉菜膠注射3小時后，用大鼠足體積測定裝置(UGO BASILE公司生產)測定大鼠右足體積。另外，測定值用角叉菜膠給藥前測定的各大鼠右足體積的增加率表示。
其結果如圖6所示。也就是說，圖6表示環戊烯酮與足浮腫增加率的關系，縱軸表示增加率(％)，橫軸表示環戊烯酮量(mg/kg)。
環戊烯酮在給藥量為50mg/kg時具有顯著的足浮腫抑制作用。另外，(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也得到了同樣的結果。實施例5(1)將來源于馬流產沙門氏菌(Salmonella abortus equi)的LPS(脂多糖，Sigma公司生產，L-2012)溶解于生理鹽水，通過腹腔內給藥(0.1mg/kg)投給20周齡的雌性CDF1小白鼠，制作內毒素休克模型。
在LPS給藥30分鐘前，按照30mg/kg的用量通過腹腔內給藥或口服給藥投給環戊烯酮。另一方面，對照組不作處理。LPS給藥后90分鐘后，由小白鼠取血，分離血清。然后，通過TNF-α·ELISA試劑盒(Genzyme公司生產)測定血清中腫瘤壞死因子的量，測定環戊烯酮給藥后抑制腫瘤壞死因子產生的效果。
其結果如表2所示。也就是說，相對于對照組環戊烯酮給藥組，腹腔內給藥組、口服給藥組兩組的血清中腫瘤壞死因子濃度值較低，通過投給環戊烯酮可以顯著抑制腫瘤壞死因子的產生。
表2

**p＜0.001與對照組相比是顯著的*p＜0.01與對照組相比是顯著的(2)試驗8周齡的CDF1小白鼠，通過腹腔內給藥投給LPS(10μg/小白鼠)，制作內毒素休克模型。在LPS給藥前15分鐘，按照0.03、0.3、3、30mg/kg的用量通過皮下給藥投給環戊烯酮(一組4只)。LPS給藥1小時后由小白鼠取血，分離血清，用市售ELISA試劑盒(Endogen公司生產)測定血清中腫瘤壞死因子-α的量以及白介素-10的量。
其結果如表3所示。也就是說，環戊烯酮可以與用量成比例地抑制由于投給LPS引起的血清中腫瘤壞死因子-α濃度的上升。另外，相對于投給蒸餾水的對照組(一組4只)，環戊烯酮30mg/kg給藥組血清中白介素-10的濃度顯著上升。表3

(3)在8周齡雌性CDF1小白鼠的腹腔內投給液狀石蠟油(CosmoBIo公司)2ml，誘導腹腔Mφ。液體石蠟油給藥1周后，在小白鼠的腹腔內注入RPMI-1640培養基(Gibco公司)4ml，充分按摩后回收，得到腹腔細胞。
將腹腔細胞用RPMI-1640培養基洗滌2次后，懸濁于含有10％牛胎兒血清(FCSHigh-Clone公司)的RPMI-1640培養基中，將細胞濃度調節為1×106細胞/ml。將調整后的細胞液1ml接種到24孔板中，在37℃、CO2培養器中培養2小時。培養后除去上清液中含有的非粘連細胞，將粘連細胞用作腹腔Mφ。
在板的各孔中加入含有10％FCS的RPMI-1640培養基800μl，然后加入溶解于生理鹽水(大冢制藥公司生產)的1、10、100μM環戊烯酮100μl，在37℃、CO2培養器中培養1小時。
培養后加入100ng/ml的LPS 100μl，再培養24小時。培養結束后回收上清液，使用市售ELISA試劑盒(Endogen公司生產)測定產生的腫瘤壞死因子-α的量。
其結果如圖7所示。也就是說，圖7表示環戊烯酮與腫瘤壞死因子產生量的關系，縱軸表示腫瘤壞死因子的量(pg/ml)，橫軸表示各試樣的環戊烯酮濃度(μM)。
環戊烯酮濃度在10μM以上時可以顯著抑制LPS誘發的小白鼠腹腔巨噬細胞產生腫瘤壞死因子。
如以上實施例5-(1)～(3)所示，環戊烯酮具有抑制腫瘤壞死因子產生的作用、增強白介素-10產生的作用。另外，(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也得到了同樣的結果。實施例6使用小白鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞(ATCC TIB 71)和LPS，如下所述測定環戊烯酮抑制NO產生的活性以及抑制細胞損傷的活性。
將含有1.5×106個RAW264.7細胞的含10％牛胎兒血清(Gibco公司生產)5ml、不含酚紅的L-谷氨酸(Life Technologies Oriental公司生產，25030-149)2mM的Dulbecco-modified Eagle’s培養基(Life Technologies Oriental公司生產，11054-020)置于具有6個孔的組織培養皿中，在5％二氧化碳存在下、37℃培養12小時后，加入50μl的50μg/ml LPS(Sigma公司生產)，在各孔中分別加入50μl的500μM環戊烯酮、250μM環戊烯酮、100μM環戊烯酮、50μM環戊烯酮，再培養12小時后，測定NO在培養基中被氧化生成的NO2-以及活細胞數。另外，將未添加LPS的組以及未添加環戊烯酮的組作為對照。
為了測定NO2-，從各孔分離出100μl的培養上清液，加入10μl的50μg/ml 2，3-二氨基萘(同仁化學研究所生產，341-07021)溶液(0.62N鹽酸溶液)，于室溫下放置15分鐘，加入5μl的2.8N氫氧化鈉水溶液，使用Titertec Fluoroscan II(大日本制藥公司生產)在激發波長355nm、測定波長460nm處測定生成的萘三唑的熒光。試驗均進行2組，從該平均值中減去未添加LPS的對照值，用相對于添加LPS部分值的各部分相對值比較。
其結果是環戊烯酮可以抑制LPS誘導RAW264.7細胞產生NO，而且可以抑制LPS對于RAW264.7細胞的細胞損傷。
其結果如圖8、圖9所示。圖8表示培養液中環戊烯酮濃度與NO2濃度的關系，縱軸表示NO2-濃度的相對值(％)。圖9表示環戊烯酮存在下的培養時間與活細胞數的關系，縱軸表示培養液5ml中含有的活細胞數(×105個/5ml)，(橫軸表示培養時間(時間)。在圖9中白四角(□)表示對照，白菱形(◇)表示LPS，白圓圈(○)表示5μM環戊烯酮，白三角(△)表示5μM環戊烯酮+LPS，黑四角(■)表示2.5μM環戊烯酮+LPS，黑菱形(◆)表示1μM環戊烯酮+LPS，黑圓圈(●)表示0.5μM環戊烯酮+LPS。
以上說明環戊烯酮具有抑制NO產生的作用。另外，(-)體環戊烯酮、(+)環戊烯酮也得到了同樣的效果。實施例7(1)將蛋清白蛋白(Sigma公司)的0.01％生理鹽水溶液100μl以及明礬(Alum)(商品名Imject Alum，Pearce公司)100μl通過腹腔內給藥投給1組5只的5周齡BALB/c雄性小白鼠(日本Clare公司)致敏，11天后由眼底靜脈取末梢血。
將采取的血液離心分離(2000rpm，5分鐘)后，分離血漿，用ELISA(IgE小白鼠EIA試劑盒，生物化學工業)測定血漿中總IgE的量。
環戊烯酮給藥組是從抗原致敏那天起到取血前一天1日1次強制口服10mg/kg。
另外，對照組同樣口服蒸餾水，以未致敏組作為未處理組。
其結果如表4所示。蛋清白蛋白致敏引起IgE量的上升可以通過投給環戊烯酮抑制。表4

2)將蛋清白蛋白(Sigma公司)的0.01％生理鹽水溶液100μl以及明礬(Alum)〔商品名Imject Alum，Pearce公司)100μl通過腹腔內給藥投給1組5只的5周齡Wister雄性大鼠(日本SLC公司)致敏，14天后由腹部大靜脈取血。
將采取的血液離心分離(2000rpm，5分鐘)后，分離血漿，用48小時大鼠被動皮膚過敏(PCA)反應測定抗原特異性IgE的量。
也就是說，用生理鹽水將血漿稀釋為4倍到64倍，制作血漿的成倍稀釋系列，分別將0.1ml注射于剔毛的7周齡Wister雄性大鼠背部皮下。皮下注射48小時后，通過尾靜脈注射0.05％蛋清白蛋白以及0.5％伊凡斯藍(Nacalai Tesque公司生產)的混合液1ml。尾靜脈注射30分鐘后，對大鼠實施斷頭術，使之放血致死，觀察其背部出現的藍色斑點，直徑為5mm以上的斑點為陽性，以最高稀釋度表示IgE效價。
環戊烯酮給藥組是從抗原致敏開始通過腹腔內給藥投給1mg/kg或10mg/kg的環戊烯酮，1日1次，給藥3日。另外，對照組是同樣通過腹腔內給藥投給蒸餾水。
其結果如表5所示。表5

可以通過投給環戊烯酮，與用量成比例地抑制蛋清白蛋白致敏引起的抗原特異性IgE量上升。
以上說明通過環戊烯酮可以抑制IgE的產生。另外，確認(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也具有同樣的抑制IgE產生的活性。實施例8(1)C57BL/6小白鼠(雌性，5周齡)由日本SLC公司購入后，預備飼養1周后，用于試驗。將引起延遲性過敏反應的抗原——羊紅血球(清水試驗材料)用生理鹽水(大冢制藥公司生產)洗滌3次，調節為1×109個細胞/ml，在小白鼠的腹腔內注射200μl，抗原致敏。
致敏5日后，將同樣配制的抗原40μl注射于右足踝部誘導抗原，引起足浮腫。從抗原致敏日開始，將1mg/kg或10mg/kg環戊烯酮通過腹腔內給藥投給1組5只的小白鼠，1日1次，給藥3日。
抗原誘導2日后用足浮腫測定裝置(Ugo Basile公司生產)測定小白鼠的右足體積，作為延遲性過敏反應的指標。測定值用抗原誘導前測定的小白鼠右足體積的增加率表示。
其結果如圖10所示。也就是說，圖10表示環戊烯酮抑制延遲性過敏反應的作用，縱軸表示增加率(％)，橫軸表示環戊烯酮給藥量(mg/kg)。另外，圖中**是指相對于對照組p＜0.01，有顯著差別。
投給1mg/kg環戊烯酮時可以抑制延遲性過敏反應，投給10mg/kg時具有顯著抑制延遲性過敏反應的作用。
另外，(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也具有同樣的效果。
(2)由C3H/HeJ小白鼠(日本SLC公司，雄性，5周齡)摘出脾臟，充分粉碎后懸濁于含有10％牛胎兒血清(High Clone公司生產)的RPMI-1640培養基(Gibco公司生產)中，得到單細胞液。將細胞懸浮液接種于塑料培養皿中，在37℃、二氧化碳培養器中培養2小時，通過使粘連細胞附著在陪替氏培養皿上將其除去，非粘連細胞用作脾臟淋巴細胞。將細胞濃度調節為2×106細胞/ml，以200μl/孔的量接種于96孔微孔板，在對照組以外的孔中加入各種濃度的環戊烯酮，然后在所有的孔中加入5μg刀豆球蛋白A(ConA，Nacalai Tesque公司生產)，在37℃、二氧化碳培養器中培養1天。培養后在各孔中加入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，再培養1天，用液體閃爍計數器測定其進入細胞的量。
其結果如圖11所示。也就是說，圖11表示環戊烯酮抑制淋巴細胞生成的作用，縱軸表示3H-胸腺嘧啶核苷攝入的量(CPM)，橫軸表示添加ConA、未添加ConA的對照、以及環戊烯酮的濃度(μg/ml)。從圖中可以看出，環戊烯酮對于促細胞分裂劑刺激引起的小白鼠淋巴細胞生成，具有用量依存的抑制作用，10μg/ml幾乎可以完全抑制淋巴細胞的增殖，并確認其具有抑制淋巴細胞活化的作用。
另外，(-)體環戊烯酮、(+)環戊烯酮也具有同樣的效果。
(3)由BALB/c小白鼠(日本SLC公司生產，雄性，5周齡)以及C57BL/6小白鼠(日本SLC公司，雄性，5周齡)摘出脾臟，按照上述方法得到脾臟淋巴細胞。將各細胞懸浮液的濃度調節為2×106個細胞/ml，每100μl混合，接種于96孔微孔板中。除對照組以外在各孔中加入各種濃度的環戊烯酮，在37℃、二氧化碳培養器中培養4天。培養后在各孔中加入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，再培養1天，用液體閃爍計數器測定其進入細胞的量。
其結果如圖12所示。也就是說，圖12表示環戊烯酮抑制混合淋巴細胞反應的作用，縱軸表示3H-胸腺嘧啶核苷攝入的量(CPM)，橫軸表示BALB/c脾臟淋巴細胞的對照(圖中用BALB/c表示)、C57BL/6脾臟淋巴細胞對照(圖中用C57BL/6表示)、BALB/c脾臟淋巴細胞于C57BL/6脾臟淋巴細胞混合對照(圖中用Mix表示)以及環戊烯酮的濃度(μg/ml)。從圖中可以看出，環戊烯酮對于同種異體抗原刺激而活化的淋巴細胞，具有用量依存的抑制作用，10μg/ml幾乎可以完全抑制，并確認其具有抑制混合淋巴細胞反應引起淋巴細胞活化的作用。
另外，(-)體環戊烯酮、(+)環戊烯酮也具有同樣抑制混合淋巴細胞反應的作用。實施例9(1)將拓撲異構酶II〔TopoGEN公司生產，2單位/μl〕2μl、10倍濃度緩沖液〔0.5M Tris-HCl(pH8.0)，1.2M KCl，0.1MMgCl2，5mM三磷酸腺苷以及5mM二硫蘇糖醇〕2μl、0.1％牛血清白蛋白(寶酒造社生產)2μl、蒸餾水11μl以及對照用蒸餾水或試樣(100、200、500、1000或2500μM的環戊烯酮)2μl混合后，向其中加入0.25μg/μl pBR322 DNA(寶酒造社生產)1μl，在37℃反應。反應30分鐘后，加入1％十二烷基硫酸鈉、50％甘油、0.02％溴酚藍水溶液2μl，停止反應。
在用瓊脂糖L03(寶酒造社生產)與TAE緩沖液〔用40mM Tris，5mM醋酸鈉，1mM乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、醋酸將pH調整為7.8〕制成的1％瓊脂糖膠中，加入上述反應液20μl，在TAE緩沖液中進行電泳。電泳后，將膠置于1μg/ml溴化乙錠水溶液中浸漬，紫外線照射觀察DNA電泳圖案。另外，在添加水的對照組中DNA完全由超螺旋型轉變為舒張型，如果抑制了拓撲異構酶的活性，則部分或完全抑制了由超螺旋型轉變為舒張型。
其結果如表6所示。表6<

>
在添加水的對照組中DNA完全由超螺旋型轉變為舒張型，環戊烯酮濃度為20μM以上時部分或完全抑制了DNA由超螺旋型轉變為舒張型，確認環戊烯酮具有抑制拓撲異構酶II的活性。在表6中，-表示完全由超螺旋型轉變為舒張型，+表示中等程度的，++表示留有大部分超螺旋型，+++表示超螺旋型一點也沒有減少。
(2)采用與實施例9-(1)相同的方法，測定環戊烯酮抑制拓撲異構酶I的活性。其中，用拓撲異構酶I〔TopoGEN公司生產，0.01單位/μl〕代替拓撲異構酶II，10倍濃度緩沖液使用100mM Tris-HCl(pH7.9)、10mM EDTA、1mM亞精胺、50％甘油。另外，試樣是添加環戊烯酮使最終濃度達到1mM。
其結果是1mM環戊烯酮可以抑制拓撲異構酶I。
以上說明對于在正常細胞中僅是分裂期一過性表達，由于癌變在整個細胞周期都高度表達的拓撲異構酶II，或由于癌變表達量及活性增加的拓撲異構酶I，環戊烯酮具有抑制活性。另外，(-)體環戊烯酮、(+)體環戊烯酮也得到了同樣的結果。實施例10注射劑(1)在生理鹽水(日本藥典收載品)中以1％的濃度加入環戊烯酮，制得注射劑。
(2)在生理鹽水(與上述相同)中分別以0.5％和0.1％的濃度加入(-)體環戊烯酮和甘草酸，制得注射劑。實施例11片劑(1)調制含有環戊烯酮10mg和適量微晶纖維素的片劑，包上糖衣，制成片劑。
(2)調制含有(+)體環戊烯酮0.1mg、甘草酸二鉀10mg和微晶纖維素適量的片劑，包上糖衣，制成片劑。實施例12(1)將果膠(Pomosin Pectin LM-13CG，Hercules公司生產)5kg添加到自來水100升中，通過通入水蒸氣使液體溫度由28℃經35分鐘升高到液體溫度120℃，然后在攪拌條件下于120℃保溫5小時，然后冷卻，制得冷卻物135升。然后在冷卻物中加入過濾助劑Celite#545(Celite公司生產)1.35kg以及二氧化硅#600-S(中央二氧化硅公司生產)1.35kg，然后使用預先涂有Celite#545 0.1kg以及二氧化硅#600-S 0.1kg的致密濾器(6英寸16段濾紙，ADVANTEC#327)進行過濾。使用金屬板加熱器(日阪制作所生產)將得到的濾液連續瞬間加熱處理(98℃，60秒)后冷卻，制得150升含有環戊烯酮的果膠加熱處理液。
含有環戊烯酮的果膠加熱處理液的pH為約3.5，酸度為6.2ml，糖度為5.8Brix％。另外，pH是用pH計測定的，酸度是用將試樣10ml中和到pH7.0所需要的0.1N NaOH的量(ml)表示的。而且糖度是用白利糖度計(Brix saccharomter)測定的。
(2)按照下述組成調制飲料果糖葡萄糖液糖 5.00％砂糖4.00％酸味成分1.20％香料0.30％含有環戊烯酮的物質 0.5％精制水 余量合計100.00％另外，含有環戊烯酮的物質使用的是實施例12-(1)所述的含有環戊烯酮的果膠加熱處理物，添加其固體物質換算量。該飲料100ml中含有4mg環戊烯酮。
發明的效果按照本發明可以提供一種含有選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物為有效成分的藥物。該藥物作為抗風濕劑或風濕病預防劑，另外作為控制炎癥性細胞分裂素的抗炎劑或炎癥預防劑、作為伴有炎癥的疾病的治療劑或預防劑，是非常有用的。另外，按照本發明可以在食品或飲料中適量含有具有生理活性的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽。由于這些化合物具有的生理機能，本發明的機能性食品或飲料通過對風濕病，特別是慢性關節風濕的癥狀改善作用和/或預防作用，對于風濕病并發癥、步行困難等的治療或預防是非常有用的。另外，由于對炎癥性細胞分裂素的控制作用，本發明的食品或飲料對于伴有炎癥的疾病的癥狀改善或預防是很有用的。
另外，采用本發明的藥物可以抑制腫瘤壞死因子的產生，本發明的藥物對于治療或預防以腫瘤壞死因子產生為媒介的疾病、由于該因子產生惡化的疾病、敗血癥、AIDS、慢性關節風濕等疾病是很有用的。另外，本發明的食品或飲料對于以腫瘤壞死因子產生為媒介的疾病、由于該因子產生惡化的疾病、敗血癥、AIDS、慢性關節風濕等疾病癥狀改善或該疾病的預防是非常有用的，以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種化合物為有效成分使用的本發明的方法對于調節腫瘤壞死因子的產生量是非常有用的。
而且按照本發明可以提供一種含有具有抑制NO產生作用的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽的藥物，該藥物對于必須抑制NO產生的疾病，例如全身性低血壓、血壓應答低下、自身免疫疾病、炎癥、關節炎、風濕性關節炎、炎癥性腸疾病、血管機能不全、病因性血管擴張、組織損傷、心血管缺血、痛感過敏、腦缺血、新血管生成引起的疾病、癌的治療或預防，以及維持生物體的體內平衡是很有用的。
另外，還可以提供一種以選自具有抑制NO產生作用的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物為有效成分的NO產生抑制劑、血管產生抑制劑、癌變預防劑、抗癌劑、缺血性腦損傷改善劑。該NO產生抑制劑對于生物化學研究、藥物的選擇是很有用的。
按照本發明，可以在食品或飲料中適量含有具有生理活性的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽。由于該環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽所具有的抑制NO產生的作用，本發明的食品或飲料是具有抑制NO產生作用帶來的預防癌變、抗癌作用、抗炎作用、缺血性腦損傷改善作用、增強生物體防御作用等維持生物體內平衡機能的健康食品或飲料。
按照本發明，可以提供一種以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物為有效成分的Fas抗原產生誘導劑；以這些化合物作為有效成分使用，對Fas抗原生理機能研究或拮抗劑的探索等有用的Fas抗原產生誘導方法；以及伴有Fas抗原產生異常的疾病，例如自身免疫疾病、關節風濕等預防劑或治療劑。
另外，含有有效量的選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上化合物的食品或飲料，是利用這些化合物所具有的Fas抗原產生誘導作用的本發明的機能性食品或飲料，對于上述疾病的癥狀改善、預防發病是非常有用的。另外，環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽具有誘導滑膜細胞自然死亡的作用，本發明的藥物、食品或飲料作為抗風濕用的藥物、食品或飲料是特別有用的。
按照本發明，可以提供一種以選自具有抑制IgE產生的作用、抑制延遲性過敏反應的作用、抑制淋巴細胞生成的作用、抑制混合淋巴細胞反應的作用的環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上化合物為有效成分的免疫調節劑。
另外，由于環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽所具有的免疫調節作用，含有選自其中的化合物的食品或飲料作為免疫調節用食品或飲料，對于自身免疫疾病等必須調節免疫機能的疾病的癥狀改善或預防免疫異常是很有用的。
另外，本發明的方法對于IgE產生量的調節、免疫調節等是很有用的。
另外，按照本發明還可以提供一種以選自環戊烯酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物為有效成分的拓撲異構酶抑制劑、以選自這些化合物的1種以上化合物為有效成分使用的拓撲異構酶抑制方法。該拓撲異構酶抑制劑作為抗癌劑是很有用的，該拓撲異構酶抑制方法對于生物化學研究或抗癌藥物的選擇是很有用的。
權利要求
1.抗風濕劑，其特征在于含有為選自下式[I]所表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物作為有效成分。
2.風濕病改善用食品或飲料，或風濕病預防用食品或飲料，其特征在于含有選自下述式[I]表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物。
全文摘要
抗風濕劑,其特征在于以選自下述式[Ⅰ]表示的4,5－二羥基－2－環戊烯－1－酮或其光學活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物作為有效成分。
文檔編號C07C45/60GK1251522SQ98803851
公開日2000年4月26日 申請日期1998年3月18日 優先權日1997年4月1日
發明者小山信人, 務華康, 富永隆生, 西山英治, 萩屋道雄, 榎龍嗣, 大野木宏, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社